Nghiên cứu chuyển gen kháng thuốc trừ cỏ vào phôi hợp tử chưa trưởng thành của cây ngô thông qua vi khuẩn agrobacterium

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN - PHẠM THỊ HƢƠNG NGHIÊN CỨU CHUYỂN GEN KHÁNG THUỐC TRỪ CỎ VÀO PHÔI HỢP TỬ CHƢA TRƢỞNG THÀNH CỦA CÂY NGÔ THÔNG QUA VI KHUẨN AGROBACTERIUM LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC Hà Nội – 2014 ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN - PHẠM THỊ HƢƠNG NGHIÊN CỨU CHUYỂN GEN KHÁNG THUỐC TRỪ CỎ VÀO PHÔI HỢP TỬ CHƢA TRƢỞNG THÀNH CỦA CÂY NGÔ THÔNG QUA VI KHUẨN AGROBACTERIUM Chuyên ngành: Sinh học thực nghiệm Mã số: 60 420 114 LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC Ngƣời hƣớng dẫn khoa học: TS PHẠM THỊ LÝ THU Hà Nội – 2014 i LỜI CẢM ƠN Để hoàn thành luận văn trước tiên xin bày tỏ lời cảm ơn chân thành sâu sắc tới TS Phạm Thị Lý Thu tận tâm, nhiệt tình bảo, hướng dẫn tơi suốt q trình học tập thực luận văn thạc sĩ Tôi xin bày tỏ lịng biết ơn chân thành tới thầy giáo phịng Sau Đại học, thầy giáo khoa Sinh học – Trường Đại học Khoa học Tự nhiên – Đại học Quốc Gia Hà Nội quan tâm tạo điều kiện thuận lợi cho thời gian hồn thành khóa học hồn thành luận văn tốt nghiệp Tôi xin chân thành cảm ơn chú, anh chị em đồng nghiệp Phịng Thí nghiệm Trọng điểm Công nghệ Tế bào Thực vật – Viện Di truyền Nông nghiệp quan tâm, giúp đỡ nhiệt tình suốt thời gian tơi thực luận văn Cuối cho phép gửi lời cảm ơn tới gia đình, bạn bè tất người thân u ln động viên, khích lệ, giúp đỡ tơi q trình học tập nghiên cứu Tơi xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành giúp đỡ quý báu Hà Nội, tháng năm 2014 Học viên Phạm Thị Hương ii MỤC LỤC Lời cảm ơn i Danh mục bảng iv Danh mục hình v Ký hiệu viết tắt vi MỞ ĐẦU CHƢƠNG I TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Nguồn gốc, phân loại vai trị ngơ 1.1.1 Nguồn gốc phân loại ngô 1.1.2 Vai trị ngơ 1.2 Các yếu tố ảnh hƣởng đến hiệu chuyển gen vào mầm nhờ vi khuẩn Agrobacterium 1.2.1 Ảnh hưởng kiểu gen 1.2.2 Dạng mẫu mơ đích 1.2.3 Chủng Agrobacterium plasmid 1.2.4 Các điều kiện xử lý mẫu mơ đích, lây nhiễm đồng ni cấy 1.3 Tình hình nghiên cứu chuyển gen vào ngô 10 1.4 Nghiên cứu tạo trồng biến đổi gen kháng thuốc trừ cỏ 13 1.4.1 Thuốc trừ cỏ Glyphosate 13 1.4.2 Thuốc diệt cỏ gluphosinate 15 1.4.3 Các gen sử dụng tạo giống trồng biến đổi gen chống chịu thuốc trừ cỏ 16 1.4.4 Giống trồng biến đổi gen kháng thuốc trừ cỏ - Thành tựu triển vọng 18 CHƢƠNG II VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 20 2.1 Vật liệu, hóa chất thiết bị 20 2.1.1 Vật liệu 20 2.1.2 Hố chất thiết bị máy móc 21 2.1.3 Địa điểm thực 21 2.2 Phƣơng pháp nghiên cứu 21 2.2.1 Phương pháp biến nạp gen thông qua vi khuẩn A tumefaciens 21 2.2.2 Chọn lọc nồng độ glyphosate để chọn lọc ngô chuyển gen điều kiện nhà lưới 23 2.2.3 Thử khả kháng thuốc trừ cỏ chuyển gen điều kiện nhà lưới 24 iii 2.2.4 Thí nghiệm nảy mầm hạt ngơ hệ T0 24 2.2.5 Phương pháp phân tích sinh học phân tử chuyển gen 24 2.2.6 Phương pháp thu thập số liệu thống kê 27 CHƢƠNG III KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 28 3.1 Nghiên cứu đánh giá khả tiếp nhận gen CP4 EPSPS dịng ngơ 28 3.2 Chọn lọc nồng độ glyphosate để chọn lọc ngô chuyển gen điều kiện nhà lƣới 33 3.3 Kết phân tích PCR có mặt gen kháng thuốc trừ cỏ EPSPS dịng ngơ chuyển gen hệ T0 34 3.4 Kết phân tích Southern blot dịng ngơ chuyển gen kháng thuốc trừ cỏ 39 3.5 