Tạo chủng EDW ardsiella ictaluri đột biến bằng phương pháp tái tổ hợp gen sử dụng làm vaccine ngừa bệnh mủ gan cho cá tra

Đại Học Quốc Gia Tp.Hồ Chí Minh TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA ************ NGUYỄN TRỌNG BÌNH TẠO CHỦNG EDWARDSIELLA ICTALURI ĐỘT BIẾN BẰNG PHƯƠNG PHÁP TÁI TỔ HỢP GEN SỬ DỤNG LÀM VACCINE NGỪA BỆNH MỦ GAN CHO CÁ TRA Chuyên ngành: CÔNG NGHỆ SINH HỌC Mã số ngành: 60 42 80 LUẬN VĂN THẠC SĨ TP HỒ CHÍ MINH, tháng 12 năm 2008 Đại Học Quốc Gia Tp.Hồ Chí Minh TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA ************ NGUYỄN TRỌNG BÌNH TẠO CHỦNG EDWARDSIELLA ICTALURI ĐỘT BIẾN BẰNG PHƯƠNG PHÁP TÁI TỔ HỢP GEN SỬ DỤNG LÀM VACCINE NGỪA BỆNH MỦ GAN CHO CÁ TRA Ngành học: CÔNG NGHỆ SINH HỌC Mã số ngành: 604280 LUẬN VĂN THẠC SĨ TP HỒ CHÍ MINH, tháng 12 năm 2008 CƠNG TRÌNH ĐƯỢC HỒN THÀNH TẠI TRUNG TÂM CƠNG NGHỆ SINH HỌC TP.HỒ CHÍ MINH Cán hướng dẫn khoa học: TSKH NGUYỄN QUỐC BÌNH Cán chấm nhận xét 1: Cán chấm nhận xét 2: Luận văn thạc sĩ bảo vệ tại: HỘI ĐỒNG CHẤM BẢO VỆ LUẬN VĂN THẠC SĨ, TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA Ngày….tháng….năm 2008 TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA CỘNG HÒA XÃ HỘI CHỦ NGHĨA VIỆT NAM PHÒNG ĐÀO TẠO SĐH Độc Lập – Tự Do – Hạnh Phúc TP.HCM, Ngày ….tháng….năm 2008 NHIỆM VỤ LUẬN VĂN THẠC SĨ Họ tên học viên: NGUYỄN TRỌNG BÌNH Phái: Nam Sinh ngày: 05/02/1982 Nơi sinh: Phú Yên Chuyên ngành: Công nghệ sinh học MSHV: 03106664 Năm trúng tuyển: 2006 TÊN ĐỀ TÀI: “Tạo chủng Edwardsiella ictaluri đột biến phương pháp tái tổ hợp gen sử dụng làm vaccine ngừa bệnh mủ gan cho cá” NHIỆM VỤ VÀ NỘI DUNG Phân lập phát vi khuẩn gây bệnh mủ gan cá tra Tạo dòng tế bào E.coli DH5α mang plasmid nhân dòng chứa gen purA Tạo dòng tế bào E.coli DH5α mang plasmid nhân dòng chứa đoạn gen gen purA Tạo dòng tế bào E.coli DH5α mang plasmid nhân dòng chứa đoạn gen cuối gen purA Tạo dòng tế bào E.coli DH5α mang plasmid nhân dòng chứa đoạn gen đầu (HpurA) đoạn gen cuối (HpurA) gen purA Tạo dòng tế bào E.coli DH5α mang plasmid nhân dòng chứa đoạn gen KmR từ pcambia Tạo dòng tế bào E.coli DH5α mang plasmid chứa gen purA biến đổi Tạo E ictaluri đột biến gen purA NGÀY GIAO NHIỆM VỤ: Ngày 25 tháng 02 năm 2008 NGÀY HOÀN THÀNH NHIỆM VỤ: Ngày 30 tháng 11 năm 2008 CÁN BỘ HƯỚNG DẪN: CÁN BỘ HƯỚNG DẪN CN BỘ MÔN QL CHUYÊN NGÀNH (Học hàm, học vị, họ tên chữ ký) Nội dung đề cương luận văn thạc sĩ Hội đồng chun ngành thơng qua Ngày….tháng….năm 2008 TRƯỞNG PHỊNG ĐT – SĐH TRƯỞNG KHOA QL NGÀNH LỜI CẢM ƠN Con thành kính biết ơn cơng lao to lớn Cha Mẹ sinh thành nuôi dưỡng để có ngày hơm nay, Xin chân