Tuy nhiên, khi kết hợp với chitosan ở những nồng độ khác nhau, mật số vi khuẩn Lactobacillus hầu như thấp hơn so với các nghiệm thức đối chứng (dịch tăng sinh vi khuẩn trong môi trườ[r]
(1)61
KHẢO SÁT ẢNH HƯỞNG CỦA NỒNG ĐỘ CHITOSAN ĐẾN SỰ SINH TRƯỞNG VÀ KHẢ NĂNG KHÁNG NẤM CỦA VI KHUẨN LACTOBACILLUS
TRÊN CHỦNG NẤM MỐC LASIODIPLODIA PSEUDOTHEOBROMAE GÂY BỆNH TRÊN CHÔM CHÔM SAU THU HOẠCH
Đỗ Thị Hiền, Nguyễn Thị Ngọc Trúc, Nguyễn Phan Thảo Trường Đại học Công nghiệp TP.HCM Ngày nhận bài: 09/5/2016 Ngày chấp nhận đăng: 14/6/2016 TÓM TẮT
Chôm chôm sau thu hoạch dễ bị hư hỏng nấm bệnh phát triển Chitosan sử dụng làm màng bao thực phẩm, có tính kháng khuẩn, kháng nấm hạn chế tổn thất chất dinh dưỡng cho thực phẩm (Allan Hadwiger, 1979) Một số chủng vi khuẩn Lactobacillus spp (L.plantarum CC6, L.fermentum DC2 và L.fermentum DG2) chứng minh có hoạt tính kháng nấm cao Đề tài kết hợp tính ưu việt Chitosan ba chủng vi khuẩn Lactobacillus spp nhằm tăng hoạt tính kháng nấmLasiodiplodia pseudotheobromae gây bệnh chôm chôm sau thu hoạch Kết khảo sát cho thấy chủng vi khuẩn Lactobacillus nhiệt độ 130C phát triển tốt nhiệt độ phòng (khoảng 25±20C) Kết hợp với 0,01% chitosan hai điều kiện nhiệt độ, vi khuẩn Lactobacillus có khả kháng nấm bệnh tốt Ở 130C nhiệt độ tốt ưu cho phát triển vi khuẩn L.plantarum CC6 kháng nấm tốt
Từ khóa: Chôm chôm, Lactobacillus plantarum, Lactobacillus fermentum, Chitosan, Lasiodiplodia pseudotheobromae
INVESTIGATION OF THE EFFECT OF CHITOSAN CONCENTRATIONS ON THE GROWTH AND ANTIFUNGAL ACTIVITY OF LACTOBACILLUS ON
POSTHARVESTING RAMBUTAN DAMAGED BY FUNGI OF LASIODIPLODIA
PSEUDOTHEOBROMAE ABSTRACT
Harvested rambutan is easy to be damaged because of fungi Chitosan has been used to make food covering and has been proved to have antibiotic and antifungal manner and having ability to slow down the nutrition loss (Allan and Hadwiger, 1979) Some kinds of Lactobacillus spp (L.plantarum CC6, L.fermentum DC2 and L.fermentum DG2) has been proved to have high antifungal ability The subject combined the advantages of Chitosan and kinds of Lactobacillus spp to increase the antifugal ability against Lasiodiplodia pseudotheobromae which causes disease on rambutan fruit The survey results show that Lactobacillus spp at 130C developed better than the room temperature (25±20C) Chitosan was combined at 0,01% w/w with Lactobacillus spp at both temperature conditions The result was shown that the L.plantarum CC6 have the best quality of the development and the antifugal ability at 130C
1. ĐẶT VẤN ĐỀ
Chôm chôm loại nhiệt đới có giá trị kinh tế cao, nguồn cung cấp vitamin C (36,8mg/100g ăn được) canxi (22mg/100g ăn được) Ngồi ra, loại trái cịn cung cấp lượng niacin, kẽm, protein chất xơ Số lượng sản xuất lớn, chủ yếu để ăn tươi (Srilaong ctv, 2002) Ở nhiệt độ cao ẩm độ thấp chôm chôm dễ bị hư hỏng phát triển nấm bệnh, chơm chơm có thời gian bảo quản ngắn Sử dụng thường xuyên thuốc diệt nấm để kiểm sốt bệnh ảnh hưởng xấu đến mơi trường ít người tiêu dùng chấp nhận (Sivakumar ctv, 2002) Sau thu hoạch, chơm chơm cịn bảo quản bằng phương pháp xử lý hóa chất kiểm soát khí (Paull ctv, 1995) kết chưa thực khả quan
Chôm chôm thường có thời gian bảo quản ngắn nấm Lasiodiplodia pseudotheobromae
(2)62
Hình 1: Triệu chứng bệnh thối lan mờ Lasiodiplodia pseudotheobromae gây chôm chôm