Đánh giá có mặt protein EPSPS dịng ngơ chuyển gen kháng thuốc trừ cỏ 41 3.6 Kết đánh giá khả kháng thuốc trừ cỏ glyphosate dòng ngô chuyển gen EPSPS điều kiện nhà lƣới 43 3.7 Đánh giá phân ly gen EPSPS dịng ngơ chuyển gen kháng cỏ hệ T1 45 CHƢƠNG IV KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 48 4.1 Kết luận 48 4.2 Kiến nghị 48 TÀI LIỆU THAM KHẢO 49 PHỤ LỤC iv DANH MỤC BẢNG Bảng 2.1 Công thức môi trƣờng 23 Bảng 2.2 Trình tự đoạn mồi sử dụng phản ứng PCR 26 Bảng 2.3 Thành phần phản ứng PCR gen EPSPS 26 Bảng 3.1 Kết biến nạp gen EPSPS vào dịng ngơ vụ Đơng Xuân 29 Bảng 3.2 Kết biến nạp gen EPSPS vào dịng ngơ vụ Hè Thu 30 Bảng 3.3 Khảo sát nồng độ glyphosate chuyển gen 33 Bảng 3.4 Hàm lƣợng ADN chuyển gen 35 Bảng 3.5 Kết phân tích PCR gen kháng thuốc trừ cỏ EPSPS dịng ngơ chuyển gen 36 Bảng 3.6 Hiệu chuyển gen thông qua vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens 39 Bảng 3.7 Kết xác định protein EPSPS dịng ngơ chuyển gen kháng thuốc trừ cỏ 42 Bảng 3.8 Đánh giá khả kháng thuốc diệt cỏ dòng chuyển gen 44 Bảng 3.9 Kết nảy mầm hạt chuyển gen hệ T0 45 v DANH MỤC HÌNH Hình 1.1 Cây ngơ Hình 2.1 Các dịng ngơ trồng làm vật liệu chuyển gen nhà lƣới cách ly côn trùng 20 Hình 2.2 Cấu trúc vector chuyển gen mang gen EPSPS 20 Hình 2.3 Tách phơi từ bắp ngơ dịng CM8 (Vụ Hè Thu, ngày sau thụ phấn) 22 Hình 3.1 Kết biến nạp gen EPSPS vào dòng ngơ vụ Đơng Xn 30 Hình 3.2 Kết biến nạp gen EPSPS vào dịng ngơ vụ Hè Thu 31 Hình 3.3 Các giai đoạn q trình chuyển gen EPSPS vào dịng ngô VH1, CM8, CH9 32 Hình 3.4 Khảo sát nồng độ glyphosate xử lí bề mặt ngô chuyển gen mẫu đối chứng (lá ngô không chuyển gen) 34 Hình 3.5 Kết điện di kiểm tra mẫu DNA tổng số gel agarose 0,8% 35 Hình 3.6 Kết phân tích PCR gen EPSPS T0 dòng CM8 37 Hình 3.7 Kết phân tích PCR gen EPSPS T0 dịng CH9 37 Hình 3.8 Kết phân tích PCR gen EPSPS T0 dịng VH1 39 Hình 3.9 DNA tổng số dịng ngơ chuyển gen đƣợc cắt enzyme BamHI 40 Hình 3.10 Kết phân tích Southern blot dịng ngơ chuyển gen kháng thuốc trừ cỏ EPSPS 41 Hình 3.11 Kết đánh giá diện protein EPSPS dịng ngơ chuyển gen kháng thuốc trừ cỏ 43 Hình 3.13 Kết đánh giá khả nảy mầm hạt dịng ngơ chuyển gen hệ T1 môi trƣờng chọn lọc 46 Hình 3.14 Cây chuyển gen kháng thuốc trừ cỏ hệ T1 dòng CH9 sau lần phun Vifosate 47 vi KÝ HIỆU VIẾT TẮT 2,4D Dichlorophenoxy acetic acid ADN Deoxyribonucleic Acid AS Acetosyringone bp Base pair CTAB Cetyltrimethylammonium Bromide CIMMYT International maize and wheat improvement center EPSPS 5-enolpyruvylshikimate 3-phosphate synthase EDTA Ethylene Diamine Tetraacetace Axit FAO Food and Agriculture Organization nptII neomycin phosphotransferase OD optical density PCR Polymerase Chain Reaction Pat/bar phosphinotricin acetyltransfer T-AND Transfer-DNA MỞ ĐẦU Ngô ba lƣơng thực quan trọng giới (cùng với lúa mì gạo) lƣơng thực có vai trị kinh tế quan trọng bậc Tính đến năm 2013 diện tích trồng ngơ giới vào khoảng 177 triệu [65] Theo dự đốn vào năm 2020, nhu cầu ngơ tăng lên 50% với 852 triệu năm vƣợt qua gạo lúa mì [35] Hiện ngành sản xuất ngơ giới nói chung nƣớc ta nói riêng phải đối mặt với nhiều vấn đề nhƣ: khí hậu biến đổi phức tạp, hạn hán, lũ lụt ngày nặng nề hơn, đặc biệt cỏ dại vấn đề lớn nông nghiệp làm giảm suất trồng từ 10 – 15% Do đó, hàng loạt biện pháp phòng trừ cỏ dại đƣợc áp dụng nhƣ: sử dụng loại thuốc diệt cỏ chọn lọc không chọn lọc Đặc biệt vùng có tƣợng xói mịn đất, thuốc