Phân lập, định tên khoa học một số vi sinh vật gây bệnh trắng nhũn thân (ice ice disease) ở rong sụn (kappaphycus alvarezii, kappaphycus striatum) bị bệnh ở việt nam

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA HÀ NỘI - BÙI ĐÌNH LÃM PHÂN LẬP, ĐỊNH TÊN KHOA HỌC MỘT SỐ VI SINH VẬT GÂY BỆNH TRẮNG NHŨN THÂN (Ice-Ice disease) Ở RONG SỤN (Kappaphycus alvarezii, Kappaphycus striatum) BỊ BỆNH Ở VIỆT NAM LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC CÔNG NGHỆ SINH HỌC Hà Nội - Năm 2011 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA HÀ NỘI - BÙI ĐÌNH LÃM PHÂN LẬP, ĐỊNH TÊN KHOA HỌC MỘT SỐ VI SINH VẬT GÂY BỆNH TRẮNG NHŨN THÂN (Ice-Ice disease) Ở RONG SỤN (Kappaphycus alvarezii, Kappaphycus striatum) BỊ BỆNH Ở VIỆT NAM Chuyên ngành: Công nghệ sinh học LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC CÔNG NGHỆ SINH HỌC NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC PGS TS Đặng Diễm Hồng Hà Nội - 2Năm 2011 LỜI CẢM ƠN Tơi xin bày tỏ lịng biết ơn sâu sắc tới PGS TS Đặng Diễm Hồng, Trưởng phịng Cơng nghệ tảo - Viện Công nghệ Sinh học, Viện Khoa học Công nghệ Việt Nam, người định hướng tận tình dẫn tơi suốt q trình thực luận văn Tôi muốn gửi lời cảm ơn đến Ban giám hiệu Trường Đại học Bách Khoa Hà Nội, Các thầy giáo tồn thể cán Viện Công nghệ sinh học Công nghệ thực phẩm – Trường Đại học Bách Khoa Hà Nội tham gia giảng dạy tạo điều kiện giúp đỡ, truyền đạt kiến thức cho tơi suốt q trình học tập nghiên cứu Qua đây, gửi lời cảm ơn chân thành đến toàn thể cán Phịng Cơng nghệ Tảo - Viện Cơng nghệ sinh học, ủng hộ giúp đỡ suốt trình thực luận văn Cuối cùng, tơi xin gửi lời cảm ơn đến gia đình bạn bè bên cạnh chia sẻ, động viên, giúp đỡ tạo điều kiện tốt cho học tập, nghiên cứu hồn thành ln văn Hà Nội, ngày tháng 11 năm 2011 Học viên Bùi Đình Lãm i LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan cơng trình nghiên cứu luận văn khoa học tơi Các số liệu sử dụng tham khảo có nguồn trích dẫn rõ ràng, kết nghiên cứu luận văn hồn tồn trung thực Bùi Đình Lãm ii DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT Từ viết tắt Viết đầy đủ CĐAS Cường độ ánh sáng EM Effective Microorganisms LG Làm giàu NB Nước biển TĐTT Tốc độ tăng trọng TNT Trắng nhũn thân TSL Tổng sản lượng TT Trực tiếp VSV Vi sinh vật STT iii MỤC LỤC LỜI CẢM ƠN……………………………………………………………… i LỜI CAM ĐOAN…………………………………………………………… ii DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT……………………………………… iii MỤC LỤC…………………………… …………………………………… iv MỞ ĐẦU…………………………………………………………………… CHƯƠNG TỔNG QUAN TÀI LIỆU………………………………… 1.1 Giới thiệu Rong Sụn……………………………………………… 1.2 Đặc điểm sinh học Rong Sụn…………………………………… 1.3 Nguồn gốc Rong Sụn Việt Nam………………………………… 1.4 Thành phần hóa học giá trị dinh dưỡng Rong Sụn…………… 1.4.1 Thành phần hóa học Rong Sụn…………………………… 1.4.1.1 Nước……………………………………………………………… 1.4.1.2 Gluxit………………………………………………………… 1.4.1.3 Protein…………………………………………………………… 10 1.4.1.3 Lipit……………………………………………………………… 10 1.4.1.5 Sắc tố ……………………………………………………… 10 1.4.1.6 Chất khoáng ……………………………………………… 10 1.4.1.7 Enzyme…………………………………………………………… 11 1.4.2 Giá trị dinh dưỡng Rong Sụn………………………………… 11 1.5 Tình hình nghiên cứu phát triển nghề trồng Rong Sụn 12 1.5.1 Tình hình nghiên cứu phát triển nghề trồng Rong Sụn…… … 12 1.5.2 Tình hình nghiên cứu phát triển nghề trồng Rong Sụn……… 15 1.6 Ứng dụng Rong Sụn……………………………………………… 17 iv 1.6.1 Trong lĩnh vực thực phẩm……………………………………… 17 1.6.2 Trong y dược dược phẩm……………………………………… 19 1.6.3 Trong công nghiệp……………………………………………… 20 1.6.4 Rong Sụn tác dụng xử lý môi trường………………………… 20 1.7 Các yếu tố tác động đến sản lượng Rong Sụn 21 1.7.1 Dấu hiệu bệnh……………………………………………… 