Xác định đột biến gen GLA, GAA và đặc điểm di truyền của bệnh Fabry và Pompe

ĐẶT VẤN ĐỀ Các bệnh lý di truyền ngày quan tâm nghiên cứu nhiều Sự hiểu rõ nguyên nhân quy luật di truyền chi phối bệnh di truyền có ý nghĩa to lớn việc chẩn đoán tư vấn di truyền, nhằm giảm tỷ lệ bệnh nhân mắc bệnh di truyền nâng cao chất lượng sống cho bệnh nhân Di truyền học người quan sát nghiên cứu hai mức độ tế bào phân tử Theo phương pháp nghiên cứu hai mức độ khác Các phương pháp nghiên cứu di truyền học y học gồm có: phương pháp di truyền học tế bào (quan sát NST kỳ giữa, quan sát NST nhân tế bào gian kỳ), phương pháp di truyền hóa sinh, phương pháp di truyền phân tử, phương pháp lập gia hệ phân tích gia hệ, phương pháp khảo sát sinh đôi, phương pháp quan sát nếp vân da, phương pháp di truyền quần thể thăm khám lâm sàng bệnh di truyền Chẩn đốn bệnh di truyền tiến hành trước sinh, sau sinh (sơ sinh chẩn đoán cộng đồng) hay giai đoạn tiền làm tổ Cùng với phát triển thụ tinh ống nghiệm, phương pháp chẩn đoán tiền làm tổ ngày phát triển đem lại kết khả quan, đặc biệt cho cặp vợ chồng có bất thường di truyền Để phục vụ cho nghiên cứu: “Xác định đột biến gen GLA, GAA đặc điểm di truyền bệnh Fabry Pompe”, tiến hành chuyên đề với mục đích hiểu rõ phương pháp chẩn đoán bệnh lý hệ di truyền, đặc biệt kỹ thuật di truyền học phân tử sử dụng nghiên cứu I CÁC PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU DI TRUYỀN HỌC TẾ BÀO Di truyền học tế bào nhánh di truyền học, lấy đối tượng nhân tế bào, mà cụ thể NST tế bào nên quan tâm chủ yếu đến chu kỳ tế bào Các phương pháp quan sát nhiều di truyền học tế bào kỳ gian kỳ Các kỹ thuật xét nghiệm thiếu chẩn đoán bệnh di truyền, đặc biệt rối loại NST Quan sát nhiễm sắc thể kỳ (karyotype) Kỹ thuật làm tiêu bản, quan sát đánh giá NST người áp dụng rộng rãi từ năm 1960 Phương pháp quan sát số lượng, cấu trúc NST, tùy vào mục đích mà có nhiều phương pháp khác Có thể phân tích NST từ tế bào tủy xương, tế bào bào thai, tế bào bạch cầu lympho hay tế bào tua rau thai… Trong chẩn đoán ung thư, tế bào sinh thiết khối u tủy xương dùng để làm karyotype Đối với chẩn đoán khác, karyotype thường tạo từ mẫu máu ngoại vi sinh thiết da Đối với chẩn đoán trước sinh, nước ối mẫu tua rau, hay máu cuống rốn thai sử dụng làm nguồn tế bào xét nghiệm Các bước kỹ thuật gồm ni cấy tế bào, dừng q trình phân chia kỳ giữa, xử lý môi trường nhược trương, nhuộm băng NST, quan sát phân tích NST, lập karyotype theo tiêu chuẩn quốc tế ISCN Nuôi cấy tế bào bước trình phân tích NST người Ni cấy tiến hành từ máu toàn phần từ TB lympho tách khỏi hồng cầu Bạch cầu lympo máu ngoại vi loại TB thường dùng nghiên cứu NST người[3] Bạch cầu tế bào không phân chia nên thường dùng PHA để kích thích tế bào phân chia Môi trường nuôi cấy thường dùng môi trường Parker F10 F12 Quá trình phân chia tế bào bị dừng lại kỳ cách thêm vào colchicine colcemid Các tế bào xử lý môi trường nhược trương (thường dùng Kali Clorua 0,075M natri citrate 1%) nhằm phá vỡ màng tế bào