diệt cỏ đƣợc sử dụng nhƣ giải pháp để loại trừ cỏ dại Tuy nhiên, việc lạm dụng số thuốc diệt cỏ có độc tính cao gây hậu nghiêm trọng môi trƣờng, hệ sinh thái sức khỏe ngƣời Điều đặt nhiệm vụ to lớn cho nhà chọn giống, nhà nghiên cứu công nghệ sinh học chọn tạo giống ngơ có suất cao, chống chịu thuốc diệt cỏ Các giống trồng biến đổi gen mang đặc tính khác đƣợc nghiên cứu áp dụng vào thực tiễn nhằm nâng cao suất trồng, tăng thu nhập cho ngƣời lao động Hàng năm, số lƣợng nông dân quốc gia trồng trồng biến đổi gen liên tục gia tăng Cây ngô chuyển gen đƣợc thƣơng mại hóa vào năm 1996, đến năm 2013 diện tích trồng ngơ biến đổi gen đạt 57,4 triệu 17 nƣớc, có nƣớc trồng triệu bao gồm: Hoa Kỳ (35,6 triệu ha), Brazil (12,9 triệu ha), Argentina (3,2 triệu ha), Nam Phi (2,4 triệu ha) Canada (1,7 triệu ha) Ngô chuyển gen kháng thuốc diệt cỏ giống trồng ƣu thế, chiếm 7,8 triệu tƣơng đƣơng với 5% diện tích trồng chuyển gen tồn cầu đƣợc trồng nƣớc [37] Ở Việt Nam, thời gian gần đây, nghiên cứu chuyển gen vào loài trồng đƣợc quan tâm, ý nhiều hơn, nhiên với đối tƣợng ngơ, nói lồi trồng tƣơng đối khó tính q trình ni cấy invitro nhƣ chuyển nạp gen, hiệu biến nạp gen thấp Mặt khác, việc tạo trồng chuyển gen có khả áp dụng vào sản xuất từ nghiên cứu nƣớc đòi hỏi cấp thiết lĩnh vực nghiên cứu công nghệ sinh học ngành nông nghiệp Việt Nam Các giống trồng biến đổi gen kháng thuốc trừ cỏ mang lại hiệu kinh tế cao, góp phần làm giảm nhiễm mơi trƣờng chi phí lao động nơng dân Xuất phát từ yêu cầu thực tiễn dựa sở lý luận khoa học nêu tiến hành đề tài “Nghiên cứu chuyển gen kháng thuốc trừ cỏ vào phôi hợp tử chưa trưởng thành ngô thông qua vi khuẩn Agrobacterium” Mục tiêu nghiên cứu Đánh giá khả tiếp nhận gen kháng thuốc trừ cỏ số dịng ngơ Việt Nam Nôi dung nghiên cứu Nghiên cứu đánh giá khả tiếp nhận gen EPSPS vào dịng ngơ Việt Nam Phân tích sinh học phân tử PCR có mặt gen kháng thuốc trừ cỏ EPSPS dịng ngơ chuyển gen hệ T0 hệ T1 Phân tích Southern blot có mặt gen kháng thuốc trừ cỏ Đánh giá có mặt protein EPSPS dịng ngơ chuyển gen kháng cỏ Đánh giá khả kháng thuốc trừ cỏ glyphosate dịng ngơ chuyển gen EPSPS điều kiện nhà lƣới 43 Hình 3.11 Kết đánh giá diện protein EPSPS dịng ngơ chuyển gen kháng thuốc trừ cỏ 3.6 Kết đánh giá khả kháng thuốc trừ cỏ glyphosate dịng ngơ chuyển gen EPSPS điều kiện nhà lƣới Các chuyển gen tái sinh đƣợc chuyển đất trồng, đạt – tiến hành đánh giá khả kháng thuốc diệt cỏ glyphosate Dựa kết sàng lọc chuyển gen phƣơng pháp hóa sinh, chúng tơi tiến hành phun thuốc glyphosate nồng độ 200 mg/l lên chuyển gen đối chứng Tiến hành phun lần, lần phun cách ngày Kết đƣợc thể bảng 3.8 44 Bảng 3.8 Đánh giá khả kháng thuốc diệt cỏ dịng chuyển gen Dịng ngơ Tổng số Số có mặt Số sống sót sau hệ T0 phun protein lần phun CM8 28 VH1 19 CH9 18 3 Đối chứng (CM8) 0 Đối chứng (VH1) 0 Đối chứng (CH9) 0 Kết thu đƣợc cho thấy có khác biệt rõ rệt dịng đối chứng (khơng chuyển gen) dịng ngô chuyển gen EPSPS kháng thuốc trừ cỏ Các đối chứng (cây không chuyển gen) sau lần phun xuất hiện tƣợng vàng lá, sau tiếp tục bị héo chết Trong đó, dịng chuyển gen sau lần phun có (2 thuộc dòng VH1, dòng CH9, dịng CM8) có khả kháng rõ rệt nhất, sống sót sinh trƣởng sau lần phun thuốc Vifosate với nồng độ glyphosate 200 mg/l (Hình 3.11) Kết đánh giá khả kháng thuốc trừ cỏ dịng ngơ chuyển gen cho thấy, hầu hết có kết dƣơng tính với protein có khả kháng lại thuốc trừ cỏ Các có mặt protein EPSPS, nhƣng khơng có khả kháng lại thuốc trừ cỏ hàm lƣợng protein EPSPS thấp, khơng đủ đáp ứng lại thuốc diệt cỏ glyphosate Nhƣ kết luận gen EPSPS đƣợc chuyển vào hệ gen bƣớc đầu biểu hoạt tính gen chuyển ngơ 45 Hình 3.12 Các ngô sau ngày phun Vifosat nồng độ 2% 3.7 Đánh giá phân ly gen EPSPS dịng ngơ chuyển gen kháng cỏ hệ T1 Để xác định phân ly gen chuyển hệ tiếp theo, tiến hành đánh giá khả nảy mầm hạt chuyển gen T0 mơi trƣờng nảy mầm có bổ sung glyphosate nồng độ 200 mg/l Lựa chọn ngẫu nhiên 30 hạt thuộc dịng ngơ đƣợc đánh giá có diện protein EPSPS bao gồm dòng CM8.53E; VH1.112E; CH9.80E, CH9.35E Những hạt đƣợc chọn đảm bảo có sức nảy mầm tốt Khử trùng hạt HgCl2 0,1% sau cho nảy mầm mơi trƣờng MS có bổ sung 200 mg/l glyphosate Kết thu đƣợc thể bảng 3.9 Bảng 3.9 Kết nảy mầm hạt chuyển gen hệ T0 Tổng số hạt thí Số hạt nảy Số hạt khơng STT Tên dịng T0 nghiệm mầm nảy mầm CM8.53Ea 35 26 VH1.112E 31 23 CH9.80E 32 29 CH9.35E 34 26 ĐC (CH9) 30 30 46 Kết thí nghiệm nảy mầm hạt chuyển gen hệ T0 cho thấy, số dòng chuyển gen có dịng chuyển gen có phân ly gen tuân theo quy luật 3:1 Menden có dịng có gen chuyển phân ly theo tỷ lệ 15:1 Theo quy luật phân ly Menden, gen chuyển nằm NST T0 tự thụ phấn, tỷ lệ phân ly mang gen/các không mang gen hệ T1 3:1, gen nằm NST cho tỷ lệ 15:1 tƣơng tự trƣờng hợp gen nằm 3, 4, 5….NST (3:1)n, n số nhiễm sắc thể mang gen chuyển Căn vào quy luật này, dịng CH9.80E có gen chuyển nằm NST khác nhau, dòng CM8.53Ea VH1.112E có gen chuyển nằm nhiễm sắc thể phân ly hệ T1 theo tỷ lệ 3:1 Hình 3.13 Kết đánh giá khả nảy mầm hạt dịng ngơ chuyển gen hệ T1 môi trƣờng chọn lọc 47 Những hạt nảy mầm đƣợc môi trƣờng chọn lọc đƣợc chuyển trồng đất để đánh giá khả kháng thuốc trừ cỏ Khi đƣợc – tiến hành phun thuốc trừ cỏ glyphosate Kết cho thấy hầu hết có khả kháng glyphosate, khơng có tƣợng vàng héo, đối chứng (không chuyển gen) chết sau phun thuốc Nhƣ vậy, bƣớc đầu chúng tơi kết luận gen EPSPS đƣợc chuyển thành công vào dịng ngơ Hình 3.14 Cây chuyển gen kháng thuốc trừ cỏ hệ T1 dòng CH9 sau lần phun Vifosate 48 CHƢƠNG IV KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 4.1 Kết luận Biến nạp gen EPSPS vào dịng ngơ VH1, CM8, CH9 thu đƣợc 65/120 sống sót đƣa bầu đất có 19/37 thuộc dịng VH1; 28/51 thuộc dịng CM8; 18/32 thuộc dòng CH9 Các chuyển gen sinh trƣởng, phát triển tốt có kiểu hình bình thƣờng so với đối chứng khơng đƣợc chuyển gen Trong số 65 chuyển gen tái sinh sống sót dịng thu đƣợc dịng CM8; dòng VH1; dòng CH9 cho kết dƣơng tính với PCR, có 2/6 dòng CM8, 1/3 dòng VH1, 2/5 dòng CH9 cho kết dƣơng tính với Southern blot Kết đánh giá có mặt protein thu đƣợc (4/6 dịng CM8; 3/3 dịng VH1; 3/5 dịng CH9 có mặt protein EPSPS Đánh giá khả kháng thuốc trừ cỏ glyphosate 65 hệ T0 có 3/28 dịng CM8; 2/19 dịng VH1; 3/18 dịng CH9 sống sót sau lần phun với nồng độ 200 mg/l Kết đánh giá tỷ lệ nảy mầm hạt dịng ngơ chuyển gen hệ T0 môi trƣờng MS bổ sung 200 mg/l glyphosate thu đƣợc: 3/4 dịng chuyển gen có phân ly gen chuyển theo tỷ lệ 3:1 dòng phân ly theo tỷ lệ 15:1 Các nảy mầm từ hạt T0 sống sót sau lần phun glyphosate 4.2 Kiến nghị Cần tiếp tục nghiên cứu đánh giá ổn định gen chuyển EPSPS dịng ngơ chuyển gen hệ nhằm chọn tạo đƣợc dịng ngơ chuyển gen kháng thuốc diệt cỏ ổn định làm nguồn vật liệu cho chọn tạo giống ngô 49 TÀI LIỆU THAM KHẢO TÀI LIỆU TIẾNG VIỆT Nguyễn Văn Đồng, Phạm Thị Lý Thu, Tạ Kim