Xác Định Đột Biến Gen Gla, Gaa Và Đặc Điểm Di Truyền Của Bệnh Fabry Và Pompe.pdf

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC Y HÀ NỘI NGUYỄN THỊ PHƯƠNG THẢO XÁC ĐỊNH ĐỘT BIẾN GEN GLA, GAA VÀ ĐẶC ĐIỂM DI TRUYỀN CỦA BỆNH FABRY VÀ POMPE LUẬN ÁN TIẾN SĨ Y HỌC HÀ NỘI 2023 BỘ GIÁO DỤC[.]

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC Y HÀ NỘI NGUYỄN THỊ PHƯƠNG THẢO XÁC ĐỊNH ĐỘT BIẾN GEN GLA, GAA VÀ ĐẶC ĐIỂM DI TRUYỀN CỦA BỆNH FABRY VÀ POMPE LUẬN ÁN TIẾN SĨ Y HỌC HÀ NỘI - 2023 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC Y HÀ NỘI NGUYỄN THỊ PHƯƠNG THẢO XÁC ĐỊNH ĐỘT BIẾN GEN GLA, GAA VÀ ĐẶC ĐIỂM DI TRUYỀN CỦA BỆNH FABRY VÀ POMPE Chuyên ngành : Hóa sinh y học Mã số : 9720101 LUẬN ÁN TIẾN SĨ Y HỌC NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC GS.TS Tạ Thành Văn PGS.TS Hoàng Thị Ngọc Lan HÀ NỘI - 2023 LỜI CẢM ƠN Với tình cảm chân thành lịng biết ơn sâu sắc, cho phép gửi lời cảm ơn chân thành tới: Ban Giám hiệu, Phòng Đào tạo sau đại học, Bộ mơn Hóa sinh, Trung tâm gen - protein - Trường Đại học Y Hà Nội; Ban Giám đốc, Khoa Khám bệnh - Bệnh viện Tim Hà Nội; Ban Giám đốc, Trung tâm Nội tiết- Chuyển hóa - Di truyền Liệu pháp phân tử - Bệnh viện Nhi Trung ương quan tâm, giúp đỡ, tạo điều kiện thuận lợi cho suốt trình tơi học tập tiến hành nghiên cứu để tơi hồn thành luận án Đặc biệt, tơi xin bày tỏ lịng kính trọng biết ơn sâu sắc tới GS.TS Tạ Thành Văn PGS.TS Hoàng Thị Ngọc Lan – người thầy tận tình hướng dẫn, dìu dắt tơi q trình học tập, công tác chuyên môn nghề nghiệp bảo giúp tơi giải nhiều khó khăn, vướng mắc q trình thực nghiên cứu, giúp tơi hồn thành luận án Tôi xin chân thành cảm ơn thầy cô hội đồng sở Các thầy cô cho tơi nhiều ý kiến đóng góp q báu, nhiệt tình bảo, giúp đỡ tơi q trình hồn thành luận án Tôi xin chân thành cảm ơn thầy cô, anh chị trước, bạn bè đồng nghiệp nhiệt tình bảo, giúp đỡ tơi q trình nghiên cứu hồn thành luận án Sau nữa, tơi xin dành tình u thương lịng biết ơn đến người thân gia đình, bạn bè chia sẻ, chỗ dựa vững để thực hồn thành luận án Hà Nơi, ngày tháng năm 2023 Tác giả luận án Nguyễn Thị Phương Thảo LỜI CAM ĐOAN Tôi Nguyễn Thị Phương Thảo, nghiên cứu sinh khóa 33 Trường Đại học Y Hà Nội, chuyên ngành Hóa sinh y học, xin cam đoan: Đây luận án thân trực tiếp thực hướng dẫn thầy GS.TS Tạ Thành Văn PGS.TS Hoàng Thị Ngọc Lan Cơng trình khơng trùng lặp với nghiên cứu khác công bố Việt Nam Các số liệu thông tin nghiên cứu hồn tồn xác, trung thực khách quan, xác nhận chấp thuận sở nơi nghiên cứu Tơi xin hồn tồn chịu trách nhiệm trước pháp luật cam kết Hà Nội, ngày tháng năm 2023 Người viết cam đoan Nguyễn Thị Phương Thảo CÁC CHỮ VIẾT TẮT BNP Bp DBS DNA ERT FD GAA Gb3 GLA HSCT IOPD IVS LOPD LSD B natriuretic peptide Base pair Dried blood spot Deoxyribonucleic acid Enzyme replacement therapy Fabry disease Alpha-glucosidase A Globotriaosylceramide Alpha-galactosidase A Hematopoietic stem cell transplantation Infantile Onset Pompe Disease Intervening sequence Late Onset Pompe Disease Lysosomal stogage diease LVI Left ventricular index LVMI Left ventricular mass index LVPWd Left ventricular posterior wall diastolic MLPA Multiplex ligation-dependent probe amplification MS Mass spectrometry NST PCR Polymerase Chain Reaction SNP Single Nucleotide Cặp base Giọt máu khô Acid deoxyribonucleic Nghiệm pháp enzyme thay bệnh Fabry Ghép tế bào gốc tạo máu Bệnh Pompe khởi phát sớm Trình tự nối Bệnh Pompe khởi phát muộn Bệnh rối loạn tích đọng tiêu thể Chỉ số khối thất trái Chỉ số khối thất trái Độ dày thành sau thất trái tâm trương Đo khối phổ Nhiễm sắc thể Phản ứng tổng hợp chuỗi Polymerase Đa hình đơn nucleotid Polymorphism VUS Variants uncertain signification Biến thể chưa rõ ý nghĩa MỤC LỤC ĐẶT VẤN ĐỀ CHƯƠNG TỔNG QUAN TÀ I LIỆU 1.1 Rố i loa ̣n dự trữ tiêu thể 1.1.1 Đa ̣i cương 1.1.2 Chẩn đoán LSDs 1.1.3 Điều trị LSDs 1.1.4 Các phương pháp sàng lọc bệnh LSDs 1.2 Bệnh Fabry 1.2.1 Biểu lâm sàng Fabry 1.2.2 Di truyền học phân tử Fabry 11 1.2.3 Liên quan kiểu gen kiểu hình 18 1.2.4 Chẩn đoán sàng lọc Fabry 21 1.3 Bệnh Pompe 26 1.3.1 Biểu lâm sàng Pompe 28 1.3.2 Di truyền học phân tử Pompe 28 1.3.3 Mối liên quan kiểu gen kiểu hình 31 1.3.4 Chẩn đoán sàng lọc Pompe 32 1.4 Các phương pháp sinh học phân tử xác định đột biến gen GLA, GAA 34 1.4.1 Phản ứng chuỗi polymerase (PCR) 35 1.4.2 Giải trình tự gen trực tiếp 36 1.4.3 Giải trình tự gen hệ NGS 37 1.4.4 Dự đoán khả gây bệnh đột biến phần mềm tin sinh học 37 CHƯƠNG ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 40 2.1 Đối tượng nghiên cứu 40 2.2 Thời gian địa điểm nghiên cứu 41 2.3 Phương pháp nghiên cứu 42 2.3.1 Thiết kế nghiên cứu 42 2.3.2 Cỡ mẫu nghiên cứu 42 2.3.3 Phương pháp thu thập mẫu 42 2.3.4 Các biến số nghiên cứu 44 2.3.5 Sơ đồ nghiên cứu 45 2.3.6 Phương tiện nghiên cứu 46 2.3.7 Quy trình kỹ thuật đo hoạt độ enzyme 50 2.3.8 Quy trình giải trình tự trực tiếp tìm đột biến gen GLA GAA 52 2.4 Thu thập xử lý số liệu 58 2.4.1 Công cụ thu thập số liệu 58 2.4.2 Quy trình thu thập số liệu 58 2.4.3 Xử lý số liệu 58 2.4.4 Khống chế sai số 59 2.5 Đạo đức nghiên cứu 59 CHƯƠNG KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 60 3.1 Đặc điểm chung đối tượng tham gia nghiên cứu 60 3.1.1 Bệnh Fabry 60 3.1.2 Bệnh Pompe 61 3.2 Kết đo hoạt độ enzyme 62 3.2.1 Hoạt độ enzyme GLA người bệnh nghi ngờ Fabry 62 3.2.2 Kết hoạt độ enzyme GAA người bệnh nghi ngờ Pompe 63 3.3 Kết phân tích gen tìm đột biến 64 3.3.1 Kết phân tích gen GLA 64 3.3.2 Kết giải trình tự gen người bệnh nghi ngờ Pompe 71 3.4 Phát người lành mang gen thành viên gia đình người bệnh 79 3.4.1 Phát người lành mang gen thành viên gia đình người bệnh Fabry 79 3.4.2 Phát người lành mang gen thành viên gia đình người bệnh Pompe 83 3.5 Đặc điểm lâm sàng người bệnh Fabry Pompe 93 3.5.1 Đặc điểm lâm sàng người bệnh Fabry 93 3.5.2 Đặc điểm lâm sàng người bệnh Pompe 93 CHƯƠNG BÀN LUẬN 96 4.1 Đặc điểm chung đối tượng nghiên cứu 96 4.1.1 Đặc điểm chung tuổi giới bệnh Fabry 96 4.1.2 Đặc điểm chung tuổi giới bệnh Pompe 98 4.2 Biến đổi hoạt độ enzyme GLA, GAA người bệnh tham gia nghiên cứu 98 4.2.1 Hoạt độ enzyme GLA 98 4.2.2 Hoạt độ enzyme GAA người bệnh nghi ngờ Pompe 100 4.3 Các đột biến gen GLA, GAA người bệnh Fabry Pompe 100 4.3.1 Các đột biến gen GLA 100 4.3.2 Các đột biến gen GAA 103 4.4 Phát người lành mang gen thành viên gia đình người bệnh tham gia nghiên cứu 113 4.4.1 Phát người lành mang gen thành viên gia đình người bệnh Fabry 113 4.4.2 Phát người lành mang gen thành viên gia đình người bệnh Pompe 114 4.5 Biểu lâm sàng người bệnh Fabry Pompe 123 4.5.1 Biểu lâm sàng người bệnh Fabry 123 4.5.2 Đặc điểm lâm sàng bệnh Pompe 124 KẾT LUẬN 127 KHUYẾN NGHỊ 128 DANH MỤC CÁC CƠNG TRÌNH NGHIÊN CỨU CĨ LIÊN QUAN ĐẾN LUẬN ÁN TÀI LIỆU THAM KHẢO PHỤ LỤC DANH MỤC BẢNG Bảng 1.1: Phân bố loại đột biến gen GLA 15 Bảng 1.2: Các SNP gen GLA 17 Bảng 1.3 Phân bố loại đột biến gen GAA 30 Bảng 2.1 Trình tự mồi gen GLA sử dụng nghiên cứu 48 Bảng 2.2 Trình tự mồi để khuếch đại gen GAA 49 Bảng 2.3: Thành phần phản ứng PCR khuếch đại exon gen GLA 53 Bảng 2.4: Chu trình nhiệt phản ứng PCR khuếch đại gen GLA 54 Bảng 2.5 Thành phần phản ứng PCR cho giải trình tự gen GLA 55 Bảng 2.6 Chu trình nhiệt phản ứng PCR cho giải trình tự gen GLA 55 Bảng 2.7: Thành phần phản ứng PCR khuếch đại gen GAA 56 Bảng 2.8: Chu trình nhiệt khuếch đại gen GAA 56 Bảng 2.9: Thành phần phản ứng PCR giải trình tự gen GAA 57 Bảng 2.10: Chu trình nhiệt PCR giải trình tự gen GAA 57 Bảng 3.1: Phân bố theo giới nhóm người bệnh tham gia nghiên cứu 61 Bảng 3.2: Phân bố theo tuổi khởi phát người bệnh Pompe nghiên cứu 61 Bảng 3.3: Phân bố theo giới người bệnh Pompe nghiên cứu 62 Bảng 3.4: Kết đo hoạt độ enzyme GLA 62 Bảng 3.5: Kết đo hoạt độ enzyme GAA 64 Bảng 3.6: Kết giải trình tự gen GLA 27 mẫu có hoạt độ enzyme thấp 66 Bảng 3.7 Dự đoán khả gây bệnh đột biến phầm mềm tin sinh học 69 Bảng 3.8: Kết hoạt độ enzyme theo loại đột biến 70 Bảng 3.9: Kết giả trình tự gen GAA đối tượng nghiên cứu 73 Bảng 3.10 Tần suất xuất đột biến nghiên cứu 76 Bảng 3.11 Kết dự đoán khả gây bệnh đột biến c.625T>C phần mền tin sinh học 77 Bảng 3.12: Kết đo hoạt độ enzyme GLA từ mẫu máu toàn phần 79 Bảng 3.13: Kết đo hoạt độ enzyme GLA từ giấy thấm DBS 80 Bảng 3.14: Kết đo hoạt độ enzyme kết giải trình tự exon gia đình người bệnh mã số VN.06 82 Bảng 3.15: Tỷ lệ thành viên mang đột biến qua hệ 92 Bảng 3.16: Triệu chứng lâm sàng khởi phát người bệnh 93 Bảng 3.17: Biến đổi số tim ngực LVMI Xquang tim phổi siêu âm tim 94 Bảng 3.18: Kết hoạt độ enzyme CK, ALT người bệnh nghiên cứu 95 DANH MỤC HÌNH Hình 1.1: Hình ảnh tế bào với tiêu thể bị tích đọng Hình 1.2: Hình ảnh tổn thương da Fabry 10 Hình 1.3: Cấu trúc alpha-galactosidase người 11 Hình 1.4: Phân bố đột biến điểm gây bệnh Fabry exon gen GLA (theo HGMD) 16 Hình 2.1: Các phản ứng enzyme đo khối phổ song song GLA 51 Hình 3.1: Kết điện di sản phẩm PCR khuếch đại gen GLA mẫu BN mã số FB64 65 Hình 3.2: Hình ảnh biến thể 5’UTR -12G>A 68 Hình 3.3: Kết đột biến c.178C>T, (p.Pro60Ser) người bệnh mã số FB64 68 Hình 3.4: Hình ảnh minh họa sử dụng cơng cụ PolyPhen-2 để dự đốn khả gây bệnh đột biến c.178C>T 69 Hình 3.5: Hình ảnh minh họa sử dụng cơng cụ MutationTaster để dự đoán khả gây bệnh đột biến c.178C>T 70 Hình 3.6: Hình ảnh điện di sản phẩm PCR sau khuếch đại exon14 gen GAA 72 Hình 3.7: Hình ảnh đột biến gen người bệnh mã số Pom11.0 75 Hình 3.8: Hình ảnh kết đột biến c.1411-1414delGAGA người bệnh Pom20.4 Pom20.7 75 Hình 3.9: Hình ảnh đột biến chỗ nối intron 14 người bệnh mã số Pom12.0 76 Hình 3.10: Hình ảnh minh họa kết dự đốn khả gây bệnh đột biến c.625T>C phần mềm PolyPhen2 78 Hình 3.11: Hình ảnh minh họa kết dự đốn khả gây bệnh đột biến c.625T>C phần mềm MutationTaster 78 Hình 3.12: Phả hệ gia đình mã số VN.06 81 Hình 3.13: Phả hệ gia đình mã số Pom16 83 Hình 3.14: Phả hệ gia đình mã số Pom17 85 Hình 3.15: Phả hệ gia đình mã số Pom18 86 Hình 3.16: Phả hệ gia đình mã số Pom19 87 Hình 3.17: Phả hệ gia đình mã số Pom20 88 Hình 3.18: Phả hệ gia đình mã số Pom21 89 Hình 3.19 Phả hệ gia đình mã số Pom22 90 Hình 3.20: Phả hệ gia đình mã số VN.0055 91 DANH MỤC BIỂU ĐỒ Biểu đồ 3.1: Phân bố theo nhóm tuổi BN nghi ngờ Fabry 60 Biểu đồ 3.2: Kết đo hoạt độ enzyme GLA 63 Biểu đồ 3.3: Đồ thị phân tích hoạt độ enzyme GLA theo kết giải trình tự gen 71 ĐẶT VẤN ĐỀ Fabry Pompe hai bệnh di truyền gặp thuộc nhóm bệnh liên quan tới rối loạn dự trữ chất tiêu thể (lysosomal storage diseasesLSDs) Đây nhóm gồm 50 bệnh di truyền gặp rối loạn chuyển hóa hậu suy giảm chức tiêu thể LSDs thường hậu thiếu hụt enzyme cần thiết cho chuyển hóa lipid, glycoprotein mucopolysaccharides Fabry bệnh di truyền gen lặn nhiễm sắc thể giới tính X Pompe bệnh di truyền gen lặn nhiễm sắc thể thường Nguyên nhân bệnh xác định đột biến gen GLA, GAA dẫn đến thiếu hụt tương ứng acid alpha-galactosidase acid alpha-glucosidase, enzyme tiêu hóa tiêu thể.1,2 Sự thiếu hụt enzyme dẫn đến tích tụ glycerophospholipid glycogen có cấu trúc bình thường tiêu thể tế bào chất Sự tích tụ mức chất tiêu thể làm gián đoạn hoạt động bình thường quan khác tế bào dẫn đến tổn thương tế bào.3,4 Rất nhiều đột biến gen GLA, GAA ghi nhận đột biến gây bệnh, đột biến tiếp tục nghiên cứu báo cáo Mặc dù tỉ lệ mắc bệnh không cao khoảng trường hợp cho 40.000 50.000 dân5 hầu hết bệnh gây tử vong sớm suy hơ hấp suy tim Tỷ lệ nhóm nguy cao, người bệnh có gan to, lách to chưa rõ nguyên nhân, cao nhiều, khoảng 1/400 Tuy nhiên phát sớm nguy tử vong giảm đáng kể liệu pháp thay enzyme (ERT) điều trị hỗ trợ khác Gần đây, nhà khoa học phát tỷ lệ đáng kể người bệnh Fabry với triệu chứng không điển hình, khởi phát muộn (sau 40 tuổi), coi biến thể Fabry: thể tim thể thận 2 Fabry Pompe bệnh di truyền, việc sàng lọc phát sớm thành viên gia đình bệnh nhân mang đột biến gen GLA, GAA cần thiết để đưa tư vấn di truyền phù hợp, hạn chế sinh đứa trẻ bị bệnh Tại Việt Nam, có nghiên cứu đột biến gen GLA, GAA bệnh nhân Fabry Pompe, xác định đột biến thành viên gia đình Với lý đề tài “Xác định đột biến gen GLA, GAA đặc điểm di truyền bệnh Fabry Pompe” tiến hành với ba mục tiêu sau: Xác định đột biến gen GLA, GAA người bệnh Fabry Pompe Phát người lành mang gen bệnh thành viên gia đình người bệnh Mô tả biểu lâm sàng cận lâm sàng người bệnh mắc bệnh Pompe Fabry 3 CHƯƠNG TỔNG QUAN TÀ I LIỆU 1.1 Rố i loa ̣n dự trữ tiêu thể 1.1.1 Đa ̣i cương Tiêu thể bào quan tế bào chất, chứa enzyme thuỷ phân có tác dụng giáng hoá đại phân tử protein, phức hợp carbohydrate, acid nucleic, lipid, sulfate, phosphate Các sản phẩm giáng hố cuối tái sử dụng loại bỏ ngồi thể Sự khơng có chức enzyme, sau thời gian, gây lên tích tụ sản phẩm chuyển hoá trung gian Bệnh liên quan đến rối loạn dự trữ tiêu thể (LSDs- Lysosome storage diseases) nhóm bệnh khơng đồng gồm khoảng 50 rối loạn gen mã hoá enzyme tiêu thể.3 Tuy nhiên, protein quan trọng khác liên quan đến chuyển hố phóng thích chất tiêu thể cho nguồn gốc số bệnh LSDs Những protein bao gồm enzyme đồng hoạt hoá (enzyme coactivators), protein màng, protein vận chuyển xuyên màng enzyme quan trọng khác liên quan tới trình xử lý protein tiêu thể Về bệnh học, tất LSDs chung chế bệnh sinh tích tụ sản phẩm chuyển hố khác tiêu thể Q trình tích tụ sản phẩm dẫn tới phá huỷ cấu trúc chức tế bào.3,4 Sự chết lượng lớn tế bào gây lên chức quan tổ chức thể Hầu hết bệnh LSDs di truyền gen lặn nhiễm sắc thể thường, ngoại trừ số bệnh di truyền lặn nhiễm sắc thể giới tính X bệnh Fabry, bệnh Hunter (MPS III), bệnh Danon.4,6 Nếu xét bệnh riêng lẻ, tỷ lệ mắc bệnh di truyền hiếm, dao động khoảng 1/50.000 tới 1/4000.000 Tuy nhiên, tính tổng thể bệnh LSDs phổ biến, khoảng 1/7.000 đến 1/8.000 trẻ sống.7 Các bệnh LSDs phân loại dựa chất tiêu thể bị rối loạn, số nhóm phân loại dựa thiếu hụt protein.7 Các nhóm bệnh lớn bao gồm rối loạn chuyển hóa mucopolysaccharid (MPS Mucopolysaccarid), GM2 gangliosidose, neutral glycosphingolipidose, glycoproteinose, mucolipidose, hội chứng loạn dưỡng chất trắng não, bệnh tích đọng glycogen, rối loạn mỡ trung tính, rối loạn protein vận chuyển rối loạn phân bố protein tế bào.4 Hình 1.1: Hình ảnh tế bào với tiêu thể bị tích đọng 1.1.2 Chẩn đốn LSDs Chẩn đốn LSDs tương đối khó biểu triệu chứng lâm sàng đa dạng.8 Biểu bệnh khác tuổi khởi phát, mức độ phức tạp của chất tích đọng tiêu thể, tỷ lệ chất tích đọng, phân bố chất tích đọng quan tổ chức thể Mỗi quan, phận thể có ngưỡng hoạt động enzyme khác nhau, phụ thuộc vào thay đổi liên tục chất, luân chuyển tế bào (cellular turnover) nhu cầu chuyển hoá Chẩn đoán LSDs dựa triệu chứng lâm sàng, xét nghiệm hóa sinh xét nghiệm phân tử Các xét nghiệm hóa sinh sử dụng chẩn đoán LSDs bao gồm xét nghiệm định lượng chất bị ứ đọng đo hoạt độ enzyme tiến hành từ mẫu bệnh phẩm khác máu, nước tiểu, dịch ối, nguyên bào sợi da hay mẫu mô sinh thiết…9 Các xét nghiệm phân tử định để xác định đột biến gen mã hóa tổng hợp enzyme.10 Tất gen biết đến liên quan đến LSDs nhân dòng xét nghiệm phân tử trở thành phần thiếu chẩn đốn LSDs, nhiên, việc giải thích kết cịn nhiều khó khăn chưa hiểu nghĩa lâm sàng biến thể mối liên quan chúng.11 Các triệu chứng hội chứng lâm sàng định hướng cho việc lựa chọn xét nghiệm Phân tích enzyme siêu cấu trúc tế bào nước ối (amniocytes) tế bào màng rau thai (chorionic villus) dùng để chẩn đoán trước sinh nhiều bệnh LSDs 1.1.3 Điều trị LSDs Khi chẩn đoán, người bệnh cần cân nhắc điều trị đặc hiệu điều trị hỗ trợ Các liệu pháp điều trị áp dụng trước có biểu bệnh lý tưởng Có thể xác định người bệnh chưa có biểu triệu chứng phân tích gen cho thành viên gia đình có người bệnh chẩn đoán LSDs Tới thời điểm này, có số phương pháp nghiên cứu để điều trị bệnh LSDs nhằm giải sai sót tế bào thiếu hụt enzyme gây Các phương pháp áp dụng ghép tế bào gốc tạo máu, hệ thống enzyme vận chuyển truyền enzyme tái tổ hợp thay 1.1.3.1 Ghép tế bào gốc tạo máu (HSCT) Khoảng 20 năm trở lại đây, HSCT cho thấy hiệu người bệnh LSDs chưa có biểu bệnh người bệnh LSDs có biểu bệnh nhẹ.3 Tuỷ xương lấy từ anh chị em ruột có hệ HLA, từ người tình nguyện có hệ kháng nguyên bạch cầu Tuỷ xương người cho cung cấp tế bào gốc khoẻ mạnh, sản xuất enzyme bù đắp cho lượng bị bị thiếu hụt người bệnh Các thử nghiệm động vật cho thấy tế bào gốc ghép giúp giải việc thiếu hụt enzyme theo thời gian, đại thực bào có nguồn gốc từ tế bào ghép thay tế bào thần kinh đệm não Trên người, HSCT sử dụng với mức độ thành công khác người bệnh mắc MPS I (Hurler), MPS II (Hunter), MPS VI (Maroteaux-Lamy), Gaucher, Wolman, Metachromatic leukodystrophy, bệnh Krable Mỗi người bệnh LSDs đáp ứng khác với HSCT định ghép HSCT có dấu hiệu khởi phát xem quan trọng việc điều trị bệnh Các biến chứng HSCT phần lớn thải loại mảnh ghép, độc tố chế độ trị liệu, tỉ lệ ghép không thành công cao.4 1.1.3.2 Liệu pháp thay enzyme (ERT) Liệu pháp thay enzyme giúp bổ sung enzyme bị thiếu hụt Kỹ thuật tái tổ hợp DNA cho phép sản suất lượng lớn số enzyme tiêu thể Hiện nay, quan quản lý thuốc thực phẩm Hoa Kỳ xác nhận sản phẩm enzyme thay dùng điều trị bệnh Gaucher, Fabry, MPS I, MPS II, MPS VI bệnh Pompe Tuy nhiên hạn chế ERT qua khơng qua hàng rào máu não, khơng xử lý triệu chứng thần kinh LSDs Ngoài ra, phản ứng miễn dịch chống lại enzyme truyền vào nhắm sai mục tiêu trở ngại cho thành công ERT.12 1.1.4 Các phương pháp sàng lọc bệnh LSDs Với LSDs có liệu pháp điều trị hiệu quả, việc phát sớm bệnh từ giai đoạn sơ sinh trẻ nhỏ có ý nghĩa đặc biệt Hoạt độ enzyme số dùng nhiều sàng lọc LSDs Có nhiều kỹ thuật sử dụng để đo hoạt độ enzyme phương pháp miễn dịch đo khối phổ song song, với bệnh phẩm huyết thanh, bạch cầu mẫu máu khô bảo quản giấy (DBS – Dry blood spot) Một số kỹ thuật phát triển hồn thiện để áp dụng cho chương trình sàng lọc sơ sinh sử dụng máu khô bảo quản giấy lọc (blood filter paper specimen) 7 Phương pháp định lượng enzyme bệnh LSDs Pompe (GAA), Fabry (GLA), Sandhoff, Gaucher, Niemann-Pick bệnh Tay-Sachs sử dụng mẫu máu khô giấy thấm số tác giả công bố Ưu điểm phương pháp hoạt độ enzyme tương đối ổn định vòng tháng Điểm hạn chế xét nghiệm dùng số hoạt động enzyme (ví dụ, 4-methylumbelliferone), việc phân tích đồng thời nhiều bệnh khơng thể Ví dụ, xét nghiệm đo hoạt độ GLA để chẩn đoán bệnh Fabry sử dụng chất 4-methylumbelliferyl-α-Dgalactopyranoside có phát huỳnh quang hỗn hợp chất-enzyme tương tự xét nghiệp bệnh MPS I, nên hai phản ứng phân tích đồng thời lúc mà phải phân tích riêng rẽ.13 Các đột biến LSDs khác nhau, phân tích đột biến khơng phù hợp cho việc sàng lọc số lượng lớn Tương tự vậy, thiếu protein thông thường, protein đặc hiệu, dấu ấn chuyển hoá máu người bệnh LSDs, làm hạn chế tác dụng chẩn đoán xét nghiệm hố sinh lâm sàng Bên cạnh đó, việc sử dụng kỹ thuật sinh thiết mô hay nuôi cấy ngun bào sợi xét nghiệm có tính xâm nhập khó áp dụng quy mơ lớn Tuy nhiên số cách tiếp cận khả thi việc sàng lọc sơ sinh bệnh LSDs công bố y văn.7 1.2 Bệnh Fabry Fabry bệnh di truyền gặp, liên kết nhiễm sắc thể X gây tích tụ mức sphingolipid tiêu thể, dẫn đến triệu chứng quan khác nhau, chí tồn thân Sự thiếu hụt enzyme alpha galactosidase A (GLA) đột biến gen GLAgen mã hóa sản xuất enzyme GLA- gây ra, làm cho loại glycolipid globotriaosylceramide (viết tắt Gb3, GL-3, ceramide trihexoside) tích lũy bên nội mơ mạch máu, tế bào trơn, cầu thận tế bào biểu mô ống thận, tim tế bào thần kinh hạch rễ lưng… Sự tích đọng tiêu thể rối loạn chức tế bào kích hoạt chuỗi kiện, bao gồm chết tế bào giảm chuyển hóa lượng, tổn thương mạch máu nhỏ14, rối loạn chức kênh K(Ca) tế bào nội mô15, cân oxy hóa (stress oxidant)16, suy giảm trưởng thành thể thực bào17, thiếu máu cục mô, quan trọng tổn thương tim thận không hồi phục tiến triển.18-21 Cơ chế tổn thương mô cho giảm tưới máu tích đọng chất tế bào biểu mô mạch máu đơn độc đặc biệt thận, tim, hệ thần kinh trung ương da, phối hợp với tích đọng mơ khác Đau dị cảm cho tưới máu dây thần kinh ngoại vi tích tụ glycosphingolipid tiêu thể tế bào thần kinh, hạch rễ lưng, tủy sống, dẫn đến teo nhỏ dây thần kinh khơng có myelin Fabry bệnh gặp nên khó xác định tỷ lệ mắc bệnh xác Những báo cáo gần cho tỷ lệ khoảng 1/40.00022 đến 1/60.0007 quần thể Tuy nhiên sàng lọc sơ sinh thấy tỷ lệ cao nhiều, khoảng 1/3.100 Italia23 1/1.500 trẻ nam Đài Loan, 86% có đột biến IVS4 +919G > A.24 Đột biến tìm thấy số người bệnh người lớn người Đài Loan- Trung Quốc có phì đại tim bẩm sinh 1.2.1 Biểu lâm sàng Fabry Nhiều nghiên cứu bệnh bệnh không đồng kiểu hình, người bệnh có triệu chứng khác tuổi khởi phát, mức độ trầm trọng bệnh… Các tổn thương tế bào thường có từ sớm, chí từ bào thai25,26, nhiên khác với phần lớn bệnh tích đọng tiêu thể khác, người bệnh Fabry khơng có triệu chứng lâm sàng năm đời.27,28 Triệu chứng lâm sàng Fabry thường gặp với trẻ từ 3-10 tuổi, trẻ gái thường muộn trẻ trai29,30 với biểu đau, tổn thương giác mạc tổn thương da, hậu cuối suy quan Giai đoạn cuối bệnh thận, tim mạch mạch máu não đe dọa tính mạng người bệnh, làm giảm tuổi thọ người bệnh Fabry.31-33 FD người lớn gặp chủ yếu gặp nam giới với kiểu hình kinh điển Sau này, biến thể “thể tim” “thể thận” mô tả với người bệnh có triệu chứng tim đơn độc kết hợp với triệu chứng thận Người dị hợp tử nữ coi người mang gen Người nữ dị hợp tử biểu triệu chứng không Các dấu hiệu triệu chứng lâm sàng khác người nữ dị hợp tử, cho có liên quan tới bất hoạt ngẫu nhiên nhiễm sắc thể X tất tế bào phôi thai nữ Ở người dị hợp tử nữ gặp tất triệu chứng bệnh, bao gồm triệu chứng quan quan trọng tim, não, thận… Tuy nhiên, triệu chứng thường xuất muộn so với nam giới khoảng 10 năm.34 - Thể điển hình: gặp trẻ em với triệu chứng là:  Đau: gặp 60-80% người bệnh Fabry, người bệnh có Fabry cấp tính (Fabry crises) với cảm giác bỏng rát bàn tay, bàn chân35, đau mạn tính với cảm giác ngứa ran  Xuất ban màu đỏ (u máu), thường gặp rốn, lưng, mông.36-38  Mệt mỏi kéo dài  Ù tai, giảm thính lực  Tổn thương giác mạc (cornea verticillata) 10 Hình 1.2: Hình ảnh tổn thương da Fabry (Nguồn: https://www.healthline.com/health/fabry-disease) - Thể khơng điển hình: khởi phát muộn, thường sau 40 tuổi, với triệu chứng:  Tổn thương tim: o Giãn thất trái o Loạn nhịp o Đau ngực o Khó thở 40-60% người bệnh FD.31,39-42 o Phì đại thất o Sa van o Tổn thương mạch vành  Tổn thương thận: kết tích tụ Gb3 màng cầu thận, biểu mô quai Henle ống lượn xa, nội mô, trơn tế bào động mạch thận.43,44 Suy thận thường bắt đầu với microalbumin niệu protein niệu xuất người bệnh 20- 30 tuổi  Tổn thương não: gây triệu chứng từ nhẹ đến nặng đau đầu, chóng mặt, nặng đột quỵ.45,46  Biểu thính giác: ù tai, giảm thính lực.47 11  Tổn thương mắt: teo giác mạc  Giảm tiết mồ hôi  Mệt mỏi kéo dài 1.2.2 Di truyền học phân tử Fabry Fabry xác định đột biến gen GLA mã hóa tổng hợp enzyme alpha galactosidase A Gen GLA nằm nhánh dài NST X, vị trí Xq22.1 Gen có exon, gồm khoảng 10.222 bp Vùng mã hóa gồm 1290 bp, mã hóa protein gồm 429 acid amin Hình 1.3: Cấu trúc alpha-galactosidase người (Nguồn: Garman2004) Enzyme GLA tổng hợp dạng tiền enzyme có trọng lượng 50kDa, vận chuyển vào tiêu thể nhờ thụ thể mannose phosphate, trở thành dạng hoạt động có trọng lượng 46kDa, sau cắt bỏ chuỗi peptid tín hiệu.48 Nó glycoprotein homodimer với monomer bao gồm hai miền: miền N-terminal có cấu trúc (β/α)8 điển hình, chứa trung tâm hoạt động (tại đầu tận C-terminal chuỗi β1 - β7) miền C-terminal chứa tám sợi β đối song song.49 Ba carbohydrate liên kết với Nito tìm thấy bề mặt phân tử enzyme, cách xa trung tâm hoạt động Các vị trí chịu trách nhiệm việc gấp nếp protein enzyme vận chuyển chất tế bào.50 12 Các đột biến gen GLA bao gồm: đột biến điểm (đột biến vô nghĩanonsenses, đột biến sai nghĩa- missenses), đột biến chỗ nối - splicing, đột biến vùng điều khiển- regulatory, đột biến thêm đoạn nhỏ - small insertions/deletions, thêm đoạn lớn – gross insertions/deletions, rối loạn cấu trúc hỗn hợp – complex rearrangements Phần lớn đột biến gây giảm chức enzym,51 vài thay đổi trình tự ví dụ Arg112His khơng gây thay đổi kiểu hình, cho tính đa hình gen Các đột biến liên quan đến cấu trúc enzyme chia thành nhóm: nhóm đột biến phá vỡ trung tâm hoạt động enzyme cách tác động đến nhóm cấu tạo lên trung tâm hoạt động cần thiết cho hình thành cấu trúc chiều nó, nhóm ảnh hưởng đến lõi kỵ nước protein đột biến ảnh hưởng đến nhóm xa trung tâm hoạt động lại ảnh hưởng đến gấp nếp tính bền vững enzyme.49 Hầu hết đột biến gây bệnh làm thay đổi lõi kỵ nước α-galactosidase A, bệnh Fabry thường đột biến dẫn đến lỗi gấp nếp chuỗi polypeptide.50 Năm 1989, Bernstein cộng phân tích gen GLA 130 gia đình mắc Fabry riêng rẽ kỹ thuật lai Southern PCR phát xếp lại gen, xóa đoạn gen với kích thước từ 0.4-5.5kb đột biến điểm đột biến c.1066C>T, p.Arg356Trp.52 Đây đột biến điểm mô tả bệnh Fabry Kể từ đến nay, nhiều nghiên cứu thực nhiều nước giới báo cáo nhiều đột biến điểm nhiều vị trí khác gen GLA, dẫn đến thay đổi acid amin enzyme GLA Năm 1990, Sakuraba cộng sử dụng kỹ thuật PCR, RT-PCR genomic DNA phát đột biến điểm khác người nam dị hợp tử (hemizygous) gia đình người Nhật Một người dị hợp tử có biểu bệnh điển hình với hoạt tính GLA thấp (không đo được) mang 13 đột biến G>A exon (codon 44), dẫn đến thay ba TGG mã hóa tổng hợp tryptophan thành ba kết thúc (TAG) tạo địa điểm giới hạn NheI (Nhel restricted site) Đột biến dẫn đến tổng hợp phân tử enzyme GLA ngắn bình thường, dẫn đến triệu chứng bệnh Fabry thể điển hình Một người dị hợp tử khác có biểu lâm sàng khơng điển hình, với biểu bệnh tim xuất muộn, có hoạt độ GLA cịn lại tương đối nhiều, có đột biến G>A exon (codon 301), làm thay arginine glutamine Sự thay dường làm thay đổi đặc tính enzyme cho hoạt động enzyme đầy đủ giữ lại để làm thay đổi rõ rệt tiến trình bệnh Xác định đột biến gen GLA giúp phát người nữ dị hợp tử gia đình này.53 Năm 1993, Davies cộng biến thể đa hình (polymorphic) exon gen GLA, chứa 60 bp đầu 5’ -UTR (không dịch mã) trước ba mã khởi đầu mã hóa methionine Mức độ đa hình cao chưa báo cáo gặp đoạn DNA ngắn.54 Cũng năm 1993, Eng cộng mô tả 18 gen GLA khác người bệnh Fabry.55,56 Nghiên cứu W Lai cộng công bố năm 200357 hầu hết đột biến gen GLA phát người bệnh Fabry giải trình tự gen, số đột biến chỗ nối phân loại sai thành đột biến sai nghĩa Để dự đốn tượng gây đột biến chỗ nối cụ thể, họ tiến hành tìm kiếm tài liệu tất đột biến gần chỗ nối gen GLA công bố, bao gồm đột biến điểm exon thực phân tích điểm chỗ nối (Splice site score – SSS).58 Họ tìm thấy 13 đột biến vị trí cho nối (donor splicing site) - bao gồm đột biến: Ser65Thr, Asp183Ser, Lys213Asn, Met267Ile exon 1, 3, 5; đột biến vị trí nhận nối (acceptor splicing site) đột biến tạo exon 14 Tất đột biến chỗ nối, ngoại trừ đột biến tạo exon mới, có SSS thấp vị trí tự nhiên tương ứng chúng Cũng năm 2003, Yasuda cộng gen GLA người gen hoi động vật có vú có trình tự thêm poly A (polyadenylation signal) vùng mã hóa thiếu đầu 3’ vùng không dịch mã Ở người bệnh nam mắc Fabry thể điển hình, họ xác định đột biến tạo khung dịch mã 1277delAA 1284delACTT xảy đầu 3’ tận vùng mã hóa, dẫn đến xóa stop codon; việc xóa 2-bp làm thay đổi trình tự polyadenylation Cả hai đột biến tạo nhiều có độ dài khác trình tự đầu 3’, dẫn đến kéo dài thêm khoảng kb Phân tích kỹ thuật Northern blot cho thấy khơng có giảm sút mRNA.59 Nhiều nghiên cứu chứng minh đột biến chỗ nối (splicing site) gây bệnh Fabry Khi phân tích đột biến chỗ nối gen GLA, Lai cộng (2003)58 thảo luận năm sai lệch thường gặp là: bỏ qua exon (exon skipping), kích hoạt vị trí bí mật (cryptic site activation), tạo vị trí (new site creation), giữ intron (intron retention), làm đứt gẫy trình tự làm tăng cường ghép nối- exonic splicing enhancer.60,61 Việc lựa chọn đột biến chỗ nối dựa nhiều yếu tố Khi khơng có khu vực bí mật khu vực tạo ra, việc phá hủy vị trí cho nối vị trí nhận nối đầu 3’ 5’ (donor acceptor) gây việc bỏ qua exon lân cận Các vị trí nối bí mật thường vùng im lặng kích hoạt trình tự thực bị xóa bỏ đột biến Nói chung, khoảng cách vị trí thực vị trí bí mật khoảng 100 nucleotide Các đột biến dẫn đến việc tạo vùng nối mới, có khơng liên quan đến xóa bỏ vị trí thực Nếu vị trí thực khơng bị thay đổi, vị trí ln nằm vùng ngược dịng (upstream) vị trí thực Giữ intron xảy không thường xuyên 15 với hình thức đột biến chỗ nối khác Các chế tương tự giải thích có nhiều đột biến sai nghĩa vơ nghĩa khơng nằm vị trí nối lại liên quan tới xóa bỏ exon Đến tháng năm 2021, theo thống kê HGV (Human Genome Variation Sociery) có 941 thay đổi trình tự gen GLA ghi nhận, 647 (gần 70%) đột biến điểm Sự xếp lại đoạn gen lớn bao gồm exon, nhiều exon hay tồn gen khơng phổ biến Fabry, chiếm khoảng 1%.9,62 Bảng 1.1: Phân bố loại đột biến gen GLA (theo HGMD) Loại đột biến Số lượng Tỷ lệ (%) Sai nghĩa, vô nghĩa 647 68,7 Chỗ nối (splicing) 44 4,7 Vùng điều khiển (Regulatory) 0,6 Xóa đoạn nhỏ 128 13,6 Thêm đoạn nhỏ 42 4,5 Xóa thêm đoạn nhỏ (small indels) 13 1,4 Xóa đoạn lớn 37 3,8 Thêm đoạn lớn 0,7 0,7 941 100 Rối loạn cấu trúc hỗn hợp (complex rearrangements) Tổng Những thay đổi trình tự xảy tất exon, chí chỗ nối Sự phân bố đột biến sai nghĩa exon gen GLA thống kê hình 1.4 Exon exon có nhiều đột biến sai nghĩa exon exon có đột biến Tuy nhiên người ta không ghi nhận 16 điểm coi “hot spot” gen GLA Exon gồm 360bp (chiếm 27,9% chiều dài gen GLA) có đến 38% tổng số đột biến điểm vùng mã hóa gen GLA Khoảng 1/3 (chiếm 30,6%) đột biến xếp lại gen nằm exon 7, exon chiếm 22,6% chiều dài vùng mã hóa 25.0 21.7 Tỷ lệ đột biến (%) 20.0 17.4 15.1 15.0 14.8 13.6 11.9 10.0 5.5 5.0 0.0 Exon Exon Exon Exon Exon Các exon gen GLA Exon Exon Hình 1.4: Phân bố đột biến điểm gây bệnh Fabry exon gen GLA (theo HGMD) Bệnh gây đột biến sai nghĩa thay nucleotide ba mã hóa dẫn đến thay acid amin chuỗi polypeptide acid amin khác Tuy nhiên, số đột biến cho đột biến sai nghĩa pSer65Thr, pGly183Ser, pLys213Asn hay pMet267Ile lại ảnh hưởng đến chỗ nối bình thường mRNA.58 Hai đột biến điểm chỗ nối c.639+861C>T c.639+919G>A gây giảm hoạt độ GLA gây thay đổi phức tạp trình tự chỗ nối Exon exon exon có nhiều đột biến chỗ nối đột biến vô nghĩa nhất, với tổng số loại 15 đột biến 17 Một vài báo cáo có người mang đột biến khác alen có khả gây bệnh, mà không dẫn đến xếp lại gen, ví dụ đột biến p.Glu66Gln + p.Arg112Cys, đột biến xóa đoạn p.Leu89Arg + bp codon 303, đột biến Ala143Thr +Gln312His, hay đột biến Asp264Tyr +Val269Met Ngược lại, khoảng 2% người bệnh mang đột biến gen GLA gây bệnh bệnh không liên quan đến bệnh biến thể không đồng nghĩa p.Asp313Tyr.63 Bảng 1.2 đa hình đơn nucleotid (SNP- Single Nucleotide Polymorphism) gen GLA đột biến không gây bệnh hoi, bao gồm thay đổi trình tự exon.64 Nó gợi ý vài biến đổi trình tự gen GLA có liên quan đến biểu gen hoạt tính thủy phân enzyme GLA Bảng 1.2: Các SNP gen GLA Vị trí 5’UTR Thay đổi nucleotid Thay đổi protein c.-30G>A c.-12G>A c.-10C>T Exon c.305C>T p.Ser102Leu c.369T>C p.= Intron c.370-77_81del5 Exon c.376A>G Intron c.639+68A>G p.Ser126Gly c.640-201del16 c.640-146T>C c 640-16A>G Exon c.937G>T Intron c.1000-22C>T Exon c.1187T>A p.Asp313Tyr p.Phe396Tyr 18 Một đặc điểm bệnh di truyền liên kết NST X giảm khả sinh sản nam giới tăng tần số đột biến mới, phần lớn người bệnh gia đình người bệnh mắc bệnh Fabry mang đột biến gen GLA độc lập Kết người bệnh hay gia đình thường mang đột biến Tỷ lệ đột biến chưa biết cách xác, nhiên ước tính tỷ lệ thấp 3,3%; khoảng từ 3-10% nhận từ nghiên cứu lý thuyết65 khoảng 8% từ nghiên cứu độc lập.62 Fabry bệnh di truyền gen lặn NST giới tính X, người nữ dị hợp tử coi người lành mang gen Những người có biểu lâm sàng thay đổi từ nhẹ đến nặng bất hoạt ngẫu nhiên NST X Tuy nhiên biểu bệnh nữ dị hợp tử thường xuất muộn nhẹ nam giới Brouns cộng mô tả xảy đồng thời hội chứng Turner bệnh Fabry người bệnh nữ có biểu nặng, có anh ruột mắc bệnh Fabry.66 Karyotype người bệnh 45,X phân tích gen thu kết người bệnh mang đột biến gen gây bệnh p.Pro259Arg trạng thái bán hợp tử Người bệnh có tần suất thấp thể khảm dịng tế bào có xóa đoạn cánh ngắn NST X thứ hai (46,X,del(X)(p11)) Điều lý giải người bệnh thể dị hợp có biểu bệnh nặng Rodriguez cộng mô tả trường hợp ngược lại, người bệnh với biểu bệnh Fabry điển hình mang đột biến đồng hợp tử p.Gln279Arg.67 1.2.3 Liên quan kiểu gen kiểu hình Nghiên cứu mối liên quan kiểu gen kiểu hình Fabry phức tạp có tham gia nhiều yếu tố Thứ nhất, phần lớn thay đổi trình tự gen GLA đột biến mang tính cá nhân (“private”), số lượng người bệnh mang loại đột biến Thứ hai thay đổi biểu lâm sàng Các thành viên gia đình có 19 biểu lâm sàng khác Thứ ba: nhiều mức độ biểu lâm sàng quan sát thấy quần thể gây khó khăn cho việc đặc điểm lâm sàng liên quan tới đột biến gen GLA Một khó khăn giai đoạn tiến triển bệnh, số biểu kiểu hình hậu số yếu tố không trực tiếp liên quan đến đột biến gen GLA Do việc đưa mối liên quan kiểu gen kiểu hình bệnh Fabry khó khăn dựa phân tích cá nhân hay gia đình Tuy nhiên việc nghiên cứu số lượng lớn người bệnh cung cấp thơng tin cần thiết để làm sáng tỏ số giả thuyết bệnh Fabry Và để loại bỏ yếu tố không liên quan đến đột biến gen GLA, phần lớn nghiên cứu tiến hành người bệnh nam Các alen bị đột biến vô nghĩa đột biến chỗ nối gen GLA hay đột biến xếp lại gen vùng dịch mã thường dẫn tới xuất mã kết thúc sớm, phần lớn dẫn đến tổng hợp enzyme khơng có chức Hơn phần lớn mRNA xuất mã kết thúc sớm thường không dịch mã thay chế bảo vệ cấp độ phân tử gọi NMC – nonsence mediated mRNA decay (cơ chế phân rã mRNA trường hợp xuất mã kết thúc sớm), dẫn đến không tổng hợp enzyme Đột biến sai nghĩa ảnh hưởng đến hoạt động enzyme mức độ khác Cụ thể thay nucleotid vùng hoạt động enzyme thay nucleotid cần thiết cho gấp nếp protein ba chiều cách, thường dẫn đến hậu hoàn toàn hoạt động enzyme Matsuzawa cộng sự liên quan số đột biến sai nghĩa gen GLA liên quan với bệnh Fabry thể điển hình, rối loạn chức không ổn định enzyme dự đoán thay đổi cấu trúc enzyme vùng quan trọng.68 Ngược lại, đột biến liên quan tới biểu nhẹ thường nằm xa vị trí hoạt động gây thay đổi cấu trúc nhỏ Một 20 số thay đổi p.Met72Val, p.Gln279Glu p.Met296Ile có Km Vmax bình thường có hoạt động xúc tác bình thường, bị ngừng hoạt động thối hóa sau dịch mã Khi tổng hợp nghiên cứu mối tương quan kiểu gen kiểu hình nghiên cứu khác, Braton cộng nhận thấy tổng số quan bị ảnh hưởng tăng chậm theo tuổi kiểu gen dạng wild-type acid amin bị đột biến nằm nhóm so với trường hợp acid amin bị đột biến nằm nhóm khác Tuy nhiên xếp người bệnh thành nhóm: nhóm mang đột biến sai nghĩa nhóm mang đột biến cịn lại khơng thấy khác biệt có ý nghĩa nhóm mức độ biểu bệnh Kết Branton cộng cho thấy nhóm người bệnh mang đột biến acid amin khác nhóm biểu bệnh thận nghiêm trọng (tần số thấp hơn, xuất suy thận muộn tỷ lệ sống sót thận cao hơn) so với nhóm người bệnh mang acid amin đột biến nhóm.69 Đột biến sai nghĩa thay acid amin aicd amin khác, gây thay đổi cấu trúc nhỏ chuỗi polypeptide Sự thay đổi dẫn đến hồn tồn hoạt tính thủy phân α-GLA, enzyme có phần toàn hoạt động Sự giảm phần lớn nhỏ hoạt động enzyme phụ thuộc vào kiểu gen người bệnh, đo hoạt độ enzyme thường dùng số trung gian để đánh giá khoảng cách biến đổi kiểu gen với thay đổi kiểu hình Nhìn chung lượng enzyme cịn hoạt động liên quan đến biểu nhẹ bệnh so với người bệnh khơng cịn enzyme hoạt động Người bệnh cịn enzyme hoạt động có biểu muộn quan tim, thận Người bệnh mang đột biến p.Asn215Ser có hoạt độ enzyme cao biểu lâm sàng nhẹ 21 đột biến khác Người bệnh có biểu đau thần kinh có hoạt độ enzyme thấp người bệnh khơng có biểu đau Fabry thể khơng điển hình xuất muộn, có hoạt độ enzyme cao với biểu muộn tim, thận báo cáo Các đột biến gây bệnh nhẹ gặp nhiều exon (8 10 đột biến, chiếm 56%), exon chiếm 28.9% vùng mã hóa Methionin vị trí 51 Aspartat 215 dường acid amin wild type gen GLA 1.2.4 Chẩn đoán sàng lọc Fabry 1.2.4.1 Chẩn đoán xác định Mặc dù bệnh khởi phát sớm triệu chứng gợi ý chẩn đốn, nhiều trường hợp người bệnh Fabry chẩn đốn muộn triệu chứng lâm sàng giống với bệnh phổ biến rối loạn chức tim, thận không phổ biến bệnh nhi - Fabry thể điển hình: Fabry thể điển hình thường chẩn đốn dựa dấu hiệu lâm sàng đặc trưng như: đau, u mạch sừng hóa, tổn thương võng mạc, triệu chứng tim: giãn thất trái, triệu chứng thận: suy thận, gan, lách to khơng rõ ngun nhân Chẩn đốn xác định có giảm hoạt độ enzyme GLA máu, nhiên nữ giới hoạt độ enzyme giới hạn bình thường, địi hỏi phải phân tích gen tìm đột biến Xét nghiệm đo hoạt độ enzyme từ giọt máu khô dần thay cho xét nghiệm cổ điển với bệnh phẩm huyết tương bạch cầu, cho kết enzyme ổn định đến tháng sau lấy mẫu.70-74 - Fabry thể khơng điển hình thường phát phòng khám tim mạch phòng chạy thận nhân tạo bệnh nhân có phì đại tim suy thận… 22  Tiêu chuẩn chẩn đốn phì đại tim * Tiêu chuẩn chẩn đốn phì đại tim trẻ em: dựa vào khối lượng thất trái (LVM) - Nếu trẻ nhỏ tuổi ta phải áp dụng đường cong bách phân vị riêng cho nam nữ Khi LVM từ 95% trẻ có phì đại tim - Nếu trẻ tuổi: o Khối lượng thất trái (LVM):  Nam - 45 g/m2  Nữ - 40 g/m2 Ngồi ta áp dụng số tim ngực ≥ 60% áp dụng cho tất độ tuổi mà khơng tìm nguyên nhân gây tim to 23 * Tiêu chuẩn chẩn đốn phì đại tim người lớn Tiêu chí Tiêu chí phụ Siêu âm tim Thất trái dày 13 mm vách Thất trái dày 12 mm vách trước trước thành sau, 15 thành sau, 14 mm vách mm vách sau hay thành tự sau thành tự SAM mức nặng SAM trung bình (tiếp xúc van-vách ngăn > 30% (không tiếp xúc vách ngăn thời gian tâm thu Thõng van hai tâm thu Điện tâm đồ Phì đại thất trái + Thay đổi tái cực Block nhánh hoàn toàn rối loạn (thang điểm Romhilt &Estes >5) dẫn truyền thất (nhẹ) (ở Sóng T đảo ngược DI, aVL chuyển đạo trước tim trái) (3mm) (với chênh lệch trục QRS-T  30o), V3-V6 (3mm) DII, DIII aVF (5mm) Q bất thường (>40ms hay >25% sóng R) chuyển đạo từ DII, DIII, aVF (đồng thời khơng có bloc nửa trước nhánh trái), V1-V4; hay DI, aV1, V5-V6 Thay đổi (bất thường) tái cực mức nhẹ chuyển đạo trước tim trái S sâu V2 (>25mm) Đau ngực, khó thở ngất khơng giải thích 24 Người bệnh chuẩn đốn phì đại tim khi: o Có tiêu chí chính, o tiêu chí siêu âm phụ, o tiêu chí siêu âm phụ cộng tiêu chí điện tim phụ  Định lượng Gb3 huyết thanh: đề nghị dùng chẩn đoán Fabry, nhiên phương pháp tốn nhiều thời gian lượng Gb3 phụ nữ thường thấp nam giới giới hạn bình thường  Gb3 nước tiểu số đáng tin cậy chẩn đoán giới nam nữ.75,76 Tuy nhiên, nồng độ Gb3 nước tiểu khơng tăng biến thể FD, người bệnh có đột biến đặc biệt gen GLA (p.Asn215Ser).77,78  Mô học: sinh thiết thận da thấy ứ đọng tiêu thể, giúp ích cho chẩn đốn số trường hợp, nhiên xét nghiệm xâm lấn nên dùng chẩn đốn  Các dấu hiệu phụ trợ: xét nghiệm thường cho kết bình thường, số báo cáo ghi nhận người bệnh Fabry có dấu hiệu sau: thiếu máu, tăng homocystein, tăng HDL-C tăng Lipoprotein máu Trong nước tiểu: hồng cầu, tăng Gb3 Ở người bệnh có phì đại thất trái tăng BNP, tăng troponin I, C…  Xét nghiệm phân tích gen Ở người nữ dị hợp tử, hoạt độ α-galactosidase giới hạn bình thường, nên cần xét nghiệm phân tích gen để chẩn đốn trường hợp nghi ngờ Cơng bố cDNA, trình tự DNA gen (Genbank X14448) mở đường cho nghiên cứu di truyền học phân tử FD Việc giải trình tự trực tiếp tương đối dễ dàng kích thước gen nhỏ cho phép xác 25 định cách xác đột biến gen Ngày nay, việc sử dụng giọt máu khơ phân tích DNA thay cho sử dụng khối bạch cầu Biến tính sắc ký lỏng hiệu cao (DHPLC- Denaturing highperformance liquid chromatography) phương pháp sàng lọc có hiệu quả.79 Trong trường hợp giải trình tự trực tiếp bị giới hạn, cần sử dụng MLPA (Multiplex ligation dependent probe amplification) có giảm hoạt độ enzyme không liên quan tới đột biến điểm.80 Ngày nay, xét nghiệm phân tích exon gen GLA (bao gồm vùng promoter vùng sườn (flaking regions) xem tiêu chuẩn vàng cho chuẩn đoán phân tử bệnh Fabry.48 1.2.4.2 Chẩn đoán phân biệt Ở bệnh nhi, cần chẩn đoán phân biệt với đau thấp khớp, viêm khớp dạng thấp, lupus ban đỏ hệ thống, bệnh Raynaud… Tuổi vị thành niên, cần phân biệt với xơ cứng đa ổ, bệnh hay bị chẩn đoán nhầm, đặc biệt nữ giới 1.2.4.3 Sàng lọc tư vấn di truyền - Sàng lọc: Sàng lọc cá nhân với gia đình có tiền sử Fabry sàng lọc sơ sinh cách phát bệnh trước xuất triệu chứng, sàng lọc cho đối tượng nguy cao trường hợp khởi phát muộn chìa khóa việc quản lý người bệnh Fabry Bất kỳ phương pháp sàng lọc phải đạt yêu cầu tốt, nhanh chi phí thấp Đo hoạt độ αgalactosidase từ giọt máu khô giấy thấm phương pháp sàng lọc tốt nay, cho phép phát Fabry người bệnh nam, bỏ sót 1/3 số phụ nữ mắc bệnh 26 - Tư vấn di truyền Khác với phần lớn bệnh tích đọng tiêu thể khác, Fabry bệnh di truyền gen lặn NST X, nên khơng có truyền bệnh từ nam sang nam Mẹ dị hợp tử không biểu bệnh mà truyền gen bệnh cho trai, trai biểu bệnh gái người mang gen bệnh Khi người gia đình chẩn đoán xác định, nên tiến hành xét nghiệm gen cho thành viên gia đình để phát người bị bệnh người mang gen bệnh để có hướng điều trị tư vấn thích hợp - Chẩn đốn trước sinh Các xét nghiệm hóa sinh di truyền học phân tử tiến hành với người bệnh Fabry đo độ giảm hoạt độ α-galactosidase A nước ối, nuôi cấy tế bào nhung mao màng đệm tuần thứ 10 tế bào ối tuần thứ 14 thai kỳ Xác định giới tính thai nhi cách sử dụng máu mẹ 9-11 tuần thường làm Tư vấn di truyền cần thảo luận kỹ, đặc biệt từ sau đời liệu pháp enzyme thay ERT 1.3 Bệnh Pompe Bệnh Pompe (Pompe disease – PD) hay gọi bệnh rối loạn chuyển hóa glycogen tiêu thể loại II (GSD II) Đây bệnh di truyền gen lặn nhiễm sắc thể thường, kết thiếu hụt acid alpha – glucosidase (acid maltase, GAA)1,2 gen đột biến gen GAA nằm NST 17 vị trí 17q25 Acid alpha – glucosidase enzyme thủy phân tiêu thể, cần thiết cho giáng hóa tỉ lệ nhỏ (1 - 3%) glycogen tế bào Bởi đường giáng hóa glycogen khơng bị ảnh hưởng nên bệnh Pompe sản xuất lượng thể không bị suy giảm khơng có hạ 27 đường huyết Tuy nhiên, kết thiếu hụt enzyme tích tụ glycogen có cấu trúc bình thường tiêu thể tế bào chất Sự tích tụ glycogen mức tiêu thể làm ảnh hưởng đến chức bình thường quan khác tế bào dẫn đến tổn thương tế bào Từ lan rộng làm rối loạn chức tồn quan liên quan (ví dụ: bệnh tim) Tỉ lệ mắc bệnh: tỉ lệ mắc bệnh khác quần thể nghiên cứu, dao động từ 1/40.000-50.000 dân Ở Hoa Kì: tỉ lệ mắc bệnh ước tính khoảng 1/ 40.000 cho thể (thể khởi phát sớm, thể khởi phát muộn thể trưởng thành) bệnh Tỉ lệ mắc cao người da đen, tỉ lệ mắc nhóm trẻ nhỏ khoảng 1/ 14.000 Tỉ lệ mắc Đài Loan miền Nam Trung Quốc khoảng 1/ 50.000 Tỉ lệ dân số Hà Lan ước tính khoảng 1/ 40.000 dân (1/ 138.000 trẻ em).5 Tỉ lệ tử vong: Trẻ bị bệnh thường tử vong năm đầu sống Yếu tiến triển nhanh dẫn đến khó khăn ăn uống suy hô hấp Dày thất trái lan rộng làm tắc nghẽn đường suy tim Nguyên nhân tử vong người bệnh thường suy tim Ở dạng khởi phát muộn, bệnh thường tiến triển chậm cuối người bệnh tử vong Hầu hết người bệnh thường chết suy hơ hấp, có số trường hợp chết phình động mạch thân Người bệnh thường tử vong vào thời kì 20 – 30 tuổi Ở người trưởng thành (20-60 tuổi), người bệnh sống nhiều năm sau chẩn đoán Yếu ảnh hưởng nhiều đến hoạt động hàng ngày suy hô hấp thường gắn liền với chứng ngưng thở ngủ Người bệnh thường chết suy hơ hấp Các đột biến khác tìm thấy chủng tộc khác Đột biến gây biểu bệnh thể khởi phát sớm tìm thấy Đài Loan, Hà Lan 28 chủng tộc người da đen Các đột biến làm bệnh biểu người trưởng thành lại tìm thấy người da trắng Giới: di truyền gen lặn nhiễm sắc thể thường nên bệnh biểu nam nữ 1.3.1 Biểu lâm sàng Pompe Biểu lâm sàng Pompe khác phụ thuộc vào tuổi khởi phát bệnh Bệnh chia thành ba thể dựa vào thời điểm khởi phát bệnh là: thể điển hình khởi phát sớm, thể khơng điển hình khởi phát sớm thể khởi phát muộn Ở thể điển hình khởi phát sớm, bệnh thường bắt đầu xuất tháng tuổi, diễn tiến nhanh chóng thường dẫn đến tử vong Trong thời kì này, tim, hơ hấp hệ xương bị ảnh hưởng Sự tích đọng glycogen tim thường dẫn tới dày thất trái gây tắc nghẽn đường ra, hệ xương gây yếu giảm trương lực Ở hơ hấp, tích đọng dẫn đến giảm thơng khí suy hơ hấp tiến triển Ngun nhân dẫn đến tử vong thường suy tim suy hô hấp Ở người trưởng thành, bệnh thường khởi phát muộn khơng có ảnh hưởng đến tim mạch Bệnh bắt đầu với biểu yếu vào khoảng 20 – 60 tuổi Giống trẻ em, người bệnh trưởng thành cuối phải chống chọi với suy hô hấp Ở dạng khởi phát muộn (từ 12 tháng – 15 tuổi), người bệnh phải chịu ảnh hưởng hệ hô hấp giống trẻ nhỏ người trưởng thành thường có bệnh tim mạch Nhìn chung, tuổi phát bệnh muộn ảnh hưởng đến hệ tim mạch.81,82 1.3.2 Di truyền học phân tử Pompe Gen GAA nằm nhánh dài NST 17 (17q25.2-17q25.3), gồm 20 exon exon khơng mã hóa acid amin, 19 exon cịn lại mã hóa tổng hợp 952 acid amin Exon chứa trình tự 5’UTR khơng dịch mã 29 ngăn cách với exon thứ hai intron lớn Mã mở đầu đầu tiên, ATG, nằm vị trí nucleotide 32 từ đầu exon cDNA GAA mã hóa protien gồm 952 acid amin, chứa bảy vị trí Nglycosyl hóa.83 Enzyme GAA tổng hợp dạng glycoprotein có lượng phân tử khoảng 110kDa, sau vận chuyển vào tiêu thể nhờ thụ thể mannose phosphate, trải qua trình N-glycosyl hóa, phân giải protien để tạo thành dạng hoạt động bao gồm chuỗi polypeptide liên kết chặt chẽ với nhau.84 Enzyme GAA thuộc nhóm GH31, có cấu trúc gồm miền: N-terminal βsheet, miền P- trefoil, miền xúc tác(β/α)8 … Mặc dù cấu trúc tinh thể enzyme GAA chưa xác định miền xúc tác bảo tồn85,86 Các đột biến gen GAA đột biến điểm, làm ảnh hưởng đến chức ổn định protein ảnh hưởng đến q trình nối; đột biến xóa thêm đoạn nhỏ lớn Chúng gây phiên mã mRNA không ổn định với hậu quả: tổng hợp protein, sửa đổi sau dịch mã, dịch chuyển tiêu thể chất phân giải protein GAA Các đột biến sai nghĩa báo cáo phổ biến Pompe xảy gốc acid amin không bộc lộ, gây xoắn vặn, gấp nếp sai cấu trúc, Pompe coi rối loạn chức gấp nếp protein.87 Theo số liệu HGMD, đến tháng năm 2021 có 582 đột biến gây Pompe báo cáo, chủ yếu đột biến điểm (344 đột biến, đột biến sai nghĩa 297 đột biến), tiếp đến đột biến chèn đột biến vị trí nối (87 74 đột biến) (http://www.hgmd.cf.ac.uk) 30 Bảng 1.3 Phân bố loại đột biến gen GAA Loại đột biến Số lượng Tỷ lệ (%) Sai nghĩa, vô nghĩa 344 59,8 Chỗ nối (splicing) 74 12,9 Vùng điều khiển (Regulatory) 0,2 Xóa đoạn nhỏ 87 15,1 Thêm đoạn nhỏ 35 6,1 Xóa thêm đoạn nhỏ (small indels) 13 2,3 Xóa đoạn lớn 15 2,6 Thêm đoạn lớn 0,2 Rối loạn cấu trúc hỗn hợp 0,8 575 100 Tổng Năm 2002, báo cáo Roberto Fernandez-Hojas cộng đột biến gen GAA thường xảy exon 2, nơi chứa mã mở đầu, exon 10,11 nơi chứa vị trí xúc tác enzyme exon 14 vùng bảo tồn cao protein,88 nhiên số báo cáo khác cho thấy phân bố đột biến nhiều exon khác Theo Taverna cộng (2020), số lượng đột biến điểm cao exon đó, 49% đột biến liên quan đến biểu lâm sàng nặng.89 Sự phân bố đột biến gen GAA khác tùy theo chủng tộc: đột biến del525T (exon 2) c.925G> A (exon 5) thường gặp người Hà Lan, tìm thấy quần thể khác.90 Ở người bệnh người Đài Loan, đột biến phổ biến c.1935C> A (exon 14); c.2560C> T (exon 18), thường gặp người Mỹ gốc Phi Đột biến phổ biến quần thể người da trắng đột biến intron, vị trí c.-32-13T> G (IVS1-13T> G) Nó 31 gây sai sót q trình nối dẫn đến bỏ qua exon 2, làm giảm tổng hợp enzyme từ 10-20% so với mức bình thường Đột biến nằm vị trí 13 nucleotide theo chiều ngược dịng gen với vị trí nhận nối gen GAA intron thường kết hợp với đột biến thứ hai alen khác gen GAA (thường exon 2, 14 14) Các người bệnh đồng hợp tử c.