3, thứ trình bảo quản Ban đầu, vỏ xuất vệt màu nâu nhạt, mờ có đường kính khoảng 0,8 cm Vết bệnh tiếp tục phát triển lan dần bề mặt vỏ với tốc độ nhanh Sau xuất đến ngày vết bệnh chuyển sang màu nâu đậm, chảy nước bắt đầu hỏng Quả chơm chơm bị hỏng có màu đen xuất khuẩn ty nấm (Trần Thượng Tuấn, 1994; Trần Thụy Ái Tâm, 2012)
Chitosan thể rắn, có màu trắng hay vàng nhạt, khơng mùi vị, không tan nước, dung dịch kiềm axit đậm đặc tan axit loãng với pH=6 Chitosan sử dụng phổ biến lựa chọn thay cho thuốc diệt nấm tổng hợp Chitosan dẫn xuất chitin nghiên cứu chế tạo làm màng bao thực phẩm thay PE, PP Màng chitosan tạo thành có tính kháng khuẩn, kháng nấm hạn chế tổn thất chất dinh dưỡng cho thực phẩm (Allan Hadwiger, 1979) Ở 4oC với 2% chitosan kéo dài thời
gian bảo quản cà rốt tuần (Wójci ctv., 2008)
Hiện nay, việc nghiên cứu, phân lập chủng vi sinh vật có hoạt tính đối kháng chống lại số bệnh sau thu hoạch trái tươi nói chung chơm chơm nói riêng quan tâm Có thể kể đến chủng vi khuẩn Lactobacillus spp (CC6, DC2 DG2) phân lập tuyển chuyển chọn từ 56 chủng vi khuẩn Lactobacillus có hoạt tính đối kháng chống lại nấm Lasiodiplodia pseudotheobromae Phomopsis mali gây bệnh thối chôm
chôm
Với mong muốn kết hợp đặc tính ưu việt chất mang chitosan với chủng vi khuẩn Lactobacillus spp nhằm tăng hoạt tính đối kháng chống lại nấm Lasiodiplodia pseudotheobromae gây bệnh thối lan mờ chôm chơm để kéo dài thời gian bảo quản xuất nên đề tài thực
2 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Vật liệu nghiên cứu
(3)63
2.2 Phương pháp nghiên cứu
2.2.1 Thí nghiệm 1: Khảo sát ảnh hưởng nồng độ Chitosan đến sinh trưởng dòng vi khuẩn Lactobacillus spp
Thí nghiệm bố trí hoàn toàn ngẫu nhiên gồm nhân tố với 36 nghiệm thức, lặp lại ngẫu nhiên lần Nhiệt độ: nhiệt độ phòng (khoảng 25±20
C) 130C Nồng độ chitosan: 0; 0,01; 0,05; 0,1; 0,15; 0,2 (%) Ba chủng vi khuẩn: L.plantarum (CC6), L.fermentum - DG2,
L.fermentum - DC2
Phương pháp thực hiện: Hút 1ml dung dịch vi khuẩn Lactobacillus mật độ 108CFU/ml, tăng sinh môi trường MRS lỏng 24 Sau đó, bổ sung dung dịch chitosan vào dịch tăng sinh vi khuẩn; tiến hành pha loãng mẫu từ nồng độ 10-1
đến 10
-8CFU/mL môi trường có nồng độ chitosan 0; 0,01; 0,05; 0,1; 0,15; 0,2 (%) Dùng
micropipet hút 0,01ml từ nồng độ pha lỗng mẫu canh trường có nồng độ chitosan mật độ Lactobacillus vào đĩa môi trường MRS agar chuẩn bị trước (mỗi nồng độ lặp lại lần) Đợi khô, đậy đĩa, úp ngược lại ủ kỵ khí nhiệt độ độ phòng (khoảng 25±20C)và nhiệt độ 13oC Lấy tiêu khoảng thời gian (1, 3, 5, 7, 14, 21 ngày)
Chỉ tiêu theo dõi: Số khuẩn lạc rời diện đĩa đếm mật số môi trường MRS agar từ nồng độ pha loãng nghiệm thức khảo sát
2.2.2. Thí nghiệm 2: Khảo sát ảnh hưởng nồng độ Chitosan đến hoạt tính kháng nấm
dòng vi khuẩn Lactobacillus spp
Thí nghiệm bố trí hoàn toàn ngẫu nhiên gồm nhân tố với 36 nghiệm thức, lặp lại ngẫu nhiên lần Nhiệt độ: nhiệt độ phòng (khoảng 25±20
C) 130C Nồng độ chitosan: 0; 0,01; 0,05; 0,1; 0,15; 0,2 (%) Sinh khối giống vi khuẩn: L.plantarum (CC6), L.fermentum
DG2, L.fermentum DC2
Phương pháp thực hiện: Tăng sinh vi khuẩn Lactobacillus môi trường MRS lỏng 24 Sau đó, chủng nồng độ chitosan 0; 0,01; 0,05; 0,1; 0,15; 0,2 (%) vào dịch tăng sinh vi khuẩn Hút ml dung dịch đối kháng phủ lên môi trường PDA agar Tiến hành cấy nấm Lasiodiplodia pseudotheobromae lên môi trường PDA agar phủ dịch đối kháng để khô, kích thước nấm nghiệm thức khảo sát Đậy kín úp ngược đĩa ủ kỵ khí 130C nhiệt độ phòng Theo dõi hoạt tính đối kháng dung dịch kết hợp
nhiệt độ phòng sau 40 13 ngày nhiệt độ 130
C
