Nghiên cứu sự biến đổi của một số vi sinh vật gây bệnh (coliforms, e coli) và tổng bazơ nitơ bay hơi trên tôm sú bảo quản lạnh

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NHA TRANG KHOA CÔNG NGHỆ THỰC PHẨM --- o0o --- LÊ THỊ MINH HOÀI NGHIÊN CỨU SỰ BIẾN ĐỔI CỦA MỘT SỐ VI SINH VẬT GÂY BỆNH (COLIFORMS, E.COLI) VÀ TỔNG BAZƠ NITƠ BAY HƠI TRÊN TÔM SÚ BẢO QUẢN LẠNH ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC NGÀNH CÔNG NGHỆ THỰC PHẨM GVHD: TS. MAI THỊ TUYẾT NGA NHA TRANG, 2015 i NHẬN XÉT CỦA CÁN BỘ HƯỚNG DẪN …………………………………………………………………………………………… …………………………………………………………………………………………… …………………………………………………………………………………………… …………………………………………………………………………………………… …………………………………………………………………………………………… …………………………………………………………………………………………… …………………………………………………………………………………………… …………………………………………………………………………………………… …………………………………………………………………………………………… …………………………………………………………………………………………… …………………………………………………………………………………………… …………………………………………………………………………………………… …………………………………………………………………………………………… …………………………………………………………………………………………… ii LỜI CẢM ƠN Nội dung của đề tài này thuộc nhiệm vụ hợp tác quốc tế về khoa học và công nghệ theo Nghị định thư “Hợp tác nghiên cứu, thiết kế và chế tạo hệ thống giám sát sử dụng mạng cảm biến không dây trong kiểm soát chất lượng và tiết kiệm năng lượng cho chuỗi hậu cần thủy sản lạnh”, Hợp đồng số 08/2014/HĐ-NĐT ngày 20/6/2014 giữa Bộ Khoa học và Công nghệ, Bộ Giáo dục & Đào tạo và Trường Đại học Nha Trang (cơ quan chủ trì nhiệm vụ) và TS.Mai Thị Tuyết Nga (chủ nhiệm nhiệm vụ), 2014-2016. Để hoàn thành đề tài tốt nghiệp này, trước hết em xin chân thành cảm ơn cô TS. Mai Thị Tuyết Nga đã tận tình hướng dẫn, giúp đỡ và truyền đạt những kiến thức, kinh nghiệm quý báu cho em trong suốt quá trình thực hiện đề tài. Em cũng xin chân thành cảm ơn: Các thầy, cô giáo Khoa Công nghệ thực phẩm, trường Đại học Nha Trang. Các cô phụ trách quản lý phòng thí nghiệm: cô Đỗ Thị Ánh Hòa- phòng Hóa, vi sinh, cô Lê Thiên Sa- khu Công nghệ thực phẩm, cô Trần Thị Hiền Mai- khu chế biến, cô Phan Thị Phượng- khu Công nghệ cao, cô Nguyễn Minh Nhật- khu Công nghệ sinh học đã tạo điều kiện cho em được sử dụng phòng thí nghiệm. Cô Nguyễn Thị Hà Trang đã hỗ trợ nước cất và cô Đào Thị Đoan Trang đã tạo điều kiện cho em mượn dụng cụ để thí nghiệm. Đặc biệt là cô Trần Thị Ái Vân- Bộ môn Công nghệ thực phẩm và chị Trần Thị Thu Lệ- học viên cao học đã nhiệt tình giúp đỡ em trong suốt thời gian qua. Hơn ai hết, iii em dành lời cảm ơn chân thành đến bạn bè và người thân đã hỗ trợ em trong suốt thời gian qua để em có động lực hoàn thành đề tài này. Do những hạn chế về kiến thức của bản thân và điều kiện khách quan nên bài báo cáo này không tránh khỏi những thiếu sót. Rất mong nhận được những nhận xét, góp ý của quý thầy cô và bạn bè để bài báo cáo này được hoàn thiện hơn. Một lần nữa em xin chân thành cảm ơn! iv MỤC LỤC BẢNG CÁC CHỮ VIẾT TẮT vi DANH MỤC CÁC BẢNG vii DANH MỤC CÁC HÌNH viii MỞ ĐẦU 1 CHƯƠNG I. TỔNG QUAN 4 1.1. Tổng quan về tôm sú 4 1.1.1. Giới thiệu về tôm sú 4 1.1.2. Phân loại tôm sú 4 1.1.3. Cấu tạo, đặc điểm sinh học và vòng đời tôm sú [13][16] 5 1.1.4. Hình thức nuôi và phân bố [6][12][16] 7 1.1.5. Tình hình xuất khẩu tôm sú 7 1.1.6. Thành phần hóa học và giá trị dinh dưỡng của tôm [12][13][26] 8 1.2. 11 Phương pháp bảo quản nguyên liệu thủy sản 1.2.1. Phương pháp bảo quản đông 12 1.2.2. Phương pháp bảo quản lạnh 12 1.2.3. Những biến đổi của nguyên liệu thủy sản trong quá trình bảo quản lạnh 17 1.2.4. Một số vi sinh vật gây bệnh thường gặp trên nguyên liệu thủy sản sau thu hoạch [5][14][15] 22 1.3. Tổng quan về các hợp chất bazơ nitơ bay hơi [7][13] 26 1.4. Các công trình nghiên cứu trong và ngoài nước 28 1.4.1. Các nghiên cứu trong nước 28 1.4.2. Các nghiên cứu ngoài nước 29 v CHƯƠNG II. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 32 2.1. Đối tượng nghiên cứu 32 2.2. Hóa chất và nguyên vật liệu dùng trong nghiên cứu 32 2.3. Phương pháp nghiên cứu 34 2.3.1. Phương pháp tiếp cận 34 2.3.2. Bố trí thí nghiệm 35 2.3.3. Các phương pháp đánh giá 37 2.4. 39 Phương pháp xử lý số liệu CHƯƠNG III. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 40 3.1. Sự biến đổi của vi sinh vật gây bệnh trên nguyên liệu tôm sú trong quá trình bảo quản lạnh 40 3.1.1. Biến đổi của Coliforms trên nguyên liệu tôm sú trong quá trình bảo quản lạnh 40 3.1.2. Biến đổi của E.coli trên nguyên liệu tôm sú trong quá trình bảo quản lạnh 45 3.2. Sự biến đổi của tổng bazơ nitơ bay hơi (TVB-N) trên tôm sú nguyên liệu quá trình bảo quản lạnh 50 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT Ý KIẾN 58 TÀI LIỆU THAM KHẢO 60 PHỤ LỤC - - 64 vi BẢNG CÁC CHỮ VIẾT TẮT E.coli Escherichia coli EMB Eosine Methylen Blue cfu Colony forming unit (đơn vị tạo thành khuẩn lạc) MPN Most Possible Number TVB-N Total volatile basic nitrogen (tổng bazơ nitơ bay hơi) TCA Axit Tricloaxetic LSB Lauryl Sulphate Broth (canh Lauryl Sulphate) vii DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 1.1 Thành phần hóa học của tôm sú và các loại tôm khác (%) [13] ....................... 9 Bảng 1.2 Thời gian bảo quản một số loài tôm và thủy sản bằng phương pháp điều chỉnh khí quyển [13] ...................................................................................................... 16 Bảng 1.3 Hệ vi sinh vật nổi trội và vi khuẩn đặc trưng gây hư hỏng cá tuyết [5][7] .... 18 viii DANH MỤC CÁC HÌNH Hình 1.1 Cấu tạo ngoài và trong của tôm sú 5 Hình 2.1 Sơ đồ bố trí thí nghiệm bảo quản tôm sú theo thời gian bảo quản Hình 2.2 Tôm được xếp khay để bảo quản 35 36 Hình 3.1 Biến đổi của Coliforms trên tôm sú bảo quản ở nhiệt độ 1± 1 °C Hình 3.2 Biến đổi của Coliforms trên tôm sú bảo quản ở nhiệt độ 4± 1 °C Hình 3.3 Biến đổi của Coliforms trên tôm sú bảo quản ở nhiệt độ 9 ± 1 °C Hình 3.4 Biến đổi của Coliforms trên tôm sú bảo quản ở nhiệt độ 15 ± 1 °C Hình 3.5 Biến đổi của Coliforms trên tôm sú bảo quản ở nhiệt độ 19 ± 1 °C Hình 3.6 Biến đổi của E.coli trên tôm sú nguyên liệu bảo quản ở nhiệt độ 1 ± 1 °C Hình 3.7 Biến đổi của E.coli trên tôm sú nguyên liệu bảo quản ở nhiệt độ 4 ± 10C Hình 3.8 Biến đổi của E.coli trên tôm sú nguyên liệu bảo quản ở nhiệt độ 9 ± 1 °C Hình 3.9 Biến đổi của E.coli trên tôm sú nguyên liệu bảo quản ở nhiệt độ 15 ± 1°C Hình 3.10 Biến đổi của E.coli trên tôm sú nguyên liệu bảo quản ở nhiệt độ 19±1°C Hình 3.11 Biến đổi của TVB-N trên tôm sú nguyên liệu bảo quản ở 1 ± 10C Hình 3.12 Biến đổi của TVB-N trong tôm sú bảo quản lạnh ở nhiệt độ 4 ± 10C Hình 3.13 Biến đổi của TVB-N trên tôm sú nguyên liệu bảo quản ở 9 ± 10C Hình 3.14 Biến đổi của TVB-N trên tôm sú nguyên liệu bảo quản ở 15 ± 10C Hình 3.15 Biến đổi của TVB-N trên tôm sú nguyên liệu bảo quản ở 19 ± 10C 40 41 41 42 42 45 46 46 47 47 51 52 52 53 53 1 MỞ ĐẦU Trong thời kỳ phát triển công nghiệp hóa, hiện đại hóa của cả nước, ngành thủy sản đóng vai trò hết sức quan trọng cho việc phát triển kinh tế của đất nước. Trong những năm gần đây, thủy sản là một trong những nhóm hàng xuất khẩu chủ lực của Việt Nam, kim ngạch xuất khẩu của mặt hàng này sang các thị trường tăng trưởng khá và có xu hướng ổn định. Sự phát triển đó nhờ vào sự chủ động về nguồn nguyên liệu, với các điều kiện tự nhiên thuận lợi như sông ngòi chằng chịt, có bờ biển dài trên 3260 km, vùng đặc quyền kinh tế 1 triệu km2, vùng nước ngọt và nước lợ có khả năng nuôi trồng thủy sản trên 1 triệu ha, nguồn lợi thủy sản phong phú, đa dạng, đặc biệt thế mạnh phát triển hiện nay là dựa trên các sản phẩm chủ lực: tôm, cá, nghêu, bạch tuột, nhuyễn thể hai mảnh vỏ. Hầu hết, thủy sản Việt Nam xuất khẩu vào thị trường EU, Mỹ, Canada, một số thị trường châu Á có nhu cầu sản lượng lớn như Nhật Bản, Hàn Quốc, Trung Quốc, Úc, Thái Lan… Trong tất cả các thị trường xuất khẩu, thị trường EU yêu cầu an toàn vệ sinh thực phẩm thủy sản nghiêm ngặt nhất, đồng thời có hệ thống quản lý chặt chẽ nhất. Ngày nay, trong giai đoạn phát triển kinh tế, tôm là mặt hàng chế biến xuất khẩu chủ lực của ngành chế biến thủy sản, chủ yếu là tôm sú và tôm thẻ chân trắng đông lạnh, trong đó tôm sú (Penaeus monodon) là đối tượng chủ lực quyết định thành công của ngành tôm Việt Nam. Theo số liệu của Vasep, chiếm tới 50% giá trị xuất khẩu thủy sản trong hơn 10 năm qua, xuất khẩu tôm Việt Nam đã đạt giá trị kỷ lục gần 4 tỷ USD năm 2014 vừa qua. Đồng thời với khối lượng lớn tôm xuất khẩu hàng năm thì loài tôm này đã, đang phát triển và được nuôi nhiều nơi trên thế giới cả về diện tích và sản lượng. Việt Nam hiện là nhà cung cấp tôm số 1 cho Mỹ nhờ sản phẩm tôm sú cỡ lớn và các sản phẩm giá trị gia tăng, thứ 2 là Nhật Bản và thứ 3 là EU. Tuy nhiên trước tình 2 hình đáng báo động về an toàn vệ sinh thực phẩm, nhu cầu của thế giới đang hướng đến sản phẩm sạch, an toàn, quan trọng nhất là tâm lý chung của khách hàng là tìm được sản phẩm chất lượng. Do đó, thực phẩm không an toàn đang là vấn đề cấp thiết của toàn xã hội, việc kiểm soát tốt sự lây nhiễm và phát triển của vi sinh vật gây bệnh, tiêu biểu là Coliforms và E.coli ngay từ nguyên liệu trong quá trình bảo quản nguyên liệu thực phẩm sẽ hạn chế phần lớn các ca ngộ độc thực phẩm và các bệnh đường ruột do vi sinh vật gây ra. Mặt khác, thủy sản là mặt hàng dễ hư hỏng do tác động của vi sinh vật, nếu bảo quản ở nhiệt độ và thời gian không hợp lý thì vi sinh vật rất dễ phát triển, sau khi chết không được chế biến và tiêu thụ ngay thì sẽ sản sinh ra hàng loạt các chất bazơ nitơ bay hơi (NH3, dimethylamine, trimethylamine) làm cho chất lượng của thủy sản giảm. Do đó cần phải có biện pháp khống chế sự phát triển của chúng ngay từ nguyên liệu để có được sản phẩm thực phẩm có chất lượng cao, ít tổn thất về mặt kinh tế. Đánh giá mức độ vệ sinh an toàn thực phẩm không phải là một việc dễ dàng mà cần phải có đủ khả năng chuyên môn về lý thuyết cũng như thực hành. Vì vậy, việc nghiên cứu sự biến đổi của vi sinh vật gây bệnh trong quá trình bảo quản lạnh tôm sú nguyên liệu cho phép quản lý được vấn đề an toàn thực phẩm và chọn phương pháp bảo quản nguyên liệu thích hợp đem lại một sản phẩm thực phẩm an toàn và có chất lượng cao. Để góp phần đánh giá mức độ vệ sinh an toàn thực phẩm cũng như đưa ra những khuyến cáo cho các bên liên quan trong chuỗi cung ứng, tôi tiến hành thực hiện đề tài: “Nghiên cứu sự biến đổi của một số vi sinh vật gây bệnh (Coliforms, E.coli) và tổng bazơ nitơ bay hơi trên tôm sú bảo quản lạnh”. Mục tiêu của đề tài: nghiên cứu được sự biến đổi vi sinh vật gây bệnh, cụ thể là Coliforms, E.coli và tổng bazơ nitơ bay hơi (TVB-N) trên tôm sú nguyên liệu trong thời gian bảo quản lạnh nhằm đưa ra chế độ bảo quản phù hợp ứng dụng trong thực tế. 3 Nội dung của đề tài: - Nghiên cứu sự biến đổi của vi sinh vật gây bệnh Coliforms và E.coli trên tôm sú nguyên liệu trong quá trình bảo quản lạnh. - Nghiên cứu sự biến đổi của tổng bazơ nitơ bay hơi trên tôm sú nguyên liệu trong quá trình bảo quản lạnh. Ý nghĩa khoa học của đề tài: Cung cấp dữ liệu khoa học về sự biến động của vi sinh vật gây bệnh (Coliforms E.coli) và TVB-N trên tôm sú nguyên liệu trong quá trình bảo quản lạnh. Ý nghĩa thực tiễn của đề tài: Kết quả nghiên cứu của đề tài góp phần ngăn ngừa mối nguy sinh học đảm bảo an toàn thực phẩm cho người tiêu dùng theo chương trình quản lý chất lượng HACCP ngay từ khâu nguyên liệu. Tính khả thi của đề tài - Vấn đề nghiên cứu phù hợp với yêu cầu và điều kiện thực tiễn. - Nguồn nguyên liệu phong phú, sẵn có. - Đối tượng nghiên cứu rất được quan tâm hiện nay, tài liệu tham khảo tương đối phong phú. KẾT CẤU ĐỀ TÀI Mở đầu Chương I. Tổng quan Chương II. Đối tượng và phương pháp nghiên cứu Chương III. Kết quả nghiên cứu và thảo luận Kết luận và đề xuất ý kiến Phụ lục 4 CHƯƠNG I. TỔNG QUAN 1.1. Tổng quan về tôm sú 1.1.1. Giới thiệu về tôm sú Tôm sú (Penaeus monodon) là loài tôm được đánh bắt và nuôi trồng hàng đầu thế giới về sản lượng. Theo thống kê của tổ chức Lương thực Nông nghiệp thế giới (Food Agriculture Organization- FAO), sản lượng tôm sú năm 1997 chiếm 52% sản lượng tôm nuôi trồng toàn thế giới, với tốc độ tăng trưởng trung bình 2%/năm. Trong các vùng nuôi tôm chủ yếu trên thế giới, Đông Nam Á là vùng dẫn đầu chiếm 53,7% tổng sản lượng tôm toàn thế giới trong tổng số 54 quốc gia có ngành công nghiệp nuôi tôm phát triển (thống kê của FAO năm 2002). 