BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC Y HÀ NỘI NGUYỄN THỊ PHƯƠNG THẢO XÁC ĐỊNH ĐỘT BIẾN GEN GLA, GAA VÀ ĐẶC ĐIỂM DI TRUYỀN CỦA BỆNH FABRY VÀ POMPE Chuyên ngành Hóa sinh Y học Mã số 9720101 TÓM[.]
BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC Y HÀ NỘI NGUYỄN THỊ PHƯƠNG THẢO XÁC ĐỊNH ĐỘT BIẾN GEN GLA, GAA VÀ ĐẶC ĐIỂM DI TRUYỀN CỦA BỆNH FABRY VÀ POMPE Chuyên ngành: Hóa sinh Y học Mã số: 9720101 TÓM TẮT LUẬN ÁN TIẾN SĨ Y HỌC HÀ NỘI - 2023 Cơng trình hoàn thành tại: TRƯỜNG ĐẠI HỌC Y HÀ NỘI Người hướng dẫn khoa học: GS.TS Tạ Thành Văn PGS.TS Hoàng Thị Ngọc Lan Phản biện 1: Phản biện 2: Phản biện 3: Luận án bảo vệ trước Hội đồng chấm luận án cấp Trường Họp tại: Trường Đại học Y Hà Nội Vào hồi: ngày tháng năm Có thể tìm hiểu luận án thư viện: - Thư viên Quốc Gia - Thư viện Trường Đại học Y Hà Nội DANH MỤC CÁC CƠNG TRÌNH ĐÃ CÔNG BỐ LIÊN QUAN ĐẾN LUẬN ÁN Nguyễn Thị Phương Thảo, Nguyễn Thị Phương Mai, Dau Ming Niu, Nguyễn Văn Hùng, Hoàng Thị Ngọc Lan, Tạ Thành Văn (2019), Phát đột biến gen GLA gia đình mắc bệnh Fabry Việt Nam, Tạp chí Y học Việt Nam, Tháng 11/2019 - Số đặc biệt (Tập 484), 645 - 650 Nguyễn Thị Phương Thảo, Dau Ming Niu, Nguyễn Quỳnh Thơ, Hoàng Thị Ngọc Lan, Tạ Thành Văn (2020), Chẩn đoán trước sinh cho thai phụ có đột biến gen GAA gây bệnh Pompe, Tạp chí Y học Việt Nam, Số chuyên đề (Tập 496), 205 - 210 Nguyễn Thị Phương Thảo, Vũ Chí Dũng, Nguyễn Ngọc Khánh, Lê Thị Phương, Trần Vân Khánh, Hoàng Thị Ngọc Lan, Tạ Thành Văn (2023), Phát đột biến gen GAA đặc điểm di truyền bệnh Pompe, Tạp chí Nghiên cứu Y học Trường Đại học Y Hà Nội, Số (Tập 164), 18 - 24 1 ĐẶT VẤN ĐỀ Fabry Pompe bệnh di truyền gặp thuộc nhóm bệnh rối loạn dự trữ tiêu thể - LSDs Nguyên nhân bệnh xác định đột biến gen GLA, GAA, dẫn đến thiếu hụt enzyme alphagalactosidase A, alpha-glucosidase tiêu thể tế bào, hậu tích tụ sphingolipid, glycogen tiêu thể tế bào, gây tổn thương tế bào Tỷ lệ mắc bệnh thấp trẻ mắc bệnh thường tử vong sớm suy tim, suy hô hấp Các nghiên cứu gần báo cáo tỷ lệ không nhỏ trường hợp mắc Fabry không điển hình Việc phát đột biến gen gây bệnh phát người lành mang gen bệnh có ý nghĩa lớn việc chẩn đoán, điều trị sớm, tư vấn di truyền hợp lý để hạn chế sinh trẻ bệnh Tuy nhiên, Việt Nam có nghiên cứu vấn đề này, dẫn đến việc chẩn đốn muộn hiệu điều trị khơng cao Vì lý trên, chúng tơi tiến hành nghiên cứu Xác định đột biến gen GLA, GAA đặc điểm di truyền bệnh Fabry Pompe” tiến hành với ba mục tiêu sau: Xác định đột biến gen GLA, GAA người bệnh Fabry Pompe Phát người lành mang gen bệnh thành viên gia đình người bệnh Mơ tả biểu lâm sàng cận lâm sàng người bệnh mắc bệnh Fabry Pompe Tính cấp thiết Fabry Pompe bệnh di truyền gặp thuộc nhóm bệnh rối loạn dự trữ tiêu thể - LSDs Tỷ lệ mắc bệnh thấp trẻ mắc bệnh thường tử vong sớm suy tim, suy hô hấp Các nghiên cứu gần báo cáo tỷ lệ không nhỏ trường hợp mắc Fabry không điển hình Việc phát đột biến gen gây bệnh phát người lành mang gen bệnh có ý nghĩa lớn việc chẩn đoán, điều trị sớm, tư vấn di truyền hợp lý để hạn chế sinh trẻ bệnh Đây lý đề tài tiến hành nghiên cứu 2 Những đóng góp luận án - Xác định đột biến gen GLA, GAA gây bệnh Fabry Pompe Việt Nam, phát 01 đột biến gen GLA 02 đột biến gen GAA chưa công bố - Phát người lành mang gen bệnh thành viên gia đình có người mắc bệnh Fabry, Pompe, từ đưa tư vấn di truyền phù hợp cho đối tượng - Cung cấp số liệu đặc điểm lâm sàng (các triệu chứng thường gặp), biến đổi cận lâm sàng (hóa sinh, chẩn đốn hình ảnh) bệnh nhân Fabry Pompe Bố cục luận án - Luận án trình bày 128 trang bao gồm: đặt vấn đề trang, tổng quan 37 trang, đối tượng phương pháp nghiên cứu 20 trang, kết nghiên cứu 36 trang, bàn luận 31 trang, kết luận trang, khuyến nghị trang - Luận án có 18 bảng, 03 biểu đồ, 20 hình, gồm 155 tài liệu tham khảo xếp theo thứ tự xuất luận án CHƯƠNG TỔNG QUAN TÀ I LIỆU 1.1 Bệnh Fabry Fabry bệnh di truyền gặp, liên kết NST giới tính X gây ứ đọng mức sphingolipid tiêu thể, dẫn đến triệu chứng quan khác nhau, hậu thiếu hụt enzyme alpha galactosidase A (GLA) đột biến gen GLA-gen mã hóa sản xuất enzyme GLA Gen GLA nằm nhánh dài NST X, vị trí Xq22.1 Gen có exon, gồm khoảng 10.222 bp Vùng mã hóa gồm 1290 bp, mã hóa protein gồm 429 acid amin Cho đến có 900 đột biến gen GLA gây bệnh Fabry báo cáo Fabry bệnh gặp, tỷ lệ mắc dao động khoảng 1/40.0001/60.000 người Triệu chứng lâm sàng Fabry đa dạng với biểu đau, tổn thương giác mạc tổn thương da, hậu cuối suy quan, thường gặp với trẻ từ 3-10 tuổi, trẻ gái thường muộn trẻ trai Cơ chế tổn thương mô cho giảm tưới máu tích đọng chất tế bào biểu mô mạch máu đơn độc đặc biệt thận, tim, hệ thần kinh trung ương da, phối hợp với tích đọng mơ khác Người nữ dị hợp tử có biểu triệu chứng khơng, bất hoạt ngẫu nhiên NST X tất tế bào phơi thai nữ Bệnh chẩn đoán dựa vào triệu chứng lâm sàng, xét nghiệm đo hoạt độ enzyme GLA xét nghiệm phân tích gen tìm đột biến Hiện nay, liệu pháp thay enzyme (ERT) coi phương pháp điều trị đặc hiệu cho bệnh Fabry Tác dụng có lợi ERT quan/hệ thống khác đánh giá rộng rãi Chất lượng sống bệnh nhân nhận ERT cải thiện 1.2 Bệnh Pompe Bệnh Pompe (Pompe disease – PD) bệnh di truyền gen lặn nhiễm sắc thể thường, kết thiếu hụt acid alpha – glucosidase (acid maltase, GAA) gen đột biến gen GAA, dẫn đến tích tụ glycogen mức tiêu thể Sự tích tụ ảnh hưởng đến chức bình thường bào quan khác tế bào dẫn đến tổn thương tế bào Từ lan rộng làm rối loạn chức toàn quan liên quan (ví dụ: bệnh tim) Gen GAA nằm NST 17 vị trí 17q25, gồm 20 exon exon khơng tham gia mã hóa Cho đến có gần 700 đột biến gen GAA gây bệnh Pompe báo cáo Tỉ lệ mắc bệnh: tỉ lệ mắc bệnh khác quần thể nghiên cứu, dao động từ 1/14.000-50.000 người Biểu lâm sàng Pompe khác phụ thuộc vào tuổi khởi phát bệnh Bệnh chẩn đoán dựa vào triệu chứng lâm sàng, xét nghiệm đo hoạt độ enzyme GAA xét nghiệm phân tích gen tìm đột biến Tương tự FD, ERT mang lại hiệu điều trị cao với người bệnh PD, giúp nâng cao chất lượng sống kéo dài tuổi thọ cho bệnh nhân 4 CHƯƠNG ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 3.1 Đối tượng nghiên cứu Tiêu chuẩn lựa chọn người bệnh: - Fabry: đối tượng có triệu chứng lâm sàng gợi ý (phì đại tim chưa rõ nguyên nhân phát qua siêu âm tim điện tâm đồ), có hoạt độ enzyme thấp phát qua sàng lọc sơ sinh thành viên gia đình có người mắc bệnh Fabry - Pompe: đối tượng có triệu chứng lâm sàng gợi ý (yếu cơ), có hoạt độ enzyme thấp phát qua sàng lọc sơ sinh thành viên gia đình có người mắc bệnh Pompe - Tiêu chuẩn lựa chọn thành viên gia đình: phát đột biến gen GLA, GAA người bệnh tham gia nghiên cứu, tiến hành lập phả hệ lấy mẫu thành viên huyết thống phạm vi hệ, để tiến hành phân tích gen GLA, GAA vị trí đột biến tìm người bệnh - Tiêu chuẩn loại trừ: người bệnh người nhà không đồng ý tham gia nghiên cứu 2.2 Thiết kế nghiên cứu - Mô tả ca bệnh, với cách lấy mẫu thuận tiện, thu thập cỡ mẫu sau: + Bệnh Fabry: 433 người bệnh đáp ứng tiêu chuẩn lựa chọn bệnh Fabry thể khơng điển hình; 01 trẻ có hoạt độ enzyme thấp phát qua sàng lọc sơ sinh 08 thành viên 01 gia đình người bệnh mắc bệnh Fabry + Bệnh Pompe: 14 người bệnh đáp ứng tiêu chuẩn bệnh Pompe; 70 thành viên từ 08 gia đình có đột biến GAA tham gia nghiên cứu 2.3 Thời gian địa điểm nghiên cứu - Thời gian: từ tháng 6/2014 đến tháng 6/2022 - Địa điểm nghiên cứu: mẫu lấy Bệnh viện Trẻ em Hải Phòng, Bệnh viện Nhi Trung ương, Viện Tim Hà Nội, Bệnh viện Xanh pon Địa điểm phân tích mẫu: xét nghiệm đo hoạt độ enzyme thực Bệnh viện đa khoa Cựu chiến binh Đài Bắc, kỹ thuật phân tích gen thực nơi Bệnh viện đa khoa Cựu chiến binh Đài Bắc Trung tâm Gen – protein – Trường Đại học Y Hà Nội, sử dụng kỹ thuật