Định hình TB dung dịch Carnoy (3methanol:1acid acetic hỗn hợp alcol – clorofoc – acid acetic với tỷ lệ 6:3:1) Tiếp theo TB dàn tiêu bản, nhuộm chất nhuộm nhân giemsa, orcein acetic… xử lý kỹ thuật nhuộm băng quan sát Bằng phương pháp nhuộm thông thường phân biệt số nhỏ NST, kỹ thuật nhuộm băng đề xuất áp dụng Cơ sở kỹ thuật nhuộm băng cấu trúc hoạt động ADN NST: vùng dị nhiễm sắc vùng nhiễm sắc thực NST bắt màu khác nhuộm (vùng dị nhiễm sắc – heterochromatin- chứa nhiều Adenosin Thyamin vùng nhiễm sắc thực – euchromatin- chứa nhiều Guanin Cytosin nên có lực cao với thuốc nhuộm giemsa) Có nhiều kỹ thuật băng sử dụng: băng Q (NST nhuộm Quinacrine), phương pháp nhuộm màu sử dụng để quan sát NST Phương pháp cần quan sát kính hiển vi huỳnh quang khơng sử dụng rộng rãi băng G- tiêu NST xử lý dung dịch enzyme phân giải protein trypsin alphachymotrypsin, sau nhuộm giemsa Băng đảo ngược (Reverses banding R-banding), hình ảnh băng sẫm băng nhạt xuất NST ngược với hình ảnh băng G Băng C – tiêu xử lý dung dịch muối kiềm nhiệt độ cao, sau nhuộm giemsa quan sát kính hiển vi quang học để quan sát phần tâm NST Băng T: sau nhuộm xong NST biểu số băng nhuộm màu, phần lớn đầu mút NST Băng N phương pháp nhuộm bạc: phần chứa gen mã ARN – ribosom nhánh ngắn NST tâm đầu bắt màu đậm Bằng kỹ thuật nhuộm băng xác định xác vị trí tất NST karyotype Ở hầu hết trường hợp, kỹ thuật băng G thực Các băng đậm, nhạt phát kỹ thuật nhuộm băng G thể thành băng nhạt, đậm tương ứng băng R Các băng đánh số liên tục từ tâm động, hai cánh ngắn (p) cánh dài (q) Tổng số băng karyotype phụ thuộc vào độ dài nhiễm sắc thể, giai đoạn nguyên phân mà chúng xuất Độ phân giải 350 băng tương ứng nhiễm sắc thể kỳ muộn Phương pháp đặc biệt hữu ích cho việc nhuộm đầu xa nhiễm sắc thể Để băng có độ phân giải cao, nhuộm NST kỳ trước kỳ sớm (prometaphase), trước nhiễm sắc thể co ngắn tối đa Vì nhiễm sắc thể kỳ không co ngắn nhiều so với nhiễm sắc thể kỳ giữa, số băng quan sát tất nhiễm sắc thể tăng từ khoảng 300 đến 450 đến khoảng 800 Điều cho phép phát bất thường cấu trúc nhiễm sắc thể mà khơng nhìn thấy với nhuộm băng thơng thường Hình 1: Hình ảnh băng NST 18 người với độ phân giải khác Đánh giá NST gồm bước: quan sát tiêu NST kính hiển vi quang học, tìm TB kỳ có NST dàn để đếm số lượng NST Trung bình mẫu phải đánh giá 30 cụm kỳ Phát phân tích rối loạn số lượng cấu trúc NST, lập karyotype, chụp ảnh cụm kỳ giữa, in phóng ảnh, cắt rời NST sau xếp cặp theo qui ước quốc tế Hiện người ta sử dụng hệ thống chụp, bắt cụm nhiễm sắc thể, cắt dán NST, lập karyotype tự động nhờ phần mềm đặc hiệu Ikaros cho phân tích NST NST đánh giá theo tiêu chuẩn quốc tế ISCN Quan sát karyotype phát hiện: - Những đột biến liên quan với số lượng NST (như dạng đa bội NST, lệch bội NST: dạng trisomy (hội chứng Down, hội chứng Edwards, hội chứng Klinefelter ) hay monosomy (như hội chứng Turner 45,X ) - Những đột biến liên quan đến bất thường cấu trúc NST (như chuyển đoạn, đảo đoạn, nhân đoạn, NST vòng, NST hai tâm ) Kỹ thuật dùng để phát trường hợp nghi ngờ có bất thường NST, sử dụng chẩn đoán trước sinh sau sinh, hay cặp vợ chồng có bất thường thai sản Quan sát nhiễm sắc thể gian kỳ Bên cạnh xét nghiệm NST kỳ giữa, xét nghiệm vật thể giới tính nhân tế bào gian kỳ xét nghiệm phát bất thường số lượng NST giới Xét nghiệm vật thể giới thường thực TB niêm mạc miệng, TB niêm mạc âm đạo, TB chân tóc… vật thể giới thường phân tích gồm vật thể Barr, vật thể Y vật thể dùi trống Hiện xét nghiệm khơng áp dụng để chẩn đoán bất thường NST giới tính II Kỹ thuật lai huỳnh quang chỗ FISH Lai huỳnh quang chỗ (Fluorescent in situ hybridization - FISH) kỹ thuật nghiên cứu di truyền sử dụng đầu dò huỳnh quang (ADN dò) gắn vào trình tự bổ sung nhiễm sắc thể kỳ gian kỳ Kỹ thuật coi phương pháp trung gian di truyền tế bào di truyền phân tử Phương pháp nhà nghiên cứu sinh y phát triển vào đầu năm 1980[4] dùng để dò tìm vị trí xác định có mặt trình tự ADN định nhiễm sắc thể Các đoạn dò ADN có đánh dấu huỳnh quang lai gắn lên vị trí tương ứng nhiễm sắc thể muốn tìm hiểu Sau lai, sản phẩm khảo sát kính hiển vi để tìm tín hiệu huỳnh quang đoạn dò lai Sự có hay khơng có tín hiệu huỳnh quang giúp suy có hay khơng có diện nhiễm sắc thể đặc hiệu tương ứng Có loại ADN dò như: ADN dò phần tâm (được sử dụng để phát bất thường số lượng NST, NST nhiều tâm mảnh khơng tâm), ADN dò đặc hiệu locus lai vùng NST (phát đột biến gen, rối loạn cấu trúc NST mà phương pháp nhuộm băng không phát đoạn nhỏ, nhân đoạn nhỏ…) hay ADN dò tồn NST (dùng ADN lai tồn chiều dài NST để phân biệt NST khác dựa vào màu sắc chúng Phương pháp chủ yếu phát rối loạn số lượng NST, cấu trúc NST ví dụ chuyển đoạn NST) Có thể sử dụng kỹ thuật mBand FISH (multicolour) để phát bất thường số lượng bất thường cấu trúc tồn NST Hình 2: Kỹ thuật FISH Lai FISH thường sử dụng để tìm điểm đặc biệt ADN, ứng dụng tư vấn di truyền, y học xác định loài Lai FISH sử dụng để phát xác định vị trí ARN đích đặc hiệu bên tế bào, tế bào khối u tuần hoàn di mẫu mô Trong trường hợp này, lai FISH giúp xác định biểu gen (trong tế bào mô định khoảng thời gian khác trình phát triển) Hiện FISH thường định chẩn đoán nhanh trước sinh liên quan đến rối loạn số loại nhiễm sắc thể hay gặp (13, 16,18,21, 22, X,Y) cho trường hợp thai nguy cao bị Hội chứng Down, Hội chứng Edwards, Hội chứng Turner, Hội chứng Klinefelter…Loại mẫu sử dụng cho kỹ thuật gồm: tế bào dịch ối, tế bào gai nhau, tế bào máu dây rốn Ngồi ra, FISH sử dụng để chẩn đoán, đánh giá tiên lượng, đánh giá tái phát bệnh, ví dụ ung thư FISH sử dụng để tìm kiếm tế bào bị bệnh dễ so với phương pháp di truyền tế bào khác, phương pháp thường đòi hỏi tế bào pha phân chia, đòi hỏi thời gian, bước chuẩn bị thủ công tốn thời gian, sức lực kinh nghiệm kỹ thuật viên phân tích tiêu Ngược lại, phương pháp lai FISH không cần đòi hỏi tế bào sống đánh giá định lượng cách tự động, máy tính đếm điểm huỳnh quang Tuy nhiên, kỹ thuật viên yêu cầu phải đào tạo phân biệt khác biệt nhỏ kiểu xếp băng nhiễm sắc thể kỳ chúng bị bẻ cong hay xoắn lại FISH kỹ thuật sử dụng để phân tích để phát bất thường số loại NST (13,16,18,21,22,X,Y) sàng lọc tiền làm tổ (PGS – Preimplantation Genetic Screening) PGS kỹ thuật dùng để xác định bất thường hay gặp nhiễm sắc thể giao tử hay phôi giai đoạn trước phôi bám vào nội mạc tử cung để làm tổ Q trình chẩn đốn di truyền trước làm tổ bao gồm hai giai đoạn sinh thiết chẩn đoán di truyền Tuy nhiên, nhược điểm FISH PGS phân tích 7-9 NST 23 cặp NST người Để khắc phục nhược điểm người ta dùng kỹ thuật lai ghép gen có so sánh (comparative genomic hybridization – CGH) array CGH III DI TRUYỀN PHÂN TỬ Phương pháp di truyền phân tử phân tích ADN sản phẩm từ gen Nguyên liệu di truyền học phân tử acid nucleic (ADN ARN), nguyên liệu khuếch đại nhờ phản ứng PCR, sản phẩm phản ứng khuếch đại phân tích nhiều phương pháp khác tùy vào mục đích Các kỹ thuật di truyền phân tử gồm: tách chiết acid nucleic, điện di ADN, lai ADN, nhân ADN PCR Di truyền học phân tử cho phép: - Phát biến đổi ADN, protein - Phát người lành mang gen - Phát sớm rối loạn chuyển hóa Các kỹ thuật di truyền phân tử có vai trò quan trọng chẩn đốn trước sinh, sau sinh chẩn đoán tiền làm tổ (PGD) Kỹ thuật tách chiết acid nucleic ADN ARN tách trực tiếp từ tế bào ADN tách chiết từ tế bào sau ni cấy Có nhiều phương pháp tách chiết ADN/ARN qua bước: phá vỡ màng TB, loại bỏ thành phần không mong muốn protein, polysaccarid bước cuối tủa ADN/ARN 1.1 Nguyên tắc Sự tách chiết dựa nguyên tắc hòa tan khác phân tử khác (nucleic acid/protein) hai pha khơng hòa tan (phenol, chloroform/nước) Trong tách chiết ARN cần lưu ý: ARN phân tử bền nên để có kết tốt nhất, việc thao tác phải thực điều kiện nghiêm ngặt: lạnh, mang găng tay, thao tác tủ cấy vô trùng 1.2 Các bước tiến hành - Phá vỡ màng TB màng nhân: nghiền dùng nito lỏng hay dùng hỗn hợp chất tẩy (SDS, Sarcosyl) proteinase K - Loại bỏ thành phần không mong muốn: dùng hỗn hợp phenol: chloroform: isoamine theo tỉ lệ 25:24:1 - Tủa ADN/ARN: tủa ethanol: thực nồng độ muối cao, nồng độ ethanol cao (2-2.5 thể tích ethanol/thể tích dung dịch cần tủa), nhiệt độ thấp thúc đẩy tủa tủa isopropanol: khơng cần muối, sử dụng 0.8-1 thể tích isopropanol/thể tích dung dịch cần tủa, đoạn ADN/ARN thật ngắn dù nồng độ cao không tủa cách nên loại bỏ chúng dễ dàng - Hòa tan ADN/ARN - ADN ARN sau tách chiết kiểm tra nồng độ độ tinh máy Nanodrop - ADN/ARN tách chiết trực tiếp từ mẫu máu toàn phần, từ khối bạch cầu, từ mô, từ mẫu máu giấy thấm khô DBS, từ mẫu tế bào nuôi cấy Trong nghiên cứu sử dụng kỹ thuật hòa tan ADN từ mẫu máu tồn phần sử dụng kit QIAamp ADN theo hướng dẫn nhà sản xuất Trong chẩn đốn trước sinh, việc ni cấy tế bào ối thực trước tách chiết ADN nhằm tăng số lượng tế bào giảm nguy lẫn ADN từ máu mẹ Trong nghiên cứu mình, chúng tơi tiến hành chọc ối để chẩn đốn trước sinh cho thai phụ có tử vong mắc bệnh Pompe Thai phụ chồng làm xác định người mang đột biến gen GAA, mang thai lần thai chọc ối tuần thứ 16 để làm xét nghiệm phân tích gen