22 1.7.2 Các nhóm nguyên nhân 22 1.7.2.1 Yếu tố ngoại sinh 22 1.7.2.2 Yếu tố nội sinh 26 B B B B 1.8 Các biện pháp phòng ngừa bệnh ice-ice disease………………………… 28 1.8.1 Chọn tạo giống khác chịu bệnh bệnh………………… 28 1.8.2 Các biện pháp kỹ thuật trồng……………………………… 28 1.8.3 Biện pháp xử lý rong bị bệnh………………………………… 29 1.8.4 Sử dụng vi sinh vật hữu hiệu 30 CHƯƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU………… 32 2.1 Mẫu Rong nước biển……………………………………………… 32 2.2 Phân lập vi khuẩn……………………………………………………… 32 2.2.1 Môi trường phân lập……………………………………………… 32 2.2.2 Phân lập vi khuẩn từ mẫu Rong Sụn…………………………… 33 2.3 Phương pháp giữ giống……………………………………………… 33 2.3.1 Giữ giống 40C………………………………………………… 33 2.3.2 Phương pháp giữ giống -200C………………………………… 33 P P P P 2.4 Phương pháp xác định Gram vi khuẩn KOH 3% 33 2.5 Phương pháp sốc nhiệt để kiểm tra khả sinh bào tử…………… 34 2.6 Phương pháp phân loại vi khuẩn kít chuẩn sinh hóa…………… 34 2.6.1 Phương pháp phân loại vi khuẩn kít chuẩn sinh hóa API20NE ……………………………………………………………… 2.6.2 Phương pháp Phân loại vi khuẩn kít chuẩn sinh hóa v 34 36 API50CH ……………………………………………………………… 2.7 Phân tích trình tự nucleotide phần gen 16S rRNA…………… 37 2.7.1 Phương pháp tách chiết ADN tổng số…………………………… 38 2.7.1.1 Phương pháp không sử dụng Kit…………………………… 38 2.7.1.2 Tách chiết ADN theo kít………………………………… 40 2.7.2 Điều kiện cho phản ứng PCR…………………………………… 41 2.7.3 Tinh sản phẩm PCR 41 CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN……………………………… 44 3.1 Kết phân lập 44 3.2 Kết phân loại chủng vi khuẩn phân lập được………………… 53 3.3 Kết định tên kỹ thuật đọc so sánh trình tự nucleotit…… 57 3.3.1 Tách chiết ADN tổng số chủng vi khuẩn……………… 57 3.3.2 Kết nhân đoạn gen 16S rRNA ……………………………… 59 3.3.3 Kết nhân gen 16S rRNA mẫu 4(2)6LG………………… 60 3.4 Kết xử lý trình tự nucleotit……………………………………… 61 CHƯƠNG 4: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ……………………………… 63 TÀI LIỆU THAM KHẢO…………………………………………………… 65 PHỤ LỤC…………………………………………………………………… 73 CÁC CƠNG TRÌNH ĐÃ CƠNG BỐ……………………………………… 93 vi DANH MỤC CÁC BẢNG Trang Bảng Thành phần hoá học Rong Sụn Bảng Sự thay đổi hàm lượng protein theo tháng năm 10 Bảng Các nước trồng Rong Sụn giới 12 Bảng Sản lượng Rong Sụn Kappaphycus alvarezii Kappaphycus striatum nước giới Bảng Diện tích, số hộ trồng sản lượng Rong Sụn Ninh thuận Bảng Một số ứng dụng điển hình carageenan công nghiệp thực phẩm Bảng Màu sắc khác thí nghiệm sử dụng test TRP Bảng Trình tự mồi nhân gen 16S rRNA loài vi khuẩn sử Bảng 13 16 19 36 dụng 38 Giá trị độ mặn mẫu nước biển thu thập đợt 45 Bảng 10 Đặc điểm chủng vi khuẩn phân lập đợt thu mẫu 10/2008 Bảng 11 Đặc điểm chủng vi khuẩn đợt thu mẫu 7/2009 Bảng 12 Kết phân loại kit chuẩn sinh hóa chủng vi khuẩn phân lập Bảng 13 Bảng tổng kết tần suất xuất chủng vi khuẩn phân lập từ đợt thu mẫu (10/2008 7/2009) Bảng 14 Danh sách chủng tách chiết ADN tổng số kit 46 50 54 56 57 Bảng 15 Kết định tên khoa học chủng phân lập kít chuẩn sinh hóa API kỹ thuật đọc so sánh trình tự nucleotit đoạn gen 16S rRNA sử dụng nghiên cứu vii 62 DANH MỤC CÁC HÌNH Trang Hình Hình ảnh hai lồi Rong Sụn Hình Sơ đồ vịng đời Rong Sụn Hình Cấu trúc phân tử dạng carrageenan Hình Hình ảnh mẫu Rong Sụn bị bệnh trắng nhũn thân (ice-ice diease) 22 Hình Hình ảnh thực vật phụ sinh phát triển kí sinh Rong Sụn 26 Hình Quy trình tách ADN tổng số từ sinh khối VSV khơng sử dụng Kit 39 Hình Quy trình tinh sản phẩm PCR Kit 42 Hình Hình thái mẫu rong thu thập đợt 44 Hình Hình thái mẫu rong thu thập đợt 45 Hình 10 Kết tách chiết ADN tổng số theo Kit Hình 11 Kết nhân đoạn gen 16S rRNA mẫu 2(5)-13 LG, 1(1)8 LG mẫu 5(2)-9 TT, 4(1)-6TT Hình 12 Kết