Chỉ tiêu theo dõi: Đo đường kính nấm phát triển bề mặt đĩa thạch PDA.Đường kính
nấm vi khuẩn tính từ điểm tơ nấm hiên đĩa đo đối xứng qua tâm thạch nấm Lasiodiplodia pseudotheobromae cấy môi trường PDA agar Kết đo đường kính trung bình lần lặp lại Khả ức chế vi khuẩn nấm xác định sau:
Khả kháng nấm (%) = [(Ā – ā)/ Ā]x100
Trong đó: Ā: đường kính trung bình ba lần lặp lại đĩa nấm đối chứng; ā: đường kính trung bình ba lần lặp lại nghiệm thức khảo sát
2.2.3 Xử lý số liệu
(4)64
3 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
3.1 Khảo sát ảnh hưởng nồng độ Chitosan đến sinh trưởng hoạt tính kháng nấm của chủng vi khuẩn Lactobacillus spp nhiệt độ phòng (khoảng 25±20C)
3.1.1 Ảnh hưởng nồng độ Chitosan đến sinh trưởng chủng vi khuẩn Lactobacillus spp nhiệt độ phòng
Kết khảo sát ảnh hưởng chitosan đến khả sinh trưởng chủng vi khuẩn, cho thấy: thời gian tồn chủng vi khuẩn L.fermentum DC2, L.fermentum DG2
L.plantarum CC6 môi trường MRS kéo dài khoảng 14 ngày Tuy nhiên, kết hợp với chitosan nồng độ khác nhau, mật số vi khuẩn Lactobacillus thấp so với nghiệm thức đối chứng (dịch tăng sinh vi khuẩn môi trường MRS không bổ sung chitosan) Do màng chitosan tạo thành có tính kháng khuẩn, kháng nấm nên nồng độ cao hoạt tính đối kháng mạnh (Theo Allan Hadwiger, 1979 ) Mỗi nghiệm thức khảo sát có khác biệt lớn mật độ biến động đường sinh trưởng Điều thể cụ thể chủng vi khuẩn Lactobacillus Hình
Xét ảnh hưởng nồng độ chitosan đến sinh trưởng chủng vi khuẩn
L.fermentum DC2, thấy nhiệt độ phòng nồng độ chitosan cao hạn chế phát triển vi khuẩn, đường cong sinh trưởng vi khuẩn L.fermentum DC2 nồng độ chitosan có khác biệt lớn thể biểu đồ sinh trưởng (Hình 2a)
0
1 ngày ngày 14 ngày 21 ngày
M
ật
độ
(Log
CF
U/
m
l)
Thời gian (ngày)
0
1 ngày ngày 14 ngày 21 ngày
Mật
độ (Log
C
F
U
/ml
)
Thời gian (ngày)
0 10
1 ngày ngày 14 ngày 21 ngày
Mật
độ
(L
ogC
F
U
/m
l)
Thời gian (ngày)
ĐC 0,01 0,05 0,1 0,15 0,2
Hình 2a
Hình 2b
Hình 2c
(5)65
Từ kết ( Hình 2a) cho thấy vi khuẩn tồn nghiệm thức khảo sát có bổ sung chitosan nồng độ từ 0,01% đến 0,1% Nồng độ cao hơn, diện vi khuẩn L.fermentum DC2 đĩa đếm mật độ Nồng độ 0,01% chitosan, sau ngày có mật số cao 106
CFU/ml (tăng từ 104 lên 106) Sau giảm mạnh đạt mật độ thấp nghiệm thức tồn vi khuẩn.Ở nồng độ chitosan 0,05% 0,1%, vi khuẩn
L.fermentum DC2 có đường tăng trưởng tương đồng, tăng dần cao sau ngày Trong đó, nồng độ 0,05% chitosan vi khuẩn phát triển tốt đạt mật số cao khoảng 10 lần so với nồng độ 0,1% chitosan Đường sinh trưởng vi khuẩn L.fermentum DC2 nghiệm thức kết hợp 0,15% chitosan có khác biệt lớn với nghiệm thức khác Sự khác biệt lỗi thao tác Nhìn chung, nghiệm thức kết hợp chitosan hầu hết ngày thấp nghiệm thức đối chứng môi trường MRS với đường sinh trưởng giảm mạnh sau ngày ( từ 107
CFU/ml xuống 104 CFU/ml), sau ổn định đến ngày thứ 7.Nồng độ chitosan tỉ lệ nghịch với phát triển vi khuẩn L.fermentum DC2
Cùng điều kiện nhiệt độ phòng, kết khảo sát cho thấy vi khuẩn L.fermentum DG2tồn môi trường MRS có bổ sung chitosan nồng độ từ 0,01% đến 0,2% (Hình 2b)
Đường sinh trưởng vi khuẩn L.fermentum DG2 có khác biệt lớn nghiệm thức khảo sát Nồng độ 0,01% chitosan, sau ngày có mật độ cao 107
CFU/ml Mật độ cao khoảng 10 lần so với nghiệm thức đối chứng ngày thứ đến ngày thứ 14 vi khuẩn L.fermentum DG2 khơng cịn diện đĩa đếm mật độ Các nghiệm thức kết hợp chitosan cịn lại vi khuẩn L.fermentum DG2 phát triển thời gian sinh trưởng ngắn Có thể thấy, sinh trưởng vi khuẩn L.fermentum DG2 bị ức chế nồng độ chitosan cao