Sau chọc ối, tế bào ối nuôi cấy môi trường Amniotic, sau tiến hành tách chiết ADN từ tế bào ối nuôi cấy Điện di AND Nguyên lý: dựa khả di chuyển acid nucleic môi trường có điện cường độ thích hợp Acid nucleic phân tử tích điện âm nên di chuyển từ cực âm đến cực dương Tùy theo kích thước phân tử acid nucleic mà dùng loại gel khác nhau: phân tử ADN có kích thước 500 bp điện di gel polyacrylamid, kích thước 500-10000 bp điện di gel agarose phân tử ADN có kích thước lớn 10.000bp điện di gel agarose có lỗ to - Để quan sát hình ảnh điện di cần nhuộm ADN ethidium bromide quan sát ánh sáng tử ngoại - Khi chạy điện di cần chạy với đoạn ADN mẫu (marker) để so sánh, xác định số lượng nu đoạn ADN Phản ứng chuỗi polymerase (PCR) PCR Mullis cộng đề xuất năm 1983[6] Đây phương pháp với mục đích phát nhân đoạn ADN nhiều lần ống nghiệm Nguyên lý kỹ thuật dùng đoạn ADN mồi đặc hiệu để khuếch đại đoạn ADN đích Thành phần phản ứng PCR gồm: phân tử ADN cần nhân lên (ADN template), đoạn ADN mồi (primer), loại nucleotid (dATP, dATP, dGTP dTTP), Taq polymerase (enzyme polymerase có tính chịu nhiệt cao, tách chiết từ vi khuẩn Thermus aquaticus), dung dịch đệm cung cấp môi trường tối ưu cho hoạt động enzyme polymerase, ion Mg2+, Mn2+ …[7] Phản ứng PCR thực qua nhiều chu kỳ (thường từ 20-40 chu kỳ), chu kỳ gồm giai đoạn: biến tính (ủ ADN 92-95 oC để tách sợi đơn ADN), lai ghép (ADN mồi lai ghép với sợi đơn ADN ban đầu, nhiệt độ 50 -52oC) giai đoạn tổng hợp ADN (Taq polymerase điều khiển gắn tiếp Nu ADN mồi dựa vào ADN ban đầu làm khuôn, thực 70-72 oC) Sau chu kỳ, từ phân tử ADN ban đầu tổng hợp nên phân tử ADN mới, đến chu 10 4.2 Tạo gen đơn dòng Mục đích kỹ thuật đưa đoạn ADN cần thiết vào, loại bỏ đoạn ADN bất lợi để tạo phân tử ADN lai quy định tổng hợp nên sản phẩm có chất lượng cao, số lượng nhiều thời gian ngắn Các bước gồm: chọn ADN cho nhận (vector- thường plasmid vi khuẩn, phage), dùng enzyme giới hạn để cắt ADN cho ADN vector, dùng enzyme nối để nối ADN cho ADN vector để tạo phân tử lai, đưa phân tử lai vào vi khuẩn, cấy truyền khuẩn lạc Hình 5: Các bước tạo gen đơn dòng 4.3 Lai ghép gen có so sánh (comparative genomic hybridization – CGH) 15 CGH thực việc so sánh mẫu ADN cần phân tích với mẫu ADN chứng thơng qua khác biệt ADN để phát trường hợp đoạn nhân đoạn có ADN Nguyên lý kỹ thuật array ADN dựa khả bắt cặp (lai) mạch đơn ADN theo nguyên tắc bổ sung Trong kỹ thuật này, hàng ngàn đoạn dò xếp cách xác vị trí xác định lam kính (chip) ADN cần phân tích ADN chứng cắt thành đoạn ngắn đánh dấu huỳnh quang khác (ADN cần phân tích đánh dấu màu đỏ, ADN chứng màu xanh), sau trộn với chip tiến hành q trình lai Sau hồn tất trình lai, chip đọc máy quét microarray để đo đoạn huỳnh quang màu đỏ màu xanh lục phân tích phần mềm để xác định tình trạng thừa, thiếu hay cân vật liệu di truyền ADN cần phân tích ADN chứng 16 Hình 6: Sơ đồ kỹ thuật CGH CGH dùng để phân tích di truyền sau sinh thiết phơi chẩn đốn di truyền tiền làm tổ Sử dụng enzyme cắt giới hạn Enzyme cắt