Nhung, Trịnh Thị Minh Thùy, Hà Văn Chiến, Lê Thanh Nga, Lê Thị Thu Về, Lê Thị Thu Hiền, Nông Văn Hải, Lê Huy Hàm (2010), “ Kết bƣớc đầu nghiên cứu chuyển gen kháng sâu cry1A(c) vào phơi non dịng ngơ mơ hình”, Tạp chí Cơng nghệ Sinh học, 8(1), tr 1-8 Nguyễn Văn Đồng, Phạm Thị Lý Thu, Lê Thị Mai Hƣơng, Phạm Thị Hƣơng, Lê Thị Thu Về, Nguyễn Chiến Hữu, Lê Huy Hàm (2013), “ Nghiên cứu biến nạp gen kháng hạn vào số dòng ngơ chọn lọc thơng qua vi khuẩn Agrobacterium”, Tạp chí Khoa học Công nghệ Nông nghiệp Việt Nam, 2(41), tr 61-67 Lê Huy Hàm, Đỗ Năng Vịnh, Trần Duy Quý (2003), “Nghiên cứu cải tiến hiệu nuôi cấy bao phấn ngơ phƣơng pháp lai hữu tính”, Tạp chí Di truyền học ứng dụng Ngơ Hữu Tình (2009), Chọn lọc lai tạo giống ngơ, Nhà xuất Nông nghiệp, Hà Nội Phạm Thị Lý Thu, Lê Huy Hàm, Đỗ Năng Vịnh (2003), “Đánh giá khả sinh trƣởng, phát triển tái sinh từ phơi non hai dịng ngơ nhập nội HR8, HR9 điều kiện Việt Nam”, Tạp chí nơng nghiệp PTNT, Số 9, tr 726-729 Phạm Thị Lý Thu, Phạm Minh Thợi, Lê Huy Hàm, Đỗ Năng Vịnh (2003), “Nghiên cứu xây dựng hệ thống tái sinh sử dụng cho biến nạp gen ngô”, Kỷ yếu hội nghị CNSH toàn quốc 2003, tr 820-824 Phạm Thị Lý Thu, Lê Huy Hàm, Đỗ Năng Vịnh (2005), “Ảnh hƣởng số yếu tố đến hiệu chuyển gen ngơ thơng qua vi khuẩn A.tumefaciens”, Tạp chí Nông nghiệp Phát triển Nông thôn, Số 10, tr 28-31 50 Phạm Thị Lý Thu, Lê Huy Hàm, Đỗ Năng Vịnh (2006), “Hồn thiện quy trình chuyển gen ngơ súng bắn gen”, Tạp chí Nơng nghiệp Phát triển Nông thôn, Số 8, tr 31-35 Phạm Thị Lý Thu (2007), Nghiên cứu xây dựng hệ thống tái sinh từ phôi non xác định phương pháp chuyển gen thích hợp ngơ, Luận án tiến sỹ sinh học, Viện Công nghệ Sinh học, Viện Khoa học Công nghệ Việt Nam, Hà Nội 10 Nguyễn Thị Khánh Vân, Lê Huy Hàm, Lƣu Mỹ Dung, Đỗ Năng Vịnh (2005), “Bƣớc đầu nghiên cứu nuôi cấy nỗn ngơ chƣa thụ tinh thơng qua mơ ni”, Tạp chí Nơng nghiệp Phát triển nơng thơn, Số 18, tr.20 – 22 TÀI LIỆU TIẾNG ANH 11 Ahmadabadi M, Ruf S, Bock R (2007), “A leaf based regeneration and transformation system for maize (Zea mays L.)”, Transgenic Res, 16, pp 437448 12 Aldemita R.R., Hodges Thomas K (1996), “Agrobacterium tumefaciensmediated transformation of japonica and indica rice varieties”, Planta, 199, pp 612-617 13 Angenon G., and Van Montagu M (1992), “Agrobacterium-mediated transformation and its application in plant molecular biology research and biotechnology”, Biotechnology and crop improvement in Asia, pp 181-199 14 Arencibia A.D., Carmona E.R.C., Tellez P., Chan M.T., Yu S.M., Trujillo L.E., Oramas P (1998), “An efficient protocol for sugarcane (S spp L.) transformation mediated by A tumefaciens”, Transgenic Research, 7(3), pp 213-222 15 Armstrong C.L., Rout J.R (2001), “A novel Agrobacterium-mediated plant transformation method”, Int Patent Publ WO01/09302 A2 16 Bajaj Y.P.S (1994), Biotechnology in Maize improvement, Biotechnology in Agriculture and Forestry, 25, pp 3-23 51 17 Bettany A.J.E., Dalton S.J., Timms E., Manderyck B., Dhanoa M.S., Morris P (2003), “A tumefaciens-mediated transformation of F arundinacea (Schreb.) and L muiltiflorum (Lam)”, Plant Cell Reports, 21, pp 437-444 18 Chan MT, Chang HH, Ho SL, Tong WF, Yu SM (1993), “A.tumefaciensmediated production of transgenic rice plants expressing a chimeric alphaamylase promoter/betaglucuronidase gene”, Plant Mol Biol, 22, pp 491506 19 Cheng M., Hu T., Layton J., Liu C.N., Fry