-32-13T> G có biểu đau cơ, mệt mỏi sau tập thể dục dấu hiệu tổn thương tăng hoạt độ creatine kinase (CK) huyết thanh.89 1.3.3 Mối liên quan kiểu gen kiểu hình Theo Kroos cộng có mối liên quan chặt chẽ kiểu gen kiểu hình Pompe, đột biến alen dẫn đến loại bỏ hoàn toàn chức enzyme, gây bệnh thể khởi phát sớm, diện đột biến alen dẫn đến việc cịn sót lại lượng enzyme hoạt động, nên gây bệnh thể khởi phát muộn Tuy nhiên, báo cáo biểu lâm sàng khác người bệnh có kiểu gen tương tự cho thấy mối liên quan kiểu gen kiểu hình Pompe vấn đề cần nghiên cứu.91 Các đột biến giống quan sát thấy trẻ sơ sinh người bệnh khởi phát muộn với tỷ lệ khác Ví dụ, nghiên cứu người bệnh người Ý, đột biến c.525delT quan sát thấy 13,8% trường hợp khởi phát sớm nghiên cứu M G Pittis cộng năm 200892 3,8% trường hợp mắc Pompe thể khởi phát muộn báo cáo M Pittis cộng năm 2007.93 Ngược lại, tác giả báo cáo tỷ lệ mắc đột biến c.2237G> A trẻ sơ sinh 3,4% so với tỷ lệ mắc bệnh người lớn 10,3% Hay đa dạng biểu lâm sàng quan sát thấy nhóm lớn người bệnh có hallotype c.-32-13C> T chứng tỏ yếu tố điều chỉnh có tác động đáng kể đến diễn tiến lâm sàng bệnh Pompe 32 Nghiên cứu Paola De Filippi cộng năm 2014 nhóm người bệnh đồng kiểu gen cho thấy số khác biệt lâm sàng tuổi khởi phát, biểu đau… liên quan đến kiểu gen.94 1.3.4 Chẩn đoán sàng lọc Pompe 1.3.4.1 Chẩn đoán xác định  Triệu chứng lâm sàng, tùy theo thể:  Thể điển hình khởi phát sớm: gặp trẻ tháng tuổi - Hội chứng Wolf-Parkinson-White - Các dấu hiệu tích tụ: gan to, bắp bình thường to - Biểu suy hô hấp thở nhanh - Tim: dày thất phải, tiếng thổi dấu hiệu suy tim - Yếu cơ, nhược  Thể khơng điển hình khởi phát sớm: - Suy hơ hấp - Yếu cơ, nhược - Gan to - Khơng có bệnh tim  Thể khởi phát muộn: - Yếu cơ: leo cầu thang khó - Teo - Giảm phản xạ gân xương  Các xét nghiệm cận lâm sàng - Định lượng enzyme CK máu: 95% BN có CK máu tăng, cao gấp 10 lần bình thường 33 - AST, ALT, LDH huyết tăng cao, đặc biệt trẻ sơ sinh bị bệnh - Sinh thiết góp phần cho chẩn đốn xâm lấn khơng cần thiết - Siêu âm tim: xét nghiệm cần thiết, siêu âm thấy hình ảnh tổng thể tim, dày thất trái, dày thất tắc nghẽn dòng chảy tim - Điện tâm đồ (ECG): đánh giá ảnh hưởng tim qua: rút ngắn khoảng PR, QRS giãn rộng - Điện đồ (EMG): hữu ích với người bệnh chưa có triệu chứng - Đo hoạt độ GAA mô nguyên bào sợi nuôi cấy từ mẫu sinh thiết da, sinh thiết cơ, tế bào lympho hay từ tế bào đơn nhân dòng tế bào bạch huyết Tuy nhiên xét nghiệm xét nghiệm xâm lấn, cho kết muộn (4-6 tuần) nên dẫn đến chẩn đốn muộn Ngày nay, xét nghiệm sử dụng nhiều chẩn đoán Pompe đo hoạt độ GAA từ giọt máu khô (DBS) Xét nghiệm có ưu điểm cho kết nhanh, dễ dàng vận chuyển đến phòng xét nghiệm có khả phân tích, hạn chế ảnh hưởng enzyme khác Xét nghiệm không dùng sàng lọc sơ sinh mà sử dụng xét nghiệm không xâm lấn chẩn đoán bệnh Pompe 1.3.4.2 Chẩn đoán phân biệt - Bệnh tim phì đại - Teo cột sống - Loạn dưỡng bẩm sinh - Thiểu tuyến giáp - Bệnh Danon - Thiếu hụt carnitin 34 - Viêm tim - Tích đọng glycogen tiêu thể typ III, IV 1.3.4.3 Sàng lọc tư vấn di truyền Tư vấn cho cha mẹ trẻ mắc bệnh Pompe nguy tái phát cho thai kì 25% khun họ có ý định sinh đứa nên xét nghiệm chẩn đoán trước sinh Nên tiến hành chẩn đoán trước sinh sớm, khoảng tuần thứ 10 thai kì Nhấn mạnh sở di truyền cho thành viên gia đình khuyến khích trao đổi thơng tin gia đình để tìm người lành mang gen bệnh 1.4 Các phương pháp sinh học phân tử xác định đột biến gen GLA, GAA Có nhiều phương pháp sinh học phân tử sử dụng để phát đột biến gen GLA, GAA: kỹ thuật phân tích đột biến truyền thống (như kỹ thuật c- RFLP, hay kỹ thuật PCR đặc hiệu alen -ARMS…) tập trung chủ yếu vào việc xác định đột biến cụ thể thời điểm, kỹ thuật đại tăng số lượng đột biến phát kỹ thuật giải trình tự trực phương pháp Sanger, Realtime PCR, MLPA, hay HRM (High Resolution Melting: phân tích nhiệt nóng chảy phân giải cao)… 95 Gần đây, kỹ thuật Giải trình tự gen hệ (NGS) nghiên cứu áp dụng chẩn đốn LSDs nói chung có bệnh Fabry Pompe 96 Tuy nhiên, PCR giải trình tự trực tiếp phản ứng sử dụng nhiều với ưu điểm phản ứng nhanh, chi phí rẻ, phát nhiều đột biến… 35 1.4.1 Phản ứng chuỗi polymerase (PCR) PCR phương pháp kinh điển đơn giản để chẩn đoán bệnh di truyền Phản ứng PCR sử dụng cặp mồi đặc hiệu để khuếch đại đoạn gen đặc hiệu từ phân tử DNA tế bào PCR Mullis cộng đề xuất năm 1983.97 Đây phương pháp với mục đích phát nhân đoạn DNA nhiều lần ống nghiệm PCR phương pháp nhạy, từ lượng DNA nhỏ ban đầu với cặp mồi đặc hiệu cho lượng DNA lớn để dùng chẩn đốn, nghiên cứu Sản phẩm PCR phân tích nhiều cách khác nhau, tùy thuộc vào mục đích thí nghiệm: xác định có mặt hay khơng có mặt sản phẩm gen cần khuếch đại, xác định chiều dài sản phẩm, xác định tỷ lệ sản phẩm thu so với lượng khuôn ban đầu hay phân tích trình tự sản phẩm… Các phương pháp gồm: điện di, southern Dot Blot, PCR lồng, sử dụng enzyme cắt giới hạn, giải trình tự gen trực tiếp, đánh dấu trực tiếp sản phẩm PCR, kỹ thuật miễn dịch, kỹ thuật điện hóa phát quang, realtime PCR PCR định lượng, phương pháp MLPA biểu sản phẩm PCR in vitro Sử dụng enzyme cắt giới hạn Enzyme cắt giới hạn có đặc điểm cắt DNA vị trí xác định Các enzyme tách chiết từ vi khuẩn, có khả cắt DNA xoắn kép vị trí xác định thường có từ 4-8 nucleotid đặc trưng Kỹ thuật thường sử dụng để phát có mặt đột biến tạo phản ứng PCR mà đột biến cấu thành vị trí cắt enzyme mà sợi DNA khuôn ban đầu Sau cắt, đoạn DNA điện di gel agarose để xác định tính chất dùng để tạo nên phân tử DNA lai 36 Trong Fabry, enzyme cắt giới hạn sử dụng để phát đột biến vị trí IVS4+919 G>A, đột biến thường gặp người Đài Loan 1.4.2 Giải trình tự gen trực tiếp Đoạn DNA cần giải trình tự sử dụng trình tự mẫu cho phản ứng khuếch đại gen (PCR) vị trí gắn mồi Hỗn hợp deoxyvà dideoxynucleotid sử dụng phản ứng với nồng độ cho dideoxynucleotid gắn vào vị trí mà deoxynucleotid thường gắn đoạn DNA tổng hợp Sự gắn dideoxynucleotid làm gián đoạn trình kéo dài đoạn DNA tổng hợp, kết tạo hỗn hợp sợi DNA có kích thước khác Nucleotid tận sợi DNA xác định cách chạy đồng thời bốn phản ứng riêng biệt phản ứng chứa loại dideoxynucleotid (ddATP, ddCTP, ddGTP, ddTTP) phản ứng hỗn hợp loại dideoxynucleotide đánh dấu chất phát huỳnh quang đặc hiệu khác Kết hỗn hợp sợi DNA tổng hợp từ sợi khuôn phân tách điện di gel acrylamid có độ phân giải cao, cho phép phân biệt sợi đơn DNA nucleotid Trình tự nucleotid xác định tương ứng với trình tự vạch gel ứng với loại dideoxynucleotid Do phần lớn đột biến gây bệnh đột biến điểm đến phương pháp giải trình tự gen coi tiêu chuẩn vàng việc phát đột biến gen GLA, GAA Vùng mã hóa gen GLA gồm khoảng 1290 bp, gồm exon, chiều dài exon khoảng từ 92 đến 291 bp Gen GAA gồm khoảng 2856 bp, gồm 20 exon, mã mở đầu exon 2, chiều dài exon khoảng từ 85 đến 187 bp nên lựa chọn giải trình tự exon hai gen 37 1.4.3 Giải trình tự gen hệ NGS (Next Generation Sequencing) Giải trình tự hệ (NGS) cơng nghệ giải trình tự DNA thơng lượng cao cho phép tạo liệu nhanh chóng hàng nghìn đến hàng triệu cặp DNA sở từ bệnh nhân riêng lẻ cách giải trình tự số lượng lớn gen phản ứng Bệnh Fabry bệnh di truyền gen lặn liên kết NST X, người nữ dị hợp tử khơng chẩn đốn xét nghiệm đo hoạt độ enzyme bình thường, xét nghiệm phân tích gen định, với ưu điểm mình, NGS sử dụng để sàng lọc bệnh Fabry người bệnh nguy cao phì đại tim.48,98 Người bệnh LOPD thường chẩn đoán muộn triệu chứng khơng điển hình, NGS sử dụng để sàng lọc bệnh Pompe người bệnh yếu khơng điển hình, người bệnh có loạn dưỡng nhẹ sinh thiết, có triệu chứng liên quan đến hô hấp gợi ý đến bệnh Pompe.99 1.4.4 Dự đoán khả gây bệnh đột biến phần mềm tin sinh học Ngày nay, phát triển mạnh mẽ phần mềm phân tích tin sinh học (in silico) sử dụng rộng rãi để hỗ trợ, phân tích, đánh giá dự đoán khả gây bệnh nghiên cứu di truyền người Một cách tiếp cận đa ngành bao gồm liệu phả hệ gia đình, xét nghiệm di truyền, phân tích in vitro phân tích tin sinh học (in silico) sử dụng để phân loại biến thể tìm lành tính hay gây bệnh.100 Dự đốn cung cấp thơng tin tác động xảy biến thể lên cấu trúc và/hoặc chức protein, dự đoán mức độ bảo tồn nucleotid cụ thể loài hay tính chất sinh hóa thay acid amin.101, 102 Việc sử dụng nhiều chương trình phần mềm để dự đoán khả gây bệnh khuyến cáo, chương trình sử 38 dụng thuật toán riêng biệt dẫn đến kết đưa khác nhau.103 Trong phần mềm phân tích in silico, SIFT, Polyphen MutationTaster trở thành công cụ tiêu chuẩn sử dụng nhiều nhất.104, 101, 102 SIFT chương trình dự đốn ảnh hưởng việc thay acid amin đến chức protein dựa việc bảo tồn trình tự acid amin q trình tiến hóa.105 Với acid amin bảo tồn cao có vai trị quan trọng chức protein, ngược lại acid amin có mức độ bảo tồn thấp có khả dung nạp số chất thay mà không ảnh hưởng đến cấu trúc chức protein Điểm SIFT nằm khoảng từ – 1, thay acid amin phân loại không dung nạp hay có khả gây bệnh giá trị điểm 0,05.101, 102 Polyphen-2 công cụ tự động để dự đoán tác động thay acid amin lên cấu trúc chức protein, dựa thay đổi cấu trúc so sánh để đánh giá hiệu tính ổn định chức protein.106 Khả gây bệnh cao điểm đánh giá gần (điểm từ – 1) MutationTaster ứng dụng dựa phần mềm đánh giá khả gây bệnh biến đổi DNA Dự đoán tác động biến đổi acid amin lên cấu trúc và/hoặc chức protein.107 Các nghiên cứu trước Fabry Pompe sử dụng phần mềm tin sinh để dự đoán khả gây bệnh cùa đột biến Nghiên cứu Yosep Chong cộng năm 2016 sử dụng phần mềm MutationTaster PolpyPhen-2 để dự đoán khả gây bệnh đột biến Tyr88Cys gia đình người Hàn Quốc với biểu Fabry thể thận Kết dự đoán hai phần mềm cho thấy đột biến có khả gây bệnh (MutationTaster với số điểm 94, PolyPhen-2 với số điểm 0.99).108 Nghiên cứu Chi Zhou cộng năm 2018 Trung Quốc sử dụng phần mền MutationTaster, PholyPhen-2 SIFT để dự đoán khả gây 39 bệnh đột biến p.Asn278Lys gia đình có người bệnh Fabry với biểu lâm sàng, cận lâm sàng điển hình Kết dự đoán cho thấy đột biến có khả gây bệnh (MutationTaster với số điểm 94, PolyPhen-2 với số điểm 0.75 SIFT với số điểm 0.005).109 Trong nghiên cứu Paula Hernndez-Arvalo (2021) 17 người bệnh Pompe Tây Ban Nha sử dụng phần mềm MutationTaster PolyPhen để dự đoán khả gây bệnh bốn đột biến phát trình tiến hành nghiên cứu Những người bệnh mang đột biến dự đốn có khả gây bệnh nghiên cứu có biểu yếu cơ, hoạt độ enzyme GAA thấp, sinh thiết phù hợp với bệnh Pompe.110 Trong nghiên cứu May T Aung-Htut cộng năm 2020 sử dụng phần mềm MutationTaster để dự đoán khả gây bệnh đột biến c.2074C>T (p.Gln692X) kết dự đốn đột biến gây bệnh với điểm 0.94.111 Năm 2019, Reuser cộng tổng hợp liệu 1079 người mắc bệnh Pompe từ 20 quốc gia chương trình Pompe Register, sử dụng cơng cụ dự đốn khả gây bệnh, kết hợp với cách tính điểm mức độ nghiêm trọng theo hướng dẫn ACMG Richard cộng công bố năm 2015103 để xác định khả gây bệnh đột biến gen GAA, kết dự đốn 52/80 đột biến có khả gây bệnh, 28 đột biến cịn lại xếp vào nhóm VUS – variant of uncertain significance chưa đủ kiện để khẳng định.112 40 CHƯƠNG ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Đối tượng nghiên cứu Đối tượng nghiên cứu bao gồm: + Bệnh Fabry: 433 người bệnh có phì đại tim chưa rõ ngun nhân đáp ứng tiêu chuẩn lựa chọn bệnh Fabry thể khơng điển hình (người bệnh có phì đại tim), 01 trẻ có hoạt độ enzym thấp phát qua sàng lọc sơ sinh 08 thành viên 01 gia đình người bệnh mắc bệnh Fabry + Bệnh Pompe: 14 người bệnh có triệu chứng lâm sàng gợi ý, đáp ứng tiêu chuẩn bệnh Pompe; 70 thành viên từ 08 gia đình có đột biến GAA tham gia nghiên cứu  Tiêu chuẩn lựa chọn người bệnh: nhóm nguy cao người bệnh có phì đại tim chưa rõ nguyên nhân, người có hoạt độ enzym thấp phát qua sàng lọc sơ sinh, người bệnh có triệu chứng lâm sàng gợi ý đến Fabry Pompe:  Fabry - Fabry không điển hình: phì đại tim chưa rõ nguyên nhân, chuẩn đoán dựa vào siêu âm tim điện tâm đồ  Pompe - Triệu chứng lâm sàng gợi ý: * Với trẻ tuổi: - Trẻ sơ sinh yếu ớt, khơng nâng đầu - Có tiến triển nhanh triệu chứng tim to, gan to, yếu ớt, nhược 41 * Khởi phát muộn: - Trẻ từ tuổi đến tuổi vị thành niên: suy nhược đa dạng nhóm khơng bao gồm bệnh tim nặng - Suy nhược bắp tiến triển chậm dẫn tới khó khăn hay leo cầu thang lệ thuộc vào xe lăn liệt giường  Tiêu chuẩn lựa chọn thành viên phả hệ gia đình Các người bệnh tham gia nghiên cứu, người phát có đột biến gen GLA, GAA tiến hành lập phả hệ lấy mẫu thành viên huyết thống phạm vi hệ, để tiến hành phân tích gen GLA, GAA vị trí đột biến tìm người bệnh - Tiêu chuẩn loại trừ người bệnh + Người bệnh, gia đình người bệnh khơng đồng ý tham gia nghiên cứu + Người bệnh có bệnh lý nguyên nhân phì đại tim tăng huyết áp, hẹp động mạch chủ… 2.2 Thời gian địa điểm nghiên cứu  Thời gian nghiên cứu: từ tháng 6/2014 đến tháng 6/2022  Địa điểm thu thập mẫu: - Bệnh viện Nhi Trung ương - Viện Tim Hà Nội  Địa điểm phân tích mẫu: Đề tài nhận giúp đỡ, hỗ trợ Bệnh viện đa khoa Cựu chiến binh Đài Bắc, Đài Loan, thời gian đầu thực nhóm nghiên cứu có số thành viên sang học tập, đồng thời thực nghiên cứu hoàn thiện quy trình kỹ thuật Với xét nghiệm đo hoạt độ enzyme thực Bệnh viện đa khoa Cựu chiến binh Đài Bắc, kỹ thuật phân tích gen thực nơi Bệnh viện đa khoa Cựu chiến binh Đài Bắc 42 Trung tâm gen – protein – Trường Đại học Y Hà Nội 35 mẫu DNA 27 người bệnh có hoạt độ enzyme GLA thấp, 09 thành viên gia đình có đột biến gen GLA; 06 mẫu DNA đối tượng nghiên cứu gia đình có trẻ Pompe phân tích trình tự gen GLA GAA Bệnh viện Cựu chiến binh Đài Bắc -Đài Loan, 14 mẫu DNA người bệnh Pompe 70 mẫu thành viên gia đình thực Trung tâm gen – protein, Đại học Y Hà Nội Xét nghiệm gen hai nơi giống nhau, sử dụng kỹ thuật PCR để khuếch đại gen, giải trình tự theo phương pháp Sanger, với mồi thiết kế, thành phần phản ứng chu kỳ nhiệt phản ứng 10% mẫu phân tích nơi để đảm bảo kết giống 2.3 Phương pháp nghiên cứu 2.3.1 Thiết kế nghiên cứu - Mô tả ca bệnh 2.3.2 Cỡ mẫu nghiên cứu Fabry Pompe bệnh gặp, chúng tơi tiến hành lấy mẫu thuận tiện Trong trình nghiên cứu, chúng tơi thu thập 433 mẫu có phì đại tim, 01 mẫu có hoạt độ enzym GLA thấp phát qua sàng lọc sơ sinh, đáp ứng tiêu chuẩn lựa chọn bệnh Fabry 08 thành viên gia đình có đột biến gen GLA; 14 bệnh nhân có triệu chứng lâm sàng gợi ý mắc bệnh Pompe đáp ứng tiêu chuẩn lựa chọn bệnh Pompe 70 thành viên 08 gia đình có đột biến gen GAA 2.3.3 Phương pháp thu thập mẫu * Thu thập thông tin người bệnh: Lựa chọn người bệnh theo tiêu chuẩn nghiên cứu, thực vấn theo câu hỏi bệnh án nghiên cứu Sau thu thập thơng tin chẩn đốn, xét nghiệm cận lâm sàng người bệnh hồ sơ bệnh án Tất 43 thông tin điền vào bệnh án nghiên cứu (mẫu bệnh án nghiên cứu phần phụ lục 2) * Thu thập mẫu bệnh phẩm: - Mẫu bệnh phẩm đo hoạt độ enzyme: Hoạt độ enzyme đo từ giọt máu khô giấy thấm (Dry blood spots- DBS) Quy trình thu thập mẫu giấy DBS: theo hướng dẫn nhà sản xuất + Lấy 3ml máu tĩnh mạch (chú ý tránh vỡ hồng cầu, không đâm kim lần 2, thay xilanh cần chọc kim lại) bảo quản ống có chứa chống đơng Heparin + Dùng pipet hút máu đầu kim, nhỏ lỗ 100l Lưu ý: Bỏ giọt máu đầu, không chạm đầu pipet vào giấy + Tiếp tục thao tác tương tự vòng tròn lại Lưu ý:1 vòng tròn nhỏ giọt Lấy giọt cho vòng tròn tờ giấy + Phơi giấy theo chiều nằm ngang nhiệt độ phịng giờ, tránh trùng, ánh sáng mặt trời, bụi… + Đóng gói tờ giấy DBS túi có gắn mép, thêm gói chống ẩm + Dán nhãn, ghi ngày tháng lấy mẫu, bảo quản nhiệt độ 40C trước gửi phân tích (mỗi tháng lần) - Mẫu bệnh phẩm để giải trình tự gen: Trong giai đoạn đầu nghiên cứu, mẫu nghi ngờ giải trình tự gen Bệnh viện đa khoa Cựu chiến binh Đài Bắc, nên mẫu bệnh phẩm thu thập vào giấy thấm DBS để tiện cho việc vận chuyển Cách tiến hành thu thập mẫu giống phần thu thập mẫu để đo hoạt độ enzyme Giai đoạn sau nghiên cứu, chúng tơi tiến hành phân tích gen Trung tâm Gen – protein, Trường Đại học Y Hà Nội nên tiến hành mẫu bệnh phẩm máu tồn phần Quy trình thu thập mẫu máu tồn phần người bệnh: 44 + Mỗi người bệnh lấy 2ml máu tĩnh mạch vào ống chống đông EDTA + Vận chuyển mẫu tới phòng nghiên cứu, mẫu mã hóa lưu tủ -20C đến phân tích Các mẫu nghiên cứu tiến hành phân tích, giải trình tự gen GLA, GAA để xác định đột biến - Người bệnh phát có đột biến gen lập phả hệ tiếp tục thu thập mẫu máu (2ml máu tĩnh mạch vào ống chống đông EDTA) thành viên gia đình vịng hệ Sau đó, tách chiết DNA định vị vùng đột biến dựa vào kết phân tích gen GLA, GAA người bệnh gia đình, để tiến hành phân tích gen cho thành viên 2.3.4 Các biến số nghiên cứu 2.3.4.1 Biến số nghiên cứu cho mục tiêu  Đặc điểm chung: Phỏng vấn theo câu hỏi nghiên cứu - Tuổi - Giới - Tiền sử gia đình có người mắc bệnh Fabry Pompe  Kết phân tích gen GLA, GAA tìm đột biến: làm thí nghiệm phân tích exon, vùng nối exon- intron gen GLA 19 exon gen GAA 2.3.4.2 Biến số nghiên cứu cho mục tiêu  Lập phả hệ: Phỏng vấn bệnh nhân mang đột biến (hoặc người thân) để lập phả hệ gia đình vịng hệ Tiến hành lấy 2ml máu tĩnh mạch vào ống chống đông EDTA thành viên gia đình, để phân tích gen GLA, GAA vị trí đoạn gen mà bệnh nhân mang đột biến  Kết phân tích gen GLA, GAA thành viên gia đình tham gia nghiên cứu 45 2.3.4.3 Biến số nghiên cứu cho mục tiêu  Đặc điểm lâm sàng, cận lâm sàng (các số siêu âm tim LVI, LVMI; số tim ngực, số xét nghiệm hóa sinh hoạt độ enzyme GLA, GAA, CK, ALT): Sử dụng hồ sơ bệnh án câu hỏi nghiên cứu (phụ lục 2) 2.3.5 Sơ đồ nghiên cứu Người bệnh có biểu lâm sàng nghi ngờ Fabry, Pompe - Phỏng vấn theo câu hỏi nghiên cứu - Thu thập mẫu máu - Đo hoạt độ enzyme Không giảm Giảm - Tách chiết DNA - Phân tích gen Có đột biến Khơng có đột biến Lập phả hệ lấy mẫu máu thành viên gia đình (3 hệ) Dừng xét nghiệm liên quan với nghiên cứu Phân tích gen thành viên gia đình Đưa tư vấn di truyền Sơ đồ 2.1: Sơ đồ nghiên cứu 46 2.3.6 Phương tiện nghiên cứu 2.3.6.1 Dụng cụ - Ống lấy máu chống đông EDTA, Heparin - Giấy thấm DBS: Protein save 903, Whatman, Kent, UK - Pipet đầu côn loại thể tích - Ống eppendorf thể tích 1,5 ml 0,2 ml 2.3.6.2 Trang thiết bị - Tủ lạnh, tủ âm sâu (Sanyo), lị vi sóng, nồi hấp ướt, tủ sấy, cân điện tử - Máy ly tâm để bàn Eppendorf (Đức), máy Voltex-Genie 2, máy ủ Thermomixer comfort - Máy quang phổ kế đo nồng độ DNA Nano drop 2000C - Máy PCR Mastercycler pro S hãng Eppendorf (Đức) - Máy điện di Consort EV243 - Máy soi gel chụp ảnh tự động Gel Doc-It2 Imager (Thermo Fisher Scientific – Mỹ) - Hệ thống sắc ký lỏng hiệu cao UHPLC (Waters, Milford, MA, USA) - Máy đo khối phổ ba tứ cực 2.3.6.3 Hóa chất sinh phẩm  Hóa chất đo hoạt độ enzyme (do Genzyme – Mỹ cung cấp): - N-Acetylgalactosamine (GALNAc) acarbose - Hóa chất phân tích đặc hiệu (ASR): analyte specific reagent) với phản ứng enzyme: gồm chất (S), nội chuẩn (IS) - Dung dịch dập tắt phản ứng, dung dịch đệm, dung dịch rửa - Dung dịch cocktail phản ứng 47  Hóa chất tách chiết DNA: - Bộ kit tách DNA từ máu toàn phần: QIAamp Kit (QIagen, Đức) - Cồn tuyệt đối  Hóa chất dùng cho PCR: - Nước free DNA - Taq polymerase Master Mix 2X - Mồi phản ứng exon khuếch đại genGLA, GAA (trình tự mồi phần phụ lục 3)  Hóa chất dùng cho điện di: - Agarose - Dung dịch đệm TAE 10X - Blue Loading Dye 10X - Ethidium bromide - Thang chuẩn DNA 100bp  Hóa chất giải trình tự: sử dụng BigDyeTM Terminator v3.1 Cycle Sequencing Kit  Mồi (primer):  Gen GLA: Mục đích thiết kế mồi nhằm khuếch đại toàn exon gen GLA vùng lân cận Trong nghiên cứu sử dụng mồi tự thiết kế, trình tự mồi cho đoạn exon nghiên cứu thiết kế đặc hiệu với vùng trình tự đích mong muốn Việc thiết kế mồi tuân thủ chặt chẽ theo nguyên tắc thiết kế mồi.113 Trình tự gen GLA lấy trực tiếp từ trình tự FASTA kho liệu NCBI thông qua phiên giới hạn phần mềm CLC Main Workbench 8.1.2 hãng QIAGEN.114,115 Trên phần mềm hiển thị rõ vùng exon, vùng mã hóa protein (coding DNA sequence), intron… 48 Nhóm nghiên cứu tiến hành thiết kế cặp mồi bao trùm exon phần intron liền kề để đảm bảo yêu cầu chiều dài đoạn DNA đích: (1) Có thể kiểm tra đột biến chỗ ghép nối (splicing) cận kề có (2) Đảm bảo giải trình tự phương pháp Sanger hạn chế vùng tín hiệu nhiễu ban đầu ảnh hưởng tới đoạn exon rìa intron mong muốn (3) Thực GTT hệ thống 3730 giải đoạn 1000bp, đoạn đích mong muốn chiều dài 1000bp Các đoạn mồi gợi ý kiểm tra ngược lại cặp BLAST NCBI so sánh với toàn hệ gen người để kiểm tra độ đặc hiệu Bảng 2.1 Trình tự mồi gen GLA sử dụng nghiên cứu Kích thước Exon sản phẩm PCR (bp) Tm (o C) E1 391 63 E2 312 62 E3 281 63 E4 241 62 E5E6 970 60 E7 695 61 IVS4 445 60 Trình tự (5’ – 3’) F: GTT GCC AGA GAA ACA ATA ACG R: GTT GAG ACT CTC CAG TTC CCC F: GAG GTA CCT AAG TGT TC R: GAG GGC TGT TTC TAA AAC AAG C F: GGT GAC TCT TTT CCT CCC TCT R: TTG GTT CTT TGG CTC AGC TAC F: TAT AFC CCC AGC TGG AAA TTC R: GTT GGA CTT TGA AGG GAG CCT T F: AGAGTTTTTCAGGCCCGCATCT R: AAA TAG ATT TAG GCC CAA GAC F: CTA GTT GCT AAG CAA CCA CAC R: CTTTGTCCACGGGATTGAGC F: TAT AGC CCC AGC TGG AA TTC R: CTA GCC TTG AGC TTT TAA AGT 49  Với gen GAA, chúng tơi sử dụng mồi chu trình nhit c cụng b nghiờn cu ca Turaỗa.116 Bng 2.2 Trình tự mồi để khuếch đại gen GAA Exon Kích thước sản phẩm PCR (bp) Tm (oC) E2.1 420 68 E2.2 424 64,7 E3 343 66 E4-E5 618 64 E6 249 62 E7-E8 441 60 E9 333 56,5 E10-E11 450 61 E12 286 64 E13 343 64,7 E14 415 56,5 E15 370 62 E16 324 65 E17 281 60 E18 315 56,5 E19 311 56,5 E20 416 58 Trình tự (5’ – 3’) F: GATGTCTCAGAGCTGCTTTG R: GAGCAGTGCCCACACAGTG F: CGCGGTTGATGTCTCAGAGCTGC R: ACCCCACCCTTGTGAGGTGC F: TGTCCTTGGCGTGCGGGTTGTTC R: GGTCGCCCTCCCCATCATGCTG F: GGTGCTCTCTGGGTGCTCTCAGG R: CATGCGGACCTCCAGTCTCCAGG F: CGCCTGTGATTGGCCCATCTGTGG R: CAGGCCAACGCCGACTTCATGAG F: TTGTGGGTAGGGCCTGCTCCCTG R: CCACACAGGCACGAGGATGACGC F: ACTGTCTCAGTTTTCCCGTGT R: AAATCCCACGGTCTTCCTGAGG F: CTCAGTGGGGCTTCCATGCAG R: GTGCTAAGTCTCCCAGGCCAGA F: AGGGAGGGCACCTTGGAGCCTG R: GCAGAGGCCCCAACCTTGTAGG F: TGCCCTGCTGGTGACAGGGTTCC R: CCGGCAAGCCTCCCATAGAGGCC F: ACTTGGCCTGAGCTGGCTCTGC R: TTCCCAGGGGAGAGTCTTGGGT F: TGAGAAGTGCAGCTCTCCCG R GACAGGGCTGCCTGGGAGTTACG F: ATTCAGCCTCTTCCTGTGCCTCC R: TTTCCGCCACCTGGTCACCAAC F: GGGAGATGGAGAGCGTGGTTCC R: CTCCCCCACCATCTCCCTGTGC F: TGCTGTACCAGCCTAGCATTCCC R: AGTGGCAGGTAGCCATCGTG F: CCAGCTGTCTGCTGACACCT R: CAGGACGCCCAGCACCTTCTGC F: TGGATACATCCTCCCTGCCCTG R: GAGGTGGAAACAAGCGATGCG 50 2.3.7 Quy trình kỹ thuật đo hoạt độ enzyme (GLA GAA) 2.3.7.1 Đo hoạt độ enzyme từ mẫu máu khô giấy thấm DBS phương pháp đo khối phổ song song  Đo hoạt độ GLA: Phương pháp quang phổ khối song song xác định có mặt αgalactosidase chiết suất từ vết máu khô ủ riêng với loại hỗn hợp enzyme cụ thể có chứa chất tương ứng chứng nội xác định trước tỉ lệ mol tối ưu hóa tham khảo theo quy trình Chamole cộng (2004).70 Sau ủ, phản ứng enzyme dập tắt cách sử dụng dung dịch acetate ethyl / methanol Hỗn hợp sản phẩm phản ứng chuẩn bị cách sử dụng phương pháp tách chất lỏng-lỏng pha rắn đồng thời định lượng sử dụng giám sát ion lựa chọn hệ thống LC-MS-MS Các mẫu giấy thấm máu khô phân tích ba tứ cực khối phổ kế Quattro Premier XE trang bị với hệ thống Acquity UPLC (Waters, Milford, MA, USA) Một cột BEH C18 (50 mm × 2,1 mm) với 1,7 m hạt sử dụng kết hợp với trước cột VanGuard với hệ thống sắc ký - Quy trình: + Tách chiết bệnh phẩm từ mẫu giấy thấm khô (cho vào giếng 3,2mm DBS, thêm 70µl dung dịch đệm tách chiết (20mM NaH2SO4 pH 7,1), Mix, phủ miếng dán nilon, lắc 875rpm/37oC/1h, ly tâm 2000rpm/2m) + Phản ứng enzyme: Cho vào giếng 15µl dung dịch cocktail GLA rã đơng nhiệt độ phịng, thêm 10µl dịch chiết suất vào giếng chứa sẵn 15µl dung dịch phản ứng (assay cocktail), bọc nhôm, mix, ly tâm 2000rpm/2min, lắc 250rpm/ 37oC/20h, ly tâm 2000rpm/2min 51 + Dập tắt phản ứng enzyme: thêm vào giếng 100µl EA: MeOH 1:1, mix + Rửa bệnh phẩm: Thêm vào giếng 400µl EtAc 400µl nước, lắc 500rpm/5min, ly tâm 4000rpm/5min Chuyển 300 µll dịch phía sang giếng mới, làm khô nito ấm, thêm vào giếng 110 µl EtAc: MeOH 1:1, bọc lại miếng nhơm, lắc 