giới hạn có đặc điểm cắt ADN vị trí xác định Các enzyme tách chiết từ vi khuẩn, có khả cắt ADN xoắn kép vị trí xác định thường có từ 4-8 nucleotid đặc trưng Kỹ thuật thường sử dụng để phát có mặt đột biến tạo phản ứng PCR mà ĐB cấu thành vị trí cắt enzyme mà sợi ADN khn ban đầu khơng có Sau cắt, đoạn ADN điện di gel agarose để xác định tính chất dùng để tạo nên phân tử ADN lai 17 M Hình 7: Hình ảnh điện di sản phẩm sau dùng enzyme cắt giới hạn để tìm đột biến IVS4+919 G>A M: marker 2: Nam, ĐB 1, 4: Bình thường 3: Nữ, dị hợp tử Xác định trình tự nucleotid phân tử ADN (sequencing) 6.3 Giải trình tự phương pháp hóa học Phương pháp hóa học Maxam Gilbert phát minh năm 1977 Nguyên tắc phương pháp trước hết cần đánh dấu đầu đoạn ADN cần giải trình tự gốc phospho đồng vị phóng xạ ( 32P), xử lý đoạn ADN đánh dấu với chất hóa học có khả làm biến đổi đặc hiệu loại base nucleotid đoạn ADN (ví dụ dimethylsulphate biến đổi Guanine, hydrazin biến đổi Thymine Cytosine… cần dùng ống nghiệm ống nghiệm ADN xử lý với lượng hạn chế chất hóa học để phá hủy nucleotid, với mục đích ống nghiệm chứa đoạn ADN mà đoạn ADN có vị trí chứa nucleotide đặc hiệu bị biến đổi Các đoạn ADN điện di gel polyacrymid phát chụp hình phóng xạ: đoạn ADN đánh dấu phóng xạ 18 rõ gel, kích thước chúng biểu khoảng cách từ đầu đánh dấu đến vị trí nu cần xác định Hình 8: Giải trình tự phương pháp hóa học 6.4 Phương pháp enzyme học (phương pháp Sanger) Phương pháp đề xuất năm 1977 Nguyên lý phương pháp dùng dideoxyribonucleotid (ddNTP) để tránh gắn thêm nu (ddNTP OH vị trí carbon số 3, nơi gốc phosphat gắn vào) Trước hết đoạn ADN cần xác định trình tự chèn vào vector phage plasmid vị trí mà trình tự chuỗi biết rõ Sau vector đưa vào TB vi khuẩn để nhân lên, sai tách chiết tinh chiết vector từ vi khuẩn để thành vector tự Dùng đoạn mồi bổ sung cách đặc hiệu với trình tự vector vị trí chèn đoạn ADN Thêm vào ống phản ứng enzyme ADN polymerase loại nu tự (dNTP) lượng giới hạn nucleotid tận (ddNTP) vào ống Bắt đầu từ đoạn mồi, enzyme ADN polymerase kéo dNTP vào để tổng hợp mạch đơn bổ sung với mạch ADN chèn vector, tổng hợp mạch đơn bị dừng lại vị trí ddNTP kéo vào thay dNTP Kết ống phản ứng có 19 mạch đơn ADN có chiều dài khác nhai tương ứng với vị trí trình tự nu đoạn ADN gốc Để giải trình tự người ta dùng phương pháp điện di gel polyacrylamide biến tính Hình 9: Giải trình tự phương pháp enzyme 6.5 Giải trình tự trực tiếp: Được tiến hành từ sản phẩm PCR Dựa nguyên lý phương pháp enzyme, nhiên đoạn ADN đánh dấu huỳnh quang để mạch đơn phát sáng qua chùm laser 20 Người ta dùng màu huỳnh quang để đánh dấu ddNTP, phản ứng cần diễn ống nghiệm giải trình tự cần điện di hàng Hình 10: kết giải trình tự trực tiếp gen GLA BN có đột biến c.