1.1.2. Phân loại tôm sú - Ngành: Arthopoda- Ngành chân khớp - Ngành phụ: Antennata- Ngành phụ có râu - Lớp: Crustacea- Lớp giáp xác - Bộ: Decapoda- Bộ mười chân - Bộ phụ: Natantia- Bộ phụ bơi lội - Họ chung: Penaeidea - Họ: Penaeidea- Họ tôm he - Giống: Penaeus - Loài: Penaeus monodon Tên tiếng Anh phổ biến là Black tiger shrimp (theo hệ thống phân loại của Holthuis, 1989). Tên tiếng Việt phổ biến là tôm sú. Hiện nay, ở Việt Nam tôm sú là một trong 5 loại tôm được nuôi trồng phổ biến và quan trọng nhất đối với nền kinh tế Việt Nam: - Tôm sú (Black tiger shrimp)- Penaeus monodon 5 - Tôm thẻ (Banana shrimp)- Penaeus merguiensis - Tôm chân trắng (White leg shrimp)- Penaeus vannamei - Tôm Nhật Bản (Kuruma shrimp)- Penaeus japonicas - Tôm càng xanh (Giant fresh water prawn) 1.1.3. Cấu tạo, đặc điểm sinh học và vòng đời tôm sú [13][16] Tôm sú (Penaeus monodon) là loài có kích thước lớn nhất của họ tôm He (Penaeidae), còn gọi là tôm cỏ, thuộc loài giáp xác, thân dài hơi tròn, được bao bằng một lớp vỏ mỏng cấu tạo bằng chất chitin thấm canxi. Màu sắc của tôm do sắc tố thuộc lớp cuticum hay những tế bào riêng biệt quyết định. Khi còn tươi ở vỏ đầu ngực tôm có vằn ngang (tôm ở biển vằn trắng nâu hoặc trắng xanh xen kẽ, ở đầm đìa nước lợ tôm có vằn màu xanh đen). Hình 1.1. Cấu tạo ngoài và trong của tôm sú 6 Chú thích: Eye stalk: mắt Oesophagus: thực quản Stomach: dạ dày Antenna: râu Hepatopancreas: gan tụy Perelopods: chân bò Heart: tim Pleopods: chân bơi Hindgut: chỉ Anus: hậu môn Abdominal segment: phân đoạn bụng Tôm sú sinh trưởng nhanh, khoảng 4-5 tháng là tôm đạt mức trưởng thành, dài đến 27cm và trọng lượng khoảng 250g. Đó là trọng lượng lý tưởng cho tôm thương phẩm tiêu thụ quốc tế. Trong tự nhiên tôm nước mặn sinh trưởng tới mùa sinh sản chúng tiến vào gần bờ và đẻ trứng. Trứng nở ra ấu trùng trải qua 3 thời kỳ biến thái Napilus, Zoea, Mysis, ấu trùng theo các làn sóng biển dạt vào các cửa sông, nơi nước biển và nước sông pha trộn nhau nên độ mặn thấp hơn ngoài biển, thích hợp cho ấu trùng phát triển, đó là vùng nước lợ. Trong môi trường này, ấu trùng (larvae) tiến sang thời kỳ hậu ấu trùng (postlarvae). Sau đó postlarvae chuyển sang thời kỳ ấu niên (juvenile) đồng thời bơi ra biển, tiếp tục tăng trưởng, sinh sản và tiếp diễn chu trình sống của chúng. Tôm sú có thể chịu được sự biến động về độ mặn rất lớn (3- 5%), độ mặn tối ưu là 15- 25%. Tôm sú thuộc loài sinh hoạt về đêm và hay ăn thịt lẫn nhau. Thường lúc còn nhỏ, ấu trùng tôm sú có khuynh hướng bám vào thành ao hồ, các góc hồ hoặc chui sâu dưới lớp cát đáy ao hồ về ban ngày, đến ban đêm nổi lên hoạt động, kiếm tìm thức ăn. Tôm sú thuộc loại động vật máu lạnh, thân nhiệt thay đổi theo nhiệt độ môi trường bên ngoài. Nhiệt độ ảnh hưởng tới nhiều phương diện đời sống của tôm: hô hấp, tiêu hóa thức ăn, miễn nhiễm đối với bệnh tật, sự tăng trưởng… Nhiệt độ thay đổi theo khí hậu mỗi mùa, vì thế tại miền Nam Việt Nam có thể nuôi tôm quanh năm trong khi miền Bắc chỉ nuôi tôm trong mùa nóng. Ở nhiệt độ 280C, tôm sú lớn tương đối chậm, ở 7 nhiệt độ 300C tôm lớn nhanh hơn nhưng rất dễ mắc các dịch bệnh như bệnh MBV (Monodon Baculor Virus). Nhiệt độ tối ưu cho tôm sú phát triển tại các vùng ao hồ nhiệt đới là 28- 300C. 1.1.4. Hình thức nuôi và phân bố [6][12][16] Tôm sú phân bố trên thế giới ở các vùng Ấn Độ, Tây Thái Bình Dương, Đông và Nam Châu Phi, đặc biệt tập trung ở các nước vùng Đông Nam Á như: Đài Loan, Philippin, Indonesia, Malaysia và Việt Nam. Ở Việt Nam tôm sú phân bố rộng từ Bắc đến Nam, vùng ven bờ đến vùng có độ sâu 40m, tập trung nhiều ở độ sâu 10- 25m, vùng phân bố chính là vùng duyên hải miền Trung. Miền Bắc và miền Nam hiếm hơn, đáng chú ý vùng Kiên Giang có sản lượng khá nhiều. Tôm có quanh năm nhưng mùa vụ sinh sản từ tháng 11- 4 năm sau. Kích thước tôm lớn nhất có thể đạt đến 290- 305mm (200- 250g), trung bình đạt từ 190- 195mm, nặng 150g. Chúng ưa sống ở những nơi có đáy bùn cát, độ trong, độ mặn cao và ổn định. Tuy vậy chúng có khả năng thích ứng với độ mặn rộng ngay trong thời kỳ trưởng thành [6]. Tôm sú nuôi trong các ao đầm nước lợ ở cả vùng cao và vùng trung triều. Một số nơi nuôi xen kẽ vụ lúa, vụ tôm và nuôi chung với cá rô phi và cua. Hình thức nuôi: thâm canh hay gọi là nuôi công nghiệp (TC), bán thâm canh (BTC) và quảng canh cải tiến (QCCT). Khu vực phía Bắc nuôi QCCT và BTC là chủ yếu, miền Trung nuôi BTC và TC, các tỉnh phía Nam nuôi BTC và QCCT. 1.1.5. Tình hình xuất khẩu tôm sú Theo số liệu Hải quan và Tổng hợp của Vasep, năm 2014, tổng giá trị xuất khẩu tôm có mức tăng trưởng mạnh (26,9%) so với cùng kỳ năm ngoái, đạt 3,95 tỷ USD, chiếm 50,38% tổng kim ngạch xuất khẩu thủy sản. Đứng đầu về nhập khẩu tôm Việt 8 Nam là thị trường Mỹ chiếm 26,92% tỷ trọng xuất khẩu tôm và giá trị xuất khẩu đạt 1,06 tỷ USD (tăng 28%). Tiếp theo là thị trường Nhật Bản và EU chiếm tỷ trọng lần lượt là 18,8% và 17,27% với giá trị xuất khẩu tăng tương ứng là 4,9% (đạt 743,4 triệu USD) và 66,7% (đạt 682,7 triệu USD). Tháng 01/2015, kim ngạch xuất khẩu thủy sản giảm 13,1% so với cùng kỳ năm trước, đạt 507 triệu USD. Các mặt hàng xuất khẩu quan trọng đều giảm so với cùng kỳ năm 2014. Trong đó, mặt hàng tôm giảm mạnh 20,3% (đạt 206,3 triệu USD) . 1.1.6. Thành phần hóa học và giá trị dinh dưỡng của tôm [12][13][26] Thành phần hóa học của cơ thịt tôm gồm có: nước, protein, lipit, gluxit, khoáng chất, vitamin, enzyme và hoocmon. Những thành phần có hàm lượng tương đối nhiều là nước, protein, lipit và khoáng chất, hàm lượng gluxit trong tôm rất ít và tồn tại dưới dạng glucogen. Thành phần hóa học của tôm thường khác nhau theo giống loài. Trong cùng một loài nhưng hoàn cảnh sinh sống khác nhau thì thành phần hóa học cũng khác nhau, ngoài ra thành phần hóa học của tôm còn phụ thuộc vào trạng thái sinh lý, mùa vụ, thời tiết…Sự khác nhau về thành phần hóa học và sự biến đổi của chúng làm ảnh hưởng rất lớn đến mùi vị và giá trị dinh dưỡng của sản phẩm, đến việc bảo quản tươi nguyên liệu và quá trình chế biến. Bên cạnh đó, thành phần hóa học của tôm rất thích hợp cho vi sinh vật phát triển. Qua nghiên cứu Stepanhue cho chúng ta thấy rằng tôm có thành phần protein 19- 23%, lipit 0,6- 1,6%, nước khoáng 73%, nhiều nguyên tố vi lượng và các vitamin nhóm B (B1, B2, B6 và B12). Ngoài ra khi phân tích các axit amin, người ta thấy rằng trong tôm chứa 18- 21 axit amin và hầu như có gần đủ các axit amin không thay thế, cáu tạo cơ tôm rất lỏng lẻo, lượng đạm hòa tan nhiều. Những đặc điểm trên làm cho giá trị dinh dưỡng của tôm rất cao, thịt tôm lại thơm ngon, ngọt. Đó là lý do khiến cho tôm là một trong những mặt hàng có giá trị cao về mặt xuất khẩu, nhưng cũng do đặc điểm 9 trên sau khi đánh bắt tôm rất mau chết và mau ươn thối. Một trong những điều kiện bất lợi gây nên sự hư hỏng của tôm là nội tạng của tôm tập trung ở đầu và cũng là nơi chứa nhiều đạm hòa tan nhất. Thành phần dinh dưỡng của tôm sú so với một số loại tôm khác: tôm càng xanh, tôm thẻ chân trắng, tôm he nâu thì thành phần dinh dưỡng của tôm sú cao hơn và tương đương với tôm he Vịnh Mexico được thể hiện trên Bảng 1.1: Bảng 1.1 Thành phần hóa học của tôm sú và các loại tôm khác (%) [13] Hàm lượng Hàm lượng Hàm lượng Hàm lượng nước protein lipit tro Tôm sú 75,06± 0,76a 21,12± 0,97a 1,83± 0,05a 1,98± 0,06a 2 Tôm càng xanh 78,57± 0,55a 19,23± 0,74a 1,20± 0,10a 1,93± 0,08a 3 Tôm thẻ 80,14± 0,76a 18,11± 0,66a 1,62± 0,02 1,51± 0,17a 4 Tôm he nâu* 76,20± 0,21 17,11± 0,14 1,39± 0,05 1,30± 0,06 5 Tôm Mexico* 77,41± 0,22 20,6± 0,21 1,82± 0,02 1,41± 0,02 STT Loài tôm 1 * Theo Fellow 1993 a là giá trị trung bình cùng cột có cùng ký tự sai khác không có ý nghĩa thống kê (P> 0,05) a/ Nước Cơ thịt của tôm chứa khoảng từ 70- 85% nước, hàm lượng này phụ thuộc vào giống loài tôm và tình trạng dinh dưỡng của tôm. Trong cơ và trong các tế bào, nước đóng một vai trò quan trọng làm dung môi cho các chất vô cơ và hữu cơ, tạo ra môi trường cho các hoạt động sinh hóa trong tế bào, đồng thời nước cũng tham gia vào rất nhiều các phản ứng hóa học và có ảnh hưởng lớn đến sự tạo thành các phản ứng của các protein. Trạng thái của nước trong cơ thịt tôm phụ thuộc vào nhiều tương tác giữa 10 cấu trúc của nước với các dung dịch khác nhau trong tế bào và đặc biệt là với các protein. Những thay đổi về hàm lượng nước trong thịt tôm, gây ra bởi quá trình chế biến, ảnh hưởng mạnh đến các đặc tính thẩm thấu, giá trị dinh dưỡng và chất lượng cảm quan của thịt tôm, đồng thời cũng ảnh hưởng lớn đến thời gian bảo quản của sản phẩm. b/ Protein Các loại protein Cơ thịt của tôm thông thường chứa khoảng từ 13- 25% protein. Hàm lượng này biến thiên tùy thuộc vào giống loài tôm, điều kiện dinh dưỡng và loại cơ thịt. Có thể chia protein trong mô cơ của tôm nguyên liệu thành 3 nhóm: - Protein cấu trúc (actin, myosin, tropomyosin và actomyosin). - Protein tương cơ (myoalbumin, globulin và các enzyme. - Protein mô liên kết: điểm đẳng điện của protein tôm vào khoảng pH 4,5- 5,5. Tỷ lệ giữa các loại protein này phụ thuộc vào sự phát triển giới tính của tôm và sự dao động của chúng trong suốt thời kỳ sinh trưởng. Thành phần các axit amin Tôm là loại thực phẩm khá giàu các axit amin. Giá trị dinh dưỡng của tôm cao cũng chính nhờ các axit amin này. Hàm lượng tổng số của một vài axit amin trong 100g thịt một số loài tôm như sau: Threonin (382 mg); Serin (922,2 mg); Axit glutamic (1033,0 mg); Glycin (673,3 mg); Alanin (623,4 mg) [13]. c/ Lipit Mô cơ của tôm chứa khoảng từ 0,05- 3% lipit, mà thành phần chủ yếu là các photpholipit. Photphatidyl chlorin và cholesterol là loại photpholipit và loại lipit trung tính chiếm tỷ trọng khá lớn trong mô cơ thịt của tôm. Cụ thể, trong 100g thịt tôm, hàm lượng lipit trung tính là 430,7 ± 20,1 mg; photpholipit là 742,0 ± 40,7 mg [13]. Nhiều 11 