PCR để khuếch đại gen, giải trình tự theo phương pháp Sanger, với mồi thiết kế, thành phần phản ứng chu kỳ nhiệt phản ứng 10% số mẫu phân tích nơi để đảm bảo tính xác kết 2.4 Các nội dung biến số nghiên cứu Thu thập liệu triệu chứng lâm sàng, cận lâm sàng (kết siêu âm tim, Xquang tim phổi, xét nghiệm ALT, CK) dựa Bệnh án nghiên cứu Đo hoạt độ enzyme GLA, GAA, giải trình tự gen cho người có hoạt độ enzyme thấp So sánh với trình tự GeneBank để tìm đột biến, đột biến dự đoán khả gây bệnh phần mềm tin-sinh học Với đối tượng có đột biến gen: lấy mẫu thành viên gia đình, phân tích gen vị trí phát đột biến người bệnh 2.5 Phương tiện, hóa chất Sử dụng trang thiết bị, máy móc hóa chất hãng uy tín Qiagen (Đức), Thermo Fisher (Mỹ), Genzyme – Sanofi (Mỹ) 2.6 Kỹ thuật sử dụng nghiên cứu - Đo hoạt độ enzyme (GLA GAA) từ giọt máu khô giấy thấm (DBS) phương pháp đo khối phổ song song - Tách chiết DNA từ máu toàn phần: dùng kit QIAamp DNA Qiagen (theo hướng dẫn nhà sản xuất) - Tiến hành phản ứng PCR khuếch đại đoạn gen mong muốn với thành phần phản ứng chu kỳ nhiệt khác cho exon - PCR giải trình tự gen: Sử dụng phương pháp Sanger hệ thống máy ABI 3730 XL (Thermo Fisher) chạy với hóa chất BigDye™ Terminator v3.1 Cycle Sequencing Kit 2.7 Xử lý số liệu - Các biến số lâm sàng xét nghiệm thông thường tính tốn dựa vào phần mềm thơng kê y học SPSS16.0 Hoạt độ enzyme tính tốn phần mềm chuyên dụng theo hướng dẫn nhà sản xuất Kết giải trình tự gen xử lý phần mềm BioEdit 7.2.6, phần mềm CLC Workbenches 8.0, sau trình tự so sánh GeneBank để phát đột biến Tìm kiếm đột biến, dạng đột biến, loại protein bị thay đổi…, dựa vào ngân hàng gen trực tuyến http://www.hgmd.cf.ac.uk/ac/index.php - Áp dụng phương pháp lập phả hệ sử dụng ký hiệu lập phả hệ theo quy định 2.8 Đạo đức nghiên cứu - Nghiên cứu đươ ̣c tiế n hành có sự đồ ng ý của hội đồng y đức BVTEHP, Bệnh viện Nhi Trung ương, Hội đồng khoa học trường Đại học Y Hải Phòng, người bệnh và gia đình người bê ̣nh CHƯƠNG KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 3.1 Đặc điểm chung đối tượng tham gia nghiên cứu 3.1.1 Bệnh Fabry 3.1.1.1 Đặc điểm phân bố theo tuổi Biểu đồ 3.1: Phân bố theo nhóm tuổi nhóm người bệnh phì đại tim nghi ngờ Fabry Biểu đồ 3.1 cho thấy người bệnh phì đại tim chủ yếu thuộc nhóm từ 40-80 tuổi, giá trị mean ± SD nhóm tuổi 57 ± 12 tuổi 3.1.1.2 Đặc điểm phân bố theo giới Trong 433 người bệnh phì đại tim tham gia nghiên cứu, có 417 người bệnh nam, chiếm 97%, có 3% người bệnh nữ 3.1.2 Bệnh Pompe Phần lớn người bệnh khởi phát sớm (dưới tháng tuổi), tuổi khởi phát trung bình ± 4,2 tháng Trường hợp biểu sớm ngày tuổi trường hợp muộn 17 tháng tuổi 3.2.2.2 Giới Trong số 14 bệnh nhân có triệu chứng lâm sàng gợi ý đến bệnh Pompe nghiên cứu có nam nữ Tỷ lệ bệnh giới tương đương 3.2 Kết đo hoạt độ enzyme 3.2.1 Hoạt độ enzyme GLA người bệnh nghi ngờ Fabry Hoạt độ enzyme GLA mẫu nghiên cứu nằm khoảng 0,17-9,18 μmol/h/L (1,87±0,94 μmol/h/L), chủ yếu dao động khoảng 0,92-2,97 μmol/h/l Hơn 60% người bệnh có hoạt độ enzyme thấp giá trị tham chiếu người Đài Loan 2,05-7,46 μmol/h/L, có 26 người bệnh có hoạt độ enzyme lại 10% giá trị tham chiếu, chiếm 6% 3.2.2 Kết hoạt độ enzyme GAA người bệnh nghi ngờ Pompe Kết đo hoạt độ enzyme GAA 14 người bệnh nghi ngờ Pompe nghiên cứu nằm khoảng từ 0,01-6,8 μmol/h/L (0,91±1,26 μmol/h/L) 100% người bệnh tham gia nghiên cứu có hoạt độ enzyme giảm so với giá trị tham chiếu, 35,7% người bệnh có hoạt độ enzyme lại nhỏ 10% giá trị tham chiếu (G 5'UTR -12 G>A 5'UTR -10 C>T IVS4-16 A>G IVS6-22 C>T Thay đổi acid amin p.Pro60Ser - Vị trí Exon Intron Exon Exon Intron 14 Intron 16 Loại đột biến Sai nghĩa SNP SNP - Tần suất 1 12 13 Tần suất xuất biến thể IVS6-22 C>T cao (48,1%), 44.4% mang biến thể IVS4-16A>G, 37% mang biến thể 5’UTR-10 C>T 18,5% mang biến thể trên, có