[178 C>T] Giải trình tự trực tiếp có ưu điểm giải trình tự nhiều đoạn gen khác sản phẩm PCR Vì có số đột biến phát sinh q trình PCR nên trình tự gen sản phẩm đại diện cho tất đoạn ADN sản phẩm đó, cần giải trình tự vài mẫu riêng biệt để đảm bảo đoạn ADN đích với trình tự xác khẳng định IV PHƯƠNG PHÁP DI TRUYỀN HÓA SINH Sự sống tập hợp phản ứng hóa sinh phức tạp việc nghiên cứu vai trò gen phản ứng hóa sinh vơ quan trọng Di truyền hóa sinh phương pháp phân tích, định lượng số sản phẩm gen phân tích, định lượng protein: enzyme, hormon, hemoglobin… sở cần thiết để nghiên cứu di truyền, đặc biệt xét nghiệm chẩn đoán số bệnh tật liên quan 21 Ví dụ bệnh Pompe bệnh di truyền gen lặn NST thường, đột biến gen GAA mã hóa tổng hợp protein alphaglucosidase, dẫn đến khơng tổng hợp tổng hợp không đầy đủ enzyme này[8] Do việc đo hoạt độ enzyme GAA giúp chẩn đoán bệnh Pompe Tương tự với bệnh Fabry, bệnh DT gen lặn NST X, đột biến gen GLA mã hóa tổng hợp protein alphagalactosidase, dẫn đến không tổng hợp tổng hợp không đầy đủ enzyme này[9] Do việc đo hoạt độ enzyme GLA giúp chẩn đốn bệnh Fabry Có nhiều phương pháp để phân tích, định lượng protein sản phẩm gen nghiên cứu này, dùng phương pháp đo khối phổ song song để đo hoạt độ enzyme GLA GAA từ mẫu máu giấy thấm khơ (DBS)[10] Một mảnh DBS đường kính 3,2mm dùng cho vào giếng để tách chiết với có mặt dung dịch đệm tách chiết (20mM NaH2SO4 pH 7,1) Phản ứng enzyme thực với tham gia dung dịch cocktail phản ứng Sau 20 phản ứng enzyme dập tắt hỗn hợp EA : MeOH tỷ lệ 1:1 Bệnh phẩm rửa với dung dịch EtAc : Nước với tỷ lệ 1:1, làm khơ nito nóng, hòa tan dung dịch EtAc : MeOH tỷ lệ 1:1, sau làm silica 250µl EtAc: MeOH 19:1 Bệnh phẩm lại làm khô lần nito ấm, sau thêm pha động (80% Acetonitrile + 20% nước có 0,2% acid formic) đo máy tandem mass 22 Hình 11: hình ảnh kết hoạt độ enzyme GLA thấp Trong Fabry, thiếu hụt enzyme GLA dẫn đến khơng thối hóa globotriaosylceramide (Gb3), làm chất bị ứ đọng tế bào Việc định lượng Gb3 huyết nước tiểu định Fabry để theo dõi điều trị Gb3 định lượng phương pháp đo khối phổ V PHƯƠNG PHÁP LẬP GIA HỆ VÀ PHÂN TÍCH GIA HỆ Phương pháp nghiên gia hệ dùng để phân tích tính trạng hay bệnh tật xem có di truyền hay khơng quy luật di truyền Theo dõi tính trạng bệnh tật qua ba hệ lập đồ gia hệ, cá thể ký hiệu theo quy ước quốc tế tùy theo giới tính, có mang bệnh tật cần phân tích hay khơng, có người mang gen hay không… Bản đồ gia hệ thường vẽ theo hình bậc thang, từ xuống theo thứ tự hệ ông bà, cha mẹ, cháu Trong nghiên cứu mình, chúng tơi sử dụng phương pháp để lập phân tích gia hệ bệnh nhân mắc bềnh Fabry Pompe để từ thấy quy luật di truyền bệnh 23 Hình 12: gia hệ gia đình mắc bệnh Fabry 24 TÀI LIỆU THAM KHẢO T V Bảo (2010) Di truyền y học, NXB Giáo dục Việt Nam, Hà Nội T T Văn (2010) PCR số kỹ thuật y sinh học phân tử, NXB Y học, Hà Nội G K.M (1991) Chromosome stains In The ACT Cytogenetics Laboratory, P R L Langer-Safer, M.; Ward, D C (1982) Immunological method for mapping genes on Drosophila polytene chromosomes Proceedings of the National Academy of Sciences, 79 (14), R F Amann, Bernhard M (2008) Single-cell identification in microbial communities by improved fluorescent in situ hybridization techniques Nature Reviews Microbiology, (5), P Rabinow (1996) Making PCR: A Story of Biotechnology University of Chicago Press, Chicago, J S D W Russel (2001) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, New York G N Eng CM, Wilcox WR, et al (2001) Safety and efficacy of recombinant human ?