nghiên cứu cho thấy rằng sự khác nhau về giống loài ảnh hưởng rất nhỏ đến thành phần các axit béo và hàm lượng cholesterol. Tuy vậy hàm lượng của các axit béo và cholesterol trong thịt tôm lại chịu ảnh hưởng của sự thay đổi mùa vụ, nhiệt độ môi trường nước sinh sống, điều kiện dinh dưỡng và thời kỳ phát triển của tôm. d/ Vitamin Hàm lượng vitamin trong tôm đặc trưng theo loài và biến thiên theo mùa vụ. Thịt tôm là nguồn thực phẩm khá giàu vitamin, hàm lượng một số vitamin trong 100g thịt tôm như sau: Thiamin (41µg), Riboflavin (76µg); Niacin (2,7 µg); Axit folic (5,2 µg); Pyridoxin (66 µg). e/ Chất khoáng Tôm là loại thực phẩm rất giàu chất khoáng. Hàm lượng chất khoáng trong thịt tôm biến thiên trong khoảng 0,6- 1,5% khối lượng tươi. Hàm lượng chất khoáng trong thịt tôm có đặc trưng theo loài và biến thiên theo mùa, đồng thời hàm lượng chất khoáng còn phụ thuộc rất lớn vào điều kiện môi trường sống của tôm. 1.2. Phương pháp bảo quản nguyên liệu thủy sản Do đặc điểm mau ươn thối của nguyên liệu thủy sản, bảo quản là một khâu rất quan trọng trong quá trình chế biến. Theo ước tính của Jame (1984) thì khoảng 8% sản lượng thủy sản của thế giới bị tổn thất về chất lượng ngay sau khi đánh bắt, chưa kể những thất thoát trong quá trình vận chuyển, bảo quản, sản xuất. Do đó chất lượng nguyên liệu sau đánh bắt có ý nghĩa quan trọng, nó làm tăng giá trị của sản phẩm tiêu dùng và mở rộng thị trường buôn bán. Trong thực tế, có hai phương pháp chính bảo quản thủy sản là bảo quản lạnh và bảo quản lạnh đông/đông, tuy nhiên phương pháp bảo quản lạnh được ứng dụng khá rộng trong các xí nghiệp chế biến thủy sản. 12 1.2.1. Phương pháp bảo quản đông Làm lạnh đông thủy sản là quá trình làm lạnh thủy sản do sự hút nhiệt của chất làm lạnh (băng môi) để đưa nhiệt độ ban đầu của cơ thể thủy sản xuống dưới điểm đóng băng và tới -80C ÷ -100C và có thể xuống thấp hơn nữa: -180C, -300C hay -400C. Mục đích: Làm lạnh đông thủy sản là hạ thấp nhiệt độ thủy sản, làm chậm sự hư hỏng của thủy sản để cho đến khi rã đông thủy sản sau thời gian bảo quản lạnh [9]. 1.2.2. Phương pháp bảo quản lạnh Làm lạnh hay ướp lạnh là hạ nhiệt độ nguyên thủy của sản phẩm xuống đến gần điểm đóng băng, tức là làm cho phần nước tự do của tế bào lạnh đi (khoảng -0,50C ÷ 10C) chủ yếu ở lớp bề mặt sản phẩm. Ở nhiệt độ này enzyme sản phẩm và vi sinh vật bị ức chế, hoạt động chậm chạp. Cấu trúc tế bào vẫn như nguyên, không thay đổi và trạng thái vật lý của tế bào chỉ là sự hạ nhiệt làm lạnh phần nước tự do của gian bào [9]. Các phương pháp bảo quản lạnh [13][14] Bảo quản tươi tôm nguyên liệu là một khâu rất quan trọng trong quá trình chế biến. Tôm nguyên liệu rất dễ bị ươn thối biến chất chất như vậy không chỉ làm giảm thấp giá trị dinh dưỡng mà có khi còn gây ra ngộ độc. Tôm nguyên liệu thu hoạch được phụ thuộc nhiều vào thời tiết, mang tính chất mùa vụ rõ rệt, cơ sở chế biến xa ngư trường…do đó công tác bảo quản tươi vô cùng quan trọng. Trong thực tế có một số phương pháp bảo quản tôm phổ biến sau: a/ Bảo quản tôm bằng phương pháp làm lạnh Nhiệt độ ảnh hưởng lớn đến tốc độ thối rữa của thực phẩm thông qua ảnh hưởng của nó đối với các enzyme của vi khuẩn và sự tự phân giải. Nhiệt độ cũng ảnh hưởng tới tỷ lệ phát triển của vi khuẩn. Khi hạ thấp nhiệt độ thì hoạt động của enzyme và vi sinh vật trong tôm sẽ giảm xuống, như vậy tôm nguyên liệu có thể giữ tươi được một thời gian. Cách quan trọng nhất để bảo quản thủy sản tươi, ở cả vùng khí hậu nhiệt đới và vùng khí hậu ôn đới từ giữa thế kỷ 19 tới nay là giữ lạnh cho thủy sản ở nhiệt độ 13 khoảng 0- 10C. Môi trường làm lạnh phổ biến nhất là nước đá (trên 00C), hỗn hợp nước đá + NaCl, hay nước đá được làm từ nước biển. Đã có rất nhiều nghiên cứu về bảo quản tôm trong nước đá ngay sau khi bắt được. Kết quả thu được của các nghiên cứu này cũng rất khác nhau, thời gian bảo quản tôm tươi ở 00C ngay sau khi chết biến đổi trong khoảng từ 5 đến 16 ngày. Nhiệt độ của nước đá (00C) chỉ làm chậm các hoạt động của vi khuẩn, chứ không ngăn chặn hoàn toàn được sự thối rữa của tôm. Theo tài liệu của Dự án Seaqip, ngay trong điều kiện xử lý và bảo quản tốt chất lượng tôm bảo quản ở nhiệt độ 00C cũng bị giảm sút. Sau 40 giờ bảo quản, tỷ lệ tôm đạt chất lượng loại 1 giảm từ 80- 90% xuống còn 5- 25% [2]. Ngoài ra tài liệu còn cho biết, nếu bảo quản lạnh tôm bằng nước đá xay trong thùng cách nhiệt có lỗ thoát ở đáy thùng sẽ hạ nhiệt độ tôm xuống dưới 50C trong 4 giờ, xuống 00C trong 6- 7 giờ. Theo nghiên cứu của Graham và cộng sự được Dự án Seaqip biên dịch cho thấy, có sự thất thoát một số hợp chất chứa nitơ, kể cả protein trong nước biển lạnh nhiều gấp đôi so với cá ướp đá đúng quy cách nhưng không nhiều hơn cá ướp thành đống lớn. Trong nước biển lạnh bảo quản cá trực tiếp, lượng hợp chất bị thất thoát sẽ lớn hơn do lực thẩm thấu mạnh hơn. Các tác giả nghiên cứu cho biết trong đá có nhiều khoảng trống và cách bảo quản thông thường cho phép không khí lưu thông ở mức độ nào đó, vì vậy vi khuẩn yếm khí không có cơ hội phát triển. Khi bảo quản bằng nước biển lạnh, hàm lượng oxy ít sẽ tạo điều kiện yếm khí cho phép vi khuẩn kỵ khí phát triển [1]. b/ Bảo quản lạnh kết hợp với hóa chất Cho đến nay, đã có nhiều nghiên cứu về các loại hóa chất dùng để bảo quản tôm nguyên liệu. Dùng hóa chất để bảo quản tôm tốt nhất là kết hợp với nhiệt độ thấp, yêu cầu của hóa chất dùng là: không hại đối với cơ thể người, không có mùi vị lạ, tính chất hóa học ổn định, dễ hòa tan trong nước, không làm hư hỏng dụng cụ bảo quản, có hiệu lực sát trùng mạnh, giá thành hạ và cách sử dụng thuận tiện. 14 Sử dụng Chlorine Cách sử dụng chlorine là được chế thành nước đá hoặc dùng dung dịch để nhúng tôm. Đối với loại dung dịch thời gian ngâm dài hay ngắn phụ thuộc vào loại nguyên liệu và lượng Cl có hiệu quả trong dung dịch. Theo nghiên cứu của Nguyễn Trọng Cẩn và Nguyễn Việt Dũng (1994), cho thấy sử dụng dung dịch chlorine 40ppm, nhúng tôm sú tươi vào dung dịch 15 phút sau đó vớt ra dùng nước đá để bảo quản trong các thùng cách nhiệt, hàng ngày kiểm tra chất lượng. Kết quả thí nghiệm cho thấy: chlorine có tác dụng bảo quản tương đối tốt. Đem so sánh với bảo quản tôm nguyên liệu bằng nước đá thì tôm sau khi ngâm vào dung dịch chlorine rồi bảo quản trong nước đá có thời gian bảo quản kéo dài thêm từ 0,5 đến 1 ngày [11]. Sử dụng các hợp chất sulfit Các hợp chất sulfit đã được giới thiệu từ thập niên những năm 1950 để bảo quản chống biến đen cho tôm nguyên liệu. Reilly, Bernarte và Dangla (1984), đã báo cáo rằng tôm sú (Penaeus monodon) của Phillipin được xử lý với Na2S2O5 (5g/l) trong 30 giây sau đó bảo quản trong nước đá vụn có tác dụng khống chế hiện tượng biến đen đến 10 ngày. Hơn nữa tôm còn giữ được vị ngọt và kết cấu cơ thịt khá chắc sau 10 ngày bảo quản. Lô tôm chỉ hoàn toàn bị hỏng sau 17 ngày bảo quản [16]. Tuy nhiên hiện nay các nhà sản xuất đang cố gắng giảm việc sử dụng các chất bảo quản có sulfit do dư lượng của chất này hiện đã gây nên một số phản ứng phụ không tốt cho người sử dụng tôm làm thực phẩm, đặc biệt là những người bị hen suyễn [16]. 15 Các chất polyphosphate (PP) Theo Menabrito và Regenstein (1988) các polyphosphate có vai trò quan trọng trong công nghệ chế biến thủy sản, chúng có khả năng tương tác với nhiều thành phần trong thực phẩm, thể hiện nhiều chức năng: - Tương tác với các ion kim loại - Tác dụng đệm: các PP được sử dụng như là các chất đệm, đặc biệt những chất này chứa các natri tripolyphosphate (Na5P3O10). - Tạo liên kết với nước: Các phương pháp xử lý thực phẩm thủy sản bằng PP làm cho protein của cơ thịt giữ lại các chất nước tự nhiên trong cơ và nhờ đó tránh được hiện tượng mất nước - Bảo quản thực phẩm: PP giúp tránh hoặc làm chậm lại quá trình oxy hóa các chất béo không no có trong thực phẩm và ngăn chặn một số vi sinh vật liên quan đến quá trình làm hư hỏng thực phẩm. c/ Bảo quản bằng phương pháp làm lạnh kết hợp với điều chỉnh khí quyển Không khí bình thường chứa khoảng 78% nitơ, 21% oxy và 0,1% CO2. Điều chỉnh khí quyển (modified atmosphere) là phương pháp phân bố lại thành phần các chất khí trong môi trường bảo quản. Các quá trình vi sinh vật sẽ bị ảnh hưởng rất lớn bởi các biến đổi trong thành phần khí và kết quả là kéo dài thời gian bảo quản. Người ta thường sử dụng riêng lẻ các khí CO2, SO2, O2, CO và N2 hay hỗn hợp giữa các khí này để tạo ra sự thay đổi trong thành phần của không khí bảo quản [16]. Bảo quản thủy sản tươi bằng phương pháp điều chỉnh không khí có những ưu điểm nổi bật: kéo dài thời gian bảo quản và đảm bảo chất lượng sản phẩm. Brown và cộng sự (1980) nghiên cứu cá tuyết fillet và cá hồi giữ bằng phương pháp điều chỉnh không khí có chứa 20% và 40% CO2. Họ thấy rằng ảnh hưởng của phương pháp dùng CO2 điều chỉnh không khí là làm giảm sự tạo thành TMA, ammoniac và ngăn chặn sự phát triển của vi khuẩn. 16 Theo Ashie và cộng sự (1996) thời gian bảo quản của một số loài tôm và thủy sản bằng phương pháp điều chỉnh khí quyển như Bảng 1.2: Bảng 1.2 Thời gian bảo quản một số loài tôm và thủy sản bằng phương pháp điều chỉnh khí quyển [13] Loại thủy sản Tôm nâu Chế độ bảo quản Thời gian bảo quản (ngày) Nhiệt độ (0C) Khí quyển Không khí ĐCKQ 4 100% CO2 4- 5 ≥ 14 66% - 34% 4- 5 ≥ 13,5 35% - 65% 4- 5 8,5 Tôm he 4 100% 6- 7 8- 9 Cá hồi 1,7 80% - 20% 12 20 Cua 1,7 80% - 20% 14 > 25 d/ Bảo quản bằng phương pháp lạnh đông Phương pháp làm lạnh đông tức là hạ thấp nhiệt độ của tôm nguyên liệu xuống dưới -80C. Như vậy một lượng nước lớn ở trong nguyên liệu sẽ bị đông kết lại, làm ngừng đến mức tối đa hoặc đình chỉ hoàn toàn hoạt động của các enzyme nội tại và các vi sinh vật gây thối rữa. Hiện tại đây là phương pháp giữ tươi nguyên liệu tốt nhất, đảm bảo được tính chất, mùi vị và giá trị dinh dưỡng của tôm nguyên liệu. Tùy theo thời gian bảo quản dài hay ngắn mà tôm nguyên liệu được bảo quản ở nhiệt độ thấp hơn như -180C hay -250C. Phương pháp làm lạnh đông là cách bảo quản tôm nguyên liệu tốt, tuy vậy trong quá trình bảo quản chất lượng của nguyên liệu cũng có sự biến đổi như protein bị đông đặc biến tính, chất béo bị thủy phân hoặc bị oxy hóa, đặc biệt là những biến đổi về vật lý và cấu trúc của nguyên liệu [12][16]. 