So với vi khuẩn L.fermentum DG2, vi khuẩn L.plantarum CC6 có khả sinh trưởng tốt kết hợp với chitosan nồng độ khác vẫn thấp so với chủng vi khuẩn L.fermentum DC2 Điều thể cụ thể biểu đồ tăng trưởng vi khuẩn
L.plantarum CC6 kết hợp chitosan nhiệt độ phịng (Hình 2c)
Từ kết thí nghiệm (Hình 2c), nhận thấy vi khuẩn L.plantarum CC6 tồn nồng độ thí nghiệm từ 0,01% đến 0,15% Nồng độ cao hơn, khơng có diện vi khuẩn đĩa đếm mật độ Nồng độ 0,01% 0,05%, mật độ cao nằm khoảng 103 đến 104 CFU/ml Trong đó, nghiệm thức đối chứng mật độ vi khuẩn L.plantarum CC6 đạt 108CFU/ml, cao khoảng 104
CFU/ml Vi khuẩn L.plantarum CC6 tồn mơi trường MRS có bổ sung chitosan nồng độ 0,1% 0,15% với thời gian tương đối ngắn (từ đến ngày) nghiệm thức ĐC (dung dịch tăng sinh vi khuẩn không bổ sung chitosan) thời gian tồn kéo dài khoảng 14 ngày Có thể thấy, điều kiện nhiệt độ phịng nồng độ chitosan làm giảm khả sinh trưởng vi khuẩn L.plantarum CC6
3.1.2 Ảnh hưởng nồng độ Chitosan đến hoạt tính kháng nấm dòng vi khuẩn Lactobacillus spp nhiệt độ phòng
Nấm Lasiodiplodia pseudotheobromae được cấy lên môi trường PDA agar phủ dịch đối
(6)66
Các giá trị bảng trung bình ba lần lặp lại, cột tiêu, các số có mẫu tự khơng khác biệt ý nghĩa mức 5% qua phép thử Duncan ngược lại
Ghi chú: NT1 = DC2 ĐC(+); NT2 = DC2 + 0,01% chitosan; NT3= DC2 + 0,05% chitosan; NT4 = DC2 + 0,1% chitosan; NT5 = DC2 + 0,15% chitosan; NT6 = DC2 + 0,2% chitosan; NT7 = DG2 ĐC(+); NT8 = DG2 + 0,01% chitosan; NT9 = DG2 + 0,05% chitosan; NT10 = DG2 + 0,1% chitosan; NT11 = DG2 + 0,15% chitosan; NT12= DG2 + 0,2% chitosan; NT13 = CC6 ĐC(+); NT14 = CC6 + 0,01% chitosan; NT15= CC6 + 0,05% chitosan; NT16 = CC6 + 0,1% chitosan; NT17 = CC6 + 0,15% chitosan; NT18 = CC6 + 0,2% chitosan
Ghi chú: Số liệu ghi cột giá trị trung bình lần lặp lại; Các số có chữ theo sau giống khơng có ý nghĩa thống kê mức 5% qua phép thử Duncan ngược lại; ĐC (+) = dung dịch tăng sinh vi khuẩn Lactobacillus môi trường MRS không bổ sung chitosan; 0,01 = Lactobacillus + 0,01% chitosan; 0,05 = Lactobacillus + 0,05% chitosan; 0,1 = Lactobacillus + 0,1% chitosan; 0,15 = Lactobacillus + 0,15% chitosan; 0,2 = Lactobacillus + 0,2% chitosan;
Nghiệm thức
Khả kháng nấm nghiệm thức (%)
Nghiệm thức
Khả kháng nấm nghiệm thức (%) NT16
NT15 NT7 NT5 NT18 NT6 NT4 NT9 NT13
29.53h 33.63gh 37.4fgh 37.43fgh 37.43efg 38.7efg 40.23defg 41.83defg 42.47def
NT14 NT17 NT10 NT3 NT11 NT8 NT12 NT2 NT1
42.77def 47.47cde 49.37cd 49.4cd 49.7cd 55.63c 70.77b 74.83b 100a
CV (%) = 0,79 LSD (5%) = 3,17
Bảng 1:Kết đối kháng nấm Lasiodiplodia pseudotheobromae chủng vi khuẩn
(7)67
Kết phân tích LSD, cho thấy chủng vi khuẩn Lactobacillus có hoạt tính đối kháng nấm tốt (nấm bị ức chế phát triển yếu so với đĩa nấm đối chứng) Ở nghiệm thức: DC2 ĐC(+), DC2 + 0,01% chitosan, DG2 + 0,01% chitosan DG2 + 0,2% chitosan thể tính đối kháng tốt khác biệt ý nghĩa thống kê mức 5% so với nghiệm thức lại Đặc biệt, nghiệm thức ĐC(+) vi khuẩn L.fermentum DC2 cho kết kháng nấm hồn tồn (mẫu nấm khơng lên đĩa khảo sát) ( Hình.3)
So sánh hoạt tính kháng nấm chủng vi khuẩn Lactobacillus, vi khuẩn L.fermentum
DC2 thể hoạt tính kháng nấm mạnh so với dòng L.fermentum DG2 L.planarum
CC6 Nghiệm thức DC2 ĐC(+) DC2 + 0,01% chitosan thể hoạt tính kháng nấm cao Các nghiệm thức khảo sát có nồng độ cao hơn, hoạt tính đối kháng nấm tương đối thấp, biệt ý nghĩa thống kê mức 5% Từ kết thí nghiệm kết luận, hoạt tính kháng nấm dung dịch vi khuẩn Lactobacillus fermentum DC2 kết hợp với chitosan nhiệt độ phòng tỷ lệ nghịch với nồng độ chitosan