thành cảm ơn! Ban Giám Hiệu Trường Đại học Bách Khoa thành phố Hồ Chí Minh, Ban chủ nhiệm Bộ Mơn cơng nghệ sinh học, tất quý thầy cô truyền đạt kiến thức cho tơi suốt q trình học trường Đặc biệt cho phép tơi bày tỏ lịng biết ơn sâu sắc đến thầy Nguyễn Quốc Bình tận tình hướng dẫn giúp đỡ tơi hồn thành luận văn Cuối xin cảm ơn bạn bè, đồng nghiệp giúp đỡ thời gian học hết lịng hỗ trợ giúp đỡ tơi thời gian thực tập Tp.HCM, Tháng 11 năm 2008 Nguyễn Trọng Bình TĨM TẮT Cá tra (Pangasius hypophthalmus) lồi cá có tiềm lớn xuất đem lại lợi ích lớn cho người ni Việt Nam Mỗi năm Việt Nam sản xuất khoảng triệu tấn, sản lượng cá tra nước ta năm 2008 đạt 1,3 triệu kim ngạch xuất đạt 1,6 tỉ USD Song ngành nuôi trồng cá tra gặp nhiều khó khăn xuất nhiều loại bệnh, bệnh đốm trắng (bệnh mủ gan) bệnh gây Edwardsiella ictaluri Hiện chưa có vaccine phịng bệnh, người nuôi chủ yếu trị bệnh cho cá thuốc kháng sinh Sử dụng vaccine việc ngừa bệnh mủ gan cho cá tra vấn đề cấp thiết Trong nghiên cứu này, thiết lập qui trình tạo chủng đột biến Edwardsiella ictaluri nhược độc phương pháp knock-out gene (đột biến gen) Edwardsiella ictaluri gây bệnh cá tra Việt Nam Hai đoạn đầu cuối gen purA mã hóa adenylosuccinate synthetase phân lập tạo dịng Sau gen kháng kháng sinh kanamycin chèn gen vào đoạn đầu cuối gen purA Để thu nhận chủng Edwardsiella ictaluri đột biến gen purA, tiến hành theo phương pháp: điện biến nạp tiếp hợp Trong phương pháp điện biến nạp, đoạn gen purA biến đổi biến nạp vào Edwardsiella ictaluri hoang dại Đối với phương pháp tiếp hợp, đoạn gen purA biến đổi nhân dòng E coli SM10 λ pir vector suicide pGP704, cho tiếp hợp với Edwardsiella ictaluri hoang dại Tất plasmid dùng cho việc tạo chủng đột biến Edwardsiella ictaluri thiết lập, việc chọn chủng đột biến tiến hành ABSTRACT Tra catfish (Pangasius hypophthalmus) is one of the fish species having essential export to benefit for pisciculturists in Viet Nam Every year, Viet Nam harvests approximately million tonnes tra catfish, production of tra catfish will have been brought 1.3 million tonnes in 2008, export turn-over will be 1.6 billion USD At present, aquaculture of tra catfish is meeting many serious difficulties causing many appearing pathogens, among them, white spot disease (liver pus disease) is one of the main diseases caused by Edwardsiella ictaluri (E ictaluri) Nowadays, nonvaccination for prevention of disease, pisciculturists mainly use antibiotics to treat for fish, so use of vaccine for liver pus disease prevention of tra catfish is necessary In this study, we founded a process making attenuated live