trường hợp nữ, mang biến thể thể đồng hợp tử Ngồi cịn phát biến thể IVS1+17 A>G 5’UTR -12G>A Người bệnh mã số FB64 VN.06 có đột biến vùng mã hóa (exon 1) vị trí 178, thay nucleotide C nucleotide T, dẫn đến thay đổi acid amin vị trí 60 Prolin thành Serin Đây đột biến chưa công bố trước nghiên cứu bệnh Fabry Hình 3.1 Hình ảnh đột biến c.178C>T, p.Pro60Ser Sử dụng phần mềm tin sinh học SIFT, PolyPhen-2 MutationTaster để dự đoán khả gây bệnh đột biến cho kết có khả gây bệnh mức độ cao Khi phân tích kết hoạt độ enzyme theo kết giải trình tự gen, chúng tơi nhận thấy nhóm có đột biến vùng mã hóa có kết hoạt độ enzyme thấp nhất, nhiên so sánh với nhóm cịn lại có đột biến vùng khơng mã hóa nhóm ko có đột biến chúng tơi nhận thấy khác biệt khơng có ý nghĩa thống kê 3.3.2 Kết giải trình tự gen người bệnh nghi ngờ Pompe Tất trường hợp phát đột biến với tần suất sau: Bảng 3.2 Tần suất xuất đột biến nghiên cứu Thay đổi nucleotid c.625T>C c736delT c 1411_1414del c.2040+1G>T c.1933G>C c.1933G>A c.1735G>A c.2173C>T c.28182819delTinsCAG Thay đổi acid amin p.Tyr209His* p.Leu246fs p.Glu471Profs p.Asp645His p.Asp645His p.Glu579Lys p.Arg725Asn p.Ser940fs* Vị trí Loại đột biến Tần suất E3 E4 E9 Intron 14 E14 E14 E14 E15 E20 Sai nghĩa Dịch khung Dịch khung Chỗ nối Sai nghĩa Sai nghĩa Sai nghĩa Sai nghĩa Dịch khung 1 1 (*): đột biến chưa báo cáo y văn Phần lớn đột biến phát nghiên cứu đột biến sai nghĩa, ngồi cịn gặp đột biến dịch khung đột biến vị trí nối Ngồi đột biến báo cáo y văn, nhận thấy xuất đột biến với tần suất cao như: c.625T>C(p.Tyr209His) gặp 4/14 người bệnh, đột biến c.28182819delTCinsCAG(p.Ser940fs) gặp 2/14 người bệnh 7/14 người bệnh mang đồng thời đột biến thể dị hợp tử (dị hợp tử kép) c.625T c.625T>C Hình 3.2 Hình ảnh đột biến c.625T>C 10 Kết dự đoán khả gây bệnh đột biến điểm c.625T>C phần mềm PolyPhen-2 MutationTaster cho đột biến có khả gây bệnh, nhiên, phần mềm SIFT lại cho đột biến lành tính với số điểm 0,14 3.4 Phát người lành mang gen thành viên gia đình người bệnh 3.4.1 Phát người lành mang gen thành viên gia đình người bệnh Fabry Kết giải trình tự gen cho 08 thành viên gia đình người bệnh mã số VN.06, cho thấy 6/8 thành viên mang đột biến gen c.178C>T Khi đối chiếu hoạt độ enzyme với kết phân tích gen thành viên gia đình chúng tơi nhận thấy cụ ngoại mẹ người bệnh có đột biến gen có hoạt độ enzyme giới hạn bình thường, dì người bệnh mang đột biến lại có hoạt độ enzyme thấp Các thành viên nam có đột biến có hoạt độ enzyme thấp so với giá trị bình thường Hình 3.3: mơ tả phả hệ gia đình người bệnh mã số VN.06 3.4.2 Phát người lành mang gen thành viên gia đình người bệnh Pompe - Gia đình người bệnh mã số Pom16 10 thành viên mang đột biến (c.1933G>C (p.Asp645His), dị hợp tử, gồm: ông nội (I-1), ông ngoại (I-3), bác ruột (II-1 II-3), bố đẻ (II-4), mẹ đẻ (II-5), dì (II-7), cậu (II-6), chị họ (III-1, III-2), em họ (III-5) 11 - Gia đình người bệnh mã số Pom17 thành viên gia đình mang đột biến (c.1933G>C (p.Asp645His) dị hợp tử, gồm: ông nội (I-2), ông ngoại (I-3), bác ruột (II2), bố đẻ (II-3), mẹ đẻ (II-4) dì (II-6) Hình 3.4: Phả hệ gia đình mã số Pom 16 Pom17 - Gia đình người bệnh mã số Pom18 thành viên mang đột biến, gồm bà nội (I-1) bố (II-1) người bệnh mang đột biến c.2173C>T (p.Arg725Trp), dị hợp tử; ông nội (I-2), ông ngoại (I-3) mẹ (II-2) người bệnh mang đột biến c.1933G>C (p.Asp645His) dị hợp tử 3.4.2.4 Gia đình người bệnh mã số Pom19 thành viên mang đột biến, gồm: ông nội (I-2) bố đẻ (II-3) mang đột biến c.2040+1G>T, dị hợp tử, ông ngoại (I-3) mẹ đẻ (II-4) anh trai ruột (III-5) mang đột biến c.1735G>A (p.Glu579Lys), dị hợp tử Hình 3.8: Phả hệ gia đình mã số Pom18 Pom19 12 - Gia đình người bệnh mã số Pom20 thành viên mang đột biến, gồm: bà nội (I-1) bố đẻ (II-2) mang đột biến c.1411-1414del (p.Glu471Profs), dị hợp tử, bà