Xét đến hoạt tính đối kháng nấm Lasiodiplodia pseudotheobromae gây bệnh thối lan
mờ chôm chôm vi khuẩn L.fermentum DG2 kết hợp với chitosan Kết cho cho thấy, nghiệm thức kết hợp 0,01% 0,2% chitosan thể hoạt tính kháng nấm tốt so với nồng độ khảo sát khác Các nồng độ từ 0,05% đến 0,2%, vi khuẩn
L.fermentum DG2 bị ức chế, thời gian tồn kéo dài không lâu, mật độ tỷ lệ nghịch với nồng độ chitosan song hoạt tính kháng nấm lại tăng tỷ lệ với nồng độ Đặc biệt nồng độ 0,2% chitosan, sau ngày khơng cịn diện vi khuẩn L.fermentum DG2 hoạt tính kháng nấm lại đạt giá trị cao (70,77 b%) nghiệm thức kết hợp, cao thứ so với
tất nghiệm thức chủng vi khuẩn cao nghiệm thức đối DG2 ĐC (+) Chứng tỏ trình sinh trưởng vi khuẩn L.fermentum DG2 sản sinh hợp chất hữu thông qua hoạt động trao đổi chất có khả ức chế nấm bệnh đồng thời kết hợp với nồng độ chitosan cao, làm tăng khả đối kháng dung dịch kết hợp Acid hữu màng plasmic trung hòa điện tích tăng tính thấm dẫn đến ức chế vi khuẩn làm cho sinh vật dễ chết Một độ nghiên cứu trước đề cập đến hoạt tính kháng nấm acid hữu phenyllactic acid xác định q trình ủ xilơ với vi khuẩn acid lactic (Broberg
100a 74.83b
49.4cd 40.23defg 37.43fgh
38.7efg
37.4fgh
55.63c 41.83defg
49.37cd 49.7cd
70.77b
42.47cde 42.77cde 33.63gh 29.53h
37.4fgh 37.43efg
ĐC (+) 0.01 0.05 0.1 0.15 0.2
Hoạt tính kháng nấm (%)
Nồng đ
ộ
Chi
tosan (%
)
CC6 DG2 DC2
Hình 3: Biểu đồ thể hoạt tính kháng nấm vi khuẩn Lactobacillus kết hợp Chitosan nhiệt độ phòng
(8)68
và ctv, 2007), L plantarum MiLAB 393 phân lập từ cỏ ủ xilô sinh phenyllactic acid chất kháng nấm (Ström ctv, 2005)
Nhiệt độ yếu tố quan trọng ảnh hưởng khả kháng nấm vi khuẩn acid lactic (Batish ctv, 1997) Trong điều kiện nhiệt độ phòng chủng L.plantarum
CC6 thể hoạt tính kháng nấm thấp so với chủng L.fermentum DC2 L.fermentum
DG2 Ở nghiệm thức kết hợp, hoạt tính kháng nấm Lasiodiplodia pseudotheobromae kết hợp với chitosan nồng độ khác khơng có chênh lệch nhiều, khơng có khác biệt ý nghĩa thống kê
Khảo sát khả sinh trưởng hoạt tính kháng nấm chủng vi khuẩn
L.fermentum DC2, L.fermentum DG2, L.plantarum (CC6) kết hợp với nghiệm thức thể hoạt tính kháng nấm Đặc biệt, nghiệm thức ĐC(+) nghiệm thức kết hợp 0,01% chitosan thể hoạt tính kháng nấm mạnh Kết phù hợp với nghiên cứu khả kháng nấm Lasiodiplodia pseudotheobromae gây bệnh thối lan mờ chôm chôm chủng vi khuẩn Lactobacillus trong điều kiện in – vitro( Trần Đình Mạnh, 2013)
Một số hình ảnh kháng nấm điển hình nhu nhận được
4.1.2. Khảo sát 130C
3.2 Khảo sát ảnh hưởng nồng độ Chitosan đến sinh trưởng hoạt tính kháng nấm của chủng vi khuẩn Lactobacillus spp nhiệt độ 13oC
3.2.1 Ảnh hưởng nồng độ Chitosan đến sinh trưởng chủng vi khuẩn Lactobacillus spp ở 13oC
Ở 13oC, chủng vi khuẩn
L.fermentum DC2, L.fermentum DG2, L.plantarum
CC6 phát triển tốt nhiệt độ phòng Mật độ cao thời gian phát triển kéo dài 21 ngày Đặc biệt, vi khuẩn L.plantarum CC6 có khả sinh trưởng mạnh so với chủng L.fermentum DC2 L.fermentum DG2
Đường cong sinh trưởng vi khuẩn L.fermentum DC2 nghiệm thức kết hợp chitosan có khác biệt thể biểu đồ sinh trưởng (Hình 5a)
Ở 130C, vi khuẩn
L.fermentum DC2 tồn mơi trường
MRS có bổ sung chitosan với nồng độ thí nghiệm 0,01% đến 0,2% Tuy nhiên, nồng độ chitosan vẫn ảnh hưởng nhiều đến vi khuẩn L.fermentum DC2 Nồng độ 0,01% chitosan có mật độ cao sau ngày đạt 106 CFU/ml Đến ngày thứ 21, vi khuẩn L.fermentum DC2 vẫn tồn nghiệm thức khác, vi khuẩn chết hoàn toàn Tuy nhiên, ngày thứ 14 mật độ tăng đột ngột đến thứ 21 đường sinh trưởng giảm dần theo thời gian Kết bị ảnh hưởng từ thao tác trình thực thí