E ictaluri strain by knock-out gene method (deleted gene) on E ictaluri causing disease for tra catfish in Viet Nam Head and tail gene fragment of purA encoding adenylosuccinate synthetase was isolated and cloned After that, gene against kanamycin antibiotic was inserted between head and tail fragment of purA gene To take in purA mutant E ictaluri strain, we conducted both transformation electroporation and conjugate method According to the transformation electroporation, modified purA gene fragment was tranformed into wild E ictaluri For bacterial conjugate method, modified purA gene fragment was cloned in E coli SM10 λ pir by means of suicide pGP704 afterwards the genetic information from E coli SM10 λ pir was transfered to wild E ictaluri by conjugation All the used plasmids for formed mutant E ictaluri strain were founded, and selection of mutant E ictaluri strain has being carried out vi MỤC LỤC PHẦN TRANG Trang bìa Trang tựa Lời cảm ơn iii Tóm Tắt .iv Mục lục vi Danh sách bảng .x Danh sách hình xi Danh sách sơ đồ xiii Phần MỞ ĐẦU 1.1 Đặt vấn đề 1.2 Mục tiêu .2 1.3 Nội dung .2 Phần TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1 Sơ lược Edwardsiella ictaluri gây bệnh mủ gan cá tra 2.2.Giới thiệu vaccine lọai vaccine 2.2.1.Giới thiệu vaccine .6 2.2.2.Các loại vaccine 2.3 Tình hình nghiên cứu vaccine cho cá kháng vi khuẩn Edwardsiella ictaluri 2.3.1 Tình hình giới .9 2.3.2 Tình hình nước .10 Phần VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 3.1 Địa điểm thời gian nghiên cứu 11 3.2 Hóa chất, dụng cụ trang thiết bị thí nghiệm 11 vii 3.2.1 Hóa chất 11 3.2.2 Dụng cụ trang thiết bị thí nghiệm 13 3.3 Phương pháp nghiên cứu 15 3.3.1 Phát vi khuẩn gây bệnh mủ gan cá tra .17 3.3.1.1 Thu mẫu 17 3.3.1.2 Phương pháp kiểm tra mổ khám bệnh tích 17 3.3.1.3 Phương pháp phân lập vi khuẩn có mẫu bệnh phẩm 18 3.3.1.4 Phương pháp nhuộm Gram 18 3.3.1.5 Thiết kế primer .18 3.3.1.6 Khuếch đại vùng gen nằm gen serC aroA PCR .19 3.3.1.7 Giải trình tự 20 3.3.2 Tạo dòng tế bào E.coli DH5α mang plasmid nhân dòng chứa gen purA 20 3.3.2.1 Thiết kế primer .21 3.3.2.2 Khuyếch đại gen purA PCR 22 3.3.2.3 Hóa biến nạp plasmid tái tổ hợp vào E.coli DH5α 22 3.3.2.4 Khẳng định dòng biến nạp PCR 24 3.3.2.5 Giải trình tự plasmid tái tổ hợp 24 3.3.3.Tạo dòng tế bào E.coli DH5α mang plasmid nhân dòng chứa đoạn gen gen purA 25 3.3.3.1 Thiết kế primer dựa vào trình tự đầu gen purA từ ngân hàng gen 25 3.3.3.2 Khuyếch đại đoạn gen gen purA PCR 25 3.3.3.3 Hóa biến nạp plasmid tái tổ hợp vào E.coli DH5α .26 3.3.3.4 Khẳng định dòng biến nạp PCR phản ứng cắt giới hạn 26 