17 1.2.3. Những biến đổi của nguyên liệu thủy sản trong quá trình bảo quản lạnh a/ Biến đổi vật lý Tùy theo phương pháp bảo quản lạnh khác nhau mà nguyên liệu có những biến đổi khác nhau. Tuy nhiên, thời gian bảo quản càng kéo dài thì biến đổi của nguyên liệu diễn ra như sau: nguyên liệu thay đổi trọng lượng, biến đổi trạng thái bề mặt, làm giảm độ đàn hồi và độ săn chắc của cơ thịt, màu sắc trở nên xấu đi, giảm mùi vị đặc trưng, có thể xuất hiện mùi lạ và thay đổi trạng thái của nước trong thực phẩm. Nguyên nhân do có sự thay đổi hàm lượng nước tự do trong sản phẩm, một lượng nước đáng kể chất ngấm ra bị thất thoát làm cho mùi vị giảm, chất béo bị oxy hóa làm cho mùi vị, màu sắc thay đổi [2][12][14]. b/ Biến đổi hóa học Nhiệt độ lạnh không tiêu diệt được vi sinh vật nhưng ức chế sự phát triển của chúng, đồng thời làm giảm tốc độ phân giải của enzyme và vi sinh vật. Do đó nguyên liệu thủy sản trong quá trình bảo quản lạnh vẫn biến đổi tăng theo thời gian bảo quản. Nhiệt độ thấp ức chế tốc độ của các phản ứng hóa sinh trong thủy sản, nhiệt độ càng thấp thì tốc độ phản ứng càng giảm: trong phạm vi nhiệt độ bình thường cứ hạ xuống 100C thì tốc độ phản ứng giảm xuống 1/2 đến 1/3 [14]. Các biến đổi hóa sinh chủ yếu như: phân giải protein, chất béo, đường, chất tạo màu, phân hủy axit amin và vitamin, TMAO, Cretinphosphat…Đầu tiên protein, lipit và các chất khác phân giải dưới tác dụng của enzyme nội tại tạo thành các chất đơn giản hơn như: pepton, peptit, axit amin, axit béo…Sau đó cùng với thời gian bảo quản kéo dài, vi sinh vật trở nên thích nghi với môi trường sẽ phát triển mạnh mẽ, chuyển hóa các chất này thành các sản vật cấp thấp như: trymetylamin, dimetylamin, indol, skatol, NH3, H2S… [2][14]. c/ Biến đổi vi sinh vật ở nguyên liệu trong quá trình bảo quản lạnh [14] Hệ vi sinh vật ban đầu trong nguyên liệu thủy sản rất đa dạng, bao gồm vi sinh vật thường trú trên nguyên liệu và vi sinh vật lây nhiễm trong quá trình đánh bắt và bảo 18 quản. Trong suốt quá trình bảo quản lạnh thực phẩm, hệ vi sinh vật ưa lạnh hoặc có khả năng chịu được nhiệt độ lạnh đặc trưng phát triển nhưng chỉ có một phần hệ này gây hư hỏng thực phẩm và một phần có khả năng gây bệnh cho con người. Những vi sinh vật đặc trưng gây hư hỏng sinh ra enzyme phân giải cơ thịt thủy sản tạo ra mùi vị khó chịu liên quan đến sự ươn hỏng. Theo nghiên cứu của Lima (1978), Gram và cộng sự (1990), Huss (1989), Shewanella putrefacien là vi sinh vật điển hình cho sự hư hỏng thủy sản ở vùng nước ôn đới khi bảo quản lạnh có không khí. Chúng sẽ sản sinh ra trimetylamin (TMA), hydro sunfit (H2S) và các sunfit dễ bay hơi khác. Theo Dalgard (1993) và Jergensen, Huss (1989), trong quá trình bảo quản ở áp suất điều chỉnh (có CO2), Photobacterium, một loài vi khuẩn ưa lạnh sản sinh khối lượng lớn TMA và là một trong những vi khuẩn gây hư hỏng chính. Một số thủy sản nước ngọt và nhiều thủy sản vùng nước nhiệt đới trong quá trình bảo quản lạnh bằng nước đá ở điều kiện hiếu khí được đặc trưng bởi một dạng hư hỏng do Pseudomonas sinh ra một vài sunfit dễ bay hơi, xeton, este và aldehit. Sự hư hỏng tăng nhanh khi số lượng vi sinh vật gây hư hỏng vượt quá 107 cfu/g. Các tác giả nghiên cứu hệ vi sinh vật nổi trội và các vi khuẩn đặc trưng gây hư hỏng trên cá tuyết thể hiện trên Bảng 1.3: Bảng 1.3 Hệ vi sinh vật nổi trội và vi khuẩn đặc trưng gây hư hỏng cá tuyết [5][7] Nhiệt độ Áp suất Hệ vi sinh vật nổi trội bảo quản bao gói Vi khuẩn hình que ưa Có lạnh Gram âm, không lên không men: Pseudomonas sp., S. khí putrefacien, Moraxella, Acinetobacter 00C Vi khuẩn hình que Gram âm ưa lạnh, hoặc có đặc Chân tính chịu được lạnh (S. không putrefacien, Photobacterium) Vi sinh vật đặc Tài liệu trưng gây hư hỏng tham khảo S. putrefacien, Pseudomonas sp. S. putrefacien, phosphoreum P. 2, 3, 4, 9 1, 9 19 Vi khuẩn hình que ưa lạnh, không lên men (S. putrefacien, PseudomoMAP1 nas sp.), vi khuẩn hình que Gram dương (vi khuẩn lactic) Vi khuẩn hình que Gram Có âm ưa lạnh không (Vibrionaceae, S. khí putrefacien) Vi khuẩn hình que ưa Chân 50C lạnh (Vibrionaceae, S. không putrefacien) Vi khuẩn hình que Gram 1 MAP âm ưa lạnh (Vibrionaceae) Vi khuẩn hình que Gram Có âm lên men ưa nhiệt độ 0 không 20- 30 C phòng (Vibrionaceae, khí Enterobacteriaceae) MAP1: bao gói có điều chỉnh không khí. P. phosphoreum 1, 7 Aeromonas sp., S. putrefaciens Aeromonas sp., S. putrefaciens Aeromonas sp. Vibrionaceae, Enterobacteriaceae 6 2, 4, 5, 8 Nguồn: 1) Dalgaard và cộng sự (1993), 2) Gram và cộng sự (1987), 3) Lima dos Santos (1978), 4) Gram và cộng sự (1990), 5) Gorezyca và Pek Poh Len (1985), 6) Donald và Gibson (1992), 7) Van Spreekens (1977), 8) Barile và cộng sự (1985), 9) Jorgensen và Huss (1989). Vi sinh vật trên tôm tươi Vi sinh vật tổng số: động vật thủy sản sống ở các vùng nước sạch, ngay sau khi đánh bắt được, lượng vi sinh vật nhiễm bẩn nhìn chung cũng giống với lượng vi sinh vật có trên thịt lợn và gia cầm sau khi giết thịt. Lượng vi sinh vật này phụ thuộc chủ yếu vào mức độ ô nhiễm và nhiệt độ môi trường, phụ thuộc vào phương pháp đánh bắt và các điều kiện xử lý sau khi đánh bắt. Nước ở các vùng biển khơi chứa rất ít các vi sinh vật, chỉ có một vài vi khuẩn/1cm3, trong khi đó nước ở các vùng ven bờ và các 20 bùn cặn ở đáy các đìa tôm lại bị nhiễm bẩn nặng, nước này chiếm khoảng 106 cfu/cm3 [13]. Đối với tôm đánh bắt được ở các vùng nước bề mặt lạnh sạch lượng vi sinh vật có ở trên bề mặt của nó chỉ từ 1 đến 10 cfu/cm2. Trong khi đó lượng vi sinh vật có trên bề mặt động vật thủy sản thương mại đánh bắt ở các vùng đáy biển có thể lên đến 105 cfu/cm2. Lượng vi sinh vật có trong hệ tiêu hóa của tôm thường cao hơn nhiều so với lượng vi sinh vật trên bề mặt, lượng vi sinh vật tổng số ở trong ruột là từ 10- 109 cfu/g, lượng này phụ thuộc nhiều vào tình trạng ăn của tôm cũng như các loài thủy sản khác nói chung [13]. Các vi sinh vật gây hư hỏng: trong thành phần các vi sinh vật trên bề mặt các động vật thủy sản tươi đánh bắt được ở vùng nước lạnh thì các vi sinh vật Gram âm chiếm ưu thế, chủ yếu là Vibrio, Pseudomonas, Flavobacterium, Psychrobacter, Acinetobacter, Alteromonas. Vi sinh vật của động vật thủy sản sống trong các vùng nước ấm thì các vi khuẩn Gram dương chiếm ưu thế, đặc biệt là Micrococci, Coryneform và Bacilli. Vi sinh vật trên bề mặt của động vật thủy sản các vùng nước lạnh chủ yếu là các vi sinh vật ưa lạnh, trong khi đó động vật thủy sản của các vùng nước ấm lại mang nhiều vi sinh vật ưa nhiệt. Theo Kochanowski và Maciejowska (1958), trong số các vi khuẩn phân lập được trên động vật thủy sản các vùng nước ôn đới và nhiệt đới châu Phi, chỉ có 15% có thể phát triển được ở nhiệt độ 00C và 17% các vi khuẩn bị ức chế. Hệ tiêu hóa của động vật thủy sản nhìn chung đều có Vibrio, một số các vi khuẩn khác như Achromobacter, Pseudomonas, Xanthomonas và các vi khuẩn Gram dương, mà chủ yếu là Clostridium và một số sinh bào tử khác [13]. Các vi sinh vật gây bệnh: rất nhiều nghiên cứu đã được tiến hành để kiểm tra sự có mặt của các vi sinh vật gây bệnh trên tôm. Mặc dù tôm đánh bắt được từ các vùng nước không ô nhiễm nhìn chung là không có Salmonellae và Stalphylococcus nhưng 21 chúng có thể bị nhiễm các vi khuẩn gây bệnh này trong quá trình xử lý và chế biến [13]. Tôm được đánh bắt ở các vùng biển ven bờ thường nhiễm các vi sinh vật gây bệnh, trong số đó có một số loài Vibrio, đặc biệt là V. parahaemolyticus, V. cholera. Các vi sinh vật này có mặt khá phổ biến ở các vịnh, các cửa sông và thường dao động theo mùa. Trong vùng nước sạch không ô nhiễm có các vi khuẩn Coliforms, E.coli, Staphylococcus aureus, Salmonella nhưng các vi khuẩn này đều có thể nhiễm vào nguyên liệu trong quá trình bảo quản, chế biến [13][14]. Như vậy, hệ vi sinh vật có mặt trên nguyên liệu thủy sản có thể chia làm hai nhóm: nhóm vi sinh vật thường trú và nhóm vi sinh vật lây nhiễm [13][14]: + Nhóm vi sinh vật thường trú: đây là nhóm vi sinh vật có trong động vật thủy sản khi còn sống. Vi sinh vật nhiễm vào thủy sản chủ yếu theo 3 con đường: tiêu hóa, tuần hoàn và qua da. Về số lượng và thành phần giống loài vi sinh vật thì tùy thuộc vào từng loại thủy sản, tùy thuộc vào môi trường sống và trạng thái sức khỏe cũng như cường độ hoạt động của động vật thủy sản. Vì vậy khi tôm được đánh bắt về cần phải có các biện pháp làm giảm thiểu số lượng vi sinh vật để đảm bảo về chất lượng nguyên liệu, số lượng này giảm đi rất nhiều nếu trước khi chế biến ta thực hiện đúng theo kỹ thuật và dùng các phương pháp hữu hiệu để loại bỏ vi sinh vật ra khỏi nguyên liệu như mang, nội tạng… + Nhóm vi sinh vật lây nhiễm: vi sinh vật có cấu tạo cơ thể nhỏ bé, đơn giản về hình thái và dễ dàng thích nghi với điều kiện môi trường sống. Đặc biệt, vi sinh vật có cường độ trao đổi chất mạnh mẽ, khả năng sinh sản nhanh nên trong tự nhiên vi sinh vật phân bố rất rộng trong các môi trường. Vì thế, vi sinh vât dễ dàng lây nhiễm qua các khâu đánh bắt, thu mua, chuyên chở tôm…trước khi được đưa vào nhà máy. 22 Biến đổi do tác dụng của vi sinh vật Nguyên liệu ngay sau khi đình chỉ sự sống thì quá trình tổng hợp trong cơ thể sẽ ngừng lại, enzyme trong các tổ chức cơ thịt sẽ tiến hành quá trình tự phân giải đồng thời lúc đó vi sinh vật sẽ phân hủy những sản vật của quá trình tự phân giải thành những sản vật cấp thấp làm cho nguyên liệu biến chất hư hỏng [12][13]. Vi sinh vật gây thối rữa có hai nhóm, một nhóm là những vi sinh vật tồn tại trong nguyên liệu trong quá trình sống, còn một nhóm là do ô nhiễm trong quá trình bảo quản và chế biến. Các quá trình trao đổi chất của vi sinh vật góp phần đáng kể làm phân hủy hoàn toàn các chất protein và tích lũy các chất thối. Nhiều loài vi sinh vật có khả năng phân hủy TMAO để sản sinh ra TMA. Các loài có khả năng phân hủy TMAO được biết đến là Enterobacteriacae, V. parahaemolyticus và một số loài thuộc họ Pseudomonas, Shewanella, Alteromonas và Campylobacter. Đối với tôm, bảo quản ở các nhiệt độ khác nhau, quá trình tích lũy một lượng lớn indol tương đồng với số lượng rất cao của protein trong số các vi sinh vật [13][14]. 1.2.4. Một số vi sinh vật gây bệnh thường gặp trên nguyên liệu thủy sản sau thu hoạch [5][14][15] Vi sinh vật gây bệnh thường gặp trên nguyên liệu thủy sản có thể kể đến: Vibrio, Staphylococcus aureus, Salmonella, Coliforms, E.coli,…tuy nhiên Coliforms và E.coli là 2 vi sinh vật chỉ thị, là 2 chỉ tiêu đang được quan tâm hàng đầu vì sự có mặt của chúng trong thực phẩm và mức độ gây bệnh đối với thủy sản. Sự có mặt của chúng chỉ thị khả năng hiện diện của các vi sinh vật gây bệnh khác. 1/ Coliforms a. Giới thiệu Coliforms được xem là nhóm vi sinh vật chỉ thị: số lượng hiện diện của chúng trong thực phẩm. Được xem là vi sinh vật chỉ thị mức độ vệ sinh trong quá trình chế 23 biến, bảo quản, vận chuyển thực phẩm, nước uống hay trong các loại mẫu môi trường dùng để chỉ thị khả năng hiện diện của các vi sinh vật gây bệnh khác. b. Đặc điểm Coliforms là nhóm những trực khuẩn đường ruột Gram âm, hình que, không sinh bào tử, hiếu khí hoặc kỵ khí tùy ý. Vi khuẩn này có khả năng phát triển trên môi trường có muối mật, hoặc các chất hoạt tính bề mặt khác có tính ức chế tương tự, có khả năng sinh axit, sinh hơi do lên men lactose ở 370C trong vòng 24 giờ [4][21]. Coliforms có nguồn gốc từ phân, nước nhiễm bẩn, rác, thuộc nhóm vi sinh vật lây nhiễm ưa ấm [15]. Coliforms là một nhóm vi sinh vật bao gồm 4 giống: 1. Escherichia (với một loài duy nhất là E.coli) 2. Citrobacter 3. Klebsiella 4. Enterobacter (gồm 2 loài Aerobacter và Cloacae) Coliforms là chỉ tiêu thông dụng được dùng để đánh giá mức an toàn thực phẩm, được áp dụng đầu tiên ở Mỹ từ năm 1920. Sự hiện diện một lượng lớn Coliforms trong thực phẩm là điều không mong muốn, tuy nhiên rõ ràng không thể loại bỏ hoàn toàn chúng khỏi nhiều loại thực phẩm tươi sống hoặc đông lạnh. Vấn đề ở chỗ số lượng chúng ở mức độ nào chỉ thị cho tính không an toàn của thực phẩm. Sự hiện diện của chúng trong thực phẩm, nước, hoặc các loại mẫu môi trường được dùng để chỉ thị khả năng hiện diện của các vi sinh vật gây bệnh khác. Tuy nhiên Coliforms hoàn toàn không có khả năng chỉ thị về sự hiện diện của virus đường ruột. Coliforms phát triển tốt trên nhiều loại thực phẩm, nhưng chúng phát triển yếu và rất chậm ở 50C trên thực phẩm mặc dù cũng có tài liệu ghi nhận sự phát triển của chúng ở 3- 60C [15]. 