tinh sản phẩm PCR mẫu: 2(5)-13 LG, 1(1)8 LG, 5(2)-9 TT 4(1)6TT Hình 13 Kết nhân gen 16S rRNA mẫu 4(2)-6 LG với cặp mồi Universal F R 58 59 60 60 Hình 14 Cây phát sinh chủng loại loài thuộc chi Pseudomonas 61 Hình 15 Cây phát sinh chủng loại loài thuộc chi Vibrio 61 viii STT 10 11 12 Ký hiệu 2(5)-13 LG 5(3)-9 LG 1(1)-8 LG 3(4)-10 LG 5(2)-9 TT 5(2)-10 TT 4(1)-4 TT 4(1)-6 TT 4(2)-6 LG 4(2)-5 LG NB3-5 TT NB4-9 TT Đợt thu mẫu 1 1 1 1 1 1 Tên chủng xác định Loại kit sử Kit API dụng API20NE Burkholderia cepacia API20NE Burkholderia cepacia API20NE Vibrio parahaemolyticus API20NE Vibrio fluvalis API20NE Vibrio parahaemolyticus API20NE Vibrio parahaemolyticus API20NE Shewanella putrefaciens API20NE Burkholderia gladioli API20NE Ochrobactrum amthropi API20NE Pasteurella spp, API20NE Ochrobactrum amthropi API20NE Pasteurella aerogenes % ID 99,5 99,2 98,6 93,3 98,1 99,9 95,7 49,8 98,8 94,1 ADN tổng số 12 chủng vi khuẩn tách chiết nhìn chung loại hồn tồn ARN Nồng độ chất lượng ADN tổng số thu được kiểm tra đo quang phổ bước sóng 260 nm 280 nm Kết rằng, ADN tổng số đạt chất lượng nồng độ cao để thực cho thí nghiệm Ảnh điện di ADN tổng số chủng vi khuẩn thể hình 10 10 11 12 21 Kb Hình 10: Kết tách chiết ADN tổng số theo Kit (Wizard genomic DNA purification) Giếng 1-12 ADN tổng số mẫu 1(1)-8 LG; 3(4)-10 LG; 4(1)-4 TT; 4(1)-6 TT; 4(2)5 LG; 4(2)-6 LG; 5(2)-10 TT; 5(3)-9 LG; 2(5)-13 LG; 5(2)-9 TT; NB3-5 TT NB4-9 TT Trình tự cặp mồi dùng để nhân đoạn gen 16S rRNA chi Aeromonas sp., Flavobacteria sp., Cytophaga sp., Pseudomonas sp., Vibrio sp cặp 58 mồi Universal Primers cho phép nhân gen mẫu VSV chi nêu chúng tơi thiết kế trình bày bảng phần vật liệu phương pháp nghiên cứu Do thời gian làm luận văn khơng có nhiều nên trước mắt để tiến hành định tên kỹ thuật sinh học phân tử, tiến hành làm số chủng ưu tiên 12 chủng tách chiết ADN (bảng 14) sau: 2(5)-13 LG, 1(1)8 LG, mẫu 5(2)-9 TT mẫu 4(2)-6LG Kết sơ định tên khoa học chủng dựa trình tự nucleotit đoạn gen 16S RNA phần sau 3.3.2 Kết nhân đoạn gen 16S rRNA mẫu 2(5)-13 LG, 1(1)8 LG, mẫu 5(2)-9 TT mẫu 4(2)-6LG Nhờ sử dụng cặp mồi Pseudo F R, nhân đoạn gen 16S rRNA mẫu 2(5)-13 LG, mẫu 4(1)-6TT có kích thước dự kiến 1,4kb Tương tự, nhân đoạn gen 16S rRNA mẫu (1)8 LG mẫu 5(2)-9 TT với cặp mồi VibrioF R có kích thước dự kiến khoảng 1,2kb Kết hình 11 1,4Kb 1,2kb Hình 11: Kết nhân đoạn gen 16S rRNA mẫu 2(5)-13 LG, 1(1)8 LG mẫu 5(2)-9 TT, 4(1)-6TT Giếng 1, 2: phần gen 16S rRNA mẫu 2(5)-13 LG, 4(1)-6TT với cặp mồi Pseudo F R Giếng 3, 4: phần gen 16S rRNA mẫu 1(1)8 LG mẫu 5(2)-9 TT với cặp mồi Vibrio F R 59 Sản phẩm PCR sau tiến hành gel tinh qua cột phương pháp ly tâm theo mô tả hãng Promega, Mỹ sản xuất Sản phẩm tinh có đủ nồng độ độ để đảm bảo chất lượng đọc trình tự trực tiếp từ sản phẩm PCR Kết hình 12 Hình 12: Kết tinh sản phẩm PCR mẫu: 2(5)-13 LG, 1(1)8 LG, 5(2)-9 TT 4(1)6TT Giếng 2: Sản phẩm PCR tinh 1(1)8 LG mẫu 5(2)-9 TT Giếng 4: Sản phẩm PCR tinh 2(5)-13 LG 4(1)6 TT Giếng 5: Thang ADN chuẩn Kb 3.3.3 Kết nhân gen 16S rRNA mẫu 4(2)6LG Theo kết định tên dựa vào kit chuẩn sinh hoá, mẫu 4(2)-6TT định tên theo KIT sinh hố API lồi Shewanella putrefaciens với độ tương đồng đạt 99,9% Theo kết phân loại lựa chọn cặp mồi Pseudo F R phù hợp để nhân đoạn gen 16S rRNA có kích thước dự kiến khoảng khoảng 1,2kb Tuy nhiên, tiến hành phản ứng PCR nhân đoạn gen 16S rRNA mẫu với cặp mồi Pseudo F R, không nhân đoạn gen 16S rRNA mong muốn Vì vậy, chúng tơi chạy PCR với cặp mồi Universal F R (với kích thước tương ứng khoảng 600bp) Kết thu được hình 13 Hình 13: Kết nhân gen 16S rRNA mẫu 4(2)-6 LG với cặp mồi Universal F R Giếng 1: phần gen 16S