ngoại (I-3), mẹ đẻ (II-2) cậu (III-3) mang đột biến c.1735G>A (p.Glu579Lys), dị hợp tử - Gia đình người bệnh mã số Pom21 thành viên mang đột biến, gồm: ông nội (I-2), ông ngoại (I-3), bác – chị gái bố (II-2), cô (II-4), bố đẻ (II-5), mẹ đẻ (II-4) anh trai họ (III-1) mang đột biến c.625T>C dị hợp tử - Gia đình người bệnh mã số Pom22 6/8 thành viên mang đột biến, gồm: ông nội (I-2), ông ngoại (I-3), bác gái (II-1), bố đẻ (II-2), mẹ đẻ (II-3) cậu (II-4) mang đột biến c.1933G>C (p.Asp645His), dị hợp tử - Gia đình mã số VN.0055 5/8 thành viên mang đột biến, gồm vợ chồng, bố chồng, bố đẻ, gái 13 Hình 3.12: Phả hệ gia đình mã số Pom22 VN.0055 Tỷ lệ thành viên gia đình mang đột biến: Khi tổng hợp thành viên gia đình có mang đột biến, chúng tơi tính tỷ lệ thành viên có huyết thống mang đột biến gen GAA Tỷ lệ tương đối cao, dao động từ 70 -100%, họ hàng bậc 50% tất gia đình tham gia nghiên cứu, họ hàng bậc dao động từ 50 – 100% (5/9 gia đình có tất thành viên họ hàng bậc mang gen bệnh), họ hàng bậc dao động từ 0- 100% 3.5 Đặc điểm lâm sàng người bệnh Fabry Pompe 3.5.1 Đặc điểm lâm sàng người bệnh Fabry Người bệnh mã số FB 64 mang đột biến gen GLA vùng mã hóa nam, 56 tuổi Kết siêu âm cho thấy số khối thất trái (LVMI) 205 g/m2, bề dày thành sau thất trái tâm trương (LVPWd) 22.6 mm cao Người bệnh biểu đặc điểm bệnh Fabry thể không điển phì đại tim với triệu chứng khó thở, đau thắt ngực, tim đập nhanh đặc biệt lao động vận động mạnh, không mang đặc điểm khác bệnh Fabry thể điển hình Người bệnh mã số VN06 có hoạt độ enzyme giảm chưa có biểu lâm sàng Các thành viên nam gia đình bên ngoại người bệnh mang đột biến gen, có hoạt độ enzyme giảm chưa có biểu lâm sàng, số LVMI LVPWd giới hạn bình thường 14 3.5.2 Đặc điểm lâm sàng người bệnh Pompe - Triệu chứng lâm sàng khởi phát 10/14 người bệnh tham gia nghiên cứu có biểu yếu cơ, 2/10 người bệnh có biểu bú - Biến đổi số tim ngực LVMI Xquang tim phổi siêu âm tim Trong 11 người bệnh có kết LVMI có đến 10 người bệnh có số cao giá trị tham chiếu LVMI trung bình người bệnh cao, nằm khoảng 236±127g/m2 Có 6/12 người bệnh có số tim ngực tăng (>60%), số tim ngực trung bình 62,5±7,7% - Kết đo hoạt độ enzyme ALT, CK Hoạt độ CK ALT tăng cao (trên lần) so với giá trị tham chiếu (Mean ± SD 909,5 ±707,8 287,7 ±187,1) CHƯƠNG BÀN LUẬN 4.1 Đặc điểm chung đối tượng nghiên cứu 4.1.1 Đặc điểm chung tuổi giới bệnh Fabry Nghiên cứu cho thấy người bệnh mắc phì đại tim chủ yếu có nhóm tuổi từ 40 đến 80 tuổi đặc biệt từ 50 - 59 tuổi (33%) Kết tương đối phù hợp với số nghiên cứu trước sàng lọc bệnh Fabry người bệnh phì đại tim giới nghiên cứu Nakao cộng (1995), hay nghiên cứu Ole Havndrup cộng (2010), nghiên cứu của Albert A Hagege (2010) Pháp nghiên cứu David Zemánek cộng (2022) Về giới tính đối tượng tham gia nghiên cứu: 97% đối tượng tham gia nghiên cứu nam, số 26 người bệnh có hoạt độ enzyme thấp giải trình tự, tỷ lệ nam chiếm đa số Điều phù hợp với quy luật di truyền liên kết NST X Fabry 4.1.2 Đặc điểm chung tuổi giới bệnh Pompe Tuổi khởi phát trung bình người bệnh nghiên cứu 5±4,2 tháng, phần lớn khởi phát tuổi, kết phù hợp với 15 công bố trước IOPD tuổi khởi phát thường khoảng tháng, tuổi chẩn đoán thường tháng Đặc điểm giới: tỷ lệ nam: nữ nghiên cứu 1:1 Điều hồn tồn phù hợp Pompe bệnh di truyền gen lặn nhiễm sắc thể thường nên khơng có khác giới tính 4.2 Biến đổi hoạt độ enzyme GLA, GAA người bệnh tham gia nghiên cứu 4.2.1 Hoạt độ enzyme GLA người bệnh phì đại tim chưa rõ nguyên nhân Hoạt độ GLA người bệnh nghiên cứu thấp nhiều so dải tham chiếu Đài Loan thể đối tượng tham gia nghiên cứu người bệnh có phì đại tim chưa rõ ngun nhân nên khơng có tính đại diện Kết thấp so với kết Nakao cộng (1995) hay kết B Sachdev cộng (2002) đối tượng người bệnh có phì đại tim, sử dụng phương pháp xác định hoạt độ enzyme GLA khác đo