200rpm/5min, chuyển sang giếng có silica, tiếp tục rửa 400 µl EtAc: MeOH 19:1, dùng chân khơng hút toàn dịch rửa xuống giếng chứa bệnh phẩm, lặp lại lần Cuối ta thu 1,7ml dung dịch giếng sâu Làm khô với luồng nito ấm 40oC, thêm 300µl pha động (80% Acetonitrile + 20% nước có 0,2% acid formic), bọc nhơm, lắc 200rpm/5min + Đem đo máy tandem mass: Hệ thống Acquity UHPLC (Mỹ) Khi hoạt động enzyme 20% chuẩn bình thường, mẫu tiếp tục phân tích gen để chẩn đốn xác định Hình 2.1: Các phản ứng enzyme đo khối phổ song song GLA 52  Đo hoạt độ GAA: tiến hành hoàn toàn tương tự, thay dung dịch cocktail cho GAA phản ứng enzyme.117 2.3.7.2 Đo hoạt độ enzyme từ mẫu máu toàn phần Hoạt độ alpha-galactosidase huyết đo phương pháp đo huỳnh quang cải tiến sử dụng chất 4MU, sử dụng kit Sigma-aldrich, theo hướng dẫn nhà sản xuất Quy trình: + Tách chiết bệnh phẩm + Phản ứng enzyme: Cho 10μl dung dịch tế bào ly giải, 10μl 4-MU 4,3 mM (Sigma) dung dịch đệm citrat-photphat 50 mM, pH 4,6, ủ 37oC + Dập tắt phản ứng: thêm vào NaOH 0,2 N + Đo máy quang phổ huỳnh quang (Hitachi) với bước sóng kích thích phát xạ 355 nm 460 nm Nồng độ protein xác định theo phương pháp Lowry tiêu chuẩn Hoạt tính enzyme biểu thị nmol/mg protein Do Việt Nam chưa có dải tham chiếu hoạt độ enzyme GLA, GAA nên sử dụng dải tham chiếu người Đài Loan cho hoạt độ enzyme này: hoạt độ enzyme GLA 2,05-7,46 μmol/h/L enzyme GAA 0,91 ±1,26 µmol/h/L 2.3.8 Quy trình giải trình tự trực tiếp tìm đột biến gen GLA GAA - Tách chiết DNA từ máu toàn phần: dùng kit QIAamp DNA Qiagen (theo hướng dẫn nhà sản xuất) với bước bản: + Ly giải tế bào + Chuyển sang cột QIAamp mini spin colum để cố định DNA 53 + Rửa dung dịch rửa AW1, AW2, thay cột tube sau lần rửa + Thêm đệm AE nước cất, ly tâm để tách DNA khỏi cột + Đo nồng độ độ tinh máy Nanodrop: Lấy 1µl DNA tổng số tách để đo máy Nano Drop Kết mẫu DNA tách từ máu đạt tiêu chuẩn nồng độ >10ng/µl độ tinh A260/A280 = 1,7 – 2,0  Khuếch đại gen GLA Tiến hành phản ứng PCR khuếch đại đoạn gen mong muốn với thành phần phản ứng chu kỳ nhiệt khác cho exon - Thành phần phản ứng PCR chu trình nhiệt khuếch đại exon thể qua bảng: Bảng 2.3: Thành phần phản ứng PCR khuếch đại exon gen GLA Exon Exon 2; 4; Exon 1; 3; 5-6 IVS 10 12,5 12,5 12,5 Mồi xuôi 1 Mồi ngược 1 DMSO 1 DNA 1,5 0,5 1,5 Tổng 25 25 25 Thành phần (µl) H2O 2X AmpliTaq gold 54 Chu trình nhiệt với phản ứng PCR Bảng 2.4: Chu trình nhiệt phản ứng PCR khuếch đại gen GLA Thời gian Nhiệt độ phút 95C 20 giây 95C 30 giây Tm (tùy vào mồi) 30 giây 72C phút 72C  4C Số chu kỳ 40 chu kỳ - Sau tiến hành điện di kiểm tra sản phẩm PCR: Lấy 3µl sản phẩm PCR, 1µl Loading Dye pha theo tỷ lệ, 1µl Water nuclear free điện di gel agarose 1,5% hiệu điện 120V 20 phút, sản phẩm sau điện di nhuộm ethidium bromide Kết điện di sản phẩm PCR gel agarose chụp máy chụp gel GelDoc-It - PCR giải trình tự gen: + Sản phẩm PCR tinh trước tiến hành phản ứng PCR giải trình tự + Sử dụng phương pháp Sanger hệ thống máy ABI 3730 XL (Thermo Fisher) chạy với hóa chất BigDye™ Terminator v3.1 Cycle Sequencing Kit + Thành phần mẫu giải trình tự: 55 Bảng 2.5 Thành phần phản ứng PCR cho giải trình tự gen GLA Thành phần Thể tích (µl) Big dye Terminator v3.1 1,0 Buffer Big dye 5X 1,5 Mồi xuôi mồi ngược (10 pmol/µL) 0,5 Nước cất 6,5 DNA tinh 0,5 Tổng thể tích 10 - Chu trình nhiệt: Bảng 2.6 Chu trình nhiệt phản ứng PCR cho giải trình tự gen GLA Chu trình Biến tính 95oC - phút – 24 95oC - 10 giây Bắt cặp Tổng hợp 50oC - 10 giây 60oC - 10 giây 60oC - phút 25 Bảo quản sản phẩm 10oC + Đọc kết quả: Sau tinh sạch, sản phẩm phản ứng PCR giải trình tự điện di máy giải trình tự gen ABI Prism® 3500 Genetic Analyzer + Kết giải trình tự gen thu thập xử lý phần mềm phần mềm CLC Workbenches 8.0 Trình tự so sánh GeneBank để phát đột biến + Trình tự nucleotid đọc tín hiệu huỳnh quang dựa nguyên tắc: loại nucleotid biểu thị màu khác A: màu xanh cây, T: màu đỏ, G: màu đen, C: màu xanh dương Bình thường vị trí nucleotid có đỉnh sóng màu, có biến đổi 56 nucleotid đỉnh sóng bị thay đổi đỉnh sóng nucleotid khác Trong trường hợp dị hợp tử, đỉnh sóng thêm đỉnh sóng nucleotid khác  Khuếch đại gen GAA: tương tự giải trình tự gen GLA với chu trình nhiệt cho exon cụ thể sau: - Thành phần phản ứng PCR Bảng 2.7: Thành phần phản ứng PCR khuếch đại gen GAA Thành phần Thể tích (µL) H2O GoTaq Hot Start Green Master Mix 10 Mồi xuôi Mồi ngược DNA Tổng 20 - Chu trình nhiệt: Bảng 2.8: Chu trình nhiệt khuếch đại gen GAA Thời gian Nhiệt độ phút 94C 45 giây 94C 30 giây Tm (tùy vào mồi) Số chu kỳ 35 chu kỳ 45 giây 72C phút 72C  4C 57 Sản phẩm PCR điện di kiểm tra, sau tinh tiến hành phản ứng PCR giải trình tự - Thành phần phản ứng PCR giải trình tự: Bảng 2.9: Thành phần phản ứng PCR giải trình tự gen GAA Thành phần Thể tích (µL) Big dye Terminator v3.1 2,0 Buffer Big dye 5X Mồi xi mồi ngược (5 pmol/µL) Nước cất 13 DNA tinh Tổng thể tích 10 - Chu trình nhiệt: Bảng 2.10: Chu trình nhiệt PCR giải trình tự gen GAA Chu trình Biến tính 96oC - phút – 20 96oC - giây Bắt cặp Tổng hợp 50oC - 10 giây 60oC – phút Bảo quản sản phẩm 15oC + Đọc kết quả: Sau tinh sạch, sản phẩm phản ứng PCR giải trình tự điện di máy giải trình tự gen ABI Prism® 3500 Genetic Analyzer + Kết giải trình tự gen thu thập xử lý phần mềm phần mềm CLC Workbenches 8.0 Trình tự so sánh GeneBank để phát đột biến 58 - So sánh với ngân hàng gen để phát đột biến Sau giải trình tự, exon gen GLA, GAA so sánh với trình tự gen công bố ngân hàng gen trực tuyến để phát đột biến: gen GLA trình tự NC_000023.11 gen GAA trình tự NG_009822.1 - Lập phả hệ: Sau có chẩn đốn xác định, tiến hành lập phả hệ lấy máu, làm xét nghiệm sàng lọc enzyme giải trình tự gen tìm đột biến cho thành viên gia đình 2.4 Thu thập xử lý số liệu 2.4.1 Công cụ thu thập số liệu - Thu thập liệu lâm sàng kết xét nghiệm thông thường: Mỗi người bệnh có mẫu phiếu nghiên cứu (phụ lục 1) để điền thông tin - Thu thập mẫu bệnh phẩm giọt máu khô giấy thấm: Mẫu máu người bệnh nhỏ làm khô hai loại giấy lọc theo quy trình Lượng máu cịn lại bảo quản ống có chống đông Heparin nhiệt độ âm 80 độ C - Thu thập mẫu máu toàn phần: mẫu máu người bệnh thu thập vào ống chống đông EDTA, bảo quản vận chuyển theo quy định 2.4.2 Quy trình thu thập số liệu - Hỏi thơng tin từ người bệnh bố mẹ người bệnh (với bệnh nhi) - Khám lâm sàng, làm xét nghiệm cần thiết - Sàng lọc bước đầu để định xem có lấy máu để định lượng enzyme hay khơng 2.4.3 Xử lý số liệu - Các biến số lâm sàng xét nghiệm thơng thường tính tốn dựa vào phần mềm thông kê y học SPSS16.0 - Hoạt độ enzyme tính tốn phần mềm chun dụng theo hướng dẫn nhà sản xuất 59 - Kết giải trình tự gen xử lý phần mềm BioEdit 7.2.6, ApE-A plasmid Editor 2.0.3 phần mềm CLC Workbenches 8.0, sau trình tự so sánh GeneBank để phát đột biến - Tìm kiếm đột biến, dạng đột biến, loại protein bị thay đổi…, dựa vào ngân hàng gen trực tuyến http://www.hgmd.cf.ac.uk/ac/index.php - Xác định đột biến khả gây bệnh đột biến phần mềm phân tích tin sinh học Polyphen-2, SIFT Mutation Taster - Áp dụng phương pháp lập phả hệ sử dụng ký hiệu lập phả hệ theo quy định 2.4.4 Khống chế sai số - Các người bệnh thu thập thông tin theo mẫu thống - Áp dụng quy trình chuẩn cho kỹ thuật lấy bảo quản bệnh phẩm, kỹ thuật tế bào, gen, sinh học phân tử Tập huấn đầy đủ cho thành viên nghiên cứu Phịng xét nghiệm enzyme giả trình tự gen đạt chuẩn quốc tế 2.5 Đạo đức nghiên cứu - Nghiên cứu đươ ̣c tiế n hành có sự đồ ng ý của hội đồng y đức Bệnh viện Nhi Trung ương (số 2177/BVNW-HĐĐĐ ngày 22/9/2022) Hội đồng khoa học trường Đại học Y Dược Hải Phòng (số 01/ HĐĐĐ, 27/9/2012) và gia đình bê ̣nh nhân - Các người bệnh thành viên gia đình người bệnh tham gia nghiên cứu giải thích rõ ràng lợi ích, quyền lợi rủi ro có Các đối tượng tham gia nghiên cứu hồn tồn tự nguyện có quyền rút khỏi nghiên cứu Các thông tin liên quan đến người bệnh đảm bảo bí mật - Việc tiến hành nghiên cứu thực theo mục tiêu nghiên cứu, phục vụ cho nghiệp khoa học chăm sóc sức khỏe nhân dân 60 CHƯƠNG KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 3.1 Đặc điểm chung đối tượng tham gia nghiên cứu 3.1.1 Bệnh Fabry 3.1.1.1 Đặc điểm phân bố theo tuổi Trong thời gian tiến hành nghiên cứu, tiến hành vấn, lấy mẫu 540 người bệnh phì đại thất trái chưa rõ nguyên nhân nghi ngờ Fabry thể khơng điển hình, sau sàng lọc bước đầu chúng tơi chọn 433 người bệnh có đủ điều kiện tham gia nghiên cứu, khơng có bệnh nhi chẩn đoán lâm sàng mắc bệnh Fabry Phân bố theo độ tuổi nhóm người bệnh phì đại tim chưa rõ nguyên nhân tham gia nghiên cứu thể qua biểu đồ 3.1 Biểu đồ 3.1: Phân bố theo nhóm tuổi BN nghi ngờ Fabry Nhận xét: Kết cho thấy BN phì đại tim chủ yếu thuộc nhóm từ 40-80 tuổi, giá trị mean ± SD nhóm tuổi đối tượng tham gia nghiên cứu 57 ± 12 61 3.1.1.2 Đặc điểm phân bố theo giới Bảng 3.1: Phân bố theo giới nhóm người bệnh tham gia nghiên cứu Giới n % Nam 417 97 Nữ 16 Tổng 433 100 Nhận xét: Trong nghiên cứu thấy phần lớn người bệnh (97%) nam giới 3.1.2 Bệnh Pompe Trong thời gian tiến hành nghiên cứu, thu thập 14 người bệnh có biểu lâm sàng yếu cơ/ bú kém/suy tim chẩn đoán lâm sàng mắc bệnh Pompe, tiến hành thu thập mẫu bệnh phẩm để đo hoạt độ enzyme giải trình tự gen 3.1.2.1 Đặc điểm tuổi khởi phát Bảng 3.2: Phân bố theo tuổi khởi phát người bệnh Pompe nghiên cứu Tuổi n % ≤ tháng 12 85,8 tháng – tuổi 7,1 >1 tuổi 7,1 Tổng 14 100 Nhận xét: Phần lớn người bệnh khởi phát sớm (dưới tháng tuổi), tuổi khởi phát trung bình ± 4,2 tháng Trường hợp biểu sớm ngày tuổi trường hợp muộn 17 tháng tuổi 62 3.2.2.2 Giới Bảng 3.3: Phân bố theo giới người bệnh Pompe nghiên cứu Giới n % Nam 50 Nữ 50 Tổng 14 100 Nhận xét: Trong số 14 người bệnh Pompe có nam nữ Số lượng nam nữ tương đương 3.2 Kết đo hoạt độ enzyme 3.2.1 Hoạt độ enzyme GLA người bệnh nghi ngờ Fabry Chúng tiến hành lấy mẫu máu giấy thấm DBS tiến hành đo hoạt độ enzyme GLA từ giấy DBS phương pháp đo khối phổ song song cho người bệnh đủ tiêu chuẩn tham gia nghiên cứu Do Việt Nam chưa có nghiên cứu hoạt độ enzyme GLA nên lấy giá trị tham chiếu người Đài Loan 2,05 – 7,46 µmol/h/L làm khoảng tham chiếu Kết sau: Bảng 3.4: Kết đo hoạt độ enzyme GLA Hoạt độ enzyme < 0,2 0,2 - 2,05 ≥ 2,05 Tổng n 26 267 140 433 Tỷ lệ (%) 61,8 32,2 100 (µmol/h/L) 63 Biểu đồ 3.2: Kết đo hoạt độ enzyme GLA Nhận xét: Hoạt độ enzyme mẫu nghiên cứu nằm khoảng 0,17-9,18 μmol/h/L (1,87±0,94 μmol/h/L), chủ yếu dao động khoảng 0,92-2,97 μmol/h/L Hơn 60% người bệnh có hoạt độ enzyme thấp giá trị tham chiếu người Đài Loan 2,05-7,46 μmol/h/L, có 26 người bệnh có hoạt độ enzyme lại 10% giá trị tham chiếu, chiếm 6% 3.2.2 Kết hoạt độ enzyme GAA người bệnh nghi ngờ Pompe Tương tự với enzyme GLA, lấy giá trị tham chiếu người Đài Loan (19,92±8,49µmol/h/L) làm giá trị tham chiếu cho nghiên cứu Kết đo hoạt độ enzyme GAA 14 người bệnh nghi ngờ Pompe nghiên cứu nằm khoảng từ 0,01-6,8 μmol/h/L, trung bình 0,91±1,26 μmol/h/L 64 Bảng 3.5: Kết đo hoạt độ enzyme GAA Hoạt độ enzyme GAA T E1 IVS4-16 A>G Intron IVS6-22 C>T Intron Loại đột biến Đồng hợp/dị Ghi hợp tử Đã công SNP Dị hợp tử - - - - - - SNP bố64 Dị hợp tử Đã công Dị hợp bố64 FB06 - - - - - - FB07 - - - - - - FB08 IVS1+17 A>G Intron 5'UTR -10 C>T E1 IVS4-16 A>G Đồng Đã công Intron hợp tử bố64 - - FB09 Intron IVS6-22 C>T FB10 - 5'UTR -12 G>A FB26 FB44 SNP - - - Đã công E1 SNP IVS6-22 C>T Intron 5'UTR -10 C>T E1 IVS4-16 A>G Intron IVS6-22 C>T Intron bố64 Đồng Đã công hợp tử bố64 SNP 67 c.178C>T FB64 IVS4-16 A>G E1 p.Pro60Ser Intron Sai nghĩa hợp tử IVS6-22 C>T Intron IVS4-16 A>G Intron Đồng IVS6-22 C>T Intron hợp tử FB69 FB70 Đồng - - - IVS4-16 A>G Intron IVS6-22 C>T Intron FB74 Mới - - - FB79 - - - - - - FB80 - - - - - - FB84 - - - - - - FB85 - - - - - - - - - IVS4-16 A>G Intron IVS6-22 C>T Intron IVS4-16 A>G Intron IVS6-22 C>T Intron FB133 FB331 FB334 FB345 FB378 - - - IVS4-16 A>G Intron IVS6-22 C>T Intron IVS4-16 A>G Intron IVS6-22 C>T Intron FB414 - - - - - - VN.06 c.178C>T p.Pro60Ser Exon Sai nghĩa - Mới (-): không phát bất thường Nhận xét: Trong số 27 mẫu giải trình tự, 11/27 mẫu (3 nữ, nam) khơng phát thay đổi trình tự, 16/27 mẫu có thay đổi trình tự Chúng tơi thấy tần số xuất biến thể IVS 5’UTR cao, 68 có 13/27 BN (48,1%) mang biến thể IVS6-22 C>T, 12/27 BN (44,4%) mang biến thể IVS4-16A>G, 10/27 BN (37%) mang biến thể 5’UTR10 C>T 5/27 BN (18,5%) mang biến thể trên, có trường hợp nữ, mang biến thể thể đồng hợp tử Ngồi cịn phát biến thể IVS1+17 A>G 5’UTR -12G>A Hình 3.2: Hình ảnh biến thể 5’UTR -12G>A Trong nghiên cứu người bệnh mã số FB64 VN.06 có đột biến vùng mã hóa (exon 1) vị trí 178, thay nucleotide C nucleotide T, dẫn đến thay đổi acid amin vị trí 60 Prolin thành Serin Hình 3.3: Kết đột biến c.178C>T, (p.Pro60Ser) người bệnh mã số FB64 Nhận xét: Tại vị trí c.178 xuất đỉnh màu đỏ rõ nét (T), thay cho đỉnh màu xanh (C) người bình thường, làm thay đổi ba CCA mã hóa acid amin Prolin chuyển thành TCA, mã hóa cho acid amin Serin 69 Khi tra cứu hệ thống liệu đột biến có sẵn Clinvar HGMD, nhận thấy đột biến chưa công bố trước Do đó, chúng tơi dùng phần mềm tin sinh học SIFT, PolyPhen-2 MutationTaster để dự đoán khả gây bệnh đột biến Kết thu sau: Bảng 3.7 Dự đoán khả gây bệnh đột biến phầm mềm tin sinh học SIFT PolyPhen-2 MutationTaster 0,00 1,00 74 Khả gây bệnh Khả gây bệnh cao cao Điểm Dự đoán Gây bệnh Kết sử dụng phần mềm cho dự đoán khả gây bệnh đột biến cao Hình 3.4: Hình ảnh minh họa sử dụng cơng cụ PolyPhen-2 để dự đoán khả gây bệnh đột biến c.178C>T Hình 3.4 mơ tả kết dự đốn khả gây bệnh đột biến c.178C>T phần mềm PolyPhen-2: đột biến có khả gây bệnh cao với số điểm 1,00 70 Gây bệnh Hình 3.5: Hình ảnh minh họa sử dụng cơng cụ MutationTaster để dự đốn khả gây bệnh đột biến c.178C>T Hình 3.5 mơ tả kết dự đốn khả gây bệnh đột biến c.178C>T phần mềm MutationTaster cho thấy đột biến có khả gây bệnh Kết giải trình tự gen chia nhóm người bệnh nghi ngờ mắc Fabry thành ba nhóm: nhóm có đột biến exon vùng có mã hóa acid amin; nhóm có đột biến gen GLA vùng khơng mã hóa acid amin (vùng intron 5'UTR); nhóm khơng có đột biến gen GLA Bảng 3.7 thể hoạt độ enzyme GLA trung bình nhóm: Bảng 3.8: Kết hoạt độ enzyme theo loại đột biến Kết Không có đột Đột biến vùng Đột biến vùng giải trình tự gen biến khơng mã hóa mã hóa N 13 12 Hoạt độ enzyme trung 1,05±0,53 1,11±0,72 0,17 bình 71 Nhận xét: Nhóm có đột biến vùng mã hóa có kết hoạt độ enzyme thấp nhất, nhiên so sánh với nhóm cịn lại chúng tơi nhận thấy khác biệt khơng có ý nghĩa thống kê Khi so sánh hoạt độ enzyme trung bình nhóm có đột biến vùng khơng mã hóa nhóm khơng có đột biến, chúng tơi nhận thấy khác biệt khơng có ý nghĩa thống kê với p>0,05 Đồ thị phân tích kết đo hoạt độ enzyme nhóm trình bày hình 3.8 Biểu đồ 3.3: Đồ thị phân tích hoạt độ enzyme GLA theo kết giải trình tự gen 3.3.2 Kết giải trình tự gen người bệnh nghi ngờ Pompe Chúng tơi tiến hành phân tích gen cho 14 người bệnh có triệu chứng nghi ngờ Pompe cặp vợ chồng có tiền sử sinh Pompe Sau lấy mẫu, DNA tách chiết từ mẫu máu toàn phần theo hướng dẫn nhà sản xuất, sau kiểm tra nồng độ độ tinh cách đo quang phổ máy Nanodrop Những mẫu DNA đạt nồng độ độ tinh ≥1,8 sử dụng cho thí nghiệm 72 3.3.2.1 Kết khuếch đại gen GAA DNA sau tách chiết khuếch đại gen GAA cặp mồi đặc hiệu Sản phẩm PCR điện di gel agarose M: marker 1-7: mẫu bệnh phẩm người bệnh mã số Pom16-Pom22 Hình 3.6: Hình ảnh điện di sản phẩm PCR sau khuếch đại exon14 gen GAA Nhận xét: băng điện di rõ nét, kích thước, đủ tiêu chuẩn cho phản ứng 3.3.2.2 Kết giải trình tự gen Sau tiến hành giải trình tự gen phương pháp giải trình tự trực tiếp cho 14 người bệnh 02 cặp vợ chồng có tiền sử sinh Pompe, thu kết sau: 73 Bảng 3.9: Kết giả trình tự gen GAA đối tượng nghiên cứu Mã số người bệnh Pom7.0 Đồng hợp/dị hợp tử Đồng hợp tử Dị hợp tử E20 Sai nghĩa Dịch khung Dị hợp tử Dị hợp tử p.Ser940fs E20 E20 Dịch khung Dị hợp tử p.Tyr209His E3 p.Ser940fs E20 Sai nghĩa Dịch khung Dị hợp tử Dị hợp tử Thay đổi acid amin Vị trí c.625T>C p.Tyr209His E3 p.Asp645His E14 p.Tyr209His E3 p.Ser940fs c.1933G>C c.625T>C Pom8.0 Loại đột biến Sai nghĩa Sai nghĩa Thay đổi nucleotid c.28182819delTCinsCAG c.2818delT Pom9.0 c.28182819delTCinsCAG c.625T>C Pom10.0 c.28182819delTCinsCAG c.1933G>C Pom11.0 c.1933G>A c.1933G>C Pom12.0 c.2040+1G>T c.736delT Pom14.0 c.1933G>C Pom16.0 c.1933G>C Pom17.0 c.1933G>C c.1933G>C Pom18.0 c.2173C>T Sai nghĩa Sai p.Asp645Asn E14 nghĩa Sai E14 nghĩa p.Asp645His Chỗ Intron 14 nối Dịch p.Leu246fs*22 E4 khung Sai p.Asp645His E14 nghĩa Sai p.Asp645His E14 nghĩa Sai p.Asp645His E14 nghĩa Sai E14 p.Asp645His nghĩa Sai E15 p.Arg725Trp nghĩa p.Asp645His E14 Dị hợp tử Dị hợp Dị hợp tử Dị hợp tử Dị hợp tử Dị hợp tử Đồng hợp tử Đồng hợp tử Dị hợp tử Dị hợp tử Ghi Mới Đã công bố118 Mới Mới Mới Mới Mới Mới Đã công bố118 Đã công bố118 Đã công bố118 Đã công bố116,117 Đã công bố119 Đã công bố118 Đã công bố118 Đã công bố118 Đã công bố118 Đã công bố56 74 Mã số người bệnh Thay đổi nucleotid Thay đổi acid amin c.1735G>A p.Glu579Lys Pom19.0 Pom20.0 c 1411_1414del Đồng hợp/dị hợp tử Ghi Sai nghĩa Chỗ nối Dị hợp tử Dị hợp tử Đã công bố56 Đã công bố120,121 Sai nghĩa Dịch E9 khung Sai E3 nghĩa Sai E14 nghĩa Intron14 Vị trí nối Intron14 Vị trí nối Sai E18 nghĩa Sai E18 nghĩa Dị hợp tử Dị hợp tử Đồng hợp tử Đồng hợp tử Dị hợp tử Dị hợp tử Dị hợp tử Dị hợp tử Đã công bố56 Đã công bố122 E12 Intron14 c.2040+1G>T c.1735G>A Loại đột biến Vị trí p.Glu579Lys p.Glu471Pfs*5 Pom21.0 c.625T>C p.Tyr209His Pom22.0 c.1933G>C p.Asp645His VN 0055.0 VN 0055.1 VN 0056.1 VN 0056.2 c.2040+1G>T c.2040+1G>T c.2563 G>C p.Gly855Arg c.2563 G>C p.Gly855Arg E14 Mới Đã công bố118 Đã công bố120,121 Đã công bố120,121 Đã công bố123 Đã công bố123 Nhận xét: Tất mẫu giải trình tự gen GAA phát đột biến Các loại đột biến gặp nghiên cứu chủ yếu đột biến sai nghĩa, thay nucleotid dẫn đến thay acid amin ngồi cịn gặp đột biến dịch khung Ngồi đột biến báo cáo y văn, nhận thấy xuất đột biến với tần suất cao như: c.625T>C (p.Tyr209His) gặp 4/14 người bệnh, đột biến c.2818-2819del TCinsCAG (p.Ser940fs) gặp 2/14 người bệnh 7/14 người bệnh mang đồng thời đột biến thể dị hợp tử (dị hợp tử kép) Các đột biến phân bố exon 3,4,9,14,15, 18 intron 14 75 Đột biến sai nghĩa Hình 3.7: Hình ảnh đột biến gen người bệnh mã số Pom11.0 Nhận xét: Kết giải trình tự đối chiếu Genebank cho thấy người bệnh Pom11.0 có biến đổi vị trí c.1933 DNA từ nucleotid G (đỉnh màu đen) thành C (màu xanh lam) G thành A (màu xanh lá) Sự biến đổi dẫn đến thay đổi acid amin từ Aspartat (GAT - D) thành Histidin (CAT - H) thành Asparagine (AAT - N) vị trí p.645 (p.Asp645His, p.Asp645Asn), đột biến sai nghĩa nằm vùng mã hóa exon 14 gen GAA Đột biến dịch khung Người bình thường Người bệnh Pom20.7 Người bệnh Pom20.4 Hình 3.8: Hình ảnh kết đột biến c.1411-1414delGAGA người bệnh Pom20.4 Pom20.7 76 Nhận xét: Tại vị trí c.1411-1414 exon người bệnh mã số Pom20.4 Pom20.7 bị thiếu đoạn gồm nucleotid so với hình ảnh người bệnh mã số Pom.20.3, gây dịch khung sau codon 471 Đột biến vị trí nối: c.2040+1G>T Hình 3.9: Hình ảnh đột biến chỗ nối intron 14 người bệnh mã số Pom12.0 Nhận xét: Tại vị trí c.2040+1 intron 14 có thay nucleotid G (đỉnh màu đen) nucleotid T (đỉnh màu đỏ) Tuy nhiên ta quan sát đỉnh G nên đột biến thể dị hợp tử Bảng 3.10 Tần suất xuất đột biến nghiên cứu Thay đổi nucleotid Vị trí c.625T>C Thay đổi acid amin p.Tyr209His Tần suất E3 Loại đột biến Sai nghĩa c736delT p.Leu246fs E4 Dịch khung c 1411_1414del p.Glu471Profs E9 Dịch khung Intron 14 Vị trí nối c.2040+1G>T c.1933G>C p.Asp645His E14 Sai nghĩa c.1933G>A p.Asp645Asn E14 Sai nghĩa c.1735G>A p.Glu579Lys E14 Sai nghĩa c.2173C>T p.Arg725Asn E15 Sai nghĩa c.2818- p.Ser940fs E20 Dịch khung 2819delTinsCAG 77 Nhận xét: đột biến xuất với tần suất cao đột biến c.1933G>C (p.Asp654His) với 7/14 trường hợp, tiếp đến đột biến c.625T>C (p.Tyr209His) với 4/14 trường hợp Các đột biến phát nghiên cứu tra cứu hệ thống dự liệu đột biến có sẵn ClinVar (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/clinvar) sở liệu bệnh Pompe (https:// pompevariantdatabase.nl/ pompe_mutations), để xác định đột biến công bố khả gây bệnh Đối với đột biến mới, sử dụng phần mềm dự đoán tin sinh học (in silico) để dự đoán khả gây bệnh Hai đột biến tìm nghiên cứu đột biến chưa cơng bố, có đột biến sai nghĩa c.625T>C, đột biến làm thay đổi trình tự acid amin không làm ảnh hưởng đến chiều dài phân tử protein Do đó, để dự đốn khả gây bệnh đột biến sai nghĩa chúng tơi sử dụng cơng cụ phân tích in silico cách dùng phần mềm MutationTaster, SIFT cơng cụ Polyphen-2 Bảng 3.11 Kết dự đốn khả gây bệnh đột biến c.625T>C phần mền tin sinh học SIFT PolyPhen-2 MutationTaster Điểm 0,14 1,0 83 Dự đốn Lành tính Khả gây bệnh Gây bệnh cao Kết dự đoán đột biến c.625T>C phần mềm PolyPhen-2 MutationTaster cho đột biến có khả gây bệnh, nhiên, phần mềm SIFT lại cho đột biến lành tính với số điểm 0.14 78 Có thể gây bệnh Hình 3.10: Hình ảnh minh họa kết dự đoán khả gây bệnh đột biến c.625T>C phần mềm PolyPhen2 Hình 3.10 cho thấy kết dự đoán khả gây bệnh đột biến c.625T>C phần mềm PolyPhen-2 cao với số điểm 1.00 Gây bệnh Hình 3.11: Hình ảnh minh họa kết dự đoán khả gây bệnh đột biến c.625T>C phần mềm MutationTaster Kết dự đoán phần mềm MutationTaster cho thấy đột biến c.625T>C đột biến có khả gây bệnh 79 3.4 Phát người lành mang gen thành viên gia đình người bệnh 3.4.1 Phát người lành mang gen thành viên gia đình người bệnh Fabry Trong nghiên cứu phát người bệnh mã số FB64 trẻ mã số VN.06 (có mẹ người Việt Nam bố người Đài Loan có hoạt độ enzyme GLA thấp, phát thông qua chương trình sàng lọc sơ sinh Đài Loan) mang đột biến vùng mã hóa gen GLA Tuy nhiên, gia đình người bệnh Fb64 khơng muốn tham gia nghiên cứu Chúng tiến hành lấy mẫu máu thành viên gia đình bên ngoại trẻ VN.06 để phân tích Bà ngoại, bố mẹ người bệnh sống Đài Loan nên tiến hành đo hoạt độ enzyme từ huyết thanh, kết hoạt độ enzyme sau: Bảng 3.12: Kết đo hoạt độ enzyme GLA từ mẫu máu toàn phần Mã số Quan hệ với Hoạt độ enzyme (nmol/h/mL) người bệnh người bệnh Ref: 5,41-17,99 (nmol/h/mL) VN.03 Bà ngoại 8,14 VN.04 Bố 9,25 VN.05 Mẹ 7,08 VN.06 Người bệnh STT 3,53 Nhận xét: Người bệnh mã số VN.06 có hoạt độ enzyme thấp giá trị bình thường, bố, mẹ bà ngoại người bệnh có hoạt độ enzyme khoảng giá trị tham chiếu Các thành viên cịn lại gia đình người bệnh sống Việt Nam nên thu thập máu giấy thấm khô DBS, hoạt độ enzyme GLA đo phương pháp đo khối phổ song song Kết thể bảng: 80 Bảng 3.13: Kết đo hoạt độ enzyme GLA từ giấy thấm DBS Mã số người Mối quan hệ với Hoạt độ enzyme (µmol/h/L) bệnh người bệnh VN.06 Ref: 2,05- 7,46 µmol/h/L VN.01 Cụ ngoại (cụ bà) 2,46 VN.02 Ông ngoại 0,6 VN.07 Dì 0,5 VN.08 Em trai họ (con dì) 0,47 VN.09 Em trai họ (con dì) 0,65 STT Nhận xét: Kết cho thấy gia đình có người bệnh, ơng ngoại, dì trai dì có hoạt độ enzyme thấp dải tham chiếu (2,05- 7,46 µmol/h/L), cụ ngoại người bệnh có hoạt độ enzyme giới hạn bình thường Từ người bệnh mã số VN 06, tiến hành giải trình tự gen exon cho thành viên gia đình Sau có kết giải trình tự gen chúng tơi lập phả hệ gia đình sau: 81 Hình 3.12: Phả hệ gia đình mã số VN.06 - Người bệnh VN.06 (IV-1) mang đột biến c.178 C>T làm thay đổi acid amin vị trí 60 prolin thành serin exon gen GLA - Gia đình có thành viên tham gia vào nghiên cứu gồm: cụ ngoại (I-1), ông ngoại (II-3), bà ngoại (II-4), bố đẻ (III-1), mẹ (III-2), cậu (III-3), dì (III-4) người cháu em họ dì (IV-2, IV-3) Tại thời điểm nghiên cứu, thành viên gia đình chưa chẩn đốn Fabry khơng có biểu bệnh lý tim mạch - Kết phân tích gen GLA vị trí exon phát có thành viên mang đột biến giống người bệnh ông ngoại (II-3), mẹ đẻ (III-2), dì (III4) người em họ (IV-2 IV-3) dì (III-4) Các thành viên