rRNA mẫu 4(2)-6LG Giếng 2: Thang ADN chuẩn Kb 60 600bp 3.4 Kết xử lý trình tự nucleotit phần gen 16S rRNA chủng lựa chọn nghiên cứu Từ kết đọc trình tự, chúng tơi tiến hành so sánh trình tự nucleotit thu chủng 1(1)8LG 5(2)9TT với trình tự gen 16S rADN lồi thuộc chi Vibrio so sánh trình tự nucleotit thu chủng 2(5)13LG, 4(1)6TT với trình tự nucleotit lồi thuộc chi Pseudomonas cơng bố Genbank Cây phát sinh chủng loại loài nghiên cứu với lồi cơng bố Genbank xây dựng dựa vào hỗ trợ chương trình máy tính chun dụng Cây phát sinh chủng loại nêu trình bày hình 14, 15 kết định tên khoa học loài nghiên cứu dựa trình tự nucleotide đoạn gen 16S rRNA trình bày bảng 15 Hình 14: Cây phát sinh chủng loại loài thuộc chi Pseudomonas 61 Hình 15: Cây phát sinh chủng loại loài thuộc chi Vibrio Bảng 15: Kết định tên khoa học chủng phân lập kít chuẩn sinh hóa API kỹ thuật đọc so sánh trình tự nucleotit đoạn gen 16S rRNA sử dụng nghiên cứu Kí hiệu mẫu Tên chủng phân loại theo kít Tên chủng phân loại API sinh học phân tử 1(1)8LG Vibrio parahaemolyticus Vibrio parahaemolyticus 5(2)9TT Vibrio parahaemolyticus Vibrio parahaemolyticus 2(5)13LG Burkholderia cepacia Pseudomonas putida 4(1)6TT Burkholderia gladioli Pseudomonas putida Kết thu bảng 15 cho thấy, hai chủng 1(1)8LG 5(2)9TT định tên kít chuẩn sinh hóa API đọc so sánh trình tự nucleotit gien 16S rRNA cho tên khoa học Trong đó, tên phân loại chủng 2(5)13LG 4(1)6TT có khác biệt hai phương pháp phân loại nêu Việc xác định tên khoa học chủng vi khuẩn dựa hệ thống Kit API phân tích trình tự nucleotit gen 16S rRNA cho kết phân loại tên khoa học khác đề cập báo cáo khoa học Lottmann cs., 2000 Như vậy, việc định tên khoa học chủng 2(5) 13 LG 4(1) 6TT có khác Kit API phương pháp sinh học phân tử cho thấy để định tên xác cần phải so sánh trình tự nucleotit khơng phải gen mà nhiều gen khác Các kết nghiên cứu thu chúng tơi cơng trình nghiên cứu minh chứng quan trọng cho việc để định tên khoa học xác đến lồi lồi cần phải kết hợp nhiều phương pháp khác dựa 62 đặc điểm hình thái, đặc điểm sinh hóa (sử dụng kit API) mà cịn phải dựa phương pháp sinh học phân tử đọc so sánh trình tự nucleotit hay nhiều gen khác có gen 16S rRNA CHƯƠNG KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ KẾT LUẬN Từ kết nghiên cứu trình bày nêu trên, rút số kết luận sau: Với đợt thu mẫu rong Sụn Kappaphycus alvarezii Kappaphycus striatum tháng 10/2008 7/2009, chúng phân lập tổng số 119 chủng vi khuẩn khác (đợt phân lập có 52 chủng đợt - 67 chủng), chủng vi khuẩn Gram âm chiếm ưu 35chủng vi khuẩn đại diện cho vị trí lấy mẫu, địa điểm khác phân loại kít chuẩn sinh hố API xếp vào 19 lồi thuộc chi Burkholderia, Vibrio, Pasteurella, Shewanella, Aeromonas, Ochrobactrum Bacillus loài Vibrio parahaemolyticus Burkholderia cepacia xác định loài xuất phổ biến rong Sụn bị bệnh với tần suất xuất tương ứng 21,7 17,4% 4 chủng vi khẩn ký hiệu 1(1)8LG, 5(2)9TT, 2(5)13LG, 4(1)6TT định tên kỹ thuật đọc so sánh trình tự nucleotit phần đoạn gen 16S rRNA với tên phân loại tương ứng Vibrio parahaemolyticus, Vibrio parahaemolyticus, Pseudomonas putida, Pseudomonas putida Các kết nghiên cứu thu cho thấy cần phải kết hợp nhiều phương pháp khác để định tên khoa học xác mẫu nghiên cứu KIẾN NGHỊ 63 - Tiếp tục xác định tên chủng lại 19 chủng phân lập được định tên xác KIT chuẩn sinh hố kỹ thuật đọc so sánh trình tự nucleotit đoạn gen 16S rRNA; - Để tăng phần xác khách quan cần nghiên cứu thêm chủng vi sinh vật phân lập từ Rong Sụn Nước Biển tiến hành lấy mẫu nhiều lần năm nhiều vùng trồng Rong Sụn khác nhau; - Cần phải kết hợp thêm nhiều phương pháp khác để có định tên khoa học xác mẫu