-galactosidase A replacement therapy in fabrys disease N Engl J Med, 345, 9-16 (2016) Fabry disease, , 10 C.-C C Hsuan-Chieh Liao, Dau-Ming Niu et al (2014) Detecting Multiple Lysosomal Storage Diseases by Tandem Mass Spectrometry- A National Newborn Screening Program in Taiwan., 11 R M Demko Z, Johnson D (2010) Current Methods for Preimplantation Genetic Diagnosis JouARNl of Clinical Embryology, 13 (1), 6-12 25 CÁC CHỮ VIẾT TẮT ADN Acid deoxyribonucleic ARN Acid ribonucleic BN Bệnh nhân bp Cặp base (base pair) CGH Comparative genomic hybridization- kỹ thuật lai có so sánh ĐB Đột biến DT Di truyền dNTP Deoxynuceotide triphosphate FISH Kỹ thuật lai chỗ GAA Alpa glucosidase A GLA Alpha galactosidase A IVS InterVening Sequence MLPA Multiplex ligation-dependent probe amplification NST Nhiễm sắc thể PCR Polymerase chain reaction – Phản ứng chuỗi polymerase 26 DANH MỤC HÌNH Hình 1: Hình ảnh băng NST 18 người với độ phân giải khác .4 Hình 2: Kỹ thuật FISH Hình 3: Hình ảnh điện di sản phẩm PCR khuếch đại gen GLA 11 Hình 4: Kỹ thuật MLPA 14 Hình 5: Các bước tạo gen đơn dòng 15 Hình 6: Sơ đồ kỹ thuật CGH .17 Hình 7: Hình ảnh điện di sản phẩm sau dùng enzyme cắt giới hạn để tìm đột biến IVS4+919 G>A .18 Hình 8: Giải trình tự phương pháp hóa học 19 Hình 9: Giải trình tự phương pháp enzyme .20 Hình 10: kết giải trình tự trực tiếp gen GLA BN có đột biến c.[178 C>T] 21 Hình 11: hình ảnh kết hoạt độ enzyme GLA thấp .23 Hình 12: gia hệ gia đình mắc bệnh Fabry 24 27 MỤC LỤC ĐẶT VẤN ĐỀ 1.1.Nguyên tắc 1.2.Các bước tiến hành 4.2.Tạo gen đơn dòng 15 TÀI LIỆU THAM KHẢO 25 CÁC CHỮ VIẾT TẮT 26 ADN .26 Acid deoxyribonucleic 26 ARN .26 Acid ribonucleic 26 BN 26 Bệnh nhân .26 bp 26 Cặp base (base pair) .26 CGH .26 Comparative genomic hybridization- kỹ thuật lai có so sánh 26 ĐB 26 Đột biến 26 DT 26 Di truyền .26 dNTP .26 Deoxynuceotide triphosphate 26 FISH 26 28 Kỹ thuật lai chỗ .26 GAA .26 Alpa glucosidase A .26 GLA .26 Alpha galactosidase A 26 IVS 26 InterVening Sequence 26 MLPA 26 Multiplex ligation-dependent probe amplification 26 NST 26 Nhiễm sắc thể 26 PCR 26 Polymerase chain reaction – Phản ứng chuỗi polymerase .26 DANH MỤC HÌNH 27 29 ... phân tích, định lượng protein: enzyme, hormon, hemoglobin… sở cần thiết để nghiên cứu di truyền, đặc biệt xét nghiệm chẩn đoán số bệnh tật liên quan 21 Ví dụ bệnh Pompe bệnh di truyền gen lặn NST... sử dụng để tìm điểm đặc biệt ADN, ứng dụng tư vấn di truyền, y học xác định loài Lai FISH sử dụng để phát xác định vị trí ARN đích đặc hiệu bên tế bào, tế bào khối u tuần hoàn di mẫu mô Trong... lập phân tích gia hệ bệnh nhân mắc bềnh Fabry Pompe để từ thấy quy luật di truyền bệnh 23 Hình 12: gia hệ gia đình mắc bệnh Fabry 24 TÀI LIỆU THAM KHẢO T V Bảo (2010) Di truyền y học, NXB Giáo