nữ mang đột biến thể dị hợp tử - Đột biến gen GLA xuất cụ ngoại (I-2) truyền cho ông ngoại (II3), từ ông ngoại truyền cho mẹ (III-2) dì (III-4) Đột biến mẹ (III-2) 82 truyền cho người bệnh (IV-1) dì (III-4) truyền cho trai (IV-2 IV-3) Như đột biến xuất hệ gia đình người bệnh VN.06 Kết hoạt độ enzyme kết giải trình tự gen: Khi tổng hợp kết giải trình tự gen kết đo hoạt độ enzyme, thu kết sau: Bảng 3.14: Kết đo hoạt độ enzyme kết giải trình tự exon gia đình người bệnh mã số VN.06 Mã số người bệnh Quan hệ Giới với người bệnh Đột biến Hoạt độ enzyme gen GLA VN.01 Nữ Cụ c.178 C>T 2,46 VN.02 Nam Ông ngoại c.178 C>T 0,6 VN.03 Nữ Bà ngoại - 8,14 VN.04 Nam Bố - 9,25 VN.05 Nữ Mẹ c.178 C>T 7,08 VN.06 Nam Người bệnh c.178 C>T 3,53 VN.07 Nữ Dì c.178 C>T 0,5 VN.08 Nam Em họ c.178 C>T 0,47 VN.09 Nam Em họ c.178 C>T 0,65 Nhận xét: Cụ ngoại mẹ người bệnh có đột biến gen có hoạt độ enzyme giới hạn bình thường, dì người bệnh mang đột biến lại có hoạt độ enzyme thấp Các thành viên nam có đột biến có hoạt độ enzyme thấp so với giá trị bình thường 83 3.4.2 Phát người lành mang gen thành viên gia đình người bệnh Pompe Từ 07 người bệnh Pompe xác định đột biến cặp vợ chồng có tiền sử sinh mắc bệnh Pompe, tiến hành lấy mẫu phân tích trình tự gen cho thành viên gia đình để lập phả hệ, xác định người lành mang gen 3.4.2.1 Gia đình người bệnh mã số Pom16 Người bệnh mã số Pom16 mang đột biến c.1933G>C (p.Asp645His) exon 14, đồng hợp tử, nên với thành viên gia đình người bệnh chúng tơi tiến hành giải trình tự exon 14 Hình 3.13: Phả hệ gia đình mã số Pom16 - Người bệnh Pom16 (III-3) mang đột biến đồng hợp tử biến c.1933G>C dẫn đến thay acid amin Aspartat thành acid amin Histidin vị trí p.645 nằm vùng mã hóa exon 14 84 - Có 14 thành viên gia đình tham gia vào nghiên cứu gồm: ơng nội (I-1), bà nội (I-2), ông ngoại (I-3), bà ngoại (I-4), bác ruột (II-1 vàII-3), bố đẻ (II4), mẹ đẻ (II-5), dì (II-6), cậu (II-5), anh họ (III-3), chị họ (III-1, III-2), em họ (III-5) - Kết phân tích gen GAA vị trí exon 14 phát 10 thành viên mang đột biến (c.1933G>C (p.Asp645His) giống người bệnh gồm: ông nội (I-1), ông ngoại (I-3), bác ruột (II-1 II-3), bố đẻ (II-4), mẹ đẻ (II-5), cậu (II-6), dì (II-7), chị họ (III-1, III-2), em họ (III-5) Các thành viên mang đột biến thể dị hợp tử - Đột biến (c.1933G>C (p.Asp645His) xuất ông nội di truyền cho bố bác gái, xuất ông ngoại di truyền cho mẹ, cậu dì Đột biến bố mẹ di truyền cho người gái người bệnh Pome16 Đột biến bác di truyền cho gái bác (là chị họ người bệnh), đột biến dì di truyền cho gái dì, em họ người bệnh Tuy nhiên, thành viên gia đình mang đột biến gen thể dị hợp tử nên biểu bệnh 3.4.2.2 Gia đình người bệnh mã số Pom17 Người bệnh mã số Pom17 mang đột biến exon 14: c.1933G>C (p.Asp645His) đồng hợp tử, với thành viên gia đình chúng tơi tiến hành giải trình tự exon 14 để tìm đột biến 85 Hình 3.14: Phả hệ gia đình mã số Pom17 - Người bệnh Pom17 (III-1) mang đột biến đồng hợp tử biến c.1933G>C dẫn đến thay acid amin Aspartat thành acid amin Histidin vị trí p.645 nằm vùng mã hóa exon 14 - Có 10 thành viên gia đình tham gia vào nghiên cứu gồm: ông nội (I-1), bà nội (I-2), ông ngoại (I-3), bà ngoại (I-4), bác ruột (II-1), bác rể (II-2), bố đẻ (II-3), mẹ đẻ (II-4), dì (II-5), cậu (II-6) - Kết phân tích gen GAA vị trí exon 14 phát thành viên mang đột biến (c.1933G>C (p.Asp645His) giống người bệnh gồm: ông nội (I-1), ông ngoại (I-3), bác ruột (II-1), bố đẻ (II-3), mẹ đẻ (II-4) dì (II-5) Các thành viên mang đột biến thể dị hợp tử - Đột biến (c.1933G>C (p.Asp645His) xuất ông nội di truyền cho bố bác gái, xuất ông ngoại di truyền cho mẹ dì Đột biến bố mẹ di truyền cho người trai người bệnh Pome17 Tuy nhiên, thành viên gia đình mang đột biến gen thể dị hợp tử nên khơng có biểu bệnh 86 3.2.4.3 Gia đình người bệnh mã số Pom18 Hình 3.15: Phả hệ gia đình mã số Pom18 - Người bệnh Pom18 (III-1) mang đột biến c.1933G>C (p.Asp645His) exon 14 đột biến c.2173C>T (p.arg725Trp) exon 15, thể dị hợp tử Có thành viên gia đình tham gia vào nghiên cứu gồm: ông nội (I-1), bà nội (I-2), ông ngoại (I-3), bà ngoại (I-4), bố đẻ (II-1), mẹ đẻ (II-2), em trai người bệnh (III-2) - Kết phân tích gen GAA vị trí exon 14 exon 15 phát thành viên mang đột biến, gồm bà nội (I-2) bố (II-1) người bệnh mang đột biến c.2173C>T (p.Arg725Trp) thể dị hợp, ông nội (I-1), ông ngoại (I-3) mẹ (II-2) người bệnh mang đột biến c.1933G>C (p.Asp645His) Các thành viên mang đột biến thể dị hợp tử - Đột biến (c.1933G>C (p.Asp645His) xuất bà nội di truyền cho bố, xuất ông ngoại di truyền cho mẹ Đột biến bố mẹ di truyền cho người gái người bệnh Pome18 Tuy nhiên, thành viên gia đình mang đột biến gen thể dị hợp tử nên khơng có biểu bệnh Người bệnh mang đột biến thể dị hợp có biểu bệnh 87 3.4.2.4 Gia đình người bệnh mã số Pom19 Hình 3.16: Phả hệ gia đình mã số Pom19 - Người bệnh Pom19 (III-3) mang đồng thời đột biến thể dị hợp tử c.1735G>A dẫn đến thay acid amin Glutamat thành acid amin Lysin vị trí p.579 nằm vùng mã hóa exon 12 đột biến c.2040+1G>T thể dị hợp intron 14 - Có 12 thành viên gia đình tham gia vào nghiên cứu gồm: ơng nội (I-1), bà nội (I-2), ông ngoại (I-3), bà ngoại (I-4), cô ruột (II-1), chồng cô (II-2), bố đẻ (II-3), mẹ đẻ (II-4), dì (II-6), cậu (II-5), anh họ (III-3), em họ - cô (III-1, III-2, III-3), anh ruột (III-5) em họ dì (III-6) - Kết phân tích gen GAA vị trí exon 12 intron 14 phát thành viên mang đột biến, gồm: ông nội (I-1) bố đẻ (II-3) mang đột biến c.2040+1G>T, ông ngoại (I-3) mẹ đẻ (II-4) anh trai ruột (III-4) mang đột biến c.1735G>A (p.Glu579Lys) Các thành viên mang đột biến thể dị hợp tử 88 - Đột biến c.2040+1G>T xuất ông nội di truyền cho bố, đột biến c.1735G>A (p.Glu579Lys) xuất ông ngoại di truyền cho mẹ Đột biến bố mẹ di truyền cho người trai người bệnh Pom e19 đột biến mẹ di truyền cho anh trai (III-4) Tuy nhiên, thành viên gia đình mang đột biến gen thể dị hợp tử nên biểu bệnh 3.4.2.5 Gia đình người bệnh mã số Pom20 Hình 3.17: Phả hệ gia đình mã số Pom20 - Người bệnh Pom20 (III-1) mang đồng thời đột biến thể dị hợp tử c.1411-1414del (p.Glu471Profs) exon 9; c.1735G>A (p.Glu579Lys) exon 12 - Có thành viên gia đình tham gia vào nghiên cứu gồm: bà nội (I-2), bà ngoại (I-3), ông ngoại (I-4), bố đẻ (II-1), mẹ đẻ (II-2), dì (II-4) cậu (II-3) - Kết phân tích gen GAA vị trí exon exon 12 phát thành viên mang đột biến, gồm: bà nội (I-2) bố đẻ (II-2) mang đột biến c.1411-1414del (p.Glu471Profs), bà ngoại (I-3), mẹ đẻ (II-1) cậu (III-3) mang đột biến c.1735G>A (p.Glu579Lys) Các thành viên mang đột biến thể dị hợp tử 89 - Đột biến c.1411del (p.Glu471Profs) xuất bà nội di truyền cho bố, đột biến c.1735G>A (p.Glu579Lys) xuất bà ngoại di truyền cho mẹ cậu đột biến bố mẹ di truyền cho người gái người bệnh Pom20 Tuy nhiên, thành viên gia đình mang đột biến gen thể dị hợp tử nên khơng có biểu bệnh 3.4.2.6 Gia đình người bệnh mã số Pom21 Hình 3.18: Phả hệ gia đình mã số Pom21 - Người bệnh Pom21 (III-2) mang đột biến thể đồng hợp tử c.625T>C dẫn đến thay acid amin Tyrosin thành acid amin Histidin vị trí p.209 exon - Có 13 thành viên gia đình tham gia vào nghiên cứu gồm: ơng nội (I-1), bà nội (I-2), ông ngoại (I-3), bà ngoại (I-4), bác – chị gái bố (II-1), chồng bác (II-2), cô ruột (II-3, II-4), bố đẻ (II-5), mẹ đẻ (II-6), cậu (II-7) anh họ (III-1) - Kết phân tích gen GAA vị trí exon phát thành viên mang đột biến, gồm: ông nội (I-1), ông ngoại (I-3), bác – chị gái bố (II1), cô (II-3), bố đẻ (II-5), mẹ đẻ (II-6), cậu (II-7) anh trai họ (III-1) mang đột biến giống người bệnh Các thành viên mang đột biến thể dị hợp tử 90 - Đột biến c.625T>C (p.Tyr209His) xuất ông nội di truyền cho bác, cô bố, xuất ông ngoại di truyền cho mẹ Đột biến bố mẹ di truyền cho người trai người bệnh Pome20 đột biến bác (II-2) di truyền cho anh họ (III-1) Tuy nhiên, thành viên gia đình mang đột biến gen thể dị hợp tử nên khơng có biểu bệnh 3.4.2.7 Gia đình người bệnh mã số Pom22 Hình 3.19 Phả hệ gia đình mã số Pom22 - Người bệnh Pom22 (III-1) mang đột biến c.1933G>C thể đồng hợp tử làm thay Aspartat Histidin vị trí p.645 exon 14 - Có thành viên gia đình tham gia vào nghiên cứu gồm: ông nội (I-1), bà ngoại (I-2), ông ngoại (I-3), bà ngoại (I-4), bác – chị gái bố (II-1), bố đẻ (II-2), mẹ đẻ (II-3), cậu (II-4) - Kết phân tích trình tự exon 14 gen GAA phát thành viên mang đột biến, gồm: ông nội (I-1), ông ngoại (I-3), bác gái (II-1), bố đẻ (II-2), mẹ đẻ (II-3) cậu (II-4) mang đột biến c.1933G>C (p.Asp645His) thể dị hợp tử 91 - Đột biến c.1933G>C (p.Asp645His) xuất ông nội di truyền cho bác gái bố, xuất ông ngoại di truyền cho mẹ cậu Đột biến bố mẹ di truyền cho người trai người bệnh Pom22 Tuy nhiên, thành viên gia đình mang đột biến gen thể dị hợp tử nên khơng có biểu bệnh 3.4.2.8 Gia đình mã số VN.0055 Đối tượng nghiên cứu mã số VN.0055.1 VN.0055.2 có tiền sử sinh Pompe, vợ chồng mang đột biến c.2040+1G>T thể dị hợp tử, chúng tơi lấy mẫu thêm thành viên gia đình, giải trình tự exon 14 để tìm đột biến c.2040+1G>T Chúng tơi xây dựng phả hệ sau: Hình 3.20: Phả hệ gia đình mã số VN.0055 - Đối tượng nghiên cứu mã số VN.0055.1 mang đột biến dị hợp tử c.2040+1G>T intron 14 - Có thành viên gia đình tham gia vào nghiên cứu gồm: bố chồng (I-1), mẹ chồng (I-2), bố đẻ (I-3), mẹ đẻ (I-4), em chồng (II-1), chồng (II-2), gái (III-2) 92 - Kết phân tích trình tự exon 14 gen GAA phát thành viên mang đột biến, gồm: bố chồng (I-2), bố đẻ (I-3), chồng (II-2) gái (III-2) mang đột biến c.2040+1G>T thể dị hợp tử - Đột biến c.2040+1G>T xuất hệ I (bố chồng bố đẻ) di truyền cho hệ II vợ chồng đối tượng nghiên cứu mã số VN.0055.1, từ di truyền cho người gái bị bệnh mất, người gái thứ thể dị hợp tử Tuy nhiên, thành viên gia đình mang đột biến gen thể dị hợp tử nên khơng có biểu bệnh Tỷ lệ thành viên gia đình mang đột biến: Khi tổng hợp thành viên gia đình có mang đột biến, chúng tơi tính tỷ lệ thành viên mang đột biến gen GAA Tỷ lệ tính thành viên có huyết thống Bảng 3.15: Tỷ lệ thành viên mang đột biến qua hệ Gia đình Tỷ lệ mang đột biến (%) Pom16 78,6 Tỷ lệ mang đột biến họ hàng bậc 50 Tỷ lệ mang đột biến họ hàng bậc 100 Tỷ lệ mang đột biến họ hàng bậc 75 Pom17 70 50 80 100 Pom18 75 75 100 50 Pom19 60 100 50 50 Pom20 75 67,7 75 100 Pom21 100 100 100 100 Pom22 75 50 100 VN.0055 85,7 67,7 100 100 - Tỷ lệ mang đột biến gen GAA gia đình tham gia nghiên cứu tương đối cao, dao động từ 70 - 100% - Tỷ lệ mang đột biến gen họ hàng bậc chiếm 50% tất gia đình tham gia nghiên cứu 93 - Tỷ lệ mang đột biến gen họ hàng bậc dao động từ 50 - 100% Có 5/9 gia đình tham gia nghiên cứu có tất thành viên họ hàng bậc mang gen bệnh - Tỷ lệ mang đột biến gen họ hàng bậc dao động từ - 100% 3.5 Đặc điểm lâm sàng người bệnh Fabry Pompe 3.5.1 Đặc điểm lâm sàng người bệnh Fabry Trong nghiên cứu phát 01 người bệnh có phì đại tim mang đột biến gen GLA vùng mã hóa người bệnh mã số FB64 Đây người bệnh nam 56 tuổi Kết siêu âm cho thấy số khối thất trái (LVMI) 205 g/m2, bề dày thành sau thất trái tâm trương (LVPWd) 22.6 mm cao Người bệnh biểu đặc điểm bệnh Fabry thể khơng điển phì đại tim với triệu chứng khó thở, đau thắt ngực, tim đập nhanh đặc biệt vận động mạnh, ngồi khơng mang đặc điểm khác bệnh Fabry thể điển hình Trẻ người Đài Loan phát thơng qua chương trình sàng lọc sơ sinh, người bệnh có hoạt độ enzyme giảm chưa có biểu lâm sàng Các thành viên nam gia đình bên ngoại người bệnh mang đột biến gen, có hoạt độ enzyme giảm chưa có biểu lâm sàng, số LVMI LVPWd giới hạn bình thường 3.5.2 Đặc điểm lâm sàng người bệnh Pompe 3.5.2.1 Triệu chứng lâm sàng khởi phát Khi thu thập thông tin triệu chứng lâm sàng khởi phát người bệnh tham gia nghiên cứu, thu kết sau: Bảng 3.16: Triệu chứng lâm sàng khởi phát người bệnh Triệu chứng lâm sàng khởi phát n % Bú 14,3 Yếu 10 71,4 Nhận xét: Trong số 14 người bệnh tham gia nghiên cứu, phần lớn người bệnh có biểu yếu (10/14 người bệnh), có người bệnh có biểu bú 94 3.5.2.2 Biến đổi số tim ngực LVMI Xquang tim phổi siêu âm tim Các người bệnh nghiên cứu chụp Xquang tim phổi siêu âm tim để đánh giá số khối thất trái siêu âm số tim ngực Xquang Bảng 3.17: Biến đổi số tim ngực LVMI Xquang tim phổi siêu âm tim Mã số người bệnh Pom7.0 Tuổi (tháng) Chỉ số khối thất trái (g/m2) 163,2 Chỉ số tim ngực (%) 65% Pom8.0 17 72,6 60% Pom9.0 240 60% Pom10.0 - 59% Pom11.0 415 67% Pom12.0 - 62,80% Pom14.0 341,2 73% Pom16.0 - - Pom17.0 378,9 71,90% 10 Pom18.0 11 214 - 11 Pom19.0 247 71,60% 12 Pom20.0 168,9 50% 13 Pom21.0 48,6 49,60% 14 Pom22.0 - 60% STT Nhận xét: - Dải tham chiếu số khối thất trái (LVMI) trẻ em từ 80g/m2 trẻ sơ sinh đến 40g/m2 trẻ 11 tuổi Trong 11 người bệnh có kết có đến 10 người bệnh có số cao giá trị tham chiếu LVMI trung bình người bệnh cao, nằm khoảng 236±127g/m2 - Có 6/12 người bệnh có số tim ngực tăng (>60%), số tim ngực trung bình 62,5±7,7% 95 3.5.2.3 Kết đo hoạt độ enzyme ALT, CK Pompe bệnh thiếu enzyme GAA dẫn đến ứ đọng glycogen tế bào cơ, gây tổn thương ALT (Alanin transaminase) CK (Creatin kinase) enzyme có nhiều tế bào Với người bệnh Pompe, ứ đọng glycogen tiêu thể tế bào gây tổn thương với mức độ khác Kết đo hoạt độ CK ALT thể qua bảng 3.18 Bảng 3.18: Kết hoạt độ enzyme CK, ALT người bệnh nghiên cứu Mã số người Hoạt độ CK (U/L) Hoạt độ ALT (U/L) bệnh Ref 0,05 Điều cho thấy độ tuổi không ảnh hưởng đến hoạt độ enzyme Hoạt độ enzyme cao hay thấp tuỳ thuộc vào tình trạng người bệnh Độ tuổi từ 20 – 30 tuổi hoạt độ enzyme có xu hướng thấp, nhiên số lượng mẫu ít, khơng đủ điều kiện để khẳng định hoạt độ enzyme nhóm tuổi suy giảm độ tuổi, để có kết luận xác vấn đề cần có nghiên cứu tiếp với số lượng mẫu lớn Mẫu đột biến FB 64 mẫu có hoạt độ enzyme GLA 0,17µmol/h/l, thấp số 26 mẫu giải trình tự Như hoạt độ enzyme người bện có xu hướng giảm mạnh mẫu có đột biến vùng khơng mã hóa, intron, UTR mẫu khơng có đột biến, nhiên số lượng mẫu bệnh cịn nên số liệu chưa có ý nghĩa thống kê Về giới tính đối tượng tham gia nghiên cứu: 97% đối tượng tham gia nghiên cứu nam, số 26 người bệnh có hoạt độ enzyme thấp 98 giải trình tự, tỷ lệ nam chiếm đa số Điều phù hợp với quy luật di truyền liên kết NST giới tính X Fabry 4.1.2 Đặc điểm chung tuổi giới bệnh Pompe Kết nghiên cứu tuổi khởi phát người bệnh nghiên cứu sớm, có tới 13/14 người bệnh (92,8%) xuất triệu chứng tuổi Chỉ có người bệnh khởi phát 17 tháng Như phần lớn người bệnh nghiên cứu thể khởi phát sớm (Infant onset Pompe disease – IOPD) Tuổi khởi phát trung bình người bệnh nghiên cứu 5±4,2 tháng, kết phù hợp với công bố trước IOPD tuổi khởi phát thường khoảng tháng, tuổi chẩn đoán thường tháng.128 Đặc điểm giới: tỷ lệ nam: nữ nghiên cứu 1:1 Điều hồn tồn phù hợp Pompe bệnh di truyền gen lặn nhiễm sắc thể thường nên khác giới tính 4.2 Biến đổi hoạt độ enzyme GLA, GAA người bệnh tham gia nghiên cứu Hai enzyme GLA GAA enzyme đặc hiệu bệnh Fabry Pompe Trong nghiên cứu hoạt độ enzyme đo từ mẫu máu giấy thấm khô, phương pháp đo khối phổ song song 4.2.1 Hoạt độ enzyme GLA Hoạt độ GLA người bệnh nghiên cứu (1,87±0,94 μmol/h/L), thấp nhiều so dải tham chiếu Đài Loan (2,05-7,46 μmol/h/L) Sau chuẩn hóa tồn quy trình, chúng tơi cho dải tham chiếu người Việt Nam thấp so với người Đài Loan Tuy nhiên, phạm vi nghiên cứu lấy mẫu người bệnh có phì đại tim chưa rõ ngun nhân nên chưa thể kết luận được, để khẳng định điều địi hỏi có nghiên cứu với cỡ mẫu lớn mẫu có tính đại diện 99 So sánh với số nghiên cứu khác giới nhận thấy kết xác định hoạt độ enzyme GLA có khác biệt Năm 1995, Nakao cộng sàng lọc bệnh Fabry 230 người bệnh nam phì đại thất trái, hoạt độ enzyme nhóm người bệnh từ 4,5 – 17,6 µmol/h/L (mean ± SD 8,5 ± 2,4 µmol/h/L).124 Năm 2002, B Sachdev cộng sàng lọc bệnh Fabry dựa vào hoạt độ enzyme GLA 147 người bệnh nam phì đại tim khởi phát muộn, kết cho thấy hoạt độ enzyme nhóm người bệnh từ 2,3 – 25 µmol/h/L (mean ± SD 7,4 ± 2,7 µmol/h/L).129 Các kết cao nhiều so với kết nghiên cứu chúng tơi Điều phương pháp xác định hoạt độ enzyme GLA khác Nhóm nghiên cứu Nakao B Sachdev sử dụng phương pháp đo huỳnh quang chuẩn với chất 4-methylumbelliferylaDgalactopyranoside (Sigma) để xác định hoạt độ enzyme GLA Theo nghiên cứu Liao cộng năm 2014, phương pháp xác định hoạt độ số enzyme có enzyme GLA sắc ký lỏng kết hợp đo khối phổ song song (LC – MS/ MS) ưu việt cho kết xác phương pháp đo huỳnh quang.130 Người bệnh mã số FB64 người bệnh nam 56 tuổi, có mang đột biến gen có hoạt độ enzyme GLA 0,17 µmol/h/L Trong gia đình người bệnh người Đài Loan có mẹ người Việt Nam tham gia nghiên cứu này, ông ngoại người bệnh (đối tượng mã số VN.06) nam, 62 tuổi, có hoạt độ enzyme 0,6 µmol/h/l Có thể thấy dù nam giới, độ tuổi tương đương nhau, mang loại đột biến hoạt độ enzyme thành viên không giống Trong nghiên cứu D Zemáneket (2022), có người bệnh nam mang đột biến có độ tuổi tương đương có khác hoạt độ enzyme (dao động từ 0,3-0,7 µmol/h/l).127 100 4.2.2 Hoạt độ enzyme GAA người bệnh nghi ngờ Pompe Khi đo hoạt độ enzyme GAA người bệnh nghiên cứu, chúng tơi nhận thấy tất người bệnh có hoạt độ enzyme GAA thấp giá trị tham chiếu, với giá trị 0,91 ±1,26 µmol/h/L Trong có người bệnh có hoạt độ enzyme thấp 3% so với giá trị tham chiếu Các người bệnh xuất triệu chứng trước tháng tuổi Điều hồn tồn phù hợp với mơ tả nghiên cứu trước đây; với IOPD, hoạt độ GAA A, đột biến intron xuất với tần số cao (có thể lên tới 1/1600 trẻ sơ sinh) Đột biến chủ yếu gặp khu vực châu Á Trung Quốc, Đài Loan, Nhật Bản xác định ảnh hưởng đến hoạt độ enzyme GLA có liên quan đến bệnh tim khởi phát muộn.131,34 Do đó, chúng tơi lựa chọn khuếch đại xác định trình tự exon đoạn intron để phát bất thường gen GLA số mẫu có hoạt độ enzyme GLAgiảm mạnh Trong số 26 người bệnh phì đại tim có hoạt độ enzyme thấp giải trình tự gen, có mẫu FB64 có đột biến vùng mã hố acid amin thuộc exon Đó đột biến điểm vị trí nucleotide 178 thay C T dẫn tới thay đổi acid amin thứ 60 từ Proline thành Serine Đây đột biến chưa công bố y văn Như vậy, tỉ lệ đột biến gen GLA gây bệnh Fabry nhóm người bệnh phì đại tim nghiên cứu 1/433 Đột biến đột biến tìm thấy người bệnh mã số VN.06, người Đài Loan có mẹ người Việt Nam, phát qua chương trình sàng lọc sơ sinh Đài Loan Trong nghiên cứu năm 2007, nghiên cứu 331 đột biến gen GLA gây bệnh Fabry, Garman phần lớn đột biến sai nghĩa gây bệnh Fabry không phân bố xung quanh vùng hoạt động enzyme GLA mà chúng tạo thay đổi lõi kỵ nước phân tử enzyme GLA, làm ảnh hưởng đến trình gấp protein enzyme.132 Đột biến c.178C>T, p.Pro60Ser làm thay acid amin Proline- acid amin phân cực, acid amin Serin – acid amin khơng phân cực, điều ảnh hưởng đến gấp nếp cấu trúc phân tử GLA, từ ảnh hưởng đến q trình hồn thiện hoạt động GLA gây biểu Fabry Các 102 phần mềm tin sinh học SIFT, MutationTaster PolyPhen-2 dự đoán đột biến có khả gây bệnh Trong Fabry, ứ đọng Gb3 tiêu thể liên quan đến triệu chứng lâm sàng chưa thực sáng tỏ, nhiên, giả thuyết đưa ứ đọng gây giảm thơng lượng đại thực bào (autophagic flux)133- quan sát thấy nguyên bào sợi, hay gây rối loạn chức lưới nội sinh chất – thể qua không gấp nếp (unfolding) protein tiêu thể.134 Trong Fabry có phá vỡ đường tự thực bào tiêu thể (ALP- Autophagy Lysosome Pathway), đường tái chế quan trọng làm trung gian cho sống tế bào Trong nghiên cứu Nakao cộng năm 1995 230 người bệnh nam phì đại tim phát đột biến gen GLA vùng mã hoá acid amin thuộc exon exon 6, có người bệnh khơng có đột biến vùng mã hố acid amin có α-galactosidase mRNA giảm rõ rệt so với bình thường Cả người bệnh biểu đặc điểm bệnh Fabry khơng điển hình.124 Năm 2002, B Sachdev cộng nghiên cứu 153 người bệnh nam phì đại tim khởi phát muộn phát người bệnh bị đột biến gen GLA với dạng đột biến khác gồm đột biến thay đột biến nucleotide.129 Năm 2011, Albert A Hagege cộng sàng lọc 392 người bệnh phì đại tim phát đột biến gen GLA.126 Năm 2010, Ole Havndrup nghiên cứu 90 đối tượng người thân họ, nhóm tác giả loại trừ 31 trường hợp có đột biến gen sarcomer, 59 trường hợp lại họ phát đột biến gen GLA.125 Nghiên cứu Maron năm 2018 585 người bệnh phì đại tim phát 02 người bệnh mang đột biến gen GLA mà khơng có biểu lâm sàng Fabry.135 Trong nghiên cứu công bố D Zemáneket cộng năm 2022 phát người bệnh có đột biến gen GLA sàng lọc 589 người bệnh phì đại tim chưa rõ nguyên nhân.127 103 Như tỉ lệ đột biến gen GLA sàng lọc người bệnh phì đại tim nghiên cứu khác Điều tần suất mang gen đột biến khác dân tộc, quốc gia, khác biệt tiêu chuẩn thu thập mẫu nghiên cứu hay số lượng mẫu Ngồi đột biến vùng mã hố acid amin exon 1, chúng tơi cịn nhận thấy có dạng đột biến IVS 5’UTR xuất với tần số cao, biến thể 5’UTR-10C>T 5’UTR-12G>A ghi nhận SNP gen GLA Có tới 15/26 mẫu mang dạng đột biến Chúng nhận thấy người bệnh mang 1, hay loại đột biến có hoạt độ enzyme khơng thấp so với người bệnh không mang đột biến nhóm giải trình tự gen Các biến thể IVS phát nghiên cứu chưa công bố gây bệnh sở liệu đột biến chỗ nối gen GLA Có thể đột biến xảy vùng intron vùng 5'UTR vùng DNA không tham gia vào trình giải mã protein, cụ thể enzyme GLA Tuy nhiên khoa học ngày phát triển vai trị nhiều trình tự DNA cịn bí ẩn với hiểu biết người, đột biến có ảnh hưởng đến kiểu hình cá thể hay khơng cần có nghiên cứu thêm Người bệnh mã số FB64 có đột biến c.178 C>T, p.Pro60Serin, có biểu lâm sàng nhẹ, đối tượng nghiên cứu khác có đột biến chưa có biểu lâm sàng thời điểm nghiên cứu, nên dự đốn đột biến liên quan đến Fabry thể khơng điển hình 4.3.2 Các đột biến gen GAA Đối tượng nghiên cứu gồm 14 người bệnh chẩn đoán Pompe 70 thành viên gia đình người bệnh mang đột biến Các người bệnh tham gia nghiên cứu thực vấn, lấy mẫu xử lý số liệu để phát biến đổi gen GAA đặc 104 điểm lâm sàng, cận lâm sàng người bệnh theo sơ đồ nghiên cứu Toàn trình tuân thủ tuyệt đối theo quy trình chuẩn hóa Trong q trình thực hiện, giai đoạn tách chiết DNA từ máu toàn phần khâu đầu tiên, nhằm cung cấp nguyên liệu để thực bước Chính thế, số lượng chất lượng DNA sau tách chiết quan trọng Nghiên cứu sử dụng kit tách chiết hãng QIAamp (Đức) Ưu điểm việc sử dụng kit quy trình đơn giản, dễ thực hiện, thu kết DNA đồng có độ tinh cao Bước khuếch đại đoạn DNA đích với cặp mồi đặc hiệu Nhưng cặp mồi thiết kế tuân thủ theo nguyên tắc thiết kế mồi đối chiếu GeneBank Sản phẩm PCR sau khuếch đại tiến hành điện di sản phẩm, việc đánh giá cặp mồi thiết kế đặc hiệu thơng qua hình ảnh điện di gel agarose Các vạch điện di rõ nét, kích thước sản phẩm theo chứng dương, khơng có sản phẩm phụ Đột biến hay gặp liên quan đến gen GAA dạng đột biến điểm (trên 90%) có khoảng 4% đột biến đoạn lớn Do đó, kỹ thuật sử dụng nghiên cứu giải trình tự gen theo phương pháp Sanger Ưu điểm phương pháp cho phép phát đột biến điểm, giá thành rẻ, dễ thực Kết giải trình tự gen phân tích trực tiếp phần mềm hỗ trợ so sánh với trình tự gốc GeneBank Các đột biến phát nghiên cứu tra cứu trực tiếp hệ thống liệu sẵn có để xác định đột biến công bố tiềm gây bệnh đột biến Cho đến đột biến gen GAA xác định nguyên nhân gây bệnh Pompe Gen GAA mã hóa protein alpha glucosidase A, nằm NST 17, vị trí 17q25.3, gồm 20 exon 19 intron Theo cập nhật https://www.hgmd.cf.ac.uk/ đến tháng năm 2021 có 779 đột biến gây bệnh mô tả bệnh Pompe đột biến nằm 105 rải rác toàn chiều dài gen GAA, bao gồm exon intron Tất loại đột biến báo cáo, thường gặp đột biến sai nghĩa, sau đột biến xóa đoạn nhỏ Các đột biến thường có tính cá nhân, tìm thấy số gia đình, nhiên, đột biến chỗ nối c.