nghiên cứu; - Cần nghiên cứu tạo chế phẩm sinh học để phòng ngừa bệnh trắng nhũn thân iceice disease sở quần thể vi sinh vật phân lập qua nhiều năm nghiên cứu 64 TÀI LIỆU THAM KHẢO TÀI LIỆU TIẾNG VIỆT Ngô Quốc Bưu, Phạm Văn Huyên Huỳnh Quang Năng, (2000), “Nghiên cứu sử dụng Rong biển để xử lý nhiễm bẩn dinh dưỡng nước thải ao nuôi tôm”, Tạp chí Hóa học - Trung tâm Khoa học Tự nhiên & Công nghệ Quốc gia, Tập 38, Số 3, trang 19 – 21 Nguyễn Lân Dũng (1980), “Nghiên cứu sử dụng vi sinh vật để sản xuất loại sinh khối giàu protein vitamin phục vụ chăn nuôi”, Tạp chí Thơng tin chun đề, Viện thơng tin khoa học kỹ thuật Trung ương, 41: 17-19 Trần Mai Đức (2005), “Hiện trạng trồng Rong Sụn - Kappaphycus alvarezii (Doty) Doty ven biển phía Nam Việt Nam”, Báo cáo chuyên đề khoa học Đề tài Bộ Thủy sản, 45 trang Phạm Hồng Hải, Nguyễn Xuân Nguyên, Nguyễn Bích Thủy, Trần Đình Toại (2007), “Một số ứng dụng Carrageenan khả sử dụng k-Carrageenan từ Rong Biển Việt Nam bảo quản chế biến thực phẩm”, Tạp chí khoa học cơng nghệ, tập 45, số 4, Tr 87-93 Đặng Diễm Hồng, Hoàng Thị Minh Hiền, Phạm Ngọc Sơn, Nguyễn Đức Bách, Nguyễn Văn Đồng (2002), “So sánh trình tự nucleotit đoạn ITS-1 số lồi tảo Việt Nam”, Tạp chí Khoa học Công nghệ 40: 161-167 Phạm Văn Huyên (2004), “Kết sử dụng rong sụn để xử lý ô nhiễm ưu dưỡng ao nuôi tôm”, Thông tin Khoa học - kỹ thuật - kinh tế thủy sản, Số 09, Tr 16-18 Nguyễn Hữu Kháng, Thái Ngọc Chiến, Nguyễn Đức Đạm (2005), “Kết nuôi kết hợp cá mú với vẹm xanh, rong sụn bào ngư vũng me, Nha Trang, Khánh Hịa”, Thơng tin Khoa học - kỹ thuật - kinh tế thủy sản, Số 08, Tr 15-17 Trần Thị Luyến, Đỗ Minh Phụng, Nguyễn Anh Tuấn, Ngô Đặng Nghĩa (2004), “Chế biến rong biển”, Nhà xuất Nơng nghiệp, Thành phố Hồ Chí Minh 65 Huỳnh Quang Năng ( 2003), “Di nhập phát triển trồng Rong Sụn - Kappaphycus alvarezii (Doty) Doty vào vùng biển phía Nam Việt Nam”, Tuyển tập báo cáo Kỷ niệm 10 năm ngày thành lập Viện Khoa học Vật liệu, Tập II, tr 176 – 181 10 Huỳnh Quang Năng (2005), “Xây dựng mơ hình trồng Rong Sụn- Kappaphycus alvarezii ln canh ao đìa ni tơm ven biển”, Báo cáo tổng kết đề tài, SUMABTS, Phân viện Khoa học vệt liệu tạ Nha Trang 11 Huỳnh Quang Năng, Nguyễn Hữu Dinh (1994), “Kết nghiên cứu khoa học kỹ thuật Rong Sụn – Kappaphycus alvarezii (Doty) Doty”, Báo cáo khoa học Chương trình rong biển nhà nước KN04 12 Huỳnh Quang Năng, Nguyễn Hữu Dinh (1996), “Khảo nghiệm di trồng định hướng quy hoạch phát triển nguồn lợi Rong Sụn-Kappaphycus alvarezii ven biển Khánh Hòa”, Báo cáo tổng kết đề tài, Sở thủy sản Khánh Hòa, 27 trang 13 Huỳnh Quang Năng, Nguyễn Hữu Dinh, Trần Kha (1999), “Kết nghiên cứu di trồng Rong Sụn- Kappaphycus alvarezii vào vùng biển Việt Nam’’, Tuyển tập báo cáo khoa học Hội nghị KHCN Biển toàn quốc lần thứ IV: 942-947, NXB Thống kê Hà Nội.” 14 Huỳnh Quang Năng, Trần Kha (2003), Nghiên cứu phát triển trồng Rong Sụn – Kappaphycus alvarezii làm thực phẩm góp phần phát triển kinh tế vung hải đảo, BCTKĐT, Trung tâm KHTN CNQG, 20 trang 15 Huỳnh Quang Năng, Trần Mai Đức, Phạm Văn Huyên, Võ Xuân Mai, Võ Duy triết, Trần Kha, Trần Quang Thái, Huỳnh Hoàng Như Khánh, Lê Thị Hoa, Phan Hồng Dũng, Đặng Diễm Hồng, Lê Mai Hương, Lê Văn Yến (2007), Điều tra quy hoạch đề xuất giải pháp phát triển trồng Rong Sụn Kappaphycus alvarezii (Doty)Doty bền vững, Báo cáo tổng kết khoa học kỹ thuật đề tài, Viện nghiên cứu nuôi trồng thủy sản III, Bộ Thủy Sản TÀI LIỆU TIẾNG ANH 66 16 Ask E.I., Rhodora V.A., (2002), “ Advances in cultivation technology of commercial eucheumatoid species: ,1 review with suggestions for future research”, Aquaculture 206: 257-277 17 