3.3.3.5 Giải trình tự plasmid tái tổ hợp 27 3.3.4 Tạo dòng tế bào E.coli DH5α mang plasmid nhân dòng chứa đoạn gen cuối gen purA .27 3.3.4 1.Thiết kế primer dựa vào trình tự cuối gen purA từ ngân hàng gen 27 3.3.4 Khuyếch đại đoạn gen cuối gen purA 27 3.3.4.3 Hóa biến nạp plasmid tái tổ hợp vào E.coli DH5α .28 1.2 Giải trình tự gen purA primer JETR 1.3 Giải trình tự gen purA primer purAR Môi trường 2.1 Môi trường BHI phân lập E ictaluri Extracts of brain and heart, and peptones 27,5 g D (+) glucose 2,0 g Sodium chloride 5,0 g Di-sodium hydrogen phosphate 2,5 g Điều chỉnh pH = 7,2 - 7,6 Môi trường hấp tiệt trùng 121oC, 15 phút 2.2 Môi trường EIM chọn lọc E ictaluri Bactotryptone 10g yeast extract 10 g Phenylalanine 1,25 g Ferric ammonium citrate 1,2 g Sodium chloride 5g Brom thymol blue 0,03 g Agar 17 g H2O 990 ml Điều chỉnh pH = 7,0 - 7,2 Môi trường hấp tiệt trùng 121oC, 15 phút Cho 10 ml dung dịch chứa 3,5 g manitol 10 mg colistin lọc vô trùng bổ sung vào môi trường trước đổ đĩa Để tăng thêm hiệu quả, cần bổ sung thêm: Bile salt Crystal violet 0,1-1,0% 10 µg/ml 100 µg/ml 2.3 Môi trường nuôi cấy E coli LB broth: 5g yeast extract, 10g NaCl, 10g bactotryptone Bổ sung nước cất đủ lít Điều chỉnh pH 7.0 Hấp vơ trùng Hóa chất 3.1.Hố chất dùng nhuộm gram (Merk) Solution 1: Crystal violet solution Solution 2: Lugol’s solution stabilized Solution : Decolouring solutions Solution 5: Safranine solution 3.2.Hoá chất dùng để điện di gel agarose Agarose Loading dye Ethidium bromide (10mg/ml): Hoà tan 0.2 g ethidium bromide 20 ml H2O TAE (Tris/acetate/EDTA) electrophoresis buffer 50X stock solution, lít Tris base 242 g Acid acetic 57,1 ml Na2EDTA.2H2O 37,2 g Thêm nước vào cho đủ lít, pH (25oC) = 8,2 - 8,5 3.3.Hố chất dùng để tinh DNA Kit tinh sản phẩm PCR: QIAquick Purification kit (Qiagen) gồm có: QIAquick Spin Columns, Buffer PB, Buffer PE, Buffer EB, Collection Tubes (2 ml) 3.4.Hoá chất dùng để chuẩn bị tế bào khả nạp LB broth CaCl2 M CaCl2.2H2O 147g Bổ sung nước đủ lít Glycerol 100% 3.5.Hố chất dùng cho biến nạp gen mục tiêu vào E.coli: Môi trường LB Ampicillin 50 mg/ml (Biorad-Labs.): hoà 50mg ampicillin 1ml nước cất Lọc qua màng X-gal 40mg/ml (Invitrogen): cân 40mg X-gal hoà 1ml N’-N methyl formamide Lọc qua màng 3.6.Hoá chất dùng để khẳng định khuẩn lạc biến nạp Taq polymerase, dNTP, MgCl2, buffer DNA khuôn mẫu Kit tách chiết plasmid Quickclean 5M Minipre (Genscript): bao gồm Solution I, Solution II, Solution III, Wash solution, Elution buffer, Quickclean column ml Collection tube - Solution I (resuspension buffer) Tris Cl, pH = 8,0 50 mM EDTA 10 mM 100 mg