-32-13T> G phổ biến người bệnh LOPD gốc da trắng, với tần số alen dao động từ 40% đến 70%.92 Nghiên cứu tiến hành 14 người bệnh chẩn đoán lâm sàng mắc bệnh Pompe, thực giải trình tự 19 exon (mồi thiết kế cho 19 exon bao trùm vùng mã hóa vùng nối intron với exon) gen GAA, với 10 đột biến tìm thấy exon 3, exon 9, exon 14, exon 15, exon 20 intron 14, bao gồm đột biến sai nghĩa, đột biến dịch khung đột biên chỗ nối, có đột biến cơng bố gây bệnh Pompe có đột biến chưa báo cáo Enzyme GAA tổng hợp lưới nội sinh chất (ER) dạng tiền chất có trọng lượng phân tử 110 kDa, vận chuyển đến tiêu thể sau trải qua nhiều biến đổi sau dịch mã; hoạt động enzyme tăng lên q trình Q trình glycosyl hóa gấp nếp thích hợp ER quan trọng để vận chuyển đến thể Golgi, nơi enzyme gắn với mannose 6-phosphate (M6P), tín hiệu để vận chuyển đến tiêu thể Q trình phosphoryl hóa thơng qua việc bổ sung nhóm M6P điều kiện tiên để liên kết enzyme với thụ thể mannose 6-phosphate (M6PR) Enzyme gắn M6PR chứa túi vận chuyển từ thể Golgi đến tiêu thể, nơi enzyme phân ly khỏi thụ thể Sau đó, enzyme vận chuyển vào tiêu thể, thụ thể quay trở lại để tiếp tục chu kỳ Trên đường đến tiêu thể, enzyme bị phân cắt protein đầu amino tận carboxyl tận, q trình quan trọng hoạt hóa xúc tác enzyme 106 Các đột biến phân bố khắp gen ảnh hưởng đến bước khác trình phức tạp tạo phân tử GAA đầy đủ chức bao gồm tổng hợp protein, sửa chữa sau dịch mã, vận chuyển trưởng thành tiêu thể.118 Hình 4.1: Các miền cấu trúc enzyme GAA (nguồn: https://hal.archives-ouvertes.fr/hal-03158352/document) Enzyme GAA cấu tạo năm miền: miền P-Trefoil (các acid amin từ 89–135), miền β-sheet đầu tận N (các acid amin từ 136–346), miền xúc tác GH31 (β / α) (các acid amin từ 347–723), bao gồm miền insert (gồm acid amin từ 444–491) miền insert (gồm acid amin từ 522–567), miền βsheet gần (các acid amin từ 724–818) miền βsheet xa (các acid amin từ 819–952) Mỗi miền có vai trị khác q trình vận chuyển, trưởng thành hoạt động xúc tác enzyme GAA, đột biến miền khác gây hậu khác Nghiên cứu Kanako Sugawara cộng năm 2009 cho thấy thay acid amin gây lỗi trình trưởng thành vận chuyển enzyme GAA gây bệnh Pompe tìm thấy tất năm miền enzyme Chúng phân bố từ lõi đến bề mặt phân tử enzyme, thay đổi cấu trúc dự đoán thay đổi từ lớn đến nhỏ.136 Trong nghiên cứu phát 10 đột biến (gồm đột biến sai nghĩa, đột biến dịch khung, đột biến chỗ nối) SNP 107 Đột biến sai nghĩa c.1933G>C (p.Asp645His) Đột biến đột biến có tần suất xuất cao nghiên cứu (7/14 trường hợp, chiếm 50%) Mặc dù phần lớn đột biến gen GAA mang tính cá nhân, gặp gia đình cộng đồng nhỏ, có vài đột biến phổ biến tìm thấy chủng tộc định, ví dụ đột biến c.-32-13T> G (IVS1) đột biến phổ biến người da trắng; c.del525, del exon18 c.925G> A (p.Gly309Arg) đột biến phổ biến người Hà Lan, tìm thấy quần thể khác; đột biến c.1935C> A (p.Asp645Glu) đột biến thường gặp người Trung Quốc Đài Loan118… Đột biến c.1933 biến đổi G thành C, làm thay đổi acid amin Aspartat thành Histidin vị trí p.645 exon 14 Đột biến thuộc vùng bảo tồn cao gen GAA Các nghiên cứu báo cáo số đột biến điểm xung quanh vị trí exon 14 từ nucleotid vị trí 1927 đến 1941 Vùng bảo tồn khơng có vai trị quan trọng chức gen mà vùng có nguy đột biến cao Sự biến đổi aspartat thành histidin vị trí p.645 vùng xúc tác enzyme GAA, chứng minh làm giảm đáng kể hoạt tính enzyme GAA, người bệnh có đột biến đồng hợp tử có biểu kiểu hình nặng.112,137 Theo https://erepo.clinicalgenome.org/ đột biến báo cáo 11 cá thể có giảm hoạt độ GAA, cá thể đồng hợp tử chẩn đoán IOPD Nghiên cứu Lukana Thái Lan năm 2019 12 người bệnh IOPD báo cáo đột biến này.122 Các nghiên cứu trước báo cáo trường hợp người bệnh mang đột biến c.1933 G>C, (p.Asp645His) thể dị hợp tử kết hợp với số đột biến khác có biểu bệnh Pompe thể khởi phát sớm thể khởi phát muộn Theo sở liệu bệnh Pompe https://www.pompevariantdatabase.nl/ đột biến tìm thấy người bệnh IOPD thể đồng hợp tử 112,137 dị 108 hợp tử kết hợp với đột biến alen khác đột biến c.1933G>C hay đột biến c.1411-1414del nghiên cứu Lukana năm 2019.122 Trong nghiên cứu này, đột biến c.1933 G>C (p.Asp645His) tìm thấy người bệnh khác nhau, đơn độc (Pom 16.0, Pom17.0 Pom22.0) kết hợp với đột biến khác (Pom11.0, Pom12.0, Pom14.0 Pom18.0) Các người bệnh mang đột biến thể đồng hợp tử biểu IOPD với hoạt độ enzyme lại thấp, 0.23; 0.32 0.08 µmol/h/L Người bệnh mã số Pom.11 mang đồng thời đột biến vị trí c.1933 c.1933G>C (p.Asp645His) c.1933G>A (p.Asp645Asn), thể dị hợp tử c.1933G>A (p.Asp645Asn) báo cáo đột biến gây bệnh Pompe nhiều nghiên cứu, thể đồng hợp tử hay dị hợp tử mà có kết hợp với đột biến khác Sự kết hợp đột biến gây IOPD LOPD, tùy theo dạng đột biến alen thứ Sự kết hợp với đột biến khác mô tả người bệnh IOPD nghiên cứu khác như: kết hợp với đột biến c.1935C>A (p.Asp645Glu) hay với đột biến c.1411_1414del (p.Glu471Profs) exon gây IOPD với tuổi khởi phát sớm tháng tháng tuổi.122 Tuy nhiên, kết hợp với đột biến c.1933G>C (p.Asp645His) lại chưa báo cáo Người bệnh mã số Pom11.0 mang đồng thời đột biến chẩn đoán IOPD, có hoạt độ enzyme GAA thấp (0.13μmol/h/L C (p.Asp645His) đồng thời với đột biến c.736delT (p.Leu246fs*22) exon Theo Clinvar đột biến làm nucleotid T vị trí c.736, tạo tín hiệu dừng sớm dịch mã, dẫn đến không tổng hợp enzyme GAA tổng hợp protein bị gián đoạn, gây 109 Pompe, coi đột biến gây bệnh Đột biến tìm thấy người bệnh với đột biến thứ c.546G>A.119 Đột biến c.1933G>C gặp người bệnh mã số Pom18.0, với đột biến c.2173C>T (p.Arg725Trp) exon 15 Cả đột biến thể dị hợp tử Đột biến c.2173C>T (p.Arg725Trp) báo cáo đột biến có khả gây bệnh (likely pathogenic) trẻ lớn người trưởng thành kết hợp với đột biến khác nhau, ảnh hưởng đến trình vận chuyển trưởng thành enzyme GAA.56 Tuy nhiên, chưa có trường hợp báo cáo đột biến kết hợp với đột biến c.1933G>C (p.Asp645His) Về biểu lâm sàng, người bệnh có hoạt độ enzyme cịn tương đối cao (4.04 µmol/h/L) khởi phát 11 tháng tuổi Đột biến sai nghĩa c.625T>C (p.Tyr209His) Đột biến có tần suất xuất cao thứ nghiên cứu với 4/14 trường hợp Đột biến vị trí c.625 biến đổi T thành C, làm thay đổi acid amin Tyrosin thành Histidin vị trí p.209 exon Đây đột biến chưa báo cáo sở liệu đột biến gen GAA Đột biến c.625T>C (p.Tyr209His) thuộc miền β-sheet đầu tận N, chịu trách nhiệm xử lý phân giải peptid tín hiệu,138 đột biến ảnh hưởng đến q trình vận chuyển tiền chất vào tiêu thể, từ ảnh hưởng đến q trình tổng hợp enzyme Các cơng cụ SIFT, MutationTaster PolyPhen-2 dự đốn đột biến có khả gây bệnh Đột biến gặp người bệnh mã số Pom8.0, Pom10.0 Pom21.0 thể dị hợp tử kép, đặc biệt, người bệnh mã số Pom8.0 Pom10.0 có kiểu gen giống hệt người bệnh có hoạt độ enzyme GAA tuổi khởi phát khác nhau, cần có nghiên cứu thực nghiệm để chứng minh chế gây bệnh đột biến 110 Các đột biến sai nghĩa khác Trong nghiên cứu chúng tơi cịn tìm thấy đột biến sai nghĩa khác c.1735G>A (p.Glu579Lys) Đột biến thay nucleotid G vị trí c.1735 exon 14 nucleotid A, dẫn đến thay acid amin Glutamat acid amin Lysin Trong nghiên cứu Herman năm 1993 trường hợp Pompe thể trưởng thành mô tả đột biến đột biến gây giảm vận chuyển nội bào trình trưởng thành enzyme GAA mà không gây ảnh hưởng đến trình tổng hợp tiền chất enzyme này.56 Đột biến c.2563 G>C (p.Gly855Arg) Đột biến có thay nucleotid G thành C vị trí c.2563 dẫn đến thay acid amin Glycin acid amin Arginin vị trí p.855 exon 18 Đột biến điểm thể dị hợp tử tìm thấy người bệnh mắc bệnh Pompe với đột biến c.111A>T nghiên cứu Xi Chen cộng 25 bệnh nhi mắc bệnh Pompe thể khởi phát sớm Đài Loan,123 nhiên đột biến phân loại gây bệnh chế liên quan đến giảm hoạt độ enzyme hay triệu chứng lâm sàng người bệnh chưa thật rõ ràng SNP c.2065 G>A (p.E689K) Khi giải trình tự gen từ tế bào dịch ối nuôi cấy đối tượng mã số VN.0056.1.1 thu SNP c.2065 G>A (p.E689K) thể dị dợp tử Biến thể thường gặp người châu Á (Nhật Bản Trung Quốc) gặp Châu Âu hay vùng khác Biến thể ghi nhận lành tính Đột biến vị trí nối c.2040+1G>T Các nghiên cứu trước đột biến vị trí nối (splicing) gây giảm hoạt độ enzyme GAA máu, liên quan đến biểu 111 lâm sàng bệnh Pompe, ví dụ nghiên cứu Stefiana Zampieri cộng năm 2011.139 Những đột biến dẫn đến việc bỏ qua hồn tồn exon, giữ lại intron tạo vị trí mối nối exon intron Đôi đột biến khơng làm gián đoạn tạo vị trí nối mà kích hoạt vị trí nối giả tồn từ trước, điều phù hợp với giả thuyết cho intron chứa trình tự ức chế tạo mối nối Những đột biến ảnh hưởng đến cân đồng dạng (isoform) tạo exon nối liền gây bệnh.140 Đột biến c.2040+1G>T vị trí nối intron 14 tìm thấy người bệnh mã số Pom12.0 lại mang đồng thời với đột biến c.1933G> C(p.Asp645His) thể dị hợp tử Đột biến c.2040+1G>T xác nhận đột biến gây bệnh Pompe nghiên cứu Đài Loan Huang HP cộng năm 2011120 YH Chien cộng năm 2015121 bệnh nhi mắc bệnh Pompe thể khởi phát sớm Đột biến xảy vị trí nối dự đoán gây gián đoạn trình nối RNA, dẫn đến khơng tổng hợp protein tổng hợp protein sai lệch, điều dẫn đến chức enzyme GAA nguyên nhân gây bệnh Pompe Đặc biệt, diện đột biến kết hợp với đột biến khác tăng nguy gây biểu lâm sàng nặng người bệnh Pompe.141 Người bệnh mã số Pom12.0 mang đồng thời đột biến đột biến c.1933 G>C; p.Asp645His, có hoạt độ enzyme thấp (0.082 µmol/h/L) khởi phát tháng tuổi, phù hợp với triệu chứng lâm sàng thể khởi phát sớm Đột biến c.2040+1G>C đột biến tìm thấy chúng tơi tiến hành chẩn đốn trước sinh cho thai phụ mã số VN.0055.1, có Pompe thể khởi phát sớm Khi phân tích trình tự gen vợ chồng mã số VN.0055.0 0055.1 thu đột biến thể dị hợp tử Do đó, cặp vợ chồng mang đột biến c.2040+1 G>C 112 thể đồng hợp tử nên có mắc IOPD với triệu chứng lâm sàng xuất sớm (5,5 tháng tuổi), nặng dẫn đến người bệnh tử vong sớm (khi tháng tuổi) Trong đột biến gen GAA gây bệnh Pompe đột biến vị trí nối thường gặp, đứng thứ sau đột biến điểm (sai nghĩa, vô nghĩa) đột biến xóa đoạn nhỏ Trong nghiên cứu tần suất xuất đột biến không cao, tính cá nhân chủng tộc đột biến gen GAA cỡ mẫu nghiên cứu nhỏ Các đột biến dịch khung Khi phân tích trình tự gen đối tượng tham gia nghiên cứu, thu đột biến dịch khung c 1411-1414 del (p.Glu471Profs*5) c.2818-2819delTCinsCAG (p.Ser940fs*22) Đột biến c.1411-1414delGAGA (p.Glu471Profs*5) báo cáo đột biến gây bệnh nhiều nghiên cứu trước kết hợp với đột biến khác nghiên cứu JJ Shielh cộng năm 1996,142 nghiên cứu Lukanua năm 2019122 Sự xóa nucleotid vị trí c.14111414 dự đốn gây dịch khung sau codon 471, dẫn đến xuất tín hiệu kết thúc sớm kết tổng hợp protein bị cắt ngắn gồm 474 acid amin Protein bị cắt ngắn thiếu vị trí xúc tác GAA, nằm codon 516520,138 làm giảm hoạt động GAA Trong nghiên cứu chúng tôi, người bệnh mã số Pom20 mang đột biến thể dị hợp tử, kết hợp với đột biến c.1735G>A (dị hợp), có hoạt độ enzyme thấp (T, p.Pro60Serin Kết phù hợp với quy luật di truyền bệnh Fabry di truyền gen lặn NST X: mẹ truyền cho trai, gen bệnh NST X bố truyền cho gái Điều đáng nói đột biến đột biến chưa công bố y văn.145 114 Cụ ngoại (VN.01), mẹ (VN.05) dì người bệnh (VN.07) mang đột biến gen GLA cụ ngoại mẹ có hoạt độ enzyme GLA giới hạn bình thường, dì người bệnh lại có hoạt độ enzyme thấp giá trị bình thường Điều giải thích bất hoạt ngẫu nhiên NST X.144,146,147 Như vậy, ghi nhận đột biến 7/9 thành viên gia đình, với mẹ cụ ngoại người lành mang gen Đột biến làm giảm hoạt độ enzyme tất các người bệnh nam số người bệnh nữ Tuy nhiên, thời điểm nghiên cứu, thành viên gia đình chưa có biểu bệnh Chúng tơi đưa tư vấn di truyền cho thành viên gia đình: bệnh Fabry di truyền liên kết NST X, mẹ dì người bệnh mang đột biến truyền cho trai, gái người mang gen, mẹ dì sinh thêm nên làm chẩn đốn trước sinh Người bệnh (VN.06) em trai họ (mã số VN.08 VN.09) dì (mã số VN.07) mang gen bệnh, có giảm hoạt độ enzyme chưa có biểu bệnh nên cần theo dõi sát bất thường cơ, tim để kịp thời phát điều trị triệu chứng cần, đồng thời, trưởng thành nên sinh trai để không di truyền gen bệnh 4.4.2 Phát người lành mang gen thành viên gia đình người bệnh Pompe Cơ chế gây bệnh Pompe đột biến gen lặn nằm NST thường chi phối, tỷ lệ đột biến trạng thái dị hợp (người lành mang gen) cao tỷ lệ mắc bệnh nhiều Người mang đột biến gen dị hợp tử thường không biểu bệnh có khả di truyền gen bệnh cho hệ sau Lập phả hệ gia đình người bệnh Pompe bước vô quan trọng việc tư vấn di truyền thành viên gia đình Mặc dù bệnh di truyền lặn nhiễm sắc thể thường, xác suất sinh bị bệnh theo lý thuyết gia đình mà bố mẹ người mang gen (dị 115 hợp tử) 25%, thực tế gia đình chúng tơi nghiên cứu có gia đình lần đẻ con, bị bệnh Vì việc phát người lành mang gen bệnh giúp cho tư vấn di truyền để họ sinh đứa trẻ khỏe mạnh (không mang gen/ người mang gen dị hợp tử) Ngoài việc phân tích liệu di truyền phả hệ gia đình cách tiếp cận việc đánh giá đột biến sai nghĩa gen GAA Sau phát đột biến gen GAA người bệnh cụ thể gọi đột biến đích, chúng tơi tiếp tục khuếch đại đoạn exon có chứa đột biến đích thành viên có quan hệ huyết thống với người bệnh Nghiên cứu thu thập 70 mẫu thành viên gia đình người bệnh Pompe mang đột biến gen Gia đình người bệnh mã số Pom16 Gia đình người bệnh mã số Pom16 có 14 thành viên tham gia nghiên cứu Người bệnh mã số Pom16 mang đột biến c.1933G>C (p.Asp645His) exon 14, thể đồng hợp tử Đây đột biến gây bệnh IOPD báo cáo nghiên cứu trước đây.137,148 Khi phân tích gen thành viên gia đình, chúng tơi nhận thấy 10/14 thành viên gia đình có đột biến thể dị hợp tử, gồm ơng nội, ơng ngoại, bác, bố, mẹ, dì, cậu, chị họ em họ người bệnh Có thể thấy đột biến di truyền từ hệ I (ông nội, ông ngoại) cho hệ II (bác, bố, mẹ, dì, cậu), từ hệ II truyền cho hệ III (người bệnh chị họ, em họ) Tuy nhiên, có người bệnh mang đột biến thể đồng hợp tử, thành viên khác mang đột biến thể dị hợp tử, khơng có biểu bệnh thời điểm nghiên cứu nên coi người lành mang gen Điều phù hợp với quy luật di truyền gen lặn liên kết NST thường, người đồng hợp tử biểu bệnh Với thành viên gia đình mang đột biến gen thể dị hợp tử, đưa tư vấn cho thành viên này: với thành viên chưa kết hôn (cậu, chị họ em họ người bệnh), cần làm xét nghiệm giải trình tự 116 gen GAA để phát đột biến (nếu có) đối tượng kết hôn Với cặp vợ chồng có người mang gen vợ chồng bác, dì cần làm xét nghiệm cho (nếu có) để phát người lành mang gen Riêng bố mẹ người bệnh, mang đột biến thể dị hợp tử, nên theo quy luật di truyền Menden, xác suất 25% cho lần mang thai sinh bị bệnh, 50% sinh người lành mang gen 25% sinh không mang gen bệnh, nên lần mang thai sau làm xét nghiệm tiền làm tổ để chọn lọc phôi, xét nghiệm sàng lọc trước sinh để hạn chế sinh đứa trẻ bị bệnh Gia đình người bệnh mã số Pom17 Gia đình người bệnh mã số Pom17 có 10 thành viên tham gia nghiên cứu Người bệnh mã số Pom17 mang đột biến c.1933G>C (p.Asp645His) exon 14, thể đồng hợp tử, giống đột biến tìm thấy người bệnh Pom16 Khi phân tích gen thành viên gia đình, chúng tơi nhận thấy 6/10 thành viên gia đình có đột biến thể dị hợp tử, gồm ông nội, ông ngoại, bác, bố, mẹ, dì người bệnh Có thể thấy đột biến di truyền từ hệ I (ông nội, ông ngoại) cho hệ II (bác, bố, mẹ, dì), từ hệ II truyền cho hệ III (người bệnh Pom17) Tuy nhiên, có người bệnh mang đột biến thể đồng hợp tử, thành viên khác mang đột biến thể dị hợp tử, không biểu bệnh thời điểm nghiên cứu nên xác định người lành mang gen Điều phù hợp với quy luật di truyền gen lặn liên kết NST thường, người đồng hợp tử biểu bệnh Với thành viên gia đình mang đột biến gen thể dị hợp tử, đưa tư vấn cho thành viên này: với thành viên chưa kết hôn (dì người bệnh), cần làm xét nghiệm giải trình tự gen GAA để phát đột biến (nếu có) đối tượng kết hôn Vợ chồng người bác có người mang gen, theo quy luật di truyền Menden xác suất cho 117 lần mang thai 25% sinh mang gen bênh, cần làm xét nghiệm cho (nếu có) để phát người lành mang gen Riêng bố mẹ người bệnh, mang đột biến thể dị hợp tử, nên có xác suất 25% cho lần mang thai sinh bị bệnh, 50% sinh người lành mang gen 25% sinh không mang gen bệnh, nên lần mang thai sau làm xét nghiệm tiền làm tổ để chọn lọc phôi, xét nghiệm sàng lọc trước sinh để hạn chế sinh đứa trẻ bị bệnh Gia đình người bệnh mã số Pom18 Gia đình người bệnh mã số Pom18 có 07 thành viên tham gia nghiên cứu Người bệnh mã số Pom18 mang đồng thời đột biến c.1933G>C (p.Asp645His) exon 14, và đột biến c.2173C>T (p.Arg725Trp) exon 15 thể dị hợp tử Cả đột biến báo cáo đột biến gây bệnh thể đồng hợp tử dị hợp tử mà kết hợp với đột biến khác Khi phân tích gen thành viên gia đình, chúng tơi nhận thấy 5/7 thành viên gia đình có đột biến: bà nội bố mang đột biến c.2173C>T (p.Arg725Trp) dị hợp tử, ông nội, ông ngoại mẹ người bệnh mang đột biến c.1933G>C (p.Asp645His) Đột biến c.1933G>C ghi nhận đột biến gây bệnh Pompe, đột biến c.2173C>T ghi nhận đột biến gây bệnh (likeky pathogenic) Có thể thấy đột biến c.2173C>T (p.Arg725Trp) di truyền từ bà nội cho bố từ bố truyền cho người bệnh Đột biến c.1933G>C (p.Asp645His) di truyền từ ông ngoại cho mẹ, từ mẹ truyền cho người bệnh Người bệnh nhận đột biến từ gia đình bênh ngoại bênh nội, thể dị hợp tử nên có biểu bệnh Rất nhiều nghiên cứu trước mô tả trường hợp người bệnh Pompe mang đột biến dị hợp tử có biểu bệnh với mức độ khác Trong nghiên cứu Lukana cộng năm 2019 tìm thấy đột biến c.1933G>C kết hợp với đột biến c.1935C>A (p.Asp645Glu) đột biến c.1411_1414del (p.Glu471Profs) 118 người bệnh IOPD Tuy nhiên, kết hợp với đột biến c.2173C>T (p.Arg725Try) người bệnh Pom18 chưa báo cáo Tại thời điểm nghiên cứu, thành viên lại mang đột biến thể dị hợp tử, không biểu bệnh, người lành mang gen Điều phù hợp với quy luật di truyền gen lặn liên kết NST thường, người đồng hợp tử biểu bệnh Từ kết phân tích gen, chúng tơi đưa tư vấn di truyền cho thành viên gia đình tham gia nghiên cứu Bố mẹ người bệnh mang đột biến thể dị hợp tử, nên theo quy luật di truyền Menden xác suất 25% cho lần mang thai sinh bị bệnh, 50% sinh người lành mang gen 25% sinh không mang gen bệnh (như em trai người bệnh), nên lần mang thai sau làm xét nghiệm tiền làm tổ để chọn lọc phôi, xét nghiệm sàng lọc trước sinh để hạn chế sinh đứa trẻ bị bệnh Gia đình người bệnh mã số Pom19 Gia đình người bệnh mã số Pom19 có 14 thành viên tham gia nghiên cứu Người bệnh mã số Pom19 mang đồng thời đột biến c.1735G>A (p.Glu579Lys) exon 12, đột biến c.2040+1G>T intron 14, thể dị hợp tử Khi phân tích gen thành viên gia đình, chúng tơi nhận thấy 5/12 thành viên gia đình có đột biến gồm: ông nội bố mang đột biến c.2040+1G>T thể dị hợp tử, ông ngoại, mẹ anh trai người bệnh mang đột biến c.1735G>A(p.Glu579Lys) Có thể thấy đột biến c.1735G>A (p.Glu579Lys) di truyền từ hệ I (ông ngoại) cho hệ II (mẹ), từ hệ II truyền cho hệ III (người bệnh anh trai), đột biến c.2040+1G>T di truyền từ hệ I (ông nội) cho hệ II (bố), từ hệ II truyền cho hệ III (người bệnh) Người bệnh nhận đột biến, thể dị hợp tử có biểu bệnh, thành viên khác mang đột biến thể dị hợp tử, thời điểm nghiên 119 cứu không biểu bệnh, coi người lành mang gen Điều phù hợp với quy luật di truyền gen lặn liên kết NST thường Từ kết giải trình tự gen, chúng tơi đưa tư vấn với thành viên gia đình: Bố mẹ người bệnh mang đột biến khác thể dị hợp tử, nên theo quy luật di truyền Menden xác suất 25% cho lần mang thai sinh bị bệnh (mang đồng thời đột biến dị hợp tử người bệnh), 50% sinh người lành mang gen 25% sinh không mang gen bệnh, nên lần mang thai sau làm xét nghiệm tiền làm tổ để chọn lọc phôi, xét nghiệm sàng lọc trước sinh để hạn chế sinh đứa trẻ bị bệnh Em trai người bệnh người lành mang gen bệnh, cần xét nghiệm tiền nhân Gia đình người bệnh mã số Pom20 Gia đình người bệnh mã số Pom20 có thành viên tham gia nghiên cứu Người bệnh mã số Pom20 mang đồng thời đột biến thể dị hợp tử c.14111418del (p.Glu471Profs) exon 9; c.1735G>A (p.Glu579Lys) exon 12 Khi phân tích gen thành viên gia đình, chúng tơi nhận thấy 5/9 thành viên gia đình có đột biến gồm: bà nội bố mang đột biến c.1411-1418del (p.Glu471Profs) thể dị hợp tử, bà ngoại, mẹ cậu người bệnh mang đột biến c.1735G>A (p.Glu579Lys) Có thể thấy đột biến c.1735G>A (p.Glu579Lys) di truyền từ hệ I (ông ngoại) cho hệ II (mẹ cậu), từ hệ II truyền cho hệ III (người bệnh), đột biến c.14111418del (p.Glu471Profs) di truyền từ hệ I (bà nội) cho hệ II (bố), từ hệ II truyền cho hệ III (người bệnh) Người bệnh nhận đột biến, thể dị hợp tử có biểu bệnh, cịn thành viên khác mang đột biến thể dị hợp tử thời điểm nghiên cứu khơng có biểu bệnh nên coi người lành mang gen Điều phù hợp với quy luật di truyền gen lặn liên kết NST thường 120 Từ kết giải trình tự gen, chúng tơi đưa tư vấn với thành viên gia đình: Bố mẹ người bệnh mang đột biến khác thể dị hợp tử, nên theo quy luật di truyền Menden xác suất 25% cho lần mang thai sinh bị bệnh (mang đồng thời đột biến dị hợp tử người bệnh), 50% sinh người lành mang gen 25% sinh không mang gen bệnh, nên lần mang thai sau làm xét nghiệm tiền làm tổ để chọn lọc phôi, xét nghiệm sàng lọc trước sinh để hạn chế sinh đứa trẻ bị bệnh Cậu người bệnh người lành mang gen bệnh, cần xét nghiệm tiền nhân Gia đình người bệnh mã số Pom21 Gia đình người bệnh mã số Pom21 có 13 thành viên tham gia nghiên cứu Người bệnh mã số Pom21 mang đột biến c.625T>C (p.Tyr209His) exon 3, thể đồng hợp tử Đây đột biến chưa công bố nghiên cứu trước Khi phân tích gen thành viên gia đình, chúng tơi nhận thấy 7/13 thành viên gia đình có đột biến thể dị hợp tử, gồm ông nội, ông ngoại, bác, cô, bố, mẹ, anh họ người bệnh Có thể thấy đột biến di truyền từ hệ I (ông nội, ông ngoại) cho hệ II (bác, bố, mẹ, bác, cô), từ hệ II truyền cho hệ III (người bệnh anh họ) Tuy nhiên, có người bệnh mang đột biến thể đồng hợp tử, thành viên khác mang đột biến thể dị hợp tử, thời điểm nghiên cứu không biểu bệnh nên xác định người lành mang gen Điều phù hợp với quy luật di truyền gen lặn liên kết NST thường, người đồng hợp tử biểu bệnh Với thành viên gia đình mang đột biến gen thể dị hợp tử, đưa tư vấn cho thành viên này: với thành viên chưa kết hôn (cô người bệnh), cần làm xét nghiệm giải trình tự gen GAA để phát đột biến (nếu có) đối tượng kết Với cặp vợ chồng có 121 người mang gen vợ chồng bác, dì cần làm xét nghiệm cho (nếu có) để phát người lành mang gen Riêng bố mẹ người bệnh, mang đột biến thể dị hợp tử, nên theo quy luật di truyền Menden xác suất 25% cho lần mang thai sinh bị bệnh, 50% sinh người lành mang gen 25% sinh không mang gen bệnh, nên lần mang thai sau làm xét nghiệm tiền làm tổ để chọn lọc phôi, xét nghiệm sàng lọc trước sinh để hạn chế sinh đứa trẻ bị bệnh Gia đình người bệnh mã số Pom22 Gia đình người bệnh mã số Pom22 có thành viên tham gia nghiên cứu Người bệnh mã số Pom22 mang đột biến c.1933G>C (p.Asp645His) exon 14, thể đồng hợp tử, giống đột biến tìm thấy người bệnh Pom16 Khi phân tích gen thành viên gia đình, chúng tơi nhận thấy 6/8 thành viên gia đình có đột biến thể dị hợp tử, gồm ông nội, ông ngoại, cô, bố, mẹ cậu người bệnh Có thể thấy đột biến di truyền từ hệ I (ông nội, ông ngoại) cho hệ II (cô, bố, mẹ, cậu), từ hệ II truyền cho hệ III (người bệnh Pom22) Tuy nhiên, có người bệnh mang đột biến thể đồng hợp tử, thành viên khác mang đột biến thể dị hợp tử, không biểu bệnh thời điểm nghiên cứu nên xác định người lành mang gen Điều phù hợp với quy luật di truyền gen lặn liên kết NST thường, người đồng hợp tử biểu bệnh Với thành viên gia đình mang đột biến gen thể dị hợp tử, đưa tư vấn cho thành viên này: với thành viên chưa kết hôn (cô cậu người bệnh), cần làm xét nghiệm giải trình tự gen GAA để phát đột biến (nếu có) đối tượng kết hôn Riêng bố mẹ người bệnh, mang đột biến thể dị hợp tử, nên theo quy luật di truyền Menden xác suất 25% cho lần mang thai sinh bị bệnh, 50% sinh người 122 lành mang gen 25% sinh không mang gen bệnh, nên lần mang thai sau làm xét nghiệm tiền làm tổ để chọn lọc phôi, xét nghiệm sàng lọc trước sinh để hạn chế sinh đứa trẻ bị bệnh Gia đình người bệnh mã số VN.0055 Gia đình người bệnh mã số VN.0055 gia đình có bệnh Pompe Khi có thai lần 2, thai phụ chọc ối làm chẩn đoán trước sinh, kết thai có đột biến c.2040+1G>T Có thành viên tham gia nghiên cứu Đối tượng