Azanza-Corrales, R., Aliaza, T.T., Montailo, N.E (1996), “Recruitment of Eucheuma and Kappaphycus on a farm in Tawi-Tawi, Philippines”, Hydrobiologia 326-327, 235-244 18 Baba M., R Pauwels, J Balzarini, J Arnout, J Desmyter & E De-Clercq ( 1988), “Mechanism of inhibitory effect of dextran sulfate and heparin on replication of human immunodeficiency virus in vitro” Proc Natl Acad Sci USA, 85: 6132-6136 19 Charles S V., Chong S C., Hurtado A Q., Flower E S., Genevieve B L., Alan C (2007), “Distribution and symptoms of epiphyte infection in major carrageenophyteproducing farms ”, Journal of Applied Phycology, Vol 20, No 5, 27–33 20 Chen X., Zeng Y., Jiao N (2008), “Characterization of Cytophaga-Flavobacteria T T community structure in the Bering Sea by cluster-specific 16S rRNA gene amplification analysis”, J Microbiol Biotechnol, 18(2):194-8 45T 21 Cheney, D.P., Dawes, C.J (1981), “Taxonomic studies of the Florida species of Eucheuma (Rhodophyta, Gigartinales): I Initial considerations In: Levring, T (Ed.)”, Proceedings of the l0nth International Seaweed Symposium, vol.8 Walter de Grnyter, Berlin, pp.59-66 22 Cook R.J (1985), “Biological control of plant pathogens:theory to application”, Phytopathology, 75(1): 25- 29 T 43T 23 Critchley A.T., Largo D., Wee W., Bleicher L’honneur G., Hurtado AQ., Schubert J (2004) “A preliminary summary on Kappaphycus farming and the impact of epiphytes”, The Japanese Journal of Phycology, 52: 231-232 24 Dang Diem Hong, Hoang Minh Hien, Ngo Hoai Thu, Hoang Lan Anh, Luyen Quoc Hai (2008), “Phylogenetic analyses of Prorocentrum spp and Alexandrium spp 67 isolated from Northern coast of Vietnam based on the use of 18S rDNA sequence”, J Environ Biol., 29 (4): 535-542 25 Dang Diem Hong, Ngo Hoai Thu, Hoang Sy Nam, Hoang Minh Hien, Luyen Quoc Hai, Dao Viet Ha, Yasuo Fukuyo, Mitsunori Iwataki (2007), “The phylogenetic tree of Alexandrium, Prorocentrum and Pseudonitzschia of harmful and toxic algae in Vietnam coastal waters based on sequences of 18S rDNA, ITS1-5.8S-ITS2 gene fragments and single cell – PCR method”, Mar Res in Indonesia 32 (2): 203-218 26 Danilo B.L., Fukami K., Nishijima T., Ohno M (1995ª), “Laboratory – induced development of ice-ice disease of farmed red algae Kappaphycus alvarezii and Eucheuma denticulatum (Solieriaceae, Gigartinales, Rhodophyta)” J Appl Phycol, (7): 539-543 27 Danilo B.L., Fukami K., Nishijima T (1995b), “Occasional pathogenic bacteria P P promoting ice-ice disease in the carrageenan-producing red algae Kappaphycus alvarezii and Eucheuma denticulatum (Solieriaceae, Gigartinales, Rhodophyta)” J Appl Phycol, 7(6): 545-554 28 Danilo B.L., Fukami K., Adachi M., Nisgijima T (1998), “Immunofluorescent detection of ice-ice disease promoting bacterial strain Vibrio sp 11 of farmed macroalgal, Kappaphycus alvarezii (Gigartinales, Rhodophyta)” J Mar Biotechnol, (6): 178-182 29 Danilo B.L., Fukami K., Nishijima T (1999), “Time-dependent attachment mechanism of bacterial pathogen during ice-ice infection in Kappahycus alvarezii (Gigartinales, Rhodophyta)” J Appl Phycol., 11 (1): 129-136 30 Dawson E.Y (1961), “Marine red algae of Pacific Mexico Part Gigartinales”, Pacific Naturalist 2: 191-343, 63 plates 31 Doty M.S (1988), “Prodromus ad systematica Eucheumatoideorum: A tribe of commercial seaweeds related to Eucheuma (Solieriaceae, Gigartinales) In: I.A Abbott 68 (Ed.)”, Taxonomy of Economic Seaweeds: With Reference to some Pacific and Caribbean Species, Volume II California Sea Grant College Program, pp 159 – 207 32 Doty M.S., Alvarez V.B., (1975), “Status, proplems, advances and economics of Eucheuma farm”, Mar Techno