24 Tôm cũng như các động vật thủy sản khác là môi trường thích hợp cho các vi sinh vật lây nhiễm và phát triển, trong đó có Coliforms. Vì thế sau khi thu hoạch, Coliforms rất dễ lây nhiễm vào tôm nguyên liệu qua các dụng cụ, môi trường nhiễm bẩn bên ngoài, nhiệt độ ngoài môi trường thúc đẩy Coliforms phát triển mạnh. 2/ Escherichia coli (E.coli) [4][5][14][17][21] a. Giới thiệu Escherichia coli (thường được viết tắt là E.coli) là một trong những loài vi khuẩn chính ký sinh trong đường ruột của động vật máu nóng (bao gồm chim và động vật có vú). Vi khuẩn này cần thiết trong quá trình tiêu hóa thức ăn và là thành phần của khuẩn lạc ruột. Sự có mặt của E.coli trong nước ngầm là một chỉ thị thường gặp cho ô nhiễm phân. E.coli thuộc họ vi khuẩn Enterrobacteriaceae và thường được sử dụng làm sinh vật mô hình cho các nghiên cứu về vi khuẩn. b. Đặc điểm E.coli là dạng Coliforms thuộc giống Escherichia có nguồn gốc từ phân, phát triển được ở nhiệt độ 44÷ 500C, nhiệt độ thích hợp là 370C trong 24 giờ, pH thích hợp là 7,3- 7,4 nhưng có thể phát triển ở pH từ 5,5- 8; có khả năng sinh indol, axit, không sinh axeton và không dùng citrat làm nguồn cacbon. Vi khuẩn E.coli phát triển dễ dàng trên các môi trường nuôi cấy thông thường, một số chủng có thể phát triển được ở môi trường tổng hợp đơn giản, cụ thể như trên môi trường EMB: sau 24 giờ nuôi cấy ở 370C, vi khuẩn hình thành khuẩn lạc màu tím có ánh kim [14]. Thông thường các chủng E.coli định cư trong hệ thống ruột- dạ dày như một loài vi sinh vật vô hại hoặc đóng vai trò quan trọng trong việc duy trì chức năng sinh lý đường ruột. Tuy nhiên, trong loài này có ít nhất 4 chủng gây bệnh cho người và một số loài động vật: 1. E.coli gây bệnh đường ruột (Enteropathogenic) (EPEC) 2. E.coli gây ngộ độc đường ruột (Enterotoxigenic) (ETEC) 25 3. E.coli gây bệnh lan tràn trong đường ruột (Enteroinvasive) (EIEC), E.coli gây bệnh giống bệnh lỵ shiga. 4. E.coli gây xuất huyết đường ruột (Enterohaemorrhagic) (EHEC)/ (VTEC) hoặc E.coli sinh độc tố Verocytoxin hoặc E.coli 0157:H7 Các chủng E.coli gây các bệnh đường ruột với mức độ nghiêm trọng có thể từ rất nhẹ đến rất nặng, hoặc có thể đe dọa tính mạng tùy thuộc vào những yếu tố như dạng chủng gây bệnh, sức đề kháng của người bệnh và mức độ nhiễm khuẩn [5][21]. Một trong những đặc tính quan trọng của E.coli liên quan đến khả năng chỉ thị sự nhiễm phân trong nước là thời hạn sống sót của chúng. Chúng thường chết đi sau cùng một khoảng thời gian như các vi sinh vật gây bệnh khác có ở ruột (có tài liệu cho thấy ở trong nước một số vi sinh vật gây bệnh có sức chống chịu cao hơn). Ở thực phẩm qua các biện pháp xử lý như ướp lạnh, cấp đông, chiếu xạ, E.coli bị tiêu diệt trong khi một số vi sinh vật gây bệnh khác vẫn chống chịu được và sống sót. Tương tự như vậy nước qua xử lý vẫn chứa một số vi sinh vật gây bệnh trong khi E.coli đã bị tiêu diệt [4]. Gần đây người ta còn chứng minh được rằng E.coli cũng hiện diện ở những vùng nước ấm, không bị ô nhiễm chất hữu cơ. Theo Ahmed (1991) cho biết không có dấu hiệu cho thấy thực phẩm thủy sản là nguồn lây nhiễm E.coli. Hầu hết những hiện tượng lây nhiễm đã xảy ra đều có mối liên quan đến ô nhiễm nguồn nước hay đến việc bảo quản thực phẩm dưới điều kiện không vệ sinh [14]. Do sự phân bố rộng rãi trong tự nhiên nên E.coli dễ dàng nhiễm vào thực phẩm từ nguyên liệu hay thông qua nguồn nước trong quá trình sản xuất, chế biến. Việc đánh giá sự có mặt của E.coli cho biết mức độ nhiễm phân của thực phẩm [4][14]. Môi trường sống tự nhiên của E.coli là ruột người và động vật có xương sống, do đó, E.coli hiện diện rộng rãi trong môi trường bị ô nhiễm phân hay chất thải hữu cơ, phát triển và tồn tại rất lâu trong môi trường [14][17][21]. Theo các nghiên cứu [14], 26 trong vùng nước ôn đới E.coli không xuất hiện trên cá và động vật giáp xác lúc đánh bắt (trừ vùng ô nhiễm nặng). Mặt khác động vật thủy sản luôn được giữ ở nhiệt độ thấp hơn nhiệt độ phát triển của E.coli. Vì vậy, E.coli được coi như một chỉ thị tốt của sự lây nhiễm (số lượng nhỏ) hoặc xử lý sai phạm về nhiệt độ trong quá trình bảo quản (số lượng lớn). Sự nhiễm E.coli trong thực phẩm chứng tỏ xuất hiện mối nguy mầm bệnh đường ruột có thể đã xâm nhập vào thực phẩm. Do đó theo quy định của Bộ Y tế 46/2007/QĐ-BYT về việc ban hành “Quy định giới hạn tối đa ô nhiễm sinh học và hóa học trong thực phẩm” quy định ở mục 6.3 phần 6 rằng: giới hạn cho phép E.coli trong cá và thủy sản tươi là 102 cfu/g hoặc 102 cfu/ml. 1.3. Tổng quan về các hợp chất bazơ nitơ bay hơi [7][13] Những biến đổi hư hỏng của tôm sau khi chết là kết quả của việc tích lũy dần dần các hợp chất bị phân giải trong cơ thịt. Hàm lượng của các chất này có thể dùng để đo tiến trình hư hỏng của tôm. Tổng nitơ bay hơi (TVN) TVN được sử dụng như là một phương pháp thay thế cho việc đo hàm lượng TMA của tôm, đặc biệt khi gần tới thời điểm hư hỏng cơ thịt tôm chứa một số nitơ bazơ bay hơi khá cao (chủ yếu là amoniac, TMA, DMA). Những biến đổi của hàm lượng TVN trong suốt quá trình bảo quản rất giống những biến đổi của hàm lượng TMA trong cùng một chủng loài, tuy vậy trị số của TVN luôn cao hơn. Khi bảo quản tôm nguyên liệu ở nhiệt độ thấp, hàm lượng TVN cũng như hàm lượng TMA rất ít biến đổi trong những ngày đầu, tuy nhiên hàm lượng TVN lại thay đổi rất lớn khi cơ thịt tôm bước vào giai đoạn thối rữa, vì vậy TVN được rất nhiều nhà nghiên cứu sử dụng dùng làm chỉ tiêu để đánh giá độ tươi của tôm ở giai đoạn sau của quá trình bảo quản. 27 Amoniac Amoniac được tạo ra do vi khuẩn phân hủy/tách amin của các protein, peptit và các amino-axit. Nó còn được tạo ra trong quá trình tự phân giải của các adenosine monophosphate (AMP) trong các sản phẩm thủy sản đã làm lạnh. Amoniac được xem như là một chất chỉ thị cho chất lượng của nguyên liệu thủy sản. LeBlanc (1987) nhận thấy đối với cá tuyết ướp đá, lượng amoniac không tăng đáng kể cho tới ngày bảo quản thứ 16. Ít nhất là trong trường hợp cá trích, lượng amoniac tăng nhanh hơn lượng trimethylamine (TMA), tuy nhiên người ta thường dùng TMA để phản ứng sự phát triển của vi khuẩn gây ươn hỏng trên các loài cá gầy. Trimethylamine (TMA) TMA là một trong các hợp chất bazơ bay hơi được tạo thành trong quá trình hư hỏng của tôm. TMA được tạo thành dưới tác dụng khử TMAO của các enzyme nội tại và hoạt động của các vi sinh vật gây thối Hàm lượng của TMA được xem là chỉ số để đánh giá độ tươi của tôm nguyên liệu và cũng đã được nhiều nghiên cứu sử dụng. Đồng thời chỉ tiêu này cũng đã được FAO/WHO đề nghị là chỉ tiêu chính để đánh giá độ tươi của tôm. TMA của tôm nguyên liệu biến đổi cùng với thời gian bảo quản và tương đồng với sự biến đổi của lượng vi sinh vật và điểm cảm quan, đặc biệt là mùi của tôm. Có rất nhiều phương pháp đã được đưa ra để đo hàm lượng TMA có trong tôm, trong số đó phương pháp chưng cất bằng hơi nước được sử dụng nhiều nhất. Dimethylamine (DMA) Một số loài cá có chứa một enzyme là TMAO dimethylaza (TMAO-aza) có khả năng biến đổi TMAO thành một số lượng phân tử DMA và formaldehyde (FA). Do đó, đối với cá thuộc họ cá Tuyết, DMA được sản sinh cùng FA khi bảo quản đông lạnh có FA dẫn đến quá trình làm cứng các protein. Lượng protein biến tính gần như tỷ lệ với lượng FA/DMA tạo ra. 28 Dimethylamine được sản sinh do sự tự phân giải trong quá trình bảo quản lạnh (đông lạnh). Sự có mặt của DMA chứng tỏ nguyên liệu thủy sản bảo quản lạnh/đông lạnh có chất lượng kém. 1.4. Các công trình nghiên cứu trong và ngoài nước 1.4.1. Các nghiên cứu trong nước Theo Nguyễn Trọng Cẩn và Đỗ Minh Phụng (1990) bảo quản thủy sản bằng nước đá ở nhiệt độ 0- 20C có thể giữ tươi được nguyên liệu từ 3- 5 ngày [12]. Theo Nguyễn Trọng Cẩn và Đỗ Minh Phụng (1990) [12], kết quả kiểm tra sự biến đổi chất lượng của tôm trong thời gian bảo quản cho thấy về quy luật biến đổi tương tự nhau nhưng về giá trị thì biến đổi của tôm được xử lý với chlorine nhỏ hơn, sau 6 ngày bảo quản trị số nitơ bay hơi là 58,15 mg% và trị số nitơ axit amin là 895,64 mg% so với 62,7 mg% và 826,5 mg% khi bảo quản trong nước đá mà không xử lý với chlorine. Nguyễn Việt Dũng (1998) [13] đã nghiên cứu sự biến đổi của tôm sau khi chết và phương pháp bảo quản tôm nguyên liệu. Kết quả nghiên cứu cho thấy: Nếu tôm nguyên liệu được ngâm 3 phút trong hỗn hợp dung dịch 4- hexylresorcinol 50ppm, axit citric 1% rồi bảo quản trong đá xay cộng với 0,1% kali sorbat và 0,05% Na5P3O10 thì thời gian bảo quản được 20 ngày. Theo tài liệu của dự án Seaqip (2002), ngay trong điều kiện xử lý và bảo quản tốt chất lượng tôm bảo quản ở nhiệt độ 00C cũng bị giảm sút. Sau 40 giờ bảo quản tỷ lệ tôm đạt loại 1 giảm từ 80- 90% xuống còn 5- 25%. Nếu như bảo quản tôm bằng nước đá xay trong thùng cách nhiệt có lỗ thoát nước ở đáy thùng sẽ hạ nhiệt độ tôm xuống 50C trong vòng 4 giờ, xuống 00C trong vòng 6- 7 giờ [2]. Về bảo quản lạnh thủy sản bằng nước đá ở nước ta cũng được các nhà nghiên cứu rất quan tâm và có nhiều công trình nghiên cứu ảnh hưởng của bảo quản lạnh sơ bộ đến chất lượng thủy sản đã rất thành công. 29 Nguyễn Thị Thanh Hải (2004) đã nghiên cứu sự biến đổi vi sinh vật trong quá trình bảo quản lạnh mực nguyên liệu. Kết quả nghiên cứu cho thấy: Bảo quản trực tiếp mực nguyên liệu trong nước đá chất lượng mực giảm mạnh, thời gian bảo quản không quá 2 ngày. Đến ngày bảo quản thứ 3 số lượng TPC là 9.105 cfu/g, Coliforms đạt 1,0.102 cfu/g, vi sinh vật gây thối đạt 6,3.105 cfu/g. Cùng với sự phát triển của vi sinh vật, hàm lượng TVB-N cũng vượt quá giới hạn cho phép là 35,615 mg% ở ngày bảo quản thứ 3. Qua nghiên cứu còn thấy rằng, không tìm thấy sự có mặt và phát triển của Salmonella/ Shigella, Listeria, Vibrio cholerae, Staphylococcus trên nguyên liệu mực ở vùng biển Khánh Hòa trong suốt quá trình bảo quản lạnh, đồng thời tổng TVB-N thường vượt quá giới hạn quy định khi vi sinh vật gây thối đạt số lượng 105- 106 MPN/g [14]. Theo tài liệu của dự án Seaqip (2002) [2], thủy sản bảo quản ở 50C có tốc độ ươn hỏng nhanh gấp 1,7 lần so với bảo quản ở 00C và thủy sản bảo quản ở 100C tốc độ ươn hỏng sẽ nhanh gấp 2,9 lần so với bảo quản ở 00C. Trong thực tế điều này có nghĩa là thủy sản sẽ không còn có thể sử dụng làm thực phẩm được sau 10 ngày nếu được bảo quản ở 00C, sau 6 ngày nếu được bảo quản ở 50C, sau 4 ngày nếu được bảo quản ở 100C và ít hơn 2 ngày nếu bảo quản ở 150C. 1.4.2. Các nghiên cứu ngoài nước Trên thế giới đã có nhiều nghiên cứu về bảo quản lạnh thủy sản bằng nước đá. Theo nghiên cứu của Park, Hurk, Ampola (1980) cho biết chất lượng của mực bảo quản trực tiếp trong nước đá chỉ có