nghiên cứu mã số VN.0055.1 mang đột biến dị hợp tử c.2040+1G>T intron 14 Khi phân tích gen thành viên gia đình, chúng tơi nhận thấy 6/8 thành viên gia đình có đột biến thể dị hợp tử, gồm bố chồng, bố đẻ, vợ chồng đối tượng nghiên cứu gái thứ Có thể thấy đột biến di truyền từ hệ I (bố chồng, bố đẻ) cho hệ II (vợ chồng đối tượng nghiên cứu), từ hệ II truyền cho hệ III (con gái Pompe gái thứ 2) Tuy nhiên, thành viên sống gia đình có mang đột biến thể dị hợp tử, không biểu bệnh thời điểm nghiên cứu nên xác định người lành mang gen Điều phù hợp với quy luật di truyền gen lặn liên kết NST thường, người đồng hợp tử biểu bệnh Với thành viên gia đình mang đột biến gen thể dị hợp tử, đưa tư vấn cho thành viên này: Do vợ chồng đối tượng nghiên mang gen bệnh thể dị hợp tử, nên theo quy luật di truyền Menden xác suất 25% cho lần mang thai sinh bị bệnh, 50% sinh người lành mang gen 25% sinh không mang gen bệnh, nên lần mang thai sau làm xét nghiệm tiền làm tổ để chọn lọc phôi, xét nghiệm sàng lọc trước sinh để hạn chế sinh đứa trẻ bị bệnh Con gái đối tượng nghiên cứu nên làm xét nghiệm tiền nhân (giải trình tự gen GAA đối tượng kết hôn để phát đột biến gen có) 123 Như vậy, qua phân tích trình tự gen gia đình có người bệnh mắc bệnh Pompe, phát 50 người lành mang gen đưa tư vấn di truyền cho đối tượng Có thể thấy, Pompe bệnh di truyền gen lặn NST thường nên tỉ lệ người lành mang gen cao tỷ lệ biểu bệnh nhiều, đo việc xác định người lành mang gen đóng vai trị quan trọng Tỷ lệ mang đột biến gia đình Trong nghiên cứu chúng tôi, tỷ lệ mang đột biến gia đình tương đối cao, dao động từ 41.6-71.4% Tất gia đình tham gia nghiên cứu có từ 50% hệ I mang đột biến gen GAA, đột biến truyền sang cho hệ II Tỷ lệ mang đột biến hệ II dao động từ 30100%, cá biệt có gia đình mã số Pom18 có tất thành viên thuộc hệ II mang gen bệnh Các thành viên truyền đột biến cho hệ III Tuy nhiên, phần lớn người bệnh nghiên cứu IOPD, nên khởi phát sớm, biểu lâm sàng nặng số lượng thành viên hệ thứ không nhiều 4.5 Biểu lâm sàng người bệnh Fabry Pompe 4.5.1 Biểu lâm sàng người bệnh Fabry Trong nghiên cứu phát người bệnh mã số FD64 có hoạt độ enzyme thấp kết giải trình tự gen cho thấy đột biến exon Kết siêu âm tim người bệnh cho thấy số LVMI 205 g/m2, LVPWd 22.6 mm cao Người bệnh biểu đặc điểm bệnh Fabry thể khơng điển hình với triệu chứng phì đại tim khó thở, đau thắt ngực, tim đập nhanh đặc biệt lao động vận động mạnh, ngồi khơng mang đặc điểm khác bệnh Fabry thể điển hình Các thành viên nam gia đình người bệnh mã số VN.06 có mang đột biến khơng có biểu lâm sàng, số LVMI LVPWd nằm giới hạn bình thường hoạt độ enzyme máu 124 thành viên thấp Điều Fabry khơng điển hình triệu chứng lâm sàng thường xuất muộn so với thể điển hình Sự xuất muộn triệu chứng lâm sàng giải thích Fabry khơng điển hình, lượng enzyme cịn lại khoảng 3-15% giá trị bình thường nên có lượng Gb3 định thối hóa, ứ đọng Gb3 mao mạch mạch máu nhỏ so với thể điển hình.149 Cũng theo https://fabrydiseasenews.com, tuổi khởi phát Fabry thể khơng điển hình thường từ 30-70 tuổi biểu khó thở gắng sức, phì đại tim triệu chứng thường gặp Nghiên cứu Maaten Arends cộng năm 2017 tuổi xuất triệu chứng người bệnh nam mắc Fabry không điển hình từ 19-71 tuổi, trung bình 55,4 tuổi.150 4.5.2 Đặc điểm lâm sàng bệnh Pompe Triệu chứng lâm sàng khởi phát Khi tổng hợp triệu chứng lâm sàng khởi phát 14 người bệnh tham gia nghiên cứu, nhận thấy triệu chứng khởi phát thường gặp yếu với 10 trường hợp, tiếp đến suy tim với trường hợp, bú suy hô hấp hai trường hợp Mặc dù Pompe, xuất mức độ triệu chứng lâm sàng thay đổi, nghiên cứu cho thấy yếu suy tim triệu chứng khởi phát thường gặp nhất, nguyên nhân ứ đọng glycogen tế bào cơ, đặc biệt tim hô hấp gây biểu triệu chứng đe dọa đến tính mạng người bệnh Trong nghiên cứu Lukana người bệnh IOPD Thái Lan,122 hay nghiên cứu Xi-chen cộng năm 2017 Trung Quốc cho thấy tỷ lệ yếu (giảm trương lực, chậm vận động…) 56%, vấn đề hô hấp 52%, vấn đề tim (suy tim, phì đại tim) gặp 82% bú gặp 62% trường hợp.123 Trong nghiên cứu tác giả Andreas Herzog cộng năm 2012 42 người mắc bệnh Pompe Đức cho thấy triệu chứng lâm sàng thường gặp yếu chi (gặp 42% người 125 bệnh), yếu không đặc trưng (gặp 31% trường hợp), triệu chứng bú gặp 6% trường hợp mắc bệnh Pompe nghiên cứu.151 Sự khác tỷ lệ triệu chứng khởi phát đột biến khác ảnh hưởng khác đến cấu trúc, trình tổng hợp, trưởng thành vận chuyển enzyme GAA, từ dẫn đến thiếu hụt enzyme mức độ khác nhau, làm cho biểu lâm sàng khác Chúng nhận thấy 10 người bệnh có biểu yếu có tới người bệnh có hoạt độ enzyme GAA thấp (60%, dấu hiệu chẩn đoán suy tim Trên siêu âm tim cho thấy số khối thất trái (LVMI) người bệnh nghiên cứu cao, giá trị trung bình 236±127g/m2 Kết tương tự kết Diqi Zhu cộng (2022).152 Cả số cho thấy tình trạng phì đại tim người bệnh tham gia nghiên cứu Đây dấu hiệu thường gặp người bệnh Pompe thể khởi phát sớm, bệnh đặc trưng ứ đọng glycogen tế bào cơ, đặc biệt tim, dẫn đến phì đại tim tiến triển thành suy tim Tuy nhiên, không nhận thấy mối tương quan số với hoạt độ enzyme GAA phân tích phần mềm thống kê y học, cỡ mẫu nghiên cứu nhỏ 126 Hoạt độ ALT, CK Trong nghiên cứu đo hoạt độ enzyme đặc hiệu cho tổn thương ALT CK Kết cho thấy hoạt độ enzyme CK ALT huyết người bệnh cao giá trị tham chiếu từ 3-10 lần Kết tương đồng với kết nghiên cứu Andreas Herzog cộng (2012)151 42 người bệnh Pompe Đức Các nghiên cứu khác hoạt độ enzyme CK, ALT người bệnh Pompe thường dao động khoảng 600-700U/L không tăng 2000U/L.153 Sự tăng hoạt độ enzyme CK ALT huyết giải thích bệnh Pompe, có ứ đọng chất tiêu thể tế bào, đặc biệt tế bào cơ, dẫn đến tế bào bị tổn thương, giải phóng enzyme vào máu làm hoạt độ enzyme máu tăng Sự tăng hoạt độ CK ALT khơng đặc hiệu cho Pompe nên khơng có giá trị chẩn đoán Tuy nhiên, xét nghiệm đo hoạt độ enzyme dễ thực nhiều so với xét nghiệm đo hoạt độ GAA hay giải trình tự gen tìm đột biến nên cần có nghiên cứu lớn để tìm mối liên quan hoạt độ CK, ALT với GAA, từ dùng số CK, ALT dấu hiệu định hướng chẩn đoán với bệnh nhi có biểu yếu hoạt độ CK, ALT tăng Theo nghiên cứu Marie Wencel cộng (2021) tỷ lệ chẩn đoán Pompe người bệnh có biểu yếu hoạt độ CK, ALT tăng khoảng 1%,154 hay nghiên cứu Zoltan Lukacs, cộng (2016) nghiên cứu 3076 người bệnh có hoạt độ CK máu tăng và/hoặc yếu tay chân cho thấy tỷ lệ mắc bệnh Pompe khởi phát muộn 2,4% Do đó, việc sàng lọc Pompe với đối tượng có yếu hoạt độ enzyme CK tăng nên khuyến khích thực hành lâm sàng.155 127 KẾT LUẬN Các đột biến gen GLA, GAA người bệnh Fabry Pompe - Bênh Fabry: phát 01 đột biến gen GLA c.178C>T, p.Pro60Serin, đột biến chưa công bố - Bệnh Pompe: Đã phát 10 đột biến 01 SNP gen GAA người bệnh người nhà người bệnh mắc bệnh Pompe, gồm 02 đột biến chưa công bố: c.625T>C (p.Tyr209His); c.2818-2819delTCinsCAG (p.Ser940fs), 08 đột biến ghi nhận đột biến gây bệnh Pompe nghiên cứu trước đây: c.736delT (p.Leu246fs), c.1411-1414delGAGA (p.Glu471fs); c.1735G>A (p.Glu579Lys); c 1933G>C (p.Asp645His), c 1933G>A (p.Asp645Asn), c.2040+1G>T; c.2173C.T (p.Arg251Try) c.2563G>C (p.Gly855Arg); SNP c.2065G>A (p.Gly689Lys) Phát người lành mang gen thành viên gia đình mắc Fabry Pompe: - Fabry: Phát 03 người lành mang đột biến gen GLA gây bệnh Fabry 01 gia đình thành viên có người bệnh Fabry - Phát 50 người lành mang đột biến gen GAA gây bệnh Pompe 08 gia đình có người bệnh Pompe Một số đặc điểm lâm sàng bật - Một số đặc điểm lâm sàng bật bệnh Fabry khơng điển hình: bệnh gặp nam giới, với biểu khó thở, tim đập nhanh gắng sức - Một số đặc điểm lâm sàng, cận lâm sàng bật bệnh Pompe: bệnh gặp nam nữ với tỷ lệ tương đương nhau, tuổi khởi phát thường tuổi với biểu yếu cơ, bú kém, lưỡi dày , hoạt độ ALT, CK tăng 128 KHUYẾN NGHỊ Cần làm thêm nghiên cứu với cỡ mẫu lớn có tính đại diện để phát đột biến gen GLA, GAA gây bệnh Fabry Pompe Việt Nam để lập đồ đột biến cho bệnh Cần có chiến lược tư vấn di truyền, quản lý, theo dõi điều trị dự phòng cho thành viên gia đình có đột biến gen GLA, GAA Cập nhật kiến thức cho bác sĩ đa khoa bác sĩ chuyên khoa nhi dấu hiệu lâm sàng, cận lâm sàng bệnh Fabry Pompe để gặp người bệnh nghi ngờ đưa vào chương trình chẩn đốn sàng lọc DANH MỤC CÁC CƠNG TRÌNH NGHIÊN CỨU CĨ LIÊN QUAN ĐẾN LUẬN ÁN Nguyễn Thị Phương Thảo, Nguyễn Thị Phương Mai, Dau Ming Niu, Nguyễn Văn Hùng, Hoàng Thị Ngọc Lan, Tạ Thành Văn (2019), Phát đột biến gen GLA gia đình mắc bệnh Fabry Việt Nam, Tạp chí Y học Việt Nam, Tháng 11/2019 - Số đặc biệt (Tập 484), 645 - 650 Nguyễn Thị Phương Thảo, Dau Ming Niu, Nguyễn Quỳnh Thơ, Hoàng Thị Ngọc Lan, Tạ Thành Văn (2020), Chẩn đốn trước sinh cho thai phụ có đột biến gen GAA gây bệnh Pompe, Tạp chí Y học Việt Nam, Số chuyên đề (Tập 496), 205 - 210 Nguyễn Thị Phương Thảo, Vũ Chí Dũng, Nguyễn Ngọc Khánh, Lê Thị Phương, Trần Vân Khánh, Hoàng Thị Ngọc Lan, Tạ Thành Văn (2023), Phát đột biến gen GAA đặc điểm di truyền bệnh Pompe, Tạp chí Nghiên cứu Y học Trường Đại học Y Hà Nội, Số (Tập 164), 18 - 24 TÀI LIỆU THAM KHẢO Hirschhorn R RA Glycogen storage disease type II: acid alphaglucosidase (acid maltase) deficiency The Metabolic and Molecular Bases of Inherited Disease 2001:3389-3420 Engel AG HR Engel AG F-AC, ed Acid maltase deficiency McGrawHill; 1996 Wenger DA CS, Liu S-L Insights into the diagnosis and treatment of lysosomal storage diseases Arch Neurol 2003;3(60):322-328 WR W Lysosomal storage disorders: the need for better pediatric recognition and comprehensive care J Pediatr 2004 may;144(5Supply):S3-14 Ausems MG VJ, Hermans MP, et al Frequency of glycogen storage disease type II in The Netherlands: implications for diagnosis and genetic counselling Eur J Hum Genet 1999;7(6):713-716 Sugie K YA, Murayama K et al Clinicopathological features of genetically confirmed Danon diease Nerology 2002;58(12):1773-8 Meikle PJ HJ, Clague AE et all Prevalence of lysosomal storage disorders Jama J Am Med Assoc 1999;3(281):249-254 M B variable clinical presentation in lysosomal storage disorders J Inherit Metab Dis 2001;24 Suppl(2):47-51 Gal A SE, Rohard I The genetic basic of Fabry disease Fabry disease: perspectives from years of FOS Oxford PharmaGenesis; 2006 10 Armin Mokhtariye LH-N, Abdol-Reza Varasteh et al Diagnostic methods for Lysosomal Storage Disease Rep Biochem Mol Biol 2019;7(2):119-128 11 María Alejandra Puentes-Tellez PAL-Bea A perspective on research, diagnosis, and management of lysosomal storage disorders in Colombia Elsevier Ltd; 2020 https://doi.org/10.1016/j.heliyon.2020.e03635 12 H LR Enzyme replacement therapy for lysosomal storage diseases Current Opinion in Pediatrics 2011;23(6):588-593 doi:10.1097/mop.0b013e32834c20d9 13 Wittmann J KE, Turi S et al Newborn screening for lysosomal storage disorders in Hungary Jimd Reports 2012;6:117-25 14 Park JL SL, Shayman JA Differential involement of COX and COX in the vasculopathy associated with the alpha-galactosidase A- knock out mouse Am J Physiol Heart Circ Phisiol 2009;296:1133-1140 15 Park S KJ, Joo KY et al Globotriaosylceramide leads to KCa 3.1 channel dysfuntion: A new insight into endothelial dysfuntion in Fabry disease Cardiovasc Res 2010; 16 Shen JS MX, Moore DF et al Globotriaosylceramide induces oxidative stress and upregulates cell adhesion molecule expression in Fabry disease endothelial cells Mol Genet Metab 2008;95:163-168 17 Chevrier M BN, Lesueur C et al Autophagosome maturation in impared in Fabry disease Autophagy 2010; 18 Weidemann F BF, Beer M et al The variation of morphologial and functional cardiac manifestation in Fabry disease: pontential implicatons for the time course of the disease Eur Heart J 2005;26:1221-1227 19 Moon JC SM, Reed E et al The histological basis of late gadoliniu enhancement cardiovascular magnetic resonace in o patient with Anderson-Fabry disease Cardiovasc Magn Reson 2006;8:479-482 20 Beer M WF, Breuning F et all Impact of enzyme replacement in therapy on cardiac morphology and function and late enhancemet in Fabry's cardiomyopathy Am J Cardiol 2006;97:1515-1518 21 R T Renal manifestions in Fabry disease and therapeutic options Kidney Int suppl 2008:29-32 22 Poorthuis BJ WR, Kleijer WJ et al The frequency of lysosomal storage disease in The Netherlands Hum Genet 1999;Aug; 105(1-2):151-6 23 Spada M PS, Yasuda M et al High incidence of later onset fabry disease revelated by newborn screening Am J Hum Genet 2006;79:31-40 24 Hwu WL CY, Lee NC et al Newborn screening for Fabry disease in Taiwan reveals a high incidence of later onset GLA mutation c.936+919G > A (IVS+919G > A) Hum Mutat 2009;30:1397-1405 25 Popli S LD, Molnar ZV et al Demonstration of Fabry disease deposots in placenta Am J Obstet Gynecol 1990;162:464-5 26 Vedder AC SA, vd Bergh Weerman MA et al Manifestations of Fabry disease in placental tissue J Inherit Metab Dis 2006;29(106-11) 27 HG H Inborn Lysosomal Disease Gastroenterology 1965 48:625-33 28 EF N Lysosomal storage diease Annu Rev Biochem 1991;60:257-80 29 Hopkin RJ BJ, Banikazemi M et al Characterization of Fabry Disease in 352 Pediatric Patients in the Fabry Registry Pediatr Res 2008;64:550-555 30 Wilcox WR OJ, Hopkin RJ et al Females with Fabry disease frequently have major organ involement: lessons from Fabry Registry Mol Genet Metab 2008;93:112-128 31 Schiffman R WD, Banikazemi M et al Fabry disease: progession of nephropathy and prevalence of cardiac and cerebrovascular events before enzyme replacement therapy Nephrol Dial Transplant 2009;24:2102-2111 32 MacDermot KD HA, Miners AH Anderson-Fabry disease: clinical manifestations and impact of disease in a cohort of 60 obligate carrier females J Med Genet 2001;38:769-775 33 Mehta A BM, Eyskens F et al Fabry disease: a review of current management strategies QJM 2010;103:641-659 34 Merk T WT, Schumann C, Krüger S Eur J Neurol Feb 2009;16(2):274-7 Glycogen storage disease type II (Pompe disease)-influence of enzyme replacement therapy in adults Eur J Neurol 2009;16(2):274-277 35 J C A 14 year-old boy with pain in hands and feet Pediatr Ann 2009;38:190-192 36 Orteu CH JT, Lidove O et al Fabry disease and the skin: data from FOS, the Fabry Outcome Suvey Br J Dermatol 2007;157:331-337 37 Mohrenschlager M B-FM, Ring J et al Fabry disease: recongnition and management of cutaneous manifestations Am J Clin Dermatol 2003;4:189-196 38 DP G Fabry's diease (alpha-galactosidase-A deficiency): physiopathology, clinical signs, and genentic aspects J Soc Biol 2002;196:161-173 39 Linhart A PT, Bultas J, Ferguson et al New insights in cardiac structural changes in patients with Fabry's disease Am Heart J 2000;139:1101-1108 40 Kampmann C WC, Whybra C et al Cardiac manifestations of AndersonFabry disease in heterozygous females J Am Coll Cardiol 2002;40(1668-1674) 41 Senechal M GD Fabry disease: a functional and anatomical study of cardiac manifestations in 20 hemizygous male patients Clin Genet Med 2003;63:46-52 42 Shah JS HD, Sachdev B, et al Prevalence and clinical significance of cardiac arrhythmia in Anderson-Fabry disease Am J Cardiol 2005;96:842-846 43 Kampmann C WC, Whybra C et al Cardiac manifestation of AndersonFabry disease in children and aldolescents Acta Peadiatr 2008;97:463-469 44 Ortiz A OJ, Waldek S et al Nephropathy in males and females with Fabry disease: cross-sectional description of patients before treatment with enzyme replacement therapy Nephrol Dial Transplant 2008;23:1193-1199 45 Sims K PJ, Banikazemi M, Lee P Stroke in Fabry disease frequently occurs before diagnosis and in the absence of other clinical events: natural history data from the Fabry Registry Stroke 2009;40:788-794 46 Clavelou P BG, Elziere C et al Neurological aspects of Fabry’s disease Rev Neutrol 2006;162:569-580 47 Keilmann A HD, Ramaswami U Ear symptoms in children with Fabry disease: data from the Fabry Outcome Survey J Inherit Metab Dis 2009;32:739-744 48 Federica Amodio MC, Emanuele Monda et al An Overview of Molecular Mechanisms in Fabry Disease eBiomolecules 2022;12:1460 49 Garboczi SCGaDN The Molecular Defect Leading to Fabry Disease: Structure of Human a-Galactosidase J Mol Biol 2004;337:319-335 doi:10.1016/j.jmb.2004.01.035 50 Guce AI, and Garman, S C The Structure of Human α-Galactosidase A and Implications for Fabry Disease Fabry Disease 2010:21-38 doi:10.1007/978-90-481-9033-1_2 51 Gal A ED, Altarescu G, Beck M., Dordrecht H, ed Molecular genetics of Fabry disease and Genotype-phenotype correlation Springer; 2010:3-19 52 Bernstein HS BD, Astrin KH, et al Fabry disease: six gene rearrangements and an exonic point mutation in the alpha-galactosidase gene J Clin Invest 1989;doi:10.1172/JCI114027 53 Sakuraba H, Oshima A, Fukuhara Y, et al Identification of point mutations in the alpha-galactosidase A gene in classical and atypical hemizygotes with Fabry disease Am J Hum Genet Nov 1990;47(5):784-9 54 Davies JP, Winchester, B G., Malcolm, S Sequence variations in the first exon of alpha-galactosidase A J Med Genet 1993;30:658-663 55 Eng CM, Resnick-Silverman, L A., Niehaus, et al Nature and frequency of mutations in the alpha-galactosidase A gene that cause Fabry disease Am J Hum Genet 1993;53:1186-1197 56 M M Hermans MAK, E de Graaff, B A Oostra, A J Reuser Two mutations affecting the transport and maturation of lysosomal alphaglucosidase in an adult case of glycogen storage disease type II Hum Mutat 1993;2(4):268-273 doi:doi: 10.1002/humu.1380020406 57 L-W Lai OW, M-J Wu,M O'Meara,Y-HH Lien Analysis of splice-site mutations of the α-galactosidase A gene in Fabry disease Clinical Genetics 2003;63(6):476-482 doi: doi:10.1034/j.1399-0004.2003.00077.x 58 Lai L.W WO, Wu M.-J.,et al Analysis of splice-site mutations of the alpha-galactosidase A gene in Fabry disease Clin Genet 2003;63:476-482 59 Yasuda M SJ, Osawa M., et al Fabry disease: novel alpha-galactosidase A 3-prime-terminal mutations result in multiple transcripts due to aberrant 3-prime-end formation Am J Hum Genet 2003;73:162-173 doi:10.1086/376608 60 Nakai K, Sakamoto, H Construction of a novel database containing aberrant splicing mutations of mammalian genes Gene 1994;141:171-177 61 Cooper TA, Mattox, W The regulation of splice-site selection, and its role in human disease Am J Hum Genet 1997;61:259-266 62 Shabbeer J YM, Benson SD et al Fabry disease; Identification of 50 novel alpha-galactosidase A mutations causing the classic phenotype and three-dimensional structuaral analysis of 29 missense mutations Hum Genomics 2006;2(5):297-309 63 Ishii S, Nakao S, Minamikawa-Tachino R, Desnick RJ, Fan JQ Alternative splicing in the alpha-galactosidase A gene: increased exon inclusion results in the Fabry cardiac phenotype Am J Hum Genet Apr 2002;70(4):994-1002 doi:10.1086/339431 64 Deborah Elstein GA, Michael Beck Fabry disease Sphinger; 2010:306 65 Schafer E BK, Widmer U, et al Thirty-four novel mutations of the GLA gene in 121 patients with Fabry disease Hum Mutat 2005;25(4):412 66 Brouns R EF, de Boeck K et al Fabry disease in a patient with Turner syndrome J inherit Metab Dis Short report 2009;doi:10.1007/s10545009-1035-x 67 Rodriguez Mari A CM, Chabas A Moleculear analysis in Fabry disease in Spain: fifteen novel GLA mutation and identification of a homozygous female Hum Mutat 2003;22(3):258 68 Fumiko Matsuzawa S-iA, Hirofumi Doi, Toshika Okumiya & Hitoshi Sakuraba Fabry disease: correlation between structural changes in αgalactosidase, and clinical and biochemical phenotypes Human Genetics 2005;117:317–328 69 Branton MH SR, Sabniss SG et al Nature history of Fabry disease Influence of alpha-galactosidase A acitivity and genetic mutations on clinical course Medicine 2002;81(2):122-138 70 Chamoles NA BM, Gaggioli D Fabry disease: enzymatic diagnosis in dried blood spots on filter paper Clin Chim Acta 2001;308:195-196 71 Caudron E MD, Zhou JY, Prognon P, Germain DP Recent advances of Fabry disease screening for at risk population Med Sci (Paris) 2005;21:48-50 72 Lukacs Z KA, Kohlschutter A, Beck M, Mengel E The ratio of alphagalactosidase to beta-glucuronidase activities in dried blood for the identification of female Fabry disease patients J Inherit Metab Dis 2005;28:803-805 73 Olivova P dVK, Cullen E et al Effect of sample collection on alphagalactosidase A enzyme activity measurements in dried blood spots on filter paper Clin Chim Acta 2009;403:159-162 74 Zhang XK EC, Chuang WL et al Multiplex enzyme assay screening of dried blood spots for lysosomal storage disorders by using tandem mass spectrometry Clin Chem 2008;54:159-162 75 Touboul D RS, Germain DP et al Fast fingerprinting by MALDI-TOF mass spectrometry of urinary sediment glycosphingolipids in Fabry disease Anal Bioanal Chem 2005;380:1209-1216 76 Roy S GK, Germain DP et al Optimisation of the separation of four major neutral glycosphingolipids: application to a rapid and simple detection of urinary globotriaosylceramide in Fabry disease J Chromatogr B Analyt Technol Biomed Life Sci 2004 2004;805:331-337 77 Mills K MP, Lee P, Vellodi A, et al Measurement of urinary CDH and CTH by tandem mass spectrometry in patients hemizygous and heterozygous for Fabry disease J Inherit Metab Dis 2005;28:35-48 78 Piraud M dGF, Froissart R, Maire I, Vanier MT Globotriaosylceramide measurement in urine Med Sci (Paris) 2005;21:45-47 79 Rodriguez-Mari A CMea Molecular analysis in Fabry disease in Spain: fifteen novel GLA mutations and identification of a homozygous female Hum Mutat 2003;22:258 80 Schirinzi A CM, Prattichizzo C, et al Identification of GLA gene deletions in Fabry patients by Multiplex Ligation-dependent Probe Amplification (MLPA) Mol Genet Metab 2008;94:382-385 81 Van der Beek NA dVJ, Hagemans ML, et al Clinical features and predictors for disease natural progression in adults with Pompe disease: a nationwide prospective observational study Orphanet J Rare Dis 2012;7:88 82 Chien YH HW, Lee NC Pompe disease: early diagnosis and early treatment make a difference Pediatr Neonatol 2013;54(4):219-217 83 Youichi Tajima FM, Sei-ichi Aikawa et al Structural and biochemical studies on Pompe disease and a ‘‘pseudodeficiency of acid aglucosidase J Hum Genet 2007;52:898-906 doi: 10.1007/s10038-0070191-9 84 Moreland RJ, Jin X, Zhang XK, et al Lysosomal acid alpha-glucosidase consists of four different peptides processed from a single chain precursor J Biol Chem Feb 25 2005;280(8):6780-91 doi:10.1074/jbc.M404008200 85 Lovering AL, Lee SS, Kim YW, Withers SG, Strynadka NC Mechanistic and structural analysis of a family 31 alpha-glycosidase and its glycosyl-enzyme intermediate J Biol Chem Jan 21 2005;280(3):2105-15 doi:10.1074/jbc.M410468200 86 Ernst HA, Lo Leggio L, Willemoës M, Leonard G, Blum P, Larsen S Structure of the Sulfolobus solfataricus alpha-glucosidase: implications for domain conservation and substrate recognition in GH31 J Mol Biol May 12 2006;358(4):1106-24 doi:10.1016/j.jmb.2006.02.056 87 D Thirumal Kumar MUN, Sadia Tasneem A computational method to characterize the missense mutations in the catalytic domain of GAA protein causing Pompe disease Journal of Cellular Biochemistry 2019;120(3):3491-3505 88 Roberto Fernandez-Hojas MLH, Carmen Navarro, Carmen Dominguez, Manuel Roig, Diana Lopez-Coronas, Susana Teijeira, Kwame AnyaneYeboa, Rochelle Hirschhorn Identification of six novel mutations in the acid alpha-glucosidase gene in three Spanish patients with infantile onset glycogen storage disease type II (Pompe disease) Neuromuscul Disord 2002;12(2):159-166 doi:doi: 10.1016/s0960-8966(01)00247-4 89 Simona Taverna GC, Paolo Colomba, et al Pompe disease: pathogenesis, molecular genetics and diagnosis Aging (Albany NY) 