Hình 4: Vòng kháng nấm Lasiodiplodiapseudotheobromae dòng DC2, DC2 kết hợp 0,01% chitosan so sánh với nấm đối chứng nhiệt độ phòng
0 10
1 ngày ngày 14 ngày 21 ngày
Mật độ (Log C F U /m l)
Thời gian (ngày) 10 12
1 ngày ngày 14 ngày21 ngày
Mật độ (Log C F U /m l)
Thời gian ( ngày)
0 10
1 ngày ngày 14 ngày 21 ngày
Mật độ (Log C F U /m l)
Thời gian (ngày)
(9)69
nghiệm Nồng độ 1%, 0,15% 0,2% chitosan vi khuẩn L.fermentum DC2 tồn khoảng thời gian ngắn Nghiệm thức kết hợp 0,05% chitosan, vi khuẩn
L.fermentum DC2 có đường sinh trưởng ổn định so với nghiệm thức khảo sát, thời gian tồn kéo dài đến ngày thứ 14, trước mật độ thấp nghiệm thức đối chứng khoảng 104
CFU/ml
Sự sinh trưởng vi khuẩn L.fermentum DG2 điều kiện 13oC mạnh nhiều so với nhiệt độ phòng, mật số đạt giá trị cao sau ngày 109
CFU/ml Ở điều kiện nhiệt độ này, vi khuẩn L.fermentum DG2 tồn mơi trường MRS bổ sung chitosan nồng độ từ 0,01% đến 0,15% Khi khảo sát nồng độ cao hơn, kết cho thấy, vi khuẩn
L.fermentum DG2 bị ức chế Sự biến thiên mật độ vi khuẩn L.fermentum DG2 nghiệm thức kết hợp chitosan thể cụ thể Hình 5b
Trong nghiệm thức kết hợp, nồng độ 0,01% chitosan, sau ngày vi khuẩn L.fermentum
DG2 đạt mật độ cao 106
CFU/ml Đến ngày thứ 21, đạt mật độ cao nghiệm thức kết hợp Nồng độ 0,05%, 0,1% 0,15% vi khuẩn L.fermentum DG2 có đường tăng trưởng ổn định Mật độ tương đồng khoảng ngày Tuy nhiên nồng độ 0,15% có khác biệt lớn ngày thứ 14 đến 21 Nguyên nhân dẫn đến khác biệt lỗi thao tác trình tiến hành thí nghiệm Nghiệm thức kết hợp 0,2% chitosan, đường sinh trưởng vi khuẩn L.fermentum DG2 hoàn toàn khác so với nghiệm thức khảo sát Điều lý giải sai sót q trình ghi nhận kết quả, mật độ vi khuẩn
L.fermentum DG2 có ít nên khơng thể đĩa đếm mật độ Từ kết thu kết luận, nồng độ chitosan vẫn cịn ảnh hưởng đến sinh trưởng vi khuẩn L.fermentum DG2 điều kiện 13oC
Kết hợp với chitosan nồng độ khác điều kiện 13oC, đường sinh
trưởng vi khuẩn L.plantarum CC6 nghiệm thức khơng có khác biệt lớn (Hình 5c)
Từ kết thể Hình 5c, thấy vi khuẩn L.plantarum CC6 tồn mơi trường MRS có bổ sung chitosan nồng độ từ 0,01% đến 0,2% Nghiệm thức kết hợp chitosan nồng độ từ 0,01% đến 0,15%, vi khuẩn L.plantarum CC6 có đường sinh trưởng tương đương Sau ngày mật độ có chênh lệch lớn nghiệm thức kết hợp so với nghiệm thức đối chứng Mật độ vi khuẩn L.plantarum CC6 nghiệm thức đối chứng đạt 108CFU/ml giá trị mật độ cao nghiệm thức kết hợp đạt 105CFU/ml nồng độ 0,01% (thấp 103 CFU/ml) Nghiệm thức có nồng độ 0,2% chitosan, từ ngày thứ vi khuẩn L.plantarum CC6 bắt đầu phát triển, đến ngày thứ 14 đạt mật độ cao Sự khác biệt nghiệm thức điều kiện nhiệt độ thấp đồng thời kết hợp chitosan nồng độ cao ức chế sinh trưởng vi khuẩn L.plantarum CC6 3.2.2. Ảnh hưởng nồng độ Chitosan hoạt tính kháng nấm chủng vi khuẩn Lactobacillus spp 13oC
Để đánh giá hoạt tính đối kháng nấm Lasiodiplodia pseudotheobromae chủng vi khuẩn Lactobacillus kết hợp với chitosan điều kiện 13oC Chúng tiến hành khảo sát khả ức chế nấm nghiệm thức có nồng độ chitosan khác Sau 13 ngày, đường kính nấm đo, hoạt tính kháng nấm dung dịch đối kháng xác định (Bảng 2, Hình 6)
Kết phân tích LSD cho thấy, điều kiện 13oC ba chủng vi khuẩn
(10)70
chủng vi khuẩn Lactobacillus ức chế hoàn toàn phát triển nấm bệnh nấm Lasiodiplodia pseudotheobromae (mẫu nấm không lên đĩa khảo sát)