Soc J : 30-35 33 Fayaz M., Namitha K.K., Murthy K.N.C., Swamy M M., Sarada R., Khanam S., Subbarao P.V., Ravishankar G.A (2005), “Chemical composition, Iron Vioavailability and Antioxidant Activity of Kappaphycus alvarezzi (Doty)”, J Agric Food Chem 53, 792-797 34 Fortes Edna G (2002), Development of Mitigating Strategies for Seaweed Diseases to Sustain or Enhance Production in Farms, Marine Science Institute, College of Science, University of the Philippines, Diliman, Quezon City Submitted to: Department of Agriculture-Bureau of Agricultural Research 35 Gerung G S., Ohno M (1997), “Growth rates of Eucheuma denticulatum (Burman) Collins et Harvey and Kappaphycus striatum (Schmitz) Doty under different conditions in warm waters of Southern Japan”, Journal of Applied Phycology 9, pp 413 - 415 36 H J van der Meulen, W Harder and H Veldkamp (1974), “Isolation and characterization of Cytophaga flevensis sp nov., a new agarolytic flexibacterium” Journal Antonie van Leeuwenhoek, 40(3): 329-346 37 Hurtado A.Q., Critchley A.T., Trespoey A., and Bleicher-Lhnneur G (2005), “Occurences of polysiphonia epiphytes in Kappaphycus farms at Calaguas Is Camarines Norte, Phillippines”, J Appl Phycol, 18 (3-4): 301-306 38 Hurtado - Ponce A.Q., R F Agbayani, E A J Chavoso (1996), “Economics of cultivating Kappaphycus alvarezii using the fixed - bottom line and hanging - long line methods in Panagatan Cays, Caluya, Philippines”, Journal of Applied Phycology 105, pp 105 - 109 69 39 Hurtado A.Q., Critchley A.T., Trespoey A., Bleicher L G (2008), “Growth and carrageenan quality of Kappaphycus Striatum var Sacol grown at different stocking densities, duration of culture and depth”, Journal of Applied Phycology, vol 20, No 5, 101-105 40 Kraft, G.T (1969), “Eucheuma procrusteanum, a new red algal species from the Philippines”, Phycologia 8, pp 215-219 41 Knutsen S., Myslabodski B., Larsen B., Usov A (1994), “A modified system of nomenclature for red algal galactans” Botanica Marina 37: 163-169 42 Lise Høi, Inger Dalsgaard, Anders Dalsgaard (1998), “Improved Isolation of Vibrio vulnificus from Seawater and Sediment with Cellobiose-Colistin Agar”, Appl Environ Microbiol, 64(5): 1721–1724 43 Lombardi J.V., de Almeida Marques H.L., Pereira R.T.L., Barreto O.J.S., de Paula E.J (2006), “Cage polyculture of the Pacific white shrimp Litopenaeus vannamei and the Philippines seaweed Kappaphycus alvarezii”, Aquaculture [Aquaculture] Vol 258, no 1-4, pp 412-415 44 Massad G., Oliver J.D (1987), ”New selective and differential medium for Vibrio cholerae and Vibrio vulnificus”, Appl Environ Microbiol, 53:2262–2264 45 Matem S.P Mtolera (2003), “Effect of Seagrass Cover and Mineral Content on Kappaphycus and Eucheuma Productivity in Zanzibar”, Western Indian Ocean Journal of Marine Sciences Vol.2(2): 163-170 46 McHugh D.J (2003), “A guide to the seaweed industry”, FAO Fisheries Technical Paper, Number 441, Rome, FAO, 105 pp 47 Mendoza W.G., Montano N E., Ganzon-Fortes E.T., Ronal D (2002), “Chemical and gelling profile of ice-ice infected carrageenan from Kappaphycus striatum, sacol strain ( Solieriaceae, Gigartinales, Rhodophyta )”, Jour Of Appl Phycol.,14: 409418 48 Miller W A., Miller M A., Gardner I A., Atwill E R., Byrne B A., Jang S., 70 Harris M., Ames J., Jessup D., Paradies D., Worcester K., Melli A., Conrad P.A (2006), “Salmonella spp., Vibrio spp., Clostridium perfringens, and Plesiomonas shigelloides in Marine and Freshwater Invertebrates from Coastal California Ecosystems” Microbial Ecology, 52(2): 198-206 49 Montolalu, R.I., Tashiro, Y., Matsukawa, S., Ogawa, H (2007), “Effect of