Rnase A Giữ oC - Solution II (lysis buffer) EDTA pH = 8,0 100 mM Tris Cl, pH = 8,0 10 mM N-lauroylsarcosine sodium salt 1% (w/v) Proteinase K 100 µg/ ml Giữ nhiệt độ phịng mà khơng có proteinase K - Solution III (neutralization/ binding solution) Guanidine HCl 477,65 g Potassium acetate 49,09 g Thêm 500 ml H2O khuấy, điều chỉnh pH ~ 4,2 acetic acid, cho H2O vào để đủ lít, lọc vô trùng, giữ oC - Wash solution (wash buffer) phần Tris Cl, pH = 7,5 10 mM phần NaCl 100 mM phần100% ethanol (nồng độ cuối 80%) Giữ nhiệt độ phòng - Elution buffer (EB), pH 7,5 Tris Cl, pH = 7,5 10 mM NaCl 50 mM EDTA , pH = 8,0 mM 3.7.Hóa chất dùng tinh DNA từ gel agarose Dung dịch NaI 60 M Buffer binding (6 M guanidine HCl) Thêm 0,75 g Na2SO3 57,3 g guanidine HCl vào 35 ml H2O khuấy tan, điều chỉnh thể tích thành 100 ml H2O, tiệt trùng dự trử 3- tháng bóng tối, 4oC Wash buffer phần Tris Cl, pH = 7,5 10 mM phần NaCl 100 mM phần100% ethanol (nồng độ cuối 80%) TE buffer, pH = 8,0 H2O khơng có nuclease Tube li tâm 1,5 ml Silica membrane spin column 3.8.Hóa chất tủa DNA ethanol acetate Sodium acetate, pH = 5,2 3M Ethanol 100%, 70% (giữ lạnh) Đệm TE - Tris – HCl, pH = 7,6-8,0 10 mM - EDTA 0,1 mM LÝ LỊCH TRÍCH NGANG Họ tên: NGUYỄN TRỌNG BÌNH Phái: Nam Sinh ngày: 05/02/1982 Nơi sinh: Phú Yên Địa liên lạc: 53/20/7 Đường 16, Vĩnh Thuận, Long Bình, Quận 9, Tp.HCM Điện Thoại nhà: 057-3755827 Di động: 0985678802 QUÁ TRÌNH ĐÀO TẠO Năm 2005: Tốt nghiệp Khoa Công Nghệ Sinh học, Trường Đại học Nơng Lâm Tp.HCM Năm 2007: Tham dự khóa đào tạo lên men công nghiệp, liên kết Trung Tâm Công Nghệ sinh học Viện CIGB (Centro de Ingeniería Genética y Biotechnología) Năm 2006 – 2008: Tham dự lớp cao học khóa 2006 – 2008, ngành Cơng Nghệ Sinh học, Trường Đại học Bách Khoa, Tp.HCM QUÁ TRÌNH CƠNG TÁC Từ 05/2006 – 07/2007: Nhân viên QC phịng kiểm nghiệm vi sinh thực phẩm, cơng ty Vinacecook, Ấp 1A, An Phú, Thuận An, Bình Dương Từ 09/2007 đến nay: Nhân Viên phịng Cơng nghệ sinh học Thủy sản Y dược, Trung tâm Công nghệ sinh học Tp.HCM ... TÀI: ? ?Tạo chủng Edwardsiella ictaluri đột biến phương pháp tái tổ hợp gen sử dụng làm vaccine ngừa bệnh mủ gan cho cá? ?? NHIỆM VỤ VÀ NỘI DUNG Phân lập phát vi khuẩn gây bệnh mủ gan cá tra Tạo dòng... BÁCH KHOA ************ NGUYỄN TRỌNG BÌNH TẠO CHỦNG EDWARDSIELLA ICTALURI ĐỘT BIẾN BẰNG PHƯƠNG PHÁP TÁI TỔ HỢP GEN SỬ DỤNG LÀM VACCINE NGỪA BỆNH MỦ GAN CHO CÁ TRA Ngành học: CÔNG NGHỆ SINH HỌC Mã... 36 3.3.8 Tạo E ictaluri đột biến gen purA .36 3.3.8.1 Tạo E ictaluri đột biến gen purA phương pháp điện biến nạp 36 3.3.8.2 Tạo E ictaluri đột biến gen purA phương pháp tiếp hợp .38