J.E., (2003), “Desiccation of plant tissues post-Agrobacterium infection enhances T-DNA delivery and increases stable transformation efficiency in wheat”, In Vitro Cell Dev Biol Plant, 39(6), pp 595-604 20 Cheng M, Lowe BA, Spencer TM, Ye X, Armstrong CL (2004), “Factors influencing Agrobacterium-mediated transformation of monocotyledonous species”, In Vitro Cellular & Developmental Biology Plant, 40(1), pp 3145 21 Coggins JR, Abell C, Evans LB, Frederickson M, Robinson DA, Roszak AW, Lapthorn AP (2003), Experiences with the shikimate-pathway enzymes as targets for rational drug design, Biochem Soc Trans, 31, pp 548-552 22 Darbani B, Farajma S, ToorchiM, Noeparvar S, StewartN,Mohammed S, Zakerbostanabad S (2008), “Plant transformation: needs and futurity of the transgenes”, Biotechnology, 7(3), pp 403-412 23 Doebley.J and H H Iltis (1980), Taxonomy of Zea (Gramineae) I A subgeneric classification with key to taxa., Amer J Bot, 67(6), pp 982-993 24 Eady, C.C., Weld, R.J., Lister, C.E (2000), “A tumefaciens-mediated transformation and transgenic-plant regeneration of onion (Allium cepa L.)”, Plant Cell Reports, 19, pp 376-381 25 Enriquez-Obregon G.A., Vazquez-Padron R.I., Prieto-Samsonov D.L., de la Riva G.A., Selman-Housein G (1998), “Herbicide-resistant sugarcane (S 52 officinarum L.) plants by Agrobacterium-mediated transformation”, Planta, 206, pp 20-27 26 Eschenburg S, Healy ML, Priestman MA, Lushington GH, Schonbrunn E (2002), “How the mutation glycine96 to alanine confers glyphosate insensitivity to 5-enolpyruvyl shikimate-3-phosphate synthase from Escherichia coli”, Planta, 216(1), pp 129-135 27 Frame BR, Shou H, Chikwamba HRK, Zhang Z, Xiang C, Fonger TM Pegg SEK, Li B, Nettleton DS, Pei D, Wang K (2002), “Agrobacterium tumefaciens-mediated transformation of maize embryo using a standard binary vector system”, Plant Physiol, 129(1), pp 13-22 28 Ganapathi T.R., Higgs N.S., Balint-Kurti P.J., Arntzen C.J., May G.D., Van Eck J.M (2001), “Agrobacterium-mediated transformation of embryogenic cell suspension of the banana cultivar Rasthali (AAB)”, Plant Cell Reports, 20, pp 157-162 29 Gordon-Kamm W., Dilkes B.P., Lowe K., Hoerster G., Sun X., Ross M., Church L., Bunde C., Farrell J., Maddock S., Snyder J., Sykes L., Li Z., Woo Y.M., Bidney D., Larkins B.A (2002), “Stimulation of the cell cycle and maize transformation by disruption of the plant retinoblastoma pathway”, Proc Natl Acad Sci USA, 99, pp 11975-11980 30 Hensel G, Kastner C, Oleszczuk S, Riechen J, and Kumlehn J (2009), A.tumefaciens-Mediated Gene Transfer to Cereal Crop Plants: Current Protocols for Barley,Wheat, Triticale, and Maize, International Journal of Plant Genomics Volume 2009, Article ID 835608 31 Hiei Y, Komari T, Kubo T (1997), “Transformation of rice mediated by Agrobacterium tumefaciens”, Plant Mol Biol, 35, pp 205-218 32 Hiei, Y., Ohta, S., Komari, T & Kumashiro (1994), “Efficient transformation of rice (Oryza sativa L.) mediated by Agrobacterium and sequence analysis of the boundaries of the T-DNA” Plant J., 6, pp 271282 53 33 Hooykaas P.J.J., Schilperoort R.A (1992), “Agrobacterium and plant genetic engineering”, Plant Mol Biol, 19, pp.15-38 34 Ishida Y, Saito H, Ohta S, Hiei Y, Komari T, Kumashiro T (1996), “High efficiency transformation of maize (Zea Mays L.) mediated by Agrobacterium tumefaciens”, Nat Biotechnol, 14, pp 745-750 35 