thể chấp nhận được trong thời gian 8 ngày. Sau 8 ngày cơ thịt mực bị đỏ và có mùi hôi xuất hiện. Tuy nhiên theo Botta và cộng sự (1990), nếu bảo quản mực cách ly nước đá thì da mực giữ tươi được 3 ngày và thời gian bảo quản mực có thể kéo dài được 11 ngày. Khi bảo quản cá hồi (Salmon) trong các môi trường: nước đá, nước biển lạnh và nước muối loãng, Bronstein và cộng sự (1985), cho thấy sự phát triển của vi sinh vật 30 hiếu khí trong môi trường nước đá tăng nhanh hơn so với các môi trường khác. Các tác giả cho rằng, trong môi trường nước đá các vi sinh vật hiếu khí có điều kiện phát triển hơn so với các môi trường lỏng có cùng nhiệt độ thấp khác [18]. Theo nghiên cứu Smith (1985), khi bảo quản mực ở nhiệt độ lạnh, đầu tiên Coliforms chưa thích nghi với nhiệt độ lạnh nên khả năng sinh trưởng bị ức chế, các tế bào Coliforms có thể bị tổn thương ở nhiệt độ thấp, kết quả số lượng Coliforms giảm, sau một thời gian, chúng quen với nhiệt độ lạnh dẫn đến vượt quá giới hạn cho phép. Do Coliforms thuộc nhóm vi sinh vật ưa ấm nên từ nhiệt độ 150C đến 280C chúng phát triển nhanh chóng theo thời gian bảo quản. Ở 280C, đồ thị phát triển của Coliforms gần như thẳng đứng. Theo các tài liệu cho biết: trong thực phẩm, Coliforms phát triển rất yếu ở nhiệt độ 50C, phát triển thích hợp ở nhiệt độ 20- 400C [14]. Theo Ozogul, Ozogul và Polat (2004) báo cáo rằng, khi bảo quản cá mòi ở 3±10C thì hàm lượng TVB-N tại thời điểm hư hỏng 10 ngày là 22,6 mg/100g thịt, đến ngày cuối của thời gian lưu trữ là 12 ngày (lớn hơn thời điểm hư hỏng) thì hàm lượng này đạt 103 mg/100g. Qua đó có thể nói rằng giá trị TVB-N bị ảnh hưởng bởi các loài, mùa, diện tích thu hoạch, tuổi tác và giới tính của nguyên liệu [27]. Qua các công trình nghiên cứu trong và ngoài nước đã nêu trên ta thấy được rằng, vấn đề an toàn vệ sinh thực phẩm của nguyên liệu thủy sản trong quá trình bảo quản lạnh dù ở thời đại nào cũng luôn được quan tâm hàng đầu. Thủy sản là nguyên liệu dễ bị ươn hỏng nếu không được chế biến và bảo quản sau khi thu mua, là môi trường thuận lợi cho vi sinh vật phát triển. Tuy nhiên việc kiểm soát sự biến đổi của các vi sinh vật này còn hạn chế, đặc biệt là các vi sinh vật gây bệnh. Dù đã có nhiều nghiên cứu về bảo quản lạnh thủy sản nhưng vẫn chưa đi sâu vào sự biến đổi của các vi sinh vật gây bệnh (Coliforms, E.coli) cũng như sự biến đổi của các hợp chất bazơ nitơ bay hơi có trong nguyên liệu. 31 Ngoài ra, đối tượng nghiên cứu liên quan đến các vi sinh vật gây bệnh (Coliforms, E.coli) và TVB-N trên tôm sú bảo quản lạnh còn chưa đầy đủ. Hiện nay tôm sú là mặt hàng phổ biến cả trong và ngoài nước, với sản lượng xuất khẩu đứng đầu trong ngành thủy sản thì tôm sú được xem là đối tượng chính trong nghiên cứu. Vì vậy, việc nghiên cứu sự biến đổi của các vi sinh vật gây bệnh và các hợp chất bazơ nitơ bay hơi trên tôm sú nguyên liệu trong bảo quản lạnh sẽ là cần thiết trong nghiên cứu ở thời điểm hiện nay. 32 CHƯƠNG II. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. Đối tượng nghiên cứu Đối tượng nghiên cứu của đề tài là: - Tôm sú. - Coliform, E.coli - TVB-N Tôm sú nguyên liệu dùng làm thí nghiệm được mua tại Nha Trang, loại tôm sú thương phẩm vừa thu hoạch từ các hộ nuôi công nghiệp với cỡ tôm là 30- 40 con/kg, chất lượng nguyên liệu phải đạt tiêu chuẩn tôm Hạng đặc biệt theo Tiêu chuẩn Việt Nam TCVN 3726-89 về tôm nguyên liệu tươi. 2.2. Hóa chất và nguyên vật liệu dùng trong nghiên cứu a/ Hóa chất - môi trường - Axit Tricloaxetic (TCA) 7,5% - H2SO4 0,025N - NaOH 10% - Axit boric 4% - Thuốc thử Methyl đỏ - Thuốc thử Kovac’s (Merck KGaA, xuất xứ từ Đức) - Chất chỉ thị Brom xanh - Môi trường canh LSB (Merck KGaA, xuất xứ từ Đức) - Môi trường EMB (Merck KGaA, xuất xứ từ Đức) - Pepton casein (Merck KGaA, xuất xứ từ Đức) - Sodium chloride (NaCl), xuất xứ từ Trung Quốc - Pepton from meat (Merck KGaA, xuất xứ từ Đức) 33 - Disodium hydrogen phosphate dodecahydrate (Na2HPO4. 12H2O), xuất xứ từ Trung Quốc - Potassium dihydrogen phosphate (KH2PO4), xuất xứ từ Trung Quốc b/ Dụng cụ - thiết bị: Các dụng cụ bằng thủy tinh - Ống nghiệm - Đĩa petri vô trùng - Đèn cồn - Cốc thủy tinh - Bình tam giác - Bình định mức - Ống đong - Đũa thủy tinh - Phễu - Lọ thủy tinh Các loại que cấy - Que cấy thẳng - Que cấy vòng Kéo Giấy lọc Túi PA vô khuẩn Ống Durham Bông không thấm nước Bộ chưng cất đạm Bộ chuẩn độ: buret, giá đỡ Cân phân tích 2 số Robevan sản xuất năm 1994 34 Micropipet Tủ sấy tiệt trùng 1800C (Memmert 2200C Đức, sản xuất năm 1997) Nồi hấp thanh trùng HIRAYAMA, sản xuất ở Nhật Bản Tủ ủ ấm 350C (MIR-153, sản xuất ở Nhật Bản) Bếp hồng ngoại công suất 2000W Máy xay thịt để đồng hóa mẫu 2.3. Phương pháp nghiên cứu 2.3.1. Phương pháp tiếp cận Từ thực nghiệm bảo quản tôm sú nguyên liệu ở 5 chế độ nhiệt độ khác nhau thường gặp trong thực tiễn chuỗi cung ứng (1± 10C, 4± 10C, 9± 10C, 15± 10C và 19± 10C) rút ra các xu hướng biến đổi của vi sinh vật gây bệnh và TVB-N trên tôm sú theo thời gian bảo quản ở nhiệt độ dương thấp. 35 2.3.2. Bố trí thí nghiệm Tôm nguyên liệu Rửa bằng nước lạnh (1- 40C) Ngâm trong chlorine 50 ppm- 10 phút Rửa lần 1 Rửa bằng nước lạnh (1- 40C) đến khi hết mùi chlorine Rửa lần 2 Rửa lần 3 Xếp khay Bảo quản lạnh Xác định Xác định Coliforms TVB-N và E.coli Hình 2.1 Sơ đồ bố trí thí nghiệm bảo quản tôm sú nguyên liệu theo thời gian bảo quản lạnh 36 Thuyết minh quy trình Tôn sú sau khi thu mua về phòng thí nghiệm được rửa bằng nước lạnh (1- 40C). Tiếp theo ngâm tôm trong nước lạnh đã hòa tan chlorine nồng độ 50 ppm trong vòng 10 phút để làm giảm thiểu lượng vi sinh vật trên bề mặt tôm. Sau đó vớt ra rửa lại bằng nước lạnh sạch (1- 40C) đến khi hết mùi chlorine (thông thường rửa 3 lần là được). Xếp tôm vào khay xốp theo 3 lô mẫu, đồng thời đem đi bảo quản ở chế độ nhiệt độ quy định. Mẫu được lấy 7 lần từ mỗi lô (L1, L2, L3, L4, L5, L6, L7). Lưu ý: thao tác nhanh gọn, cẩn thận, sau khi xếp khay phải đem bảo quản ngay để tránh hạ nhiệt độ thân tôm. Hình 2.2 Tôm được xếp khay để bảo quản Dựa vào các tài liệu đã nghiên cứu trước đó, dự đoán thời gian bảo quản tôm ở 5 chế độ nhiệt độ (1± 10C, 4± 10C, 9± 10C, 15± 10C, 19± 10C) là bao lâu, mỗi chế độ chỉ làm một lô khảo sát, riêng chế độ 4± 10C làm thí nghiệm trên cả 3 lô (1, 2 và 3), mỗi chế độ luôn có 7 điểm mẫu tương ứng, quy định bao nhiêu giờ lấy mẫu một lần. Lấy 37 mẫu ở mỗi thời điểm quy định để kiểm tra các chỉ tiêu vi sinh vật gây bệnh: Coliforms và E.coli và TVB-N. 2.3.3. Các phương pháp đánh giá 2.3.3.1. Phương pháp hóa học Xác định tổng bazơ nitơ bay hơi (TVB-N): tổng bazơ nitơ bay hơi được xác định theo phương pháp chiết rút bằng axit tricloaxetic từ khối lượng cơ thịt tôm theo tỷ lệ thịt tôm/axit tricloaxetic là 1/2. Sau đó dùng phương pháp chưng cất lôi cuốn hơi nước để xác định lượng TVB-N bay ra [24]. Tiến hành [24]: 100g cơ thịt tôm được xay nhuyễn với 200ml dung dịch axit tricloaxetic (TCA) 7,5% trong 3 phút. Vì lượng thịt tôm đôi khi không đủ 100g nên lấy lượng dung dịch TCA gấp đôi lượng thịt tôm. Hỗn hợp sau đó được lọc qua giấy lọc, dịch chiết có thể bảo quản lạnh/đông trong 1 tuần. Cốc hứng: cho vào 10ml dung dịch axit boric 4%; 0,04ml methyl đỏ và 0,04ml brom xanh vào cốc hứng 50ml. Dùng cốc này để hứng hỗn hợp thoát ra từ bộ cất Kjeldahl. Cốc chưng: hút 25ml dịch chiết thịt tôm bằng TCA được cho vào bình đựng mẫu của bộ cất đạm. Thêm chính xác 6ml dung dịch natri hydroxide (NaOH) 10%, sau đó bắt đầu chưng cất. Lưu ý: khi cho xút vào cốc chưng phải đi chưng ngay để tránh NH3 thất thoát, do đó phải chuẩn bị cốc hứng trước. Sau khi cất hết nitơ bay hơi dung dịch thu được chuyển qua cốc hứng 50ml và đem chuẩn độ bằng dung dịch H2SO4 0,025N đến điểm chuyển màu của chỉ thị màu. Xác định lượng H2SO4 0,025N đã tiêu tốn và tính ra hàm lượng TVB-N theo công thức: 14 mg/mol × a × b × 300 (mgN/100g) 25 ml 38 a: thể tích của axit sunfuric chuẩn độ b: nồng độ đương lượng của axit sunfuric chuẩn độ [24] 2.3.3.2. Các phương pháp vi sinh Chuẩn bị mẫu [3][14][21]: Cân tôm bỏ vào túi PA, tán nhuyễn rồi được pha loãng bằng dung dịch đệm phosphat theo tỷ lệ thịt tôm/dung dịch đệm là 1/9. Lắc đều để dung dịch đồng nhất, sau đó thực hiện pha loãng các nồng độ khác nhau bằng nước muối sinh lý (0,85%) tùy thuộc nồng độ vi sinh vật cần kiểm tra. Lưu ý: Do sự phân bố không đều của vi sinh vật trong mẫu nên mẫu cần được làm đồng nhất trước khi phân tích. Việc đồng nhất các mẫu lỏng được thực hiện bằng cách lắc kỹ trước khi phân tích. Xác định sự có mặt của Coliforms, E.coli theo phương pháp pha loãng tới hạn MPN (số lượng tế bào có xác suất lớn nhất trong một đơn vị thể tích của dịch huyền phù). Phương pháp này dựa vào nguyên tắc mẫu được pha loãng thành một dãy thập phân (hai nồng độ kế tiếp nhau khác nhau 10 lần) 1/ Coliforms [21]: Xác định MPN bằng hệ 3 dãy nồng độ và 3 ống nghiệm lặp lại (hệ 3×3 hay 9 ống nghiệm). Nếu nghi ngờ số lượng Coliforms trong mẫu quá cao, phải sử dụng các mẫu có bậc pha loãng cao hơn. Tiến hành: + Pha loãng mẫu: NaCl được loãng trong bình tam giác, phân dung dịch NaCl 8.5% bằng pipet vô trùng vào các ống nghiệm vô trùng, mối ống 9ml. sau đó hút 1ml dịch nghiên cứu cho vào ống nghiệm đã được chứa sẵn dung dịch NaCl 0,85%, lắc đều được độ pha loãng 10-2. Tiếp tục hút 1ml dung dịch ở độ pha loãng 10-2 cho vào ống nghiệm chứa 9ml NaCl 0,85% được độ pha loãng 10-3. Cứ tiếp tục chuẩn bị các dịch pha loãng như vậy với mức độ pha loãng phụ thuộc số lượng vi sinh vật cần xác định 39 dự kiến có trong mẫu. Chú ý dùng đầu côn riêng khi hút bằng mµ pipet cho mỗi độ pha loãng. + Hút 1ml dịch mẫu đã pha loãng 10-1 vào 3 ống nghiệm giống nhau, mỗi ống chứa 5ml môi trường LSB có ống bẫy khí Durham . Thực hiện tương tự với dịch mẫu đã pha loãng 10-2 và 10-3. Ủ các ống nghiệm ở 350C trong 24 giờ. Ghi nhận số ống nghiệm có phản ứng dương tính làm đục môi trường và có sinh hơi trong ống Durham ứng với mỗi nồng độ pha loãng và tra bảng Mac Crandy. 2/ Escherichia coli [3][21]: + Cấy trên môi trường thạch trong đĩa petri: Rót 20ml môi trường EMB vô trùng có nhiệt độ 450C vào đĩa petri, trộn đều bằng cách lắc đĩa theo chiều kim đồng hồ và ngược chiều kim đồng hồ 5 vòng sau đó để trên mặt phẳng ngang cho đến khi thạch nguội. Dùng que cấy ria lấy 1 vòng dịch trong ống nghiệm có phản ứng dương tính làm đục môi trường và có sinh hơi trong ống Durham để cấy ria trên môi trường thạch đĩa EMB để xác định E.coli. + Nuôi cấy: Sau khi cấy, lật úp đĩa và đặt vào tủ ấm 350C trong 24 giờ. Nhận dạng khuẩn lạc đặc trưng E.coli: Khuẩn lạc tròn, dẹp, màu tím ánh kim. Chọn khuẩn lạc đặc trưng cấy chuyển sang môi trường canh Pepton casein ủ ở nhiệt độ 350C trong vòng 24 giờ. Thử test sinh hóa để xác định có hay không có E.coli trong mẫu: nhỏ vài giọt thuốc thử Kovac’s. Phản ứng dương tính (+) khi trên bề mặt có vòng đỏ cánh sen xuất hiện, âm tính (-) khi không có vòng đỏ xuất hiện. + Ghi nhận kết quả và tra bảng Mac Crandy. 