khối phổ song song phương pháp đo huỳnh quang chuẩn với chất 4-methylumbelliferyla-D-galactopyranoside) Trong nghiên cứu có 02 đối tượng có độ tuổi, mang đột biến hoạt độ enzyme lại khác nhau, kết tương tự kết D Zemáneket (2022) có người bệnh nam mang đột biến có độ tuổi tương đương có khác hoạt độ enzyme 4.2.2 Hoạt độ enzyme GAA người bệnh có triệu chứng lâm sàng nghi ngờ mắc Pompe Tất bệnh nhi có triệu chứng lâm sàng gợi ý bệnh Pompe có hoạt độ GAA nhỏ giá trị tham chiếu, có người bệnh có hoạt độ enzyme thấp 3% so với giá trị tham chiếu Các người bệnh xuất triệu chứng trước tháng tuổi Điều hoàn toàn phù hợp với mô tả nghiên cứu trước đây; với IOPD, hoạt độ GAA T p.Pro60Seu, chưa công bố y văn Sự thay Proline - acid amin phân cực Serin - acid amin khơng phân cực ảnh hưởng đến gấp nếp cấu trúc phân tử GLA, từ giảm trưởng thành hoạt động GLA gây biểu Fabry Người bệnh mã só FB64 có đột biến c.178 C>T, p.Pro60Serin, có biểu lâm sàng nhẹ, đối tượng nghiên cứu khác có đột biến chưa có biểu lâm sàng thời điểm nghiên cứu, nên dự đốn đột biến liên quan đến Fabry thể khơng điển hình Khi sử dụng cơng cụ SIFT, PolyPhen-2 MutationTaster dự đốn đột biến khả gây bệnh Tuy nhiên cần có nghiên cứu in vitro để khẳng định ảnh hưởng đột biến đến hoạt độ enzyme GLA Tỉ lệ đột biến gen GLA sàng lọc người bệnh phì đại tim nghiên cứu khác Điều tần suất mang gen đột biến khác dân tộc, quốc gia, khác biệt tiêu chuẩn thu thập mẫu nghiên cứu hay số lượng mẫu Ngồi ra, chúng tơi cịn nhận thấy có biến thể vị trí IVS 17 5’UTR xuất với tần số cao, thay đổi trình tự 5’UTR-10C>T 5’UTR-12G>A ghi nhận SNP gen GLA Tuy nhiên, hoạt độ enzyme người bệnh có biến thể khơng có khác biệt có ý nghĩa thống kê với người bệnh không mang đột biến mang đột biến vùng mã hóa Có thể đột biến xảy vùng intron vùng 5'UTR vùng DNA khơng tham gia vào q trình giải mã protein, cụ thể enzyme GLA Tuy nhiên khoa học ngày phát triển vai trị nhiều trình tự DNA cịn bí ẩn với hiểu biết người, đột biến có ảnh hưởng đến kiểu hình cá thể hay khơng cần có nghiên cứu thêm 4.3.2 Các đột biến gen GAA Kanako Sugawara (2009) cho thay acid amin gây bất thường trình trưởng thành vận chuyển enzyme GAA gây bệnh Pompe tìm thấy tất năm miền enzyme GAA Trong nghiên cứu phát 10 đột biến (gồm đột biến sai nghĩa, đột biến dịch khung, đột biến chỗ nối) SNP Đột biến sai nghĩa c.1933G>C (p.Asp645His) Đột biến đột biến có tần suất xuất cao nghiên cứu (7/14 trường hợp, chiếm 50%) Đột biến xảy exon 14, thuộc vùng bảo tồn cao gen GAA, báo cáo đột biến gây bệnh nghiên cứu trước người bệnh IOPD LOPD, thể đồng hợp tử dị hợp tử kép, kết hợp với đột biến thể dị hợp tử khác đột biến c.1933G>C hay đột biến c.1411-1414del nghiên cứu Lukana (2019) Trong nghiên cứu này, đột biến c.1933 G>C (p.Asp645His) thể đồng hợp tử tìm thấy 03 người bệnh IOPD khác nhau, có hoạt độ enzyme thấp Thể dị hợp tử kép kết hợp với đột biến c.1933G>A (p.Asp645Asn), đột biến (p.Leu246fs*22) hay đột biến c.2173C>T (p.Arg725Trp), đột biến gây bệnh báo cáo nhiều 18 nghiên cứu trước người bệnh IOPD LOPD Người bệnh mang đột biến kép có hoạt độ enzyme thấp khởi phát sớm (dưới tuổi) Đột biến sai nghĩa c.625T>C (p.Tyr209His) Đột biến có tần suất xuất cao thứ nghiên cứu với 4/14 trường hợp Đột biến nằm exon Đây đột biến chưa báo cáo sở liệu đột biến gen GAA, thuộc miền β-sheet đầu tận N, chịu trách nhiệm xử lý phân giải peptid tín hiệu đột biến ảnh hưởng đến trình vận chuyển chất vào tiêu thể, từ ảnh hưởng đến q trình tổng hợp enzyme Các công cụ SIFT, PolyPhen-2 hay MutationTaster dự đốn đột biến gây bệnh với mức độ khác Đột biến gặp người bệnh mã số Pom8.0, Pom10.0 Pom21.0 thể dị hợp tử kép, đặc biệt, người bệnh mã số Pom8.0 Pom10.0 có kiểu gen giống hệt người bệnh có hoạt độ enzyme GAA tuổi khởi phát khác nhau, cần có nghiên cứu thực nghiệm để chứng minh