2020;12(15):15856-15874 doi:10.18632/aging.103794 90 Van der Ploeg A.T RAJ Pompe’s disease Lancet 2008;372:1342– 1353 doi:doi: 10.1016/S0140-6736(08) 91 Marian Kroos MH-W, Ans van der Ploeg et al The genotype-phenotype correlation in Pompe disease Am J Med Genet C Semin Med Genet 2012;160C(1):59-68 doi:10.1002/ajmg.c.31318 92 M G Pittis MD, A L E Montalvo et al Molecular and functional characterization of eight novel GAA mutations in Italian infants with Pompe disease Hum Mutat 2008;29(6):27-36 doi: 10.1002/humu.20753 93 M G Pittis MF Molecular genetics of late onset glycogen storage disease II in Italy Acta Myol 2007;26(1):67-71 94 Paola De Filippi KS, Sabrina Ravaglia et al Genotype-phenotype correlation in Pompe disease, a step forward Orphanet J Rare Dis 2014;9:102 doi:10.1186/s13023-014-0102-z 95 Giugliani R B-FA-C, Pasqualim G., et al Current molecular genetics strategies for the diagnosis of lysosomal storage disorders Expert Review of Molecular Diagnostics 2015;16(1):113-123 doi:10.1586/14737159.2016.1121101 96 Katalin Komlosi ASl, and Michael Beck The Role of Next-Generation Sequencing in the Diagnosis of Lysosomal Storage Disorders Journal of Inborn Errors of Metabolism & Screening 2016;4:1-6 doi:10.1177/2326409816669376 97 Rabinow P Making PCR: A Story of Biotechnology University of Chicago Press 1996 98 F Koraichi FA, E Donal et al The impact of the Next Generation Sequencing strategy in the diagnosis of two rare causes of hypertrophic cardiomyopathy: Fabry disease and hereditary transthyretin amyloidosis (ATTR) Archives of Cardiovascular Diseases Supplements 2021;13(1):23 doi: 10.1016/j.acvdsp.2020.10.086 99 Angelini C, Savarese M, Fanin M, Nigro V Next generation sequencing detection of late onset pompe disease Muscle Nerve Jun 2016;53(6):981-3 doi:10.1002/mus.25042 100 Fitzgerald RC, Caldas C Clinical implications of E-cadherin associated hereditary diffuse gastric cancer Gut Jun 2004;53(6):775-8 doi:10.1136/gut.2003.022061 101 Simoes-Correia J, Figueiredo J, Lopes R, et al E-cadherin destabilization accounts for the pathogenicity of missense mutations in hereditary diffuse gastric cancer PLoS One 2012;7(3):e33783 doi:10.1371/journal.pone.0033783 102 Suriano G, Seixas S, Rocha J, Seruca R A model to infer the pathogenic significance of CDH1 germline missense variants J Mol Med (Berl) Dec 2006;84(12):1023-31 doi:10.1007/s00109-006-0091-z 103 Richards S, Aziz N, Bale S, et al Standards and guidelines for the interpretation of sequence variants: a joint consensus recommendation of the American College of Medical Genetics and Genomics and the Association for Molecular Pathology Genet Med May 2015;17(5):40524 doi:10.1038/gim.2015.30 104 More H, Humar B, Weber W, et al Identification of seven novel germline mutations in the human E-cadherin (CDH1) gene Hum Mutat Feb 2007;28(2):203 doi:10.1002/humu.9473 105 Sim NL, Kumar P, Hu J, Henikoff S, Schneider G, Ng PC SIFT web server: predicting effects of amino acid substitutions on proteins Nucleic Acids Res Jul 2012;40(Web Server issue):W452-7 doi:10.1093/nar/gks539 106 Adzhubei I, Jordan DM, Sunyaev SR Predicting functional effect of human missense mutations using PolyPhen-2 Current protocols in human genetics Jan 2013;Chapter 7:Unit7 20 doi:10.1002/0471142905.hg0720s76 107 Schwarz JM, Rodelsperger C, Schuelke M, Seelow D MutationTaster evaluates disease-causing potential of sequence alterations Nature methods Aug 2010;7(8):575-6 doi:10.1038/nmeth0810-575 108 Yosep Chong MK, Eun Sil Koh Identification of a novel GLA mutation (Y88C) in a Korean family with Fabry nephropathy: a case report BMC Med Genet 2016;17(76) doi:10.1186/s12881-016-0338-7 109 Chi Zhou JH, Guanglin Cui, et al Identification of a novel loss-offunction mutation of the GLA gene in a Chinese Han family with Fabry disease BMC Medical Genetics 2018;19(218) 110 P Hernndez-Arvalo JDS, R Delarosa-Rodrguez Genotypephenotype correlation of 17 cases of Pompe disease in Spanish patients and identification of novel GAA variants Orphanet J Rare Diseases 2021;16(223)doi:10.1186/s13023-021-01864-8 111 May T Aung-Htut O, Kristin A Ham, Michel C Tchan et al Novel Mutations Found in Individuals with Adult-Onset Pompe Disease Gene 2020;11(2) 112 Arnold J J Reuser ATvdP, Yin-Hsiu Chien et al GAA variants and phenotypes among 1,079 patients with Pompe disease: Data from the Pompe Registry Hum Mutat 2019;40(11)doi:10.1002/humu.23878 113 J Ye GC, I Zaretskaya et al Primer-BLAST: a tool to design targetspecific primers for polymerase chain reaction BMC Bioinformatics 2012;13:134 114 Smith DR Buying in to bioinformatics: an introduction to commercial sequence analysis software Brief Bioinform Jul 2015;16(4):700-9 doi:10.1093/bib/bbu030 115 Smith DR Buying in to bioinformatics: an introduction to commercial sequence analysis software Brief Bioinform 2015;16(4) 116 Turaỗa LT, de Faria DO, Kyosen SO, et al Novel GAA mutations in patients with Pompe disease Gene Apr 25 2015;561(1):124-31 doi:10.1016/j.gene.2015.02.023 117 Ne´stor A Chamoles* GN, Mariana Blanco et al Glycogen storage disease type II: enzymatic screening in dried blood spots on filter paper Clinica Chimica Acta 2004;347:97-102 doi:10.1016/j.cccn.2004.04.009 118 Lara Kohler RPNR Pompe Disease: From Basic Science to Therapy Neurotherapeutics 2018;15:928-942 119 Nallamilli BRR CS, Kesari A, Tanner A, Ankala A et al Genetic landscape and novel disease mechanisms from a large LGMD cohort of 4656 patients Ann Clin Transl Neurol 2018;5(12):1574-1587 doi: doi: 10.1002/acn3.649 eCollection 2018 Dec 120 Huang HP CP, Hw WL et al Pompe disease induced pluripotent stem cell for pathogenesis modeling, drug testing and disease marker identification Hum Mol Genet 2011;20(24):14 doi:10.1093/hmg/ddr424 121 YH Chien NL, CA Chen et al Long-term prognosis of patients with infantile-onset Pompe disease diagnosed by newborn screening and treated since birth The journal of pediatrics 2015 April;166(4):985991.e2 122 Lukana Ngiwsara DW, et al Clinical course, mutations and its functional characteristics of infantile-onset Pompe disease in Thailand BMC Medical article 2019;20:156 123 Xi Chen TL, Meirong Huang, Jinjin Wu, Junxue Zhu, Ying Guo, Xinyi Xu, Fen Li, Jian Wang, Lijun Fu Clinical and Molecular Characterization of Infantile-Onset Pompe Disease in Mainland Chinese Patients: Identification of Two Common Mutations Genet Test Mol Biomarkers 2017;21(6):391-396 doi: doi: 10.1089/gtmb.2016.0424 124 Nakao TT, Maeda M, et al An atypical variant of Fabry's disease in men with left ventricular hypertrophy The new england journal of medicine 1995;333(5):288-293 125 Ole Havndrup MC, Birgitte Stoevring et al Fabry disease mimicking hypertrophic cardiomyopathy: genetic screening needed for establishing the diagnosis in women European Journal of Heart Failure 2010;12:535-540 126 Albert A Hage`ge EC, Thibaud Damy et al Screening patients with hypertrophic cardiomyopathy for Fabry disease using a filter-paper test: the FOCUS study Heart 2011;97:131-136 127 David Zemánek JJea Nationwide screening of Fabry disease in patients withhypertrophic cardiomyopathy in Czech Republic ESC HEART FAILURE 2022;doi:10.1002/ehf2.14135 128 Marsden D Infantile onset Pompe disease: A report of physician narratives from an epidemiologic study Genetics in Medicine 2005;7:147-150 129 B Sachdev TT, H Teraguchi et al Prevalence of Anderson-Fabry Disease in Male Patients With Late Onset Cardiomyopathy Circulation 2002;105(12):1407-1411 Hypertrophic 130 Hsuan-Chieh Liao C-CC, Dau-Ming Niu Detecting multiple lysosomal storage diseases by tandem mass spectrometry-a national newborn screening program in Taiwan Clin Chim Acta 2014;431:80-86 131 Yin-Hsiu Chien N-CL, Shu-Chuan Chiang et al Fabry Disease: Incidence of the Common Later-Onset α-Galactosidase A IVS4+919G→A Mutation in Taiwanese Newborns—Superiority of DNA-Based to Enzyme-Based Newborn Screening for Common Mutations Molecular Medicine volume 18, pages780–784 2012;18:780-784 132 Garman SC Structure-function relationships in α-galactosidase A Acta Paediatrica 2007;96:6-16 doi:doi:10.1111/j.1651-2227.2007.00198.x 133 Altered IM Sphingolipids Metabolism Damaged Mitochondrial Functions: Lessons Learned From Gaucher and Fabry Diseases J Clin Med 2020;9:1116 doi:doi: 10.3390/jcm9041116 134 Ishii S CH-H, Kawasaki K., et al Mutant α-galactosidase A enzymes identified in Fabry disease patients with residual enzyme activity: Biochemical characterization and restoration of normal intracellular processing by 1-deoxygalactonojirimycin Biochem J 2007 2007;406:285-295 doi:doi: 10.1042/BJ20070479 135 Maron MS, Xin, W., Sims, K B., et al Identification of Fabry Disease in a Tertiary Referral Cohort of Patients with Hypertrophic Cardiomyopathy The American Journal of Medicine, 2018;131(2): 200.e1-200.e8 doi:10.1016/j.amjmed.2017.09.010 136 Kanako Sugawara SS, Masakazu Sekijima et al Structural modeling of mutant α-glucosidases resulting in a processing/transport defect in Pompe disease Journal of Human Genetics 2009;54:324-330 137 LinC.Y.ShiehJ.J Identification of a de Novo Point Mutation Resulting in Infantile Form of Pompe′s Disease ScienceDirect 1995;208(2):886-893 doi:https://doi.org/10.1006/bbrc.1995.1418 138 Lies H.Hoefsloot MH, Marian A.Kroos, Jos van Beeumen', Arnold J.J.Reuser and Ben A.Oostra Primary structure and processing of lysosomal alpha-glucosidase; homology with the intestinal sucrase isomaltase complex The EMBO Journal 1988;7(6):1 697 - 704 139 Stefania Zampieri EB, Silvia Dominissini, et al Splicing mutations in glycogen-storage disease type II: evaluation of the full spectrum of mutations and their relation to patients phenotypes Eur J Hum Genet 2011 Apr;19(4):422–431 140 D Baralle MB Splicing in action: assessing disease causing sequence changes J Med Genet 2005;42(10):737-48 doi:10.1136/jmg.2004.029538 141 Kroos M PR, van Vliet L, et al Update of the Pompe disease mutation database with 107 sequence variants and a format for severity rating Hum Mutat 2008;29(6) 142 Lin J-JSaC-Y Identification of a Small Deletion in One Allele of Patients with Infantile Form of Glycogen Storage Disease Type II Biochemical and biophysical research communications 219 1996;219:322-326 143 Yasuyuki Fukuhara NF, Narutoshi Yamazaki et al A molecular analysis of the GAA gene and clinical spectrum in 38 patients with Pompe disease in Japan Mol Genet Metab Rep 2019;14:3-9 doi:10.1016/j.ymgmr.2017.10.009 144 Fabry Disease: Perspectives from Years of FOS Oxford pharmagenesis; 2006 145 http://www.hgmd.cf.ac.uk/ac/index.php 146 Linthorst GE VA, Aerts JM, Hollak CE Screening for Fabry disease using whole blood spots fails to identify one-third of female carriers Clin Chim Acta 2005;353:201-203 147 Rietra PJ TJT The use of biochemical parameters for the detection of carriers of Fabry’s disease J Mol Med 1976:237-255 148 C Y Chien JJS Identification of a de novo point mutation resulting in infantile form of Pompe's disease Biochem Biophys Res Commun 1995;208(2):886-893 149 Late-onset Fabry Disease https://fabrydiseasenews.com/type-2-fabrydisease/ 150 Maarten Arends CW, Derralynn Hughes Characterization of Classical and Nonclassical Fabry Disease: A Multicenter Study JASN 2017;28(5):1631-1641 151 Andreas Herzog RH, Arnold J J Reuser, et al A cross-sectional singlecentre study on the spectrum of Pompe disease, German patients: molecular analysis of the GAA gene, manifestation and genotypephenotype correlations Orphanet Journal of Rare Diseases 2012;7 152 Diqi Zhu JZ, Wenjuan Qiu et al A Multi-Centre Prospective Study of the Efficacy and Safety of Alglucosidase Alfa in Chinese Patients With Infantile-Onset Pompe Disease Front Pharmacol 2022;13 153 David Stevens MD SM-NDTMM Pompe Disease: a Clinical, Diagnostic, and Therapeutic Overview Neuromuscular Disorders 2022;24:573-588 doi:10.1007/s11940-022-00736-1 154 Wencel M SA, Goyal NA Investigating Pompe Prevalence in Neuromuscular Medicine Academic Practices (The IPaNeMA Study) Neurology: Genetics.623 155 Zoltan Lukacs PNC, Stephan Wenninger et al Prevalence of Pompe disease in 3,076 patients with hyperCKemia and limb-girdle muscular weakness Neurology 87(3):295–298 doi:10.1212/WNL.0000000000002758 13,28,56,59,61,64-67,69,70,73,75-81,83,97 PHỤ LỤC TRƯỜNG ĐẠI HỌC Y HÀ NỘI NGHIÊN CỨU XÁC ĐỊNH ĐỘT BIẾN GEN GLA, GAA VÀ ĐẶC ĐIỂM DI TRUYỀN CỦA BỆNH FABRY VÀ POMPE BỘ CÂU HỎI PHỎNG VẤN NGƯỜI BỆNH Mã số phiếu: Loại hình sở y tế (nơi tiếp cận BN): Bệnh viện Quận/ Huyện: Tỉnh/ Thành phố: Họ tên người bệnh: Họ tên người giam hộ: Địa chỉ: Điện thoại:…………………… Mã số bệnh án : Thoả thuận nghiên cứu Tôi ………………………………………… nghiên cứu viên đề tài trường Đại học Y Hà Nội chủ trì Hiện nay, chúng tơi muốn tìm hiểu Xác định đột biến genGLA, GAA đặc điểm di truyền bệnh Fabry Pompe Do đó, tơi xin phép hỏi ý kiến anh/chị số câu hỏi chăm sóc sức khỏe anh/chị thành viên gia đình Sự tham gia anh/chị gia đình khảo sát hoàn toàn tự nguyện Chúng đảm bảo thông tin anh/chị cung cấp phục vụ cho mục đích nghiên cứu Đồng thời, thơng tin cá nhân anh/chị hồn tồn giữ bí mật Đồng thời, thơng tin anh/ chị cung cấp có đóng góp ý nghĩa vào việc xây dựng thực sách chương trình y tế mang lại lợi ích cho người Cuộc vấn kéo dài khoảng 15 phút, anh/chị từ chối trả lời câu hỏi mà anh /chị không muốn suốt trình vấn Sau vấn tiến hành lấy khoảng 4mL máu anh/chị để phục vụ đề tài nghiên cứu Anh/ chị có đồng ý tham gia nghiên cứu khơng? 1- Có- / 2- Không Chữ ký người vấn: Chữ ký điều tra viên: _ A THÔNG TIN CHUNG CỦA NGƯỜI BỆNH A1 Năm sinh anh/chị? …………………… Giới tính? Nam A2 Nữ NGƯỜI GIÁM HỘ A4 Năm sinh anh/chị? …………………… Giới tính? Nam A5 Nữ A6 Quan hệ với người bệnh B TIỀN SỬ BỆNH TẬT B1 Có tiền sử phì đại tim? …………………… Có Khơng B2 Đã chẩn đốn Fabry/ Pompe? Có Khơng B3 Gia đình có chẩn đốn Fabry/ Pompe? Có Khơng …………………… Quan hệ với người bệnh C TRIỆU CHỨNG LÂM SÀNG C1 Lý đến khám Chiều cao Cân nặng Nhịp tim C2 Triệu chứng lâm sàng người bệnh khởi phát Khó thở Tím tái Yếu Lưỡi dày Bú C3 Thời điểm xuất triệu chứng lâm sàng khởi phát D D1 CẬN LÂM SÀNG: XQ tim phổi: …………………… …………………… …………………… …………………… …………………… Chỉ số tim ngực D2 D3 D4 D5 D6 Siêu âm tim: …………………… Độ dày thất trái (LVI) Chỉ số khối thất trái (LVMI) Bề dày thành sau thất trái tâm trương (LVPWd) Hóa sinh máu: …………………… CK ALT GAA …………………… GLA …………………… KQ giải trình tự gen …………………… Ngày …… tháng…… năm… Người thu thập thông tin PHỤ LỤC DANH SÁCH CÁC THÀNH VIÊN THAM GIA NGHIÊN CỨU CỦA GIA ĐÌNH NGƯỜI BỆNH POM16 STT 10 11 12 13 14 15 16 Ký hiệu Pom 16.0 Pom 16.1 Pom 16.2 Pom 16.3 Pom 16.4 Pom 16.5 Pom 16.6 Pom 16.7 Pom 16.8 Pom 16.9 Pom 16.10 Pom 16.11 Pom 16.12 Pom 16.13 Pom 16.14 Pom 16.15 Họ tên Nguyễn Phương T Nguyễn Thị L Nguyễn Huy D Nguyễn Huy C Khiếu Thị Đ Nguyễn Thị H Nguyễn Văn K Nguyễn Thị Thùy L Nguyễn Thùy D Nguyễn Anh T Nguyễn Đức Q Nguyễn Thị Kim L Nguyễn Đức Đ Nguyễn Thị Diệp A Nguyễn Khánh N Nguyễn Văn K Năm sinh 2015-2016 1998 1990 1965 1969 1989 1989 2009 2015 2019 1970 1975 2005 1995 2018 1993 Quan hệ với BN Bênh nhân Mẹ Bố Ông nội Bà nội Chị gái bố Anh rể bố Cơ (bố) Chị họ Anh họ Ơng ngoại Bà Ngoại Cậu Bác gái (mẹ) Chị họ Chồng bác gái(mẹ) DANH SÁCH CÁC THÀNH VIÊN THAM GIA NGHIÊN CỨU CỦA GIA ĐÌNH NGƯỜI BỆNH POM17 STT 10 11 Ký hiệu Pom 17.0 Pom 17.1 Pom 17.2 Pom 17.3 Pom 17.4 Pom 17.5 Pom 17.6 Pom 17.7 Pom 17.8 Pom 17.9 Pom 17.10 Họ tên Phùng Quang T Phùng Minh C Lê Thị Thu V Phùng Thị M Nguyễn Văn T Phùng Văn T Kiều Thị Như Q Kiều Văn C Nguyễn Thị T Kiều Thị Hồng N Kiều Ngọc D Năm sinh 2020 1970 1972 1995 1994 1995 2000 1976 1982 2007 2011 Quan hệ với BN Bênh nhân Ông nội Bà nội Chị gái chồng Anh rể chồng Bố Mẹ Ông ngoại Bà ngoại Em gái (vợ) Cậu DANH SÁCH CÁC THÀNH VIÊN THAM GIA NGHIÊN CỨU CỦA GIA ĐÌNH NGƯỜI BỆNH POM18 STT Ký hiệu Họ tên Năm sinh Quan hệ với BN Pom 18.0 Phạm Tú Anh 2007 Bênh nhân Pom 18.1 Phạm Công T 1961 Ông nội Pom 18.2 Hà Thị D 1962 Bà nội Pom 18.3 Phan Văn M 1955 Ông ngoại Pom 18.4 Nguyễn Thị P 1957 Bà ngoại Pom 18.5 Phạm Minh T 1988 Bố Pom 18.6 Phan Thị Thu H 1988 Mẹ Pom 18.7 Phạm Anh Đ 2013 Em trai DANH SÁCH CÁC THÀNH VIÊN THAM GIA NGHIÊN CỨU CỦA GIA ĐÌNH NGƯỜI BỆNH POM19 STT Ký hiệu Họ tên Năm sinh Quan hệ với BN Pom 19.0 Đặng Anh T Pom 19.1 Đặng Văn D 1985 Bố Pom 19.2 Ngô Thị Thanh T 1987 Mẹ Pom 19.3 Đặng Nhật M 2012 Anh trai Pom 19.4 Đặng văn T 1954 Ông nội Pom 19.5 Nguyễn Thị N 1955 Bà nội Pom 19.6 Ngô Văn T 1961 Ông ngoại Pom 19.7 Man Thị M 1963 Bà ngoại Pom 19.8 Đặng Văn L 1980 Anh trai bố 10 Pom 19.9 Đặng Hải N 2008 Anh họ 11 Pom 19.10 Đặng Hào N 2009 Anh họ 12 Pom 19.11 Ngơ Chí C 1992 Cậu 13 Pom 19.12 Nguyễn Thị A 1996 Vợ cậu 14 Pom 19.13 Nguyễn Thị H 1989 Chị dâu bố Bênh nhân DANH SÁCH CÁC THÀNH VIÊN THAM GIA NGHIÊN CỨU CỦA GIA ĐÌNH NGƯỜI BỆNH POM20 STT Ký hiệu Họ tên Năm sinh Quan hệ với BN Pom 20.0 Nguyễn Ngọc D 2018 Bênh nhân Pom 20.1 Nguyễn Thị L 1995 Mẹ Pom 20.2 Nguyễn Minh Q 2003 Cậu Pom 20.3 Nguyễn Thùy D 2002 Em gái mẹ Pom 20.4 Tạ Thị H 1970 Bà nội Pom 20.5 Nguyễn Thị H 1974 Bà Ngoại Pom 20.6 Nguyễn Văn Q 1971 Ông ngoại Pom 20.7 Nguyễn Hữu H 1993 Bố DANH SÁCH CÁC THÀNH VIÊN THAM GIA NGHIÊN CỨU CỦA GIA ĐÌNH NGƯỜI BỆNH POM21 Pom 21.0 Nguyễn Nhật N Năm sinh 2018 Pom 21.1 Nguyễn Hà A 2008 Cô Pom 21.2 Nguyễn Thị L 1971 Bà Nội Pom 21.3 Nguyễn Ngọc Khánh L 2003 Cô Pom 21.4 Nguyễn Việt L 1970 Ông nội Pom 21.5 Lê Thị H 1980 Bà ngoại Pom 21.6 Đào Minh Triết 2021 Em họ Pom 21.8 Nguyễn Thị Mỹ D 1998 Mẹ Pom 21.9 Nguyễn Việt D 1994 Bố 10 Pom 21.10 Nguyễn Tuấn V 2002 Cậu 11 Pom 21.11 Nguyễn Văn C 1975 Ông ngoại 12 Pom 21.12 Đào Tiến T 1990 Em rể bố 13 Pom 21.13 Nguyễn Thị Thu H 1992 Em gái bố STT Ký hiệu Họ tên Quan hệ với BN Bênh nhân DANH SÁCH CÁC THÀNH VIÊN THAM GIA NGHIÊN CỨU CỦA GIA ĐÌNH NGƯỜI BỆNH POM22 Năm sinh 2020 1996 1968 1993 1994 1972 1973 STT Ký hiệu Pom 22.0 Pom 22.1 Pom 22.2 Pom 22.3 Pom 22.4 Pom 22.5 Pom 22.6 Họ tên Nguyễn Mạnh D Nguyễn Văn T Nguyễn Văn T Nguyễn Thị Thu H Nguyễn Thị L Bùi Thị Đ Bùi Thị Thu V Pom 22.7 Nguyễn Hồng T 1992 Quan hệ với BN Bênh nhân Cậu Ông nội Mẹ Em gái bố Bà Ngoại Bà nội Bố Pom 22.8 Nguyễn Quốc T 1967 Ông ngoại DANH SÁCH CÁC THÀNH VIÊN THAM GIA NGHIÊN CỨU CỦA GIA ĐÌNH NGƯỜI BỆNH VN0055 STT Ký hiệu VN.0055.0 VN.0055.1 VN.0055.2 VN.0055.3 VN.0055.4 VN.0055.5 VN.0055.6 Họ tên VN.0055 Nhữ Thị L Nguyễn Văn H Nguyễn Văn T Nguyễn Thảo N Nhữ Văn K Nguyễn Thị T Năm sinh VN.0055.7 Nguyễn Văn C 1970 Quan hệ với BN Con - Bênh nhân Đối tượng nghiên cứu Chồng Em trai chồng Con gái Bố Mẹ Bố chồng VN.0055.8 Nguyễn Thị H 1972 Mẹ Chồng 1993 1991 1993 2017 1968 1968 PHỤ LỤC KẾT QUẢ GIẢI TRÌNH TỰ GEN CỦA CÁC THÀNH VIÊN TRONG GIA ĐÌNH Gia đình người bệnh mã số VN.06 STT Mã số người bệnh VN.01 VN.02 VN.03 VN.04 VN.05 VN.06 VN.07 VN.08 VN.09 Giới tính Kết giải trình tự gen Nữ Nam Nữ Nam Nữ Nam Nữ Nam Nam c.178 C>T – dị hợp tử c.178 C>T Không phát đột biến Không phát đột biến c.178 C>T dị hợp tử c.178 C>T c.178 C>T dị hợp tử c.178 C>T c.178 C>T Gia đình người bệnh mã số Pom16 STT Mã số Đột biến Đồng/dị hợp tử Pom 16.1 c.1933G>C(p.Asp645His) Dị hợp tử Pom 16.2 c.1933G>C(p.Asp645His) Dị hợp tử Pom 16.3 c.1933G>C(p.Asp645His) Dị hợp tử Pom 16.4 E14 bình thường Pom 16.5 c.1933G>C(p.Asp645His) Pom 16.6 E14 bình thường Pom 16.7 c.1933G>C(p.Asp645His) Dị hợp tử Pom 16.8 c.1933G>C(p.Asp645His) Dị hợp tử Pom 16.9 E14 bình thường 10 Pom 16.10 c.1933G>C(p.Asp645His) Dị hợp tử Dị hợp tử 11 Pom 16.11 E14 bình thường 12 Pom 16.12 c.1933G>C(p.Asp645His) Dị hợp tử 13 Pom 16.13 c.1933G>C(p.Asp645His) Dị hợp tử 14 Pom 16.14 c.1933G>C(p.Asp645His) Dị hợp tử Gia đình bênh nhân mã sơ Pom17 STT Mã số Đột biến Đồng/dị hợp tử Dị hợp tử Pom 17.1 c.1933G>C(p.Asp645His) Pom 17.2 E14 bình thường Pom 17.3 c.1933G>C(p.Asp645His) Pom 17.4 E14 bình thường Pom 17.5 c.1933G>C(p.Asp645His) Dị hợp tử Pom 17.6 c.1933G>C(p.Asp645His) Dị hợp tử Pom 17.7 c.1933G>C(p.Asp645His) Dị hợp tử Pom 17.8 E14 bình thường Pom 17.9 c.1933G>C(p.Asp645His) Dị hợp tử 10 Pom 17.10 c.1933G>C(p.Asp645His) Dị hợp tử Dị hợp tử Gia đình người bệnh mã số Pom18 STT Mã số Đột biến Đồng/dị hợp tử Pom 17.1 c.1933G>C(p.Asp645His) Dị hợp tử Pom 17.2 E14 bình thường Pom 17.3 c.1933G>C(p.Asp645His) Pom 17.4 E14 bình thường Pom 17.5 c.1933G>C(p.Asp645His) Dị hợp tử Pom 17.6 c.1933G>C(p.Asp645His) Dị hợp tử Pom 17.7 c.1933G>C(p.Asp645His) Dị hợp tử Dị hợp tử Gia đình người bệnh mã số Pom19 STT Mã số Pom 19.0 Pom 19.1 Pom 19.2 Pom 19.3 Pom 19.4 Pom 19.5 Pom 19.6 Pom 19.7 Pom 19.8 10 Pom 19.9 11 Pom 19.10 12 Pom 19.11 13 Pom 19.12 Đột biến c.1735G>A(P.E579K) c.2040+1G>T c.2040+1G>T E14 bình thường, c.1735G>A(P.E579K) E14 bình thường, c.1735G>A(P.E579K) c.2040+1G>T E14 bình thường, E12 bình thường E14 bình thường, c.1735G>A(P.E579K) E14 bình thường, E12 bình thường E14 bình thường, E12 bình thường E14 bình thường, E12 bình thường E14 bình thường, E12 bình thường E14 bình thường, E12 bình thường E14 bình thường, E12 bình thường STT Mã số Gia đình người bệnh mã số Pom20 Đột biến Đồng/dị hợp tử Đồng/dị hợp tử dị hợp tử dị hợp tử dị hợp tử dị hợp tử dị hợp tử dị hợp tử c 1411_1414del(p.Glu471Profs*5) E9 dị hợp tử Pom 20.0 c.1735G>A(C579K)dị hợp E12 Pom 20.1 c.1735G>A(E579K) dị hợp tử Pom 20.2 c.1735G>A(E579K) dị hợp tử Pom 20.3 E12, E9 bình thường Pom 20.4 c.1411delGAGA dị hợp tử Pom 20.5 c.1735G>A(E579K) dị hợp tử Pom 20.6 E12, E9 bình thường Pom 20.7 c.1411delGAGA dị hợp tử Gia đình người bệnh mã số Pom21 STT Mã số Đột biến Đồng/dị hợp tử Đồng hợp Pom 21.0 c.625T>C (p.Tyr209His) Pom 21.1 E3 bình thường Pom 21.2 E3 bình thường Pom 21.3 c.625T>C (p.Tyr209His) dị hợp tử Pom 21.4 c.625T>C (p.Tyr209His) dị hợp tử Pom 21.5 E3 bình thường Pom 21.6 c.625T>C (p.Tyr209His) dị hợp tử Pom 21.8 c.625T>C (Y209H) dị hợp tử Pom 21.9 c.625T>C (p.Tyr209His) dị hợp tử 10 Pom 21.10 E3 bình thường 11 Pom 21.11 c.625T>C (p.Tyr209His) dị hợp dị hợp tử 12 Pom 21.12 E3 bình thường 13 Pom 21.13 c.625T>C (Y209H) dị hợp dị hợp tử Gia đình người bệnh mã số Pom22 STT Mã số Đột biến Đồng/dị hợp tử Pom 22.0 c.1933G>C(p.Asp645His) đồng hợp tử Pom 22.1 c.1933G>C(p.Asp645His) dị hợp tử Pom 22.2 c.1933G>C(p.Asp645His) dị hợp tử Pom 22.3 c.1933G>C(p.Asp645His) dị hợp tử Pom 22.4 c.1933G>C(p.Asp645His) dị hợp tử Pom 22.5 c.1933G>C(p.Asp645His) dị hợp tử Pom 22.6 E14 bình thường Pom 22.7 c.1933G>C(p.Asp645His) dị hợp Pom 22.8 E14 bình thường dị hợp tử Gia đình người bệnh mã số VN0055 STT Mã số Đột biến Đồng/dị hợp tử VN.0055.0 VN.0055.1 c.2040+1G>T dị hợp tử VN.0055.2 c.2040+1G>T dị hợp tử VN.0055.3 bình thường VN.0055.4 c.2040+1G>T dị hợp tử VN.0055.5 c.2040+1G>T dị hợp tử VN.0055.6 bình thường VN.0055.7 c.2040+1G>T VN.0055.8 bình thường dị hợp tử PHỤ LỤC Hình ảnh điện di exon genGAA Hình ảnh điện di Exon 2.1 (420bp) Hình ảnh điện di Exon 2.2 (424bp) Hình ảnh điện di Exon (343bp) Hình ảnh điện di Exon 17 Exon 4,5 (618bp) Hình ảnh điện di Exon (249bp) Hình ảnh điện di Exon 7,8 (441bp) Hình ảnh điện di Exon (333bp) Hình ảnh điện di Exon 10,11 (450bp) Hình ảnh điện di Exon 12 (502bp) Hình ảnh điện di Exon 13 (287bp) Hình ảnh điện di Exon 14 (286bp) Hình ảnh điện di Exon 15 (343bp) Hình ảnh điện di Exon 16 (415bp) Hình ảnh điện di Exon 6, exon 15, exon 20 (416bp) PHỤ LỤC Một số hình ảnh kết giải trinh tự genGLA Hình ảnh biến thể 5’UTR -12 G>A Hình ảnh biến thể 5’UTR -10 C>T Hình ảnh biến thể IVS1 +17 A>G Một số hình ảnh kết giải trinh tự genGAA Hình ảnh SNP 2065G>A (p.Glu689Lys) z Hình ảnh đột biến 2818-2819delTinsCAG Hình ảnh đột biến c.2173C>T p.Arg725Asn Hình ảnh đột biến c.625T>C p.Tyr209His Hình ảnh đột biến c.1735 G>A p.Glu579Lys Hình ảnh đột biến c.736delT p.Leu246fs