IPRI, 2003 36 James C (2007), “Global Status of Commercialized Biotech/GM Crops: 2007”, ISAAA Brief No 36, ISAAA, pp 3-4 37 James C (2013), “Global Status of Commercialized Biotech/GM Crops: 2013”, ISAAA 38 Kondo T., Hasegawa H., Suzuki M (2000), “Transformation and regeneration of garlic (Allium sativum L.) by Agrobacterium-mediated gene transfer”, Plant Cell Reports, 19, pp 989-993 39 Limanton-Grevet A., Jullien M (2001), “Agrobacterium-mediated transformation of A officinalis L.: molecular and genetic analysis of transgenic plants”, Mol Breed, 7, pp 141-150 40 Lucca P., Ye X., Potrykus I (2001), “Effective selection and regeneration of transgenic rice plants with mannose as selective agent”, Mol Breed, 7, pp 43-49 41 Narasimhulu SB, Deng XB, Sarria R, and Gelvin SB (1996), “Early transcription of A.tumefaciens T-DNA genes in tobacco and maize”, Plant Cell, 8(5), pp 873-886 42 Negrotto D, Beer MJS, Wench AR, Hansen G (2000), “The use of phosphomannose-isomerase as a selectable marker to recover transgenic maize plants (Zea mays L.) via Agrobacterium transformation”, Plant Cell Rep, 19, pp 798-803 43 OECD (1999), Consensus document on general information concerning the genes and their enzymes that confer tolerance to glyphosate herbicide ENV/JM/MONO(99)9, Series on Harmonization of Regulatory Oversight 54 in Biotechnology No.10, Organisation of Economic Co-operation and Development, Paris, France 44 Priestman MA, Healy ML, Becker A, Alberg DG, Bartlett PA, Lushington GH, Schonbrunn E (2005), “Interaction of phosphonate analogues of the tetrahedral reaction intermediate with 5-enolpyruvylshikimate-3- phosphate synthase in atomic detail”, Biochemistry, pp 44-324 45 Repellin A, Boga M, Jauhar PP, Chibbar RN (2001), “Genetic enhancement of cereal crops by alien gene transfers: New challenges, Plant Cell Tissue and organ culture, 64, pp 159-183 46 Rout J.R.; Hironaka, C.M.; Conner, T.W.; DeBoer, D.L.; Duncan, D.R.; Fromm, M.E.; Armstrong, C.L (1996), “Agrobacterium-mediated stable genetic transformation of suspension cells of corn (Zea mays L.)”, Annual Maize Genetics Conf., St.Charles, pp 14-17 47 Russell DA, Fromm ME (1997), “Tissue-specific expression in transgenic maize of four endosperm promoters from maize and rice”, Transgenic Res, 692, pp 157-168 48 Salas M.G., Park, S.H., Srivatanakul, M., Smith, R.H (2001), “Temperature influence on stable T-DNA integration in plant cells”, Plant Cell Reports 20, pp 701-705 49 Saghai-Maroof MA, Soliman KM, Jorgensen RA, Allard RW (1984), “Ribosomal DNA spacer-length polymorphisms in bar-ley: mendelian inheritance, chromosomal location, and population dynamics”, Proc Natl Acad Sci USA, 81(24), pp 8014-8018 50 Sunikumar G., Rathore K.S (2001), “Transgenic cotton: factors influencing Agrobacterium-mediated transformation and regeneration”, Mol Breed, 8, pp 37-52 51 Suzuki S., Nakano M (2002), “Agrobacterium-mediated production of transgenic plants of Muscari armeniacum Leichtl Ex Bak”, Plant Cell Reports, 20, pp 835-841 55 52 Tingay S., McElroy D., Kalla R., Fieg S., Wang M., Thornton S & Brettell R., (1997), “A tumefaciens-mediated barley transformation”, Plant J, 11, pp 1369-1376 53 Uze M., Wiinn J., Puonti-Kaerlas J., Potrykus I., Sautter C (1997), “Plasmolysis of precultured immature embryos improves Agrobacteriummediated gene transfer to rice (Oryza sativa L.)”, Plant Science, 