2.4. Phương pháp xử lý số liệu Số liệu thực nghiệm xử lý theo phương pháp thống kê toán học dựa trên các phần mềm MS. Excel 2007 và SPSS 16.0. Phương pháp tính sai số trong kết quả kiểm nghiệm hóa học [10]. Hiệu số giữa 2 lần thử không vượt quá 25% trung bình cộng của 2 lần thử mới được chấp nhận. 40 CHƯƠNG III. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 3.1. Sự biến đổi của vi sinh vật gây bệnh trên nguyên liệu tôm sú trong quá trình bảo quản lạnh Nguyên liệu dùng để thí nghiệm được bảo quản ở các nhiệt độ: 1± 10C, 4± 10C, 9± 10C, 15± 10C và 19± 10C, làm thí nghiệm cho 3 lô ở chế độ 4± 10C và lô khảo sát ứng với 4 chế độ còn lại. 3.1.1. Biến đổi của Coliforms trên nguyên liệu tôm sú trong quá trình bảo quản lạnh Theo thời gian và nhiệt độ bảo quản, biến đổi của Coliforms trên tôm sú nguyên liệu trong quá trình bảo quản lạnh được thể hiện ở Hình 3.1, Hình 3.2, Hình 3.3, Hình 3.4 và Hình 3.5. Coliforms (MPN/g) 100 80 60 40 20 0 0 50 100 150 200 Thời gian bảo quản ở 1± 1°°C (giờ) 250 Hình 3.1 Biến đổi của Coliforms trên tôm sú bảo quản ở nhiệt độ 1± 1°°C 41 600 Coliforms (MPN/g) 500 400 300 200 100 0 0 1 2 3 4 5 6 7 Thời gian bảo quản ở 4± 1°°C (ngày) Hình 3.2 Biến đổi của Coliforms trên tôm sú bảo quản ở nhiệt độ 4± 1°°C Ghi chú: Đồ thị biểu diễn giá trị lượng Coliforms trung bình của 3 lô thí nghiệm từ ngày 0 đến ngày bảo quản thứ 6, riêng ngày thứ 7 theo lượng Coliforms của lô 1. 1200 Coliforms (MPN/g) 1000 800 600 400 200 0 0 20 40 60 80 100 120 140 Thời gian bảo quản ở 9 ± 1°°C (giờ) Hình 3.3 Biến đổi của Coliforms trên tôm sú bảo quản ở nhiệt độ 9 ± 1°°C 42 1200 Coliforms (MPN/g) 1000 800 600 400 200 0 0 10 20 30 40 50 60 Thời gian bảo quản ở 15 ± 1°°C (giờ) 70 Hình 3.4 Biến đổi của Coliforms trên tôm sú bảo quản ở nhiệt độ 15 ± 1°°C Coliforms (MPN/g) 1200 1000 800 600 400 200 0 0 5 10 15 20 25 30 Thời gian bảo quản ở 19 ± 1°°C (giờ) Hình 3.5 Biến đổi của Coliforms trên tôm sú bảo quản ở nhiệt độ 19 ± 1°°C 43 Coliforms có nguồn gốc từ phân, nước nhiễm bẩn, rác, thuộc nhóm vi sinh vật lây nhiễm ưa ấm [14][15][20]. Vì thế sau khi thu hoạch, Coliforms rất dễ lây nhiễm vào nguyên liệu tôm. Từ kết quả thực nghiệm trên Hình 3.1cho thấy: Ở 10C, lượng Coliforms biến thiên không ổn định, tăng giảm liên tục, chênh lệch lượng Coliforms giữa các thời điểm bảo quản không quá lớn. Nguyên liệu ngay từ khi vừa mới thu mua đã có lượng Coliforms là 93 MPN/g. Sau 48h lượng Coliforms lại giảm sút, chỉ còn 43 MPN/g chênh lệch 50 MPN/g so với 0h. Sau đó lại tăng trở lại sau 96h bảo quản, lượng Coliforms lúc này tương đương với lúc 0h là 93 MPN/g, đến 144h lại giảm mạnh chỉ còn 9.1 MPN/g, giá trị này tăng lên ở 2 thời điểm bảo quản sau, đạt 75 MPN/g sau 216h và đến 240h chỉ đạt 43 MPN/g. Qua các số liệu thực nghiệm trên Hình 3.2 cho thấy, Coliforms lượng Coliforms trung bình giảm mạnh từ 523 MPN/g (ngày 0) xuống còn 58MPN/g sau 1 ngày bảo quản, chênh lệch gấp 9 lần, sang đến ngày thứ 2 giảm còn 23MPN/g. Tuy nhiên đến ngày thứ 3 lại tăng trở lại xấp xỉ với lượng Coliforms ngày 1 là 59,67 MPN/g, sau đó mới thấy sự phát triển rất nhanh ở những ngày sau, sau ngày 5 lượng Coliforms là 168 MPN/g, nhưng tăng không ổn định lại giảm trở lại ở ngày cuối 163 MPN/g. Phân tích ANOVA cho thấy không có sự khác biệt có ý nghĩa thống kê giữa các giá trị trung bình của lượng Coliforms ở các ngày bảo quản. Sau 7 ngày bảo quản lượng Coliforms vẫn ở trong mức cho phép. Ở 90C (Hình 3.3), lượng Coliforms tăng từ 15 MPN/g lên 28 MPN/g sau 24 h bảo quản, lượng Coliforms đều là 28 MPN/g ở 24h và 48h. So với 48h bảo quản ở 10C thì ở 90C sau 48h lượng Coliforms ít hơn, chênh lệch 15 MPN/g, và sau 72h bảo quản lượng Coliforms tăng rất mạnh, từ 28 MPN/g lên đến 1100 MPN/g, tăng gấp 4 lần so với 3 thời gian bảo quản đầu. 44 Kết quả trên Hình 3.4 và Hình 3.5 cho thấy, ở 150C, chỉ sau 21,5h đã đạt 1100 MPN/g. Ở 190C, ở 0h lượng Coliforms có giá trị như lượng Coliforms ở 0h bảo quản 150C là 240 MPN/g, sau 4h lượng này đã giảm mạnh chỉ còn 39 MPN/g, tiếp tục tăng trở lại sau 8h và lại giảm sau 12h, ở 12h lượng Coliforms giảm còn 43 MPN/g. So với 150C sau 21,5h thì ở 190C lượng Coliforms tăng mạnh hơn, chỉ sau 20h đã đạt 1100 MPN/g, chứng tỏ nhiệt độ càng cao thời gian bảo quản càng ngắn. Kết quả nghiên cứu tương tự với kết quả nghiên cứu bảo quản mực ở nhiệt độ lạnh của Smith (1985) [14], Smith (1985) cho rằng đầu tiên Coliforms chưa thích nghi với nhiệt độ lạnh nên khả năng sinh trưởng bị ức chế, các tế bào Coliforms có thể bị tổn thương ở nhiệt độ thấp, kết quả số lượng Coliforms giảm, sau một thời gian, chúng quen với nhiệt độ lạnh, Coliforms sẽ phát triển tăng dần dẫn đến vượt quá giới hạn cho phép. Do Coliforms thuộc nhóm vi sinh vật ưa ấm nên từ nhiệt độ 150C đến 280C chúng phát triển mau chóng theo thời gian bảo quản. Với nghiên cứu của Nguyễn Thị Thanh Hải trong bảo quản lạnh mực nguyên liệu (2004), sau 0,5 ngày bảo quản lượng Coliforms đạt 7,0.101, vẫn nằm trong giới hạn cho phép. Sau 3 ngày bảo quản lượng Coliforms đã lên tới 4,9.105 cfu/g vượt ngưỡng giới hạn cho phép của Bộ Y tế (BYT 4/1998) là 102 cfu/g. Do đó, ở 150C thời gian bảo quản mực không quá 0,5 ngày. • Như vậy: Ở nhệt độ càng thấp, Coliforms phát triển càng chậm, nghĩa là ở nhiệt độ lạnh càng thấp càng kéo dài thời gian bảo quản, đảm bảo an toàn vệ sinh của tôm sú nguyên liệu. Để đảm bảo nguyên liệu đạt tiêu chuẩn vi sinh, dựa trên chỉ tiêu Coliforms thì: + Ở 1 ± 10C, thời gian bảo quản tôm kéo dài trên 240h (10 ngày) + Ở 4 ± 1°C, thời gian bảo quản tôm có thể trên 168h (7 ngày) + Ở 9 ± 10C, thời gian bảo quản tôm kéo dài được 48h + Ở 15 ± 10C, thời gian bảo quản tôm trước 21,5h 45 + Ở 19 ± 10C, thời gian bảo quản tôm chỉ kéo dài 12h. 3.1.2. Biến đổi của E.coli trên nguyên liệu tôm sú trong quá trình bảo quản lạnh Sự biến đổi của E.coli trên tôm sú nguyên liệu trong quá trình bảo quản lạnh theo nhiệt độ và thời gian bảo quản được thể hiện ở Hình 3.6, Hình 3.7, Hình 3.8, Hình 3.9 và Hình 3.10. 80 E.coli (MPN/g) 70 60 50 40 30 20 10 0 0 50 100 150 200 250 Thời gian bảo quản ở 1 ± 1°°C (giờ) Hình 3.6 Biến đổi của E.coli trên tôm sú nguyên liệu bảo quản ở nhiệt độ 1 ± 1°°C 46 8 7 E.coli (MPN/g) 6 5 4 3 2 1 0 0 1 2 3 4 5 6 7 Thời gian bảo quản ở 4 ± 1°°C (ngày) Hình 3.7 Biến đổi của E.coli trên tôm sú nguyên liệu bảo quản ở nhiệt độ 4 ± 10C E.coli (MPN/g) Ghi chú: Đồ thị biểu diễn giá trị E.coli trung bình của 3 lô thí nghiệm từ ngày 0 đến ngày bảo quản thứ 6, riêng ngày thứ 7 theo giá trị E.coli của lô 1. 225 200 175 150 125 100 75 50 25 0 0 20 40 60 80 100 120 Thời gian bảo quản ở 9 ± 1°°C (giờ) Hình 3.8 Biến đổi của E.coli trên tôm sú nguyên liệu bảo quản ở nhiệt độ 9 ± 1°°C 47 1200 E.coli (MPN/g) 1050 900 750 600 450 300 150 0 0 10 20 30 40 50 Thời gian bảo quản ở 15 ± 1°°C (giờ) 60 70 Hình 3.9 Biến đổi của E.coli trên tôm sú nguyên liệu bảo quản ở nhiệt độ 15 ± 1°°C 1200 E.coli (MPN/g) 1000 800 600 400 200 0 0 5 10 15 20 25 Thời gian bảo quản ở 19 ± 1°°C (giờ) 30 Hình 3.10 Biến đổi của E.coli trên tôm sú nguyên liệu bảo quản ở nhiệt độ 19±1°°C 48 E.coli có thể gặp trên nguyên liệu thủy sản khi đánh bắt trong vùng nước gần bờ bị nhiễm bẩn hoặc lây nhiễm qua dụng cụ đánh bắt, chứa đựng nhiễm bẩn. Đặc biệt sau cơn mưa, các nguồn nước nội địa chảy ra biển làm tăng số lượng vi sinh vật trong nước biển, do đó có thể gặp mặt các vi sinh vật gây bệnh lây nhiễm trong đó có E.coli trong nguyên liệu thủy sản [14]. Theo lý thuyết, quần thể vi sinh vật sinh trưởng và phát triển theo đường cong sinh trưởng trong điều kiện nuôi cấy tĩnh, đường cong sinh trưởng qua 4 phase: phase lag (phase tiềm ẩn) là pha vi sinh vật làm quen môi trường, phase log (phase hàm số mũ) là phase vi sinh vật phát triển theo hàm số mũ, phase ổn định và phase suy vong. Khi gặp yếu tố ức chế sinh trưởng và phát triển, vi sinh vật sẽ thực hiện 2 phase đầu trong thời gian rất ngắn để mau chóng chuyển sang phase ổn định. Tuy nhiên, một số loài vi sinh vật khi thực hiện phase ổn định lại có thể trở thành dạng thích nghi với điều kiện môi trường mới để tiếp tục và phát triển. Theo kết quả thực nghiệm trên Hình 3.6 cho thấy, trên nguyên liệu tôm vừa mới thu hoạch đã phát hiện sự có mặt của E.coli với một lượng nhỏ chưa vượt ngưỡng cho phép ở các nhiệt độ bảo quản khác nhau 10C, 40C, 90C, 150C và 190C. Ở 10C, sau 96h lượng E.coli không tăng cũng không giảm so với khi mới thu mua (43 MPN/g), tuy nhiên sau 144h bảo quản lượng E.coli lại giảm mạnh, chỉ còn 9,1 MPN/g, rồi lại tăng dần lên ở những thời điểm bảo quản sau (192h, 216h) và sau 216h bảo quản lượng E.coli đạt 75MPN/g. Đến cuối thời gian bảo quản (240h) lượng E.coli có giá trị tương đương với 3 thời điểm bảo quản đầu là 43 MPN/g. Căn cứ vào bảng chuyển đổi từ MPN/g sang CFU/g trong nghiên cứu của Thararat Chitov và Supa-aksorn Rattanachaiyanon (2010) [28], có thể thấy giá trị E.coli (MPN/g) chưa vượt ngưỡng giới hạn 100 cfu/g (QĐ 46/2007/QĐ-BYT) trong suốt thời gian bảo quản. Qua các số liệu thực nghiệm trên Hình 3.7 có thể thấy, khi bảo quản 40C vào ngày 0, không thấy sự phát triển của E.coli trong nguyên liệu tôm, nhưng ở các thời 49 điểm bảo quản sau, đã tìm thấy sự có mặt của chúng. Chứng tỏ thời gian bảo quản càng dài, sự phát triển của E.coli càng nhiều, do đó dễ dàng tìm thấy E.coli ở những ngày bảo quản tiếp theo. Ở ngày bảo quản đầu tiên mới thấy sự phát triển của E.coli nên khả năng E.coli có mặt trong nguyên liệu ngay từ khi mới thu mua nhưng số lượng quá ít không tìm thấy sự có mặt của chúng là hợp lý. Đến ngày 1 mới thấy sự phát triển của chúng là 3,3 MPN/g, tăng đều lên ngày 2 ngày là 3,6 MPN/g, nhưng đến ngày 3 lại không thấy sự có mặt của E.coli, những ngày sau mới tăng trở lại và có xu hướng giảm ở 2 ngày cuối bảo quản, lượng E.coli trung bình là như nhau ở ngày 5 và 6 (1,8 MPN/g). Căn cứ vào bảng chuyển đổi từ MPN/g sang CFU/g trong nghiên cứu của Thararat Chitov và Supa-aksorn Rattanachaiyanon (2010) [28], có thể thấy giá trị E.coli (MPN/g) chưa vượt ngưỡng giới hạn 100 cfu/g trong suốt thời gian bảo quản. Kết quả phân tích ANOVA cho thấy không có sự khác biệt có ý nghĩa thống kê giữa các giá trị trung bình của lượng E.coli ở các ngày bảo quản. Như vậy, ở nhiệt độ lạnh 40C, tuy có sự phát triển của trực khuẩn E.coli nhưng số lượng của chúng chưa vượt quá ngưỡng cho phép 100 cfu/g sau 6 ngày bảo quản. Đồ thị trên Hình 3.8 cho biết, ở 90C, thời gian bảo quản càng dài lượng E.coli phát triển càng nhanh. Ở nhiệt độ này, lượng E.coli tăng đều so với khi mới thu mua, đến 96h mới thấy sự phát triển mạnh của E.coli, lượng E.coli tăng gấp 3 lần (20 MPN/g) so với 72h (7,3 MPN/g), tiếp tục tăng nhẹ ở 118h và tăng mạnh ở thời gian bảo quản cuối, tăng từ 28 MPN/g lên đến 240 MPN/g ở 126,5h, nhưng vẫn chưa vượt ngưỡng giới hạn cho phép của quy định 46/2007/QĐ-BYT. Nhiệt độ càng cao thì lượng E.coli tăng nhanh. Kết quả trên Hình 3.9 cho thấy, ở 150C từ 0h đến 42,5h, lượng E.coli tăng nhẹ đến 28 MPN/g, trong khoảng 8h từ 30,5h đến 42.5h, lượng E.coli hầu như không thay đổi, tuy nhiên ngay sau đó 8h (50,5h) đã tăng đến 460 MPN/g, tăng nhanh so với bảo quản ở 90C (sau 126,5h mới đạt 50 240 MPN/g). Căn cứ vào bảng chuyển đổi từ MPN/g hay MPN/ml sang CFU/g hay CFU/ml trong nghiên cứu của Thararat Chitov và Supa-aksorn Rattanachaiyanon (2010) [28], cho thấy được rằng tại thời điểm cuối của bảo quản giá trị E.coli (MPN/g) đã vượt ngưỡng giới hạn cho phép 102 cfu/g (theo quy định 46/2007/ QĐ-BYT). Với nghiên cứu của Nguyễn Thị Thanh Hải trong bảo quản lạnh mực nguyên liệu (2004), ở 150C sau 1 ngày bảo quản lượng E.coli là 3,0.100 cfu/g. Kết quả trên Hình 3.10 cho thấy, ở 190C, lượng E.coli tăng giảm không theo quy luật ở các thời điểm bảo quản đầu (từ 0h đến 20h), nhưng đến điểm bảo quản thứ 6, chỉ sau 25h lượng E.coli đã đạt 1100 MPN/g (vượt giới hạn cho phép 102 cfu/g, dựa vào bảng chuyển đổi sang cfu/g của Thararat Chitov và Supa-aksorn Rattanachaiyanon, 2010) [28], tuy nhiên đến điểm bảo quản cuối (30h) lượng E.coli lại giảm mạnh, chỉ còn 210 MPN/g. • Như vậy: Ở nhiệt độ bảo quản lạnh càng thấp, sự phát triển của trực khuẩn của E.coli càng bị ức chế trong thời gian bảo quản dài. Đồng thời, cần tránh bảo quản thực phẩm lâu ở nhiệt độ lạnh, thường xuyên giám sát nhiệt độ và thời gian bảo quản. 3.2. Sự biến đổi của tổng bazơ nitơ bay hơi (TVB-N) trên tôm sú nguyên liệu quá trình bảo quản lạnh Nguyên liệu dùng để thí nghiệm được bảo quản ở các nhiệt độ: 1± 10C, 4± 10C, 9± 10C, 15± 10C và 19± 10C, làm thí nghiệm cho 3 lô ở chế độ 1± 10C và 4± 10C và lô khảo sát ứng với 3 chế độ còn lại. Tổng bazơ nitơ bay hơi của tôm sú nguyên liệu biến đổi trong quá trình bảo quản lạnh theo thời gian và nhiệt độ bảo quản được thể hiện ở Hình 3.11, Hình 3.12, Hình 3.13, Hình 3.14 và Hình 3.15. 