Ở nghiệm thức có nồng độ từ 0,05 % đến 0,2% chitosan, vi khuẩn L.fermentum DC2 có hoạt tính kháng nấm tăng tuyến tính với nồng độ chitosan Trong mật độ vi khuẩn
L.fermentum DC2 nghiệm thức gần không tồn ngày thứ 13 Chứng tỏ, trình trao đổi chất vi khuẩn L.fermentum DC2 tiết hợp chất hữu có tác dụng đối kháng nấm Do đó, kết hợp với chitosan nồng độ cao, hoạt tính đối kháng chống lại nấm Lasiodiplodia pseudotheobromae dung dịch kết hợp mạnh Ở nghiệm thức kết hợp chitosan 0,01%, 0,05% nghiệm thức DG2 ĐC (+), vi khuẩn
L.fermentum DG2 thể hoạt tính kháng nấm cao so với nghiệm thức khảo sát có khác biệt ý nghĩa thống kê mức 5% Các nghiệm thức có nồng độ cao hơn, vi khuẩn
L.fermentum DG2 bị ức chế, mật độ thấp dẫn đến hoạt tính kháng nấm thấp
Bảng 2: Kết đối kháng nấm Lasiodiplodia pseudotheobromae chủng vi khuẩn Lactobacillus spp kết hợp với chitosan 13oC
* Các giá trị bảng trung bình ba lần lặp lại, cột tiêu, các số có mẫu tự không khác biệt ý nghĩa mức 5% qua phép thử Duncan ngược lại
Ghi chú: NT1 = DC2 ĐC(+); NT2 = DC2 + 0,01% chitosan; NT3= DC2 + 0,05% chitosan; NT4 = DC2 + 0,1% chitosan; NT5 = DC2 + 0,15% chitosan; NT6 = DC2 + 0,2% chitosan; NT7 = DG2 ĐC(+); NT8 = DG2 + 0,01% chitosan; NT9 = DG2 + 0,05% chitosan; NT10 = DG2 + 0,1% chitosan; NT11 = DG2 + 0,15% chitosan; NT12= DG2 + 0,2% chitosan; NT13 = CC6 ĐC(+); NT14 = CC6 + 0,01% chitosan; NT15= CC6 + 0,05% chitosan; NT16 = CC6 + 0,1% chitosan; NT17 = CC6 + 0,15% chitosan; NT18 = CC6 + 0,2% chitosan;
Ghi chú: Số liệu ghi cột giá trị trung bình lần lặp lại; Các số có chữ theo sau giống khơng có ý nghĩa thống kê mức 5% qua phép thử Duncan ngược lại; ĐC (+) = dung dịch tăng sinh vi khuẩn Lactobacillus môi trường MRS không bổ sung chitosan; 0,01 = Lactobacillus + 0,01% chitosan; 0,05 = Lactobacillus + 0,05% chitosan; 0,1 = Lactobacillus + 0,1% chitosan; 0,15 = Lactobacillus + 0,15% chitosan; 0,2 = Lactobacillus + 0,2% chitosan;
Nghiệm thức Khả kháng nấm nghiệm thức
(%)
Nghiệm thức Khả kháng nấm nghiệm thức
(%) NT3
NT4 NT10 NT5 NT12 NT11 NT16 NT18 NT17
6h 26.33g 37.67ef 44.33de 44.67de 45.67de 48de 55.67cd 64c
NT6 NT9 NT15 NT2 NT1 NT14 NT7 NT13 NT8
(11)71
Trong chủng Lactobacillus khảo sát, chủng vi khuẩn L.plantarum CC6 thể hoạt tính kháng nấm cao Các nghiệm thức CC6 + 0,05% chitosan, CC6 + 0,15% chitosan, CC6 + 0,01% chitosan nghiệm thức CC6 ĐC (+) thể hoạt tính đối kháng cao, có độ tin cậy thống kê mức 95% Các nghiệm thức này, mật độ vi khuẩn L.plantarum 13 ngày vẫn cao khoảng 104
đếm 103 CFU/ml Từ kết thấy, hoạt tính kháng nấm dung dịch vi khuẩn L.plantarum CC6 kết hợp với chitosan tỷ lệ tuyến tính với mật độ vi khuẩn tỷ lệ nghịch với nồng độ chitosan Kết phù hợp với nghiên cứu Martínez-Castellanos ctv (2009), sử dụng Lb.plantarum kết hợp với chitosan trì chất lượng màu chôm chôm (Nephelium Lappaceum) bảo
quản 25 10°C với độ ẩm tương đối 75 ± 2,5% 10 15 ngày tương ứng Một số hình ảnh kháng nấm điển hình:
Hình 7: Kết kháng nấm hoàn toàn nghiệm thức CC6 ĐC (+) DG2 ĐC (+)
Hình 8: Kết kháng nấm nghiệm thức DG2 + 0,1% chitosan so với nấm đối chứng
Hình 6: Biểu đồ thể hoạt tính kháng nấm vi khuẩn Lactobacillus kết hợp
Chitosan nhiệt độ 130C
CV = 0,85%
100a
100a
6g
26.33f
44.33de
66.33c
100a
100a
78b
37.67ef
45.67de
44.67de
100a
100a
86.33b
48de
64c
55.67cd
ĐC (+) 0.01 0.05 0.1 0.15 0.2
Hoạt tính kháng nấm (%)
N
ồng đ
ộ
C
hi
tosan (
%
)
(12)72
Hình : Kết kháng nấm nghiệm thức DG2 + 0,05% chitosan so với nấm đối chứng