130, pp 87-95 54 Urushibara S., Tozawa, Y., Kawagishi-Kobayashi M., Wakasa K (2001), “Efficient transformation of suspension-cultured rice cells mediated by A tumefaciens”, Breed Sci, 51, pp 33-38 55 Vladimir Sidorov, Larry Gilberston, Prince Addae (2006), “Agrobacterium mediate transformation of seedling – derived maize callus”, Plant Cell Rep, 25, pp 320-328 56 Xueqing Huang & Zhiming Wei (2005), “Successful Agrobacteriummediated genetic transformation of maize elite inbred lines”, Plant Cell Tissue and Organ Culture, 83, pp 187-200 57 Ye, G.-N., Hajdukiewicz, P.T.J., Broyles, D., Rodriguez, D., Xu, C.W., Nehra, N., Staub, J.M (2001), “Plastid-expressed 5-enolpyruvulshikimate3-phosphate synthase genes provide high level glyphosate tolerance in tobacco”, Plant J., 25, pp 261-270 58 Zhang W., Subbarao S., Addae P., Shen A., Armstrong C., Peschke V., Gilbertson L (2003), “Cre/lox mediated marker gene excision in transgenic maize (Zea mays L.) plants”, Theor Appl Genet, 107, pp 1157-1168 59 Zhao Z Y T Cai, L Tagliani, M Miller, N Wang, H Pang, M Rudert, S Schroeder, D Hondred, J Seltzer, D Pierce (2000), “Agrobacteriummediated sorghum transformation”, Plant Mol Biol, 44, pp 789-798 60 Zhao ZY, Gu W, Cai T, Tagliani LA, Hondred DA, Bond D, Krell S, Rudert ML, Bruce WB, Pierce DA (1998), “Molecular analysis of T0 plants transformed by Agrobacterium and comparison of Agrobacterium- 56 mediated transformation with bombardment transformation in maize”, Maize Genet Coop Newsl, 72, pp 34-37 61 Zhao Z.Y., Gu W., Cai T., Tagliani L., Hondred D., Bond D., Schroeder S., Rudert M., Pierce D (2001), “High throughput genetic transformation mediated by A tumefaciens in maize”, Mol Breed, 8, pp 323-333 62 Wang M.B., Abbott D.C., Upadhyaya N.M., Jacobsen J.V., Waterhouse P.M (2001), “A tumefaciens-mediated transformation of an elite Australian barley cultivar with virus resistance and reporter genes”, Aust J Plant Physiol, 28, pp 149-156 63 Wilkes, H G (1967), Teosinte: the closet relative of maize, Bussey Inst., Harvard Univ., Cambridge, MA 64 Wu H., McCormac A.C., Elliott, M.C., Chen, D.F (1998), “Agrobacteriummediated stable transformation of cell suspension cultures of barley”, Plant Cell Tissue and Organ Culture, 54, pp 161-171 Tài liệu website 65 FAOSTAT : www.faostat.fao.org 66 www.nongnghiep.vn PHỤ LỤC Bảng Thành phần mơi trƣờng MS STT Thành phần Stock Hàm lƣợng (mg)/1lít Lƣợng lấy (ml)/1lít mơi trƣờng mơi trƣờng KNO3 1MS 1900 20 NH4NO3 2MS 1650 20 KH2PO4 3MS 170 10 MgSO4.7H2O 4MS 370 10 CaCl2.2H2O 5MS 440 10 FeSO4.7H2O Na2EDTA H3BO3 6,2 MnSO4.4H2O 22,3 10 ZnSO4.7H2O 11 Na2MoO4.2H20 12 CuSO4.5H2O 0,025 13 KI 0,0445 14 Thiamin 15 Pyridoxin 0,5 16 Nicotinic acid 0,5 17 Glycine 2,0 6MS 7MS 8MS 27,8 37,3 8,6 0,25 10 10 0,1 10 ... ? ?Nghiên cứu chuyển gen kháng thuốc trừ cỏ vào phôi hợp tử chưa trưởng thành ngô thông qua vi khuẩn Agrobacterium? ?? Mục tiêu nghiên cứu Đánh giá khả tiếp nhận gen kháng thuốc trừ cỏ số dịng ngơ Vi? ??t... KHOA HỌC TỰ NHIÊN - PHẠM THỊ HƢƠNG NGHIÊN CỨU CHUYỂN GEN KHÁNG THUỐC TRỪ CỎ VÀO PHÔI HỢP TỬ CHƢA TRƢỞNG THÀNH CỦA CÂY NGÔ THÔNG QUA VI KHUẨN AGROBACTERIUM Chuyên ngành: Sinh học thực nghiệm... nghiên cứu vấn đề sinh học thông qua nghiên cứu ngô chuyển gen Các nghiên cứu gần chứng minh phƣơng pháp chuyển gen thông qua vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens lựa chọn tốt kết hợp gen vào ngô