51 70 e 60 de TVB-N (mg N%) 50 bcd bcd 40 abcd 30 20 a ab cde abc 10 0 0 2 4 6 8 10 12 Thời gian bảo quản lạnh ở 1 ± 1 °C (ngày) Hình 3.11 Biến đổi của TVB-N trên tôm sú nguyên liệu bảo quản ở 1 ± 10C Ghi chú: Các chữ cái khác nhau thể hiện sự khác biệt có ý nghĩa thống kê (p < 0,05) về hàm lượng TVB-N trong tôm giữa các ngày bảo quản lạnh ở 1 ± 1°C. 52 41 b TVB-N (mgN%) 38 c bc 35 32 a 29 a 26 a a 23 20 0 1 2 3 4 5 Thời gian bảo quản ở 4 ± 1°°C (ngày) 6 7 Hình 3.12 Biến đổi của TVB-N trong tôm sú bảo quản lạnh ở nhiệt độ 4 ± 10C Ghi chú: Đồ thị biểu diễn trị số trung bình của tổng đạm bazơ bay hơi (TVB-N) của 3 lô thí nghiệm từ ngày 0 đến ngày bảo quản thứ 6, riêng ngày thứ 7 theo lượng TVB-N của lô 1. 60 TVB-N (mgN%) 50 40 30 20 10 0 0 20 40 60 80 100 Thời gian bảo quản ở 9 ± 1°°C (giờ) 120 140 Hình 3.13 Biến đổi của TVB-N trên tôm sú nguyên liệu bảo quản ở 9 ± 10C 53 140 TVB-N (mgN%) 120 100 80 60 40 20 0 0 10 20 30 40 50 Thời gian bảo quản ở 15 ± 1°°C (giờ) 60 70 Hình 3.14 Biến đổi của TVB-N trên tôm sú nguyên liệu bảo quản ở 15 ± 10C TVB-N (mgN%) 40 37 34 31 28 25 0 5 10 15 20 25 Thời gian bảo quản ở 19 ± 1°°C (giờ) 30 Hình 3.15 Biến đổi của TVB-N trên tôm sú nguyên liệu bảo quản ở 19 ± 10C 54 Thủy sản sau khi chết nếu không được chế biến và tiêu thụ ngay mà được đưa vào bảo quản thì trong suốt quá trình bảo quản này hoạt động của vi sinh vật và các enzyme nội tại sẽ sản sinh ra hàng loạt các chất bazơ bay hơi (chủ yếu là NH3, dimethylamin và trimethylamine) làm cho chất lượng của thủy sản giảm. Trong thực tế hàm lượng các bazơ bay hơi này có thể được xác định để đánh giá chất lượng của thủy sản. Nếu tổng lượng bazơ bay hơi này càng nhiều thì chất lượng thủy sản càng giảm [18]. Theo kết quả thực nghiệm được thể hiện trên Hình 3.11, Hình 3.12, Hình 3.13, Hình 3.14 và Hình 3.15 cho thấy, hàm lượng tổng bazơ nitơ bay hơi hầu như tăng đều cùng với thời gian và nhiệt độ bảo quản. Nhiệt độ càng cao tốc độ tăng TVB-N càng nhanh. Ở 10C, phân tích phương sai (ANOVA) và kiểm định Tukey cho thấy các mẫu sau 9 ngày bảo quản khác biệt có ý nghĩa (p < 0,05) với các mẫu mới bảo quản 0 và 2 ngày. Mẫu sau 11 ngày bảo quản khác biệt có ý nghĩa (p < 0,05) với các mẫu bảo quản từ 0-8 ngày. Mẫu bắt đầu bảo quản (ngày 0) có hàm lượng TVB-N thấp hơn hẳn (p < 0,05) so với các mẫu bảo quản từ ngày 6-11. Nếu căn cứ trên quy định 95/149/EC của châu Âu thì hàm lượng TVB-N trong tôm sú vượt qua ngưỡng 35 mg/100 g chỉ sau 4 ngày bảo quản lạnh ở 1 ± 1 °C. So với tôm bảo quản ở 4 0C, 9 0C, 15 0C và 19 0C thì tốc độ tăng của tổng bazơ nitơ bay hơi ở nhiệt độ 10C là cao. Trong khi Trần Văn Mạnh (2008) [18] nghiên cứu về “Sự biến đổi thành phần hóa học, chất lượng cảm quan và phương pháp bảo quản tươi cá tra sau thu hoạch” cho thấy, tại chế độ bảo quản 10C tổng bazơ nitơ bay hơi trong bảo quản cá tra là ít biến đổi nhất, tăng chậm hơn so với các chế độ bảo quản khác (50C và 280C), sau 12 ngày bảo quản lượng bazơ nitơ bay hơi chỉ đạt 22,44 mgN%, do đó có thể bảo quản cá tối đa 12 ngày ở 10C. Chứng tỏ nhiệt độ càng cao và thời gian càng dài thì lượng bazơ bay hơi sinh ra càng lớn. Có sự khác biệt về kết quả nghiên cứu có thể là do sự khác biệt về nguồn nguyên liệu. 55 Tổng bazơ nitơ bay hơi (TVB-N) chủ yếu là hàm lượng nitơ của các chất: NH3, TMA, DMA…là sản phẩm của quá trình phân giải protein và phân hủy axit amin. Vì vậy, tổng lượng TVB-N càng nhiều thì chất lượng tôm càng giảm [12][14]. Số liệu ở Hình 3.12 cho thấy hàm lượng TVB-N ở 4 ± 1°C tăng theo thời gian bảo quản, tuy nhiên ngày đầu tiên (ngày 0) lại có hàm lượng TVB-N trung bình cao hơn ngày bảo quản đầu tiên (ngày 1), cụ thể trị số trung bình của tổng bazơ nitơ bay hơi của tôm ở ngày 0 là 24,82 mgN%, ngày 1 là 23,05 mgN%, sau 6 ngày bảo quản tăng lên 36,13 mgN%. Mức chênh lệch trị số giữa các ngày không cao, thường dao động trong khoảng 2- 3 mgN%. Kết quả phân tích ANOVA cho thấy trị số trung bình của tổng đạm bazơ bay hơi 2 ngày đầu bảo quản không có sự khác biệt có ý nghĩa thống kê giữa các ngày, nhưng lại có sự khác biệt với 3 ngày 4, 5, 6. Lượng TVB-N ở ngày bảo quản thứ 6 khác biệt với tất cả các ngày trước đó và đã vượt ngưỡng 35 mgN%. Ở nhiệt độ bảo quản 40C, những ngày đầu bảo quản lượng TVB-N ít hơn những ngày sau, chứng tỏ thời gian đầu bảo quản tôm ít bị hư hỏng nên quá trình phân giải tạo ra sản phẩm ít vì vậy lượng TVB-N ít. Càng về sau lượng TVB-N càng nhiều, khẳng định được rằng thời gian bảo quản tôm càng dài thì chất lượng tôm càng giảm, hàng loạt chất bazơ nitơ bay hơi được sản sinh ra. Tóm lại ở nhiệt độ ở 40C, trị số trung bình của tổng bazơ nitơ bay hơi nằm trong giới hạn cho phép ([...]... tiêu của đề tài: nghiên cứu được sự biến đổi vi sinh vật gây bệnh, cụ thể là Coliforms, E. coli và tổng bazơ nitơ bay hơi (TVB-N) trên tôm sú nguyên liệu trong thời gian bảo quản lạnh nhằm đưa ra chế độ bảo quản phù hợp ứng dụng trong thực tế 3 Nội dung của đề tài: - Nghiên cứu sự biến đổi của vi sinh vật gây bệnh Coliforms và E. coli trên tôm sú nguyên liệu trong quá trình bảo quản lạnh - Nghiên cứu sự. .. nhất 4 chủng gây bệnh cho người và một số loài động vật: 1 E. coli gây bệnh đường ruột (Enteropathogenic) (EPEC) 2 E. coli gây ngộ độc đường ruột (Enterotoxigenic) (ETEC) 25 3 E. coli gây bệnh lan tràn trong đường ruột (Enteroinvasive) (EIEC), E. coli gây bệnh giống bệnh lỵ shiga 4 E. coli gây xuất huyết đường ruột (Enterohaemorrhagic) (EHEC)/ (VTEC) hoặc E. coli sinh độc tố Verocytoxin hoặc E. coli 0157:H7... - Nghiên cứu sự biến đổi của tổng bazơ nitơ bay hơi trên tôm sú nguyên liệu trong quá trình bảo quản lạnh Ý nghĩa khoa học của đề tài: Cung cấp dữ liệu khoa học về sự biến động của vi sinh vật gây bệnh (Coliforms E. coli) và TVB-N trên tôm sú nguyên liệu trong quá trình bảo quản lạnh Ý nghĩa thực tiễn của đề tài: Kết quả nghiên cứu của đề tài góp phần ngăn ngừa mối nguy sinh học đảm bảo an toàn thực... S putrefacien, phosphoreum P 2, 3, 4, 9 1, 9 19 Vi khuẩn hình que ưa lạnh, không lên men (S putrefacien, PseudomoMAP1 nas sp.), vi khuẩn hình que Gram dương (vi khuẩn lactic) Vi khuẩn hình que Gram Có âm ưa lạnh không (Vibrionaceae, S khí putrefacien) Vi khuẩn hình que ưa Chân 50C lạnh (Vibrionaceae, S không putrefacien) Vi khuẩn hình que Gram 1 MAP âm ưa lạnh (Vibrionaceae) Vi khuẩn hình que Gram... trình bảo quản lạnh bằng nước đá ở điều kiện hiếu khí được đặc trưng bởi một dạng hư hỏng do Pseudomonas sinh ra một vài sunfit dễ bay hơi, xeton, este và aldehit Sự hư hỏng tăng nhanh khi số lượng vi sinh vật gây hư hỏng vượt quá 107 cfu/g Các tác giả nghiên cứu hệ vi sinh vật nổi trội và các vi khuẩn đặc trưng gây hư hỏng trên cá tuyết thể hiện trên Bảng 1.3: Bảng 1.3 Hệ vi sinh vật nổi trội và vi khuẩn... lên men ưa nhiệt độ 0 không 20- 30 C phòng (Vibrionaceae, khí Enterobacteriaceae) MAP1: bao gói có điều chỉnh không khí P phosphoreum 1, 7 Aeromonas sp., S putrefaciens Aeromonas sp., S putrefaciens Aeromonas sp Vibrionaceae, Enterobacteriaceae 6 2, 4, 5, 8 Nguồn: 1) Dalgaard và cộng sự (1993), 2) Gram và cộng sự (1987), 3) Lima dos Santos (1978), 4) Gram và cộng sự (1990), 5) Gorezyca và Pek Poh Len... Donald và Gibson (1992), 7) Van Spreekens (1977), 8) Barile và cộng sự (1985), 9) Jorgensen và Huss (1989) Vi sinh vật trên tôm tươi Vi sinh vật tổng số: động vật thủy sản sống ở các vùng nước sạch, ngay sau khi đánh bắt được, lượng vi sinh vật nhiễm bẩn nhìn chung cũng giống với lượng vi sinh vật có trên thịt lợn và gia cầm sau khi giết thịt Lượng vi sinh vật này phụ thuộc chủ yếu vào mức độ ô nhiễm và. .. phẩm và chọn phương pháp bảo quản nguyên liệu thích hợp đem lại một sản phẩm thực phẩm an toàn và có chất lượng cao Để góp phần đánh giá mức độ vệ sinh an toàn thực phẩm cũng như đưa ra những khuyến cáo cho các bên liên quan trong chuỗi cung ứng, tôi tiến hành thực hiện đề tài: Nghiên cứu sự biến đổi của một số vi sinh vật gây bệnh (Coliforms, E. coli) và tổng bazơ nitơ bay hơi trên tôm sú bảo quản lạnh ... để sản sinh ra TMA Các loài có khả năng phân hủy TMAO được biết đến là Enterobacteriacae, V parahaemolyticus và một số loài thuộc họ Pseudomonas, Shewanella, Alteromonas và Campylobacter Đối với tôm, bảo quản ở các nhiệt độ khác nhau, quá trình tích lũy một lượng lớn indol tương đồng với số lượng rất cao của protein trong số các vi sinh vật [13][14] 1.2.4 Một số vi sinh vật gây bệnh thường gặp trên nguyên... Họ chung: Penaeidea - Họ: Penaeidea- Họ tôm he - Giống: Penaeus - Loài: Penaeus monodon Tên tiếng Anh phổ biến là Black tiger shrimp (theo hệ thống phân loại của Holthuis, 1989) Tên tiếng Vi t phổ biến là tôm sú Hiện nay, ở Vi t Nam tôm sú là một trong 5 loại tôm được nuôi trồng phổ biến và quan trọng nhất đối với nền kinh tế Vi t Nam: - Tôm sú (Black tiger shrimp)- Penaeus monodon 5 - Tôm thẻ (Banana ... Nghiên cứu biến đổi số vi sinh vật gây bệnh (Coliforms, E. coli) tổng bazơ nitơ bay tôm sú bảo quản lạnh Mục tiêu đề tài: nghiên cứu biến đổi vi sinh vật gây bệnh, cụ thể Coliforms, E. coli tổng. .. ruột (Enteropathogenic) (EPEC) E. coli gây ngộ độc đường ruột (Enterotoxigenic) (ETEC) 25 E. coli gây bệnh lan tràn đường ruột (Enteroinvasive) (EIEC), E. coli gây bệnh giống bệnh lỵ shiga E. coli gây. .. sâu vào biến đổi vi sinh vật gây bệnh (Coliforms, E. coli) biến đổi hợp chất bazơ nitơ bay có nguyên liệu 31 Ngoài ra, đối tượng nghiên cứu liên quan đến vi sinh vật gây bệnh (Coliforms, E. coli)