Extraction Parameters on Gel Properties of Carrageenan from Kappaphycus alvarezii (Rhodophyta)”, J of App Phycology, 20, 521- 526 50 Nabil S., Cosson J (1996), “Seasonal variations in sterol composition of Delesseria sanguinea (Ceramiales, Rhodophyta)”, Hydrobiologia 326/327, 511–514 51 Nang Huynh Quang, I.Tsutsui (2006), “Kappaphycus cultivation and utilization in Vietnam”, Advances in Seaweed Cultivation and Utilization in Asia; Phang, Critchley & Ang(eds): 171-177 52 Nang Huynh Quang, Duc Tran Mai, Kha Tran (2007), “The growth of Kappaphycus alvarezii (Doty) Doty and Kappaphycus Striatum (Schmitz) Doty cultivated in the different temperature seasons”, Program & Abstracts XIXth P P International Seaweed Symposium, Kobe, Japan, pp 70-71 53 Neish, I C and SuariLink.com (2003), “The ABC of Eucheuma Seaplant Production: Agronomy, Biology and Crop – handling of Betaphycus, Eucheuma and Kappaphycus (the Gelatinae, Spinosum and Cottonii of commerce)”, Marine Botanicals, URL, : http://www.surialink.com/mb/ 54 Norris, J.N (1985), “ Observations on Eucheuma J Agardh (Solieriaceae, Rhodophyta), from the Gulf of California Mexico” In I.A Abbott & J N Norris (eds), Taxonomy of Economic Seaweeds California Sea Grant College Report No TCSGCP-011, pp 63-65 55 Ohno M., (1993), “Seaweed cultivation and Marine ranching”, JICA, pp.151 56 Oliver J D (2005), “Wound infections caused by Vibrio vulnificus and other marine bacteria”, Epidemiol Infect.,133(3): 383-91 71 57 Qian, P Y., C Y Wu, M Wu and Y K Xie (1996), “Integrated cultivation of the red alga Kappaphycus alvarezii and the pearl oyster Pinctada martensi ”, Aquaculture 147, Issues - 3, pp 21 - 35 58 Rajasulochana P., Krishnamoorthy P., Dhamotharan R (2010), “AMINO ACIDS, FATTY ACIDS AND MINERALS IN Kappaphycus sps.”, ARPN Journal of Agricultural and Biological Science, VOL 5, NO 59 Ruiter G A D., Rudolph B (1997), “Carrageenan biotechnology”, Trends in Food science & technology, 8: 389-395 60 Trono G C., Fortes E T G., (1989), “Eucheuma farming”, SIEN, Marine Seience Institute, University of Philippines, pp.56 61 Uyenco F., Saniel L.S., Jacinto G.S (1981), “The ice-ice proplem in seaweed farming”, proc Intl Seaweed Symp., (10): 625-630 62 Vairappan CS (2004), “Seasonal occurrences of epiphytic algae on commercially cultivated red algae, Kappaphycus alvarezii (Solieriaceae, Gigartinales, Rhodophyta)”, J Appl Phycol 18(3-4): 611-617 63 Yumoto L., Ezura Y., Kimura T (1989a), “Distribution of the Yumoto 1, Ezura Y, P P Kimura T (1989a) Distribution of the Alteromonas sp., the causative agent of red-spots on the culture bed of makombu Laminaria japonica”, Nippon Suisan Gakk, 55: 453462 TÀI LIỆU TRANG WEB 64 http://biogeodb.stri.si.edu/bioinformatics/dfm/metas/view/31187 65.http://www.khafa.org.vn/default.aspx?cmd=newspub&cmdid=newspubdetail&idnew = 450 66 http://www.sinhhocvietnam.com/carrageenan-một hợp chất chiết rút từ rong sụn 67 http://www biendong.com 68 http://www.bannhanong.com 72 ... chống bệnh trắng nhũn thân (ice – ice disease), tiến hành thực đề tài ? ?Phân lập, định tên khoa học số vi sinh vật gây bệnh trắng nhũn thân (ice – ice disease) Rong Sụn (Kappaphycus alvarezii, Kappaphycus. .. thực đề tài: ? ?Phân lập, định tên khoa học số vi sinh vật gây bệnh trắng nhũn thân (ice – ice disease) Rong Sụn (Kappaphycus alvarezii, Kappaphycus striatum) bị bệnh Vi? ??t Nam? ?? Cơng vi? ??c thực phịng... TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA HÀ NỘI - BÙI ĐÌNH LÃM PHÂN LẬP, ĐỊNH TÊN KHOA HỌC MỘT SỐ VI SINH VẬT GÂY BỆNH TRẮNG NHŨN THÂN (Ice- Ice disease) Ở RONG SỤN (Kappaphycus alvarezii, Kappaphycus