chế gây bệnh đột biến Các đột biến sai nghĩa khác Đột biến c.1745G>A (p.Glu579Lys) báo cáo nghiên cứu Herman năm 1993 trường hợp LOPD đột biến gây giảm vận chuyển nội bào q trình trưởng thành enzyme GAA mà khơng gây ảnh hưởng đến trình tổng hợp tiền chất enzyme Đột biến c.2563 G>C (p.Gly855Arg) thể dị hợp tử mô tả người bệnh mắc bệnh Pompe với đột biến c.111A>T nghiên cứu Xi Chen cộng 25 bệnh nhi mắc bệnh Pompe thể khởi phát sớm Đài Loan, nhiên đột biến phân loại gây bệnh chế liên quan đến giảm hoạt độ enzyme hay triệu chứng lâm sàng người bệnh chưa thật rõ ràng SNP c.2065 G>A (p.E689K) Các nghiên cứu trước biến thể lành tính thường gặp người châu Á (Nhật Bản Trung Quốc) gặp Châu Âu hay vùng khác 19 Đột biến vị trí nối c.2040+1G>T Đột biến c.2040+1G>T xác nhận đột biến gây bệnh Pompe nghiên cứu Đài Loan Huang HP cộng năm 2011 YH Chien cộng năm 2015 bệnh nhi mắc bệnh Pompe thể khởi phát sớm Đột biến xảy vị trí nối dự đốn gây gián đoạn q trình nối RNA, dẫn đến khơng tổng hợp protein tổng hợp protein sai lệch, điều dẫn đến chức enzyme GAA nguyên nhân gây bệnh Pompe Đặc biệt, diện đột biến kết hợp với đột biến khác tăng nguy gây biểu lâm sàng nặng người bệnh Pompe Người bệnh mã số Pom12.0 mang đồng thời đột biến đột biến c.1933 G>C; p.Asp645His, có hoạt độ enzyme thấp (0.082 µmol/h/l) khởi phát tháng tuổi, phù hợp với triệu chứng lâm sàng thể khởi phát sớm Đột biến c.2040+1G>C đột biến tìm thấy chúng tơi tiến hành chẩn đốn trước sinh cho thai phụ mã số VN.0055.1, có Pompe thể khởi phát sớm Khi phân tích trình tự gen vợ chồng mã số VN.0055.0 0055.1 thu đột biến thể dị hợp tử Có thể cặp vợ chồng mang đột biến c.2040+1 G>C thể đồng hợp tử nên có mắc IOPD với triệu chứng lâm sàng xuất sớm (5,5 tháng tuổi) nặng dẫn đến người bệnh tử vong sớm (khi tháng tuổi) Trong đột biến gen GAA gây bệnh Pompe đột biến vị trí nối thường gặp, đứng thứ sau đột biến điểm (sai nghĩa, vơ nghĩa) đột biến xóa đoạn nhỏ Các đột biến dịch khung Đột biến c.1411-1414delGAGA (p.Glu471Profs*5) báo cáo đột biến gây bệnh nhiều nghiên cứu trước kết hợp với đột biến khác nghiên cứu JJ Shielh (1996) hay Lukanua (2019) Sự xóa nucleotid GAGA vị trí c.1411-1414 dự đoán gây dịch khung sau codon 471, dẫn đến xuất tín hiệu kết thúc sớm kết tổng hợp protein bị cắt ngắn gồm 474 acid amin Protein bị cắt ngắn thiếu vị trí xúc tác GAA, nằm codon 516-520, làm giảm hoạt động GAA Trong nghiên cứu chúng tôi, người 20 bệnh mã số Pom20 mang đột biến thể dị hợp tử, kết hợp với đột biến c.1735G>A (dị hợp), có hoạt độ enzyme thấp (T, p.Pro60Serin Kết phù hợp với quy luật di truyền bệnh Fabry di truyền gen lặn NST X: mẹ truyền cho trai, gen bệnh NST X bố truyền cho gái Các thành viên nữ gia đình tham gia nghiên cứu mang đột biến gen GLA cụ ngoại mẹ có hoạt độ enzyme GLA giới hạn bình thường, dì người bệnh lại có hoạt độ enzyme thấp giá trị bình thường Điều giải thích bất hoạt ngẫu nhiên NST X Như vậy, ghi nhận đột biến 7/9 thành viên gia đình, với mẹ, dì cụ ngoại người lành mang gen Đột biến làm giảm hoạt độ enzyme tất các người bệnh nam số người nữ mang gen bệnh Tuy nhiên, thời điểm nghiên cứu, thành viên gia đình chưa có biểu bệnh Chúng tơi đưa tư vấn di truyền cho thành viên gia đình: bệnh Fabry di truyền liên kết NST X, mẹ dì người bệnh mang đột biến truyền cho trai, số 21 trai biểu bênh, gái người mang gen, nên mẹ dì sinh thêm nên làm xét nghiệm chẩn đoán trước sinh Người bệnh (VN.06) em trai họ (mã số VN.08 VN.09) dì (mã số VN.07) mang gen bệnh, có giảm hoạt độ enzyme chưa có biểu bệnh nên cần theo dõi sát bất thường cơ, tim để kịp thời phát điều trị triệu chứng cần, đồng thời, trưởng thành nên sinh trai để không di truyền gen bệnh 4.4.2 Phát người lành mang gen thành viên gia đình người bệnh Pompe Pompe di truyền gen lặn nằm NST Trên lý thuyết, xác suất sinh bị bệnh gia đình mà bố