4 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ
Kết khảo sát sinh trưởng vi khuẩn Lactobacillus cho thấy điều kiện nhiệt độ 13oC, vi khuẩn Lactobacillus phát triển tốt nhiệt độ phịng Trong mơi trường MRS mật số vi khuẩn tỉ lệ nghịch với nồng độ chitosan
Kết kháng nấm cho thấy, chủng vi khuẩn Lactobacillus có hoạt tính đối kháng điều kiện nhiệt độ phòng (khoảng 25±20
C)và 13oC Đặc biệt, chủng vi khuẩn
L.fermentum DC2 có hoạt tính mạnh nhiệt độ Kết hợp với 0,01% chitosan hai điều kiện nhiệt độ, vi khuẩn Lactobacillus thể hoạt tính đối kháng chống lại nấm bệnh
Lasiodiplodia pseudotheobromae tốt
Điều kiện 130C nhiệt độ tốt ưu cho phát triển vi khuẩn
L.plantarum CC6 Đồng thời nhiệt độ này, vi khuẩn L.plantarum CC6 thể hoạt tính đối kháng tốt Vi khuẩn
L.fermentum DG2 có khả sinh trưởng hoạt tính kháng nấm thấp chủng
Lactobacillus khảo sát Tuy nhiên, sản phẩm hữu tạo trình trao đổi chất làm cho dịch tăng sinh có hoạt tính kháng nấm khơng tồn vi khuẩn L.fermentum DG2
TÀI LIỆU THAM KHẢO
[1] Nguyễn Thị Diễm Hương, Đỗ Thị Bích Thủy, Trường Đại học Nông Lâm, Đại học Huế (2012) Xác định khảo sát số tính chất có lợi chủng Lactobacillus fermentum
DC1 phân lập từ sản phẩm dưa cải Huế Tạp Chí Khoa Học Đại học Huế, 71(2): 177-187 [2] Nguyễn Thị Bích Thủy, Nguyễn Thị Thu Nga Đỗ Thị Thu Thủy (2008) Ảnh hưởng nồng độ chitosan đến chất lượng thời gian bảo quản chanh Tạp chí khoa học phát triển 2008
[3] Trần Đình Mạnh,(2013) Phân lập, tuyển chọn dịng vi khuẩn Lactobacillus spp có tác dụng ức chế in-vitro số nấm bệnh sau thu hoạch chôm chôm Luận văn thạc sĩ ngành Công Nghệ Thực Phẩm, trường Đại Học Nông Lâm, Việt Nam Trang – 51
[4] Trần Thụy Ái Tâm, 2012 Nghiên cứu bệnh nấm chôm chôm sau thu hoạch từ
hình thức canh tác theo mơ hình VietGap mơ hình tự do Luận văn thạc sỹ ngành Công Nghệ Sinh Học, trường Đại Học Cần Thơ, Việt Nam, pp 12, 32-53
[5] Trần Linh Thước, 2009 Phương pháp phân tích vi sinh vật nước, thực phẩm mỹ phẩm Tái lần thứ năm, Nhà Xuất Bản Giáo Dục, pp 81-82, 86-89, 92-93, 217
(13)73
[7] Kasra – Kermanshahi, R., Fooladi, J., Peymanfar, S, (2010) Isolation and microencapsulation of Lactobacillus spp from corn silage for probiotic application Iranian Journal of Microbiology (June 2010), No (2), Vol (2): 98-102
[8] Jarvenpaa, S., Tahvonen, R L., Ouwehand, A C., Sandell, M., Jarvenpaa, E and Salminen, S, (2007) A Probiotic, Lactobacillus fermentum ME-3, Has Antioxidative Capacity in Soft Cheese Spreads with Different Fats Journal of Dairy Science (2007), No (7), Vol (90): 3171-3177
[9] Limohpasmanee, W., Keawchoung, P., Segsarnviriya, S., Malakrong, A., Kongratarpon, T., Vongcherree, S and Pransophon, P, (2005) Irradiation as a Quarantine Treatment of Fruits International Symposium “New Frontier of Irradiated food and Non-Food Products”, (2005) Page: 22-23
[10] Martínez-Castellanos, G., Shirai, K., Pelayo-Zaldívar, C., J Pérez-Flores, L, D Sepúlveda-Sánchez, D, (2009) Effect of Lactobacillus plantarum and chitosan in the reduction of browning of pericarp Rambutan (Nephelium lappaceum) Food Microbiology, (June 2009), No.4, Vol.(26): 444-449 [14] Paunonen, S, (2013) Strength and Barrier Enhancements of Cellophane and Cellulose Derivative Films Bioresources Page: 3098-3121 [11] Wójcik, W., Złotek, U, (2008) Use of Chitosan Film Coatings in the Storage of Carrots (Daucus carota) Department of Food Biochemistry and Chemistry,
University of Life Sciences. Page: 141-148