mẹ người mang gen 25%, thực tế gia đình chúng tơi nghiên cứu có gia đình lần đẻ con, bị bệnh Vì việc phát người lành mang gen bệnh giúp cho tư vấn di truyền để họ sinh đứa trẻ khỏe mạnh (không mang gen/ người mang gen dị hợp tử) Ngồi việc phân tích liệu di truyền phả hệ gia đình cách tiếp cận việc đánh giá đột biến sai nghĩa gen GAA Quan sát phả hệ gia đình tham gia nghiên cứu, phát tất đột biến xuất từ hệ I, di truyền cho hệ II, từ hệ II truyền cho hệ Có thể bố mẹ mang đột biến dị hợp tử, nhận đột biến từ bố mẹ, nên mang đột biến thể đồng hợp co biểu bệnh Hoặc bố mẹ đột biến dị hợp tử khác nhau, di truyền cho con, mang đột biến dị hợ tử kép biểu bệnh Điều hoàn toàn phù hợp với quy luật di truyền gen lặn NST thường Khơng có đột biến de novo phát nghiên cứu Tư vấn di truyền với người lành mang gen bệnh Với cặp vợ chồng mang gen bệnh thể dị hợp tử, lần mang thai sau làm xét nghiệm tiền làm tổ để chọn lọc phôi, xét nghiệm sàng lọc trước sinh để hạn chế sinh đứa trẻ bị bệnh Với thành viên mang gen bệnh chưa kết hôn, nên làm xét nghiệm tiền nhân (giải trình tự gen GAA đối tượng kết hôn để phát đột biến gen có) 22 Tỷ lệ mang đột biến gia đình Trong nghiên cứu chúng tơi, tỷ lệ mang đột biến gia đình tương đối cao, hệ II cao nhất, có nhiều gia đình có tất thành viên hệ II mang gen bệnh Số lượng hệ cao khơng nhiều, phần lớn bệnh nhân nghiên cứu IOPD 4.5 Biểu lâm sàng người bệnh Fabry Pompe 4.5.1 Biểu lâm sàng người bệnh Fabry Người bệnh mã số FB64 mang đột biến vùng mã hóa, có hoạt độ enzyme GLA thấp, số LVMI LVPWd, có biểu đặc điểm bệnh Fabry thể khơng điển phì đại tim với triệu chứng khó thở, đau thắt ngực, tim đập nhanh đặc biệt lao động vận động mạnh, ngồi khơng mang đặc điểm khác bệnh Fabry thể điển hình Các thành viên nam gia đình người bệnh mã số VN.06 có mang đột biến khơng có biểu lâm sàng, số LVMI LVPWd nằm giới hạn bình thường hoạt độ enzyme máu thành viên thấp Điều Fabry khơng điển hình triệu chứng lâm sàng thường xuất muộn so với thể điển hình Sự xuất muộn triệu chứng lâm sàng giải thích Fabry khơng điển hình, lượng enzyme cịn lại khoảng 3-15% giá trị bình thường nên có lượng Gb3 định thối hóa, ứ đọng Gb3 mao mạch mạch máu nhỏ so với thể điển hình Kết phù hợp với mô tả Fabry thể khơng điển hình nghiên cứu Maaten Arends cộng năm 2017 4.5.2 Đặc điểm lâm sàng bệnh Pompe Triệu chứng lâm sàng khởi phát Triệu chứng khởi phát thường gặp yếu cơ, tiếp đến suy tim, bú suy hô hấp Kết tương tự nghiên cứu Lukana người bệnh IOPD Thái Lan, hay nghiên cứu Xichen cộng năm 2017 Trung Quốc Nguyên nhân ứ đọng glycogen tế bào cơ, đặc biệt tim hô hấp gây biểu 23 triệu chứng đe dọa đến tính mạng người bệnh Sự khác tỷ lệ triệu chứng khởi phát đột biến khác ảnh hưởng khác đến cấu trúc, trình tổng hợp, trưởng thành vận chuyển enzyme GAA, từ dẫn đến thiếu hụt enzyme mức độ khác nhau, làm cho biểu lâm sàng khác Chúng tơi nhận thấy 10 người bệnh có biểu yếu có tới người bệnh có hoạt độ enzyme GAA thấp (T, p.Pro60Serin, đột biến chưa công bố - Bệnh Pompe: Đã phát 10 đột biến 01 SNP gen GAA người bệnh người nhà người bệnh mắc bệnh Pompe, gồm 02 đột biến chưa công bố: c.625T>C (p.Tyr209His); c.28182819delTCinsCAG (p.Ser940fs) Phát người lành mang gen thành viên gia đình mắc Fabry Pompe: - Fabry: Phát 03 người lành mang đột biến gen GLA gây bệnh Fabry 01 gia đình thành viên có người bệnh Fabry - Phát 50 người lành mang đột biến gen GAA gây bệnh Pompe 08 gia đình có người bệnh Pompe Một số đặc điểm lâm sàng bật - Một số đặc điểm lâm sàng bật bệnh Fabry khơng điển hình: bệnh gặp nam giới, với biểu khó thở gắng sức, LVMI tăng, hoạt độ GLA giảm - Một số đặc điểm lâm sàng, cận lâm sàng bật bệnh Pompe: bệnh gặp nam nữ với tỷ lệ tương đương nhau, tuổi khởi phát thường tuổi với biểu yếu cơ, bú kém, LVMI số tim ngực tăng hoạt độ CK, ALT tăng, hoạt độ GAA giảm