Nghiên cứu lên men, thu nhận và tạo sản phẩm chức năng giàu peptit ức chế enzim chuyển angiotensin từ nguồn protein sữa bò

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA HÀ NỘI *********♦********* BÙI THỊ HỒNG PHƯƠNG NGHIÊN CỨU LÊN MEN, THU NHẬN VÀ TẠO SẢN PHẨM CHỨC NĂNG GIÀU PEPTIT ỨC CHẾ ENZIM CHUYỂN ANGIOTENSIN TỪ NGUỒN PROTEIN SỮA BỊ LUẬN VĂN THẠC SĨ NGÀNH: CƠNG NGHỆ SINH HỌC NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC TS NGUYỄN THỊ HOÀI TRÂM HÀ NỘI 2008 MỞ ĐẦU Hiện bệnh cao huyết áp biết đến chứng bệnh nguy hiểm làm ảnh hưởng đến phần tư dân số toàn cầu Khi bị cao huyết áp dẫn đến nhồi máu tim, tai biến mạch máu não gây tử vong cao Bệnh thường chữa trị, phòng chống nhiều phương pháp loại thuốc đặc hiệu cho chế gây cao huyết áp Một biện pháp sử dụng thuốc thực phẩm có chứa peptit chức - loại peptit ức chế enzim chuyển angiotensin (ACEIPs-angiotensin converting enzim inhibitor peptides) Nhóm sản phẩm ACEIPs công nhận thiếu việc điều trị cao huyết áp xếp hàng đầu phịng chống suy tim ứ đọng mãn tính, dùng nhiều năm, hợp cho giai đoạn suy tim, từ loại suy tim trơ đến suy tim độ chớm bị, chí suy tim chưa phát sinh đe dọa Chúng dùng lề phối hợp với loại thuốc điều trị khác, giúp cải thiện đáng kể tiên lượng bệnh mà cải thiện triệu chứng suy tim, nâng cao chất lượng sống cho bệnh nhân cao huyết áp tim mạch Và đặc biệt, chúng chọn để dùng cho bệnh nhân cao huyết áp kèm theo hen xuyễn tiểu đường khơng thể dùng thêm loại thuốc khác Hiện thị trường có số loại thuốc ức chế ACE bao gồm Benazepril( tên thương mại Lotensin), Enalapril(tên thương mại vasotec), Quinapril( tên thương mại Accupril) Các loại dược phẩm kể có tác dụng ngăn cản thể hạn chế sản xuất Angiotensin II nguyên nhân gây hẹp lòng mạch máu- gây co thắt mạch, dùng loại thuốc giúp thể hạ huyết áp chúng có nhược điểm tổng hợp đường hoá học chúng có tác dụng phụ sử dụng gây au u, hoa mt, bun nụn, Luận văn Thạc sỹ Khoa học Chuyên ngành: Công nghệ sinh học mt mi, yếu cơ, lơ mơ hay ngủ lịm, rối loạn tiêu hố, viêm da Vì vậy, năm gần đây, ACEIPs đặc biệt tìm kiếm, nghiên cứu, sản xuất từ nguồn tự nhiên chúng khơng độc có độ an tồn cao từ protein thực vật (đậu tương, ngơ), động vật (cá ngừ, cá trích, gà ác) Các ACEIPs sản xuất từ vi sinh vật quan tâm ưu việt chúng an tồn, sản xuất quy mô công nghiệp, không phụ thuộc vào nguồn nguyên liệu, giá thành rẻ mà chúng tơi tiến hành nghiên cứu đối tượng vi sinh vật Từ tính cấp bách chúng tơi tiến hành thực đề tài: “Lên men, thu nhận, tạo sản phẩm peptit chức giàu peptit ức chế enzim chuyển Angiotensin từ nguồn protein sữa bò’’ Mục tiêu đề tài Tổng hợp thu nhận peptit có hoạt tính ức chế enzim chuyển angiotensin từ protein sữa bò phương pháp lên men vi sinh vật Nội dung đề tài 1.Lên men qui mô 10lít/mẻ thu nhận peptit ức chế enzim chuyển angiotensin từ protein sữa bò Nghiên cứu xác định tính chất peptide ức chế enzyme chuyển angiotensin từ protein sữa bò sử dụng chủng vi khuẩn Lactobacilus nấm men sacchamyces Nghiên cứu tạo sản phẩm thực phẩm chức giàu peptit ức chế enzim chuyển angiotensin từ ngun protein sa bũ Đại học Bách khoa Hà Nội Bùi Thị Hồng Phương Luận văn Thạc sỹ Khoa học PHN I TNG Chuyên ngành: Công nghệ sinh học QUAN TÀI LIỆU Cao huyết áp bệnh phổ biến khắp giới, tỷ lệ người mắc bệnh tăng theo tuổi, chiếm khoảng 20% dân số, chiếm 60 % người 60 tuổi Cao huyết áp làm tăng nguy đột quỵ ( stroke), nhồi máu tim (heart attack), suy tim, suy thận, tai biến mạch máu não, tử vong Bệnh cao huyết áp gọi “sát thủ thầm lặng’’vì thường khơng có triệu trứng gây nguy hại lớn cho quan thể, theo lời bác sĩ Douglas C Throckmorton, phó Giám đốc trung tâm nghiên cứu đánh giá thuốc FDA Điều trị tốt cao huyết áp làm giảm bớt số người bị biến chứng gây tàn phế, giảm phần gánh nặng cho gia đình xã hội [1] Có nhiều nguyên nhân dẫn đến cao huyết áp, nhóm bệnh lại phù hợp với loại thuốc khác Chính mà ln có nghiên cứu để tìm loại thuốc Người ta tìm nguyên nhân gây bệnh cao huyết áp hệ thống renin-angiotensin vào năm 1950 Từ nghiên cứu tìm thuốc chống chế quan tâm [2] Giới thiệu chất ức chế enzim chuyển angiotensin Lịch sử chất ức chế men chuyển angiotensin (ACE) bắt đầu nǎm 1954, tầm quan trọng enzym thừa nhận lần đầu Nǎm 1968, hợp chất có khả nǎng ức chế chuyển angiotensin I thành angiotensin II tách chiết từ nọc rắn Tuy nhiên chất ức chế ACE sử dụng lâm sàng chưa xuất thị trường thuốc khơng có sinh tác dụng sau uống Nǎm 1980, captopril trở thành chất ức chế men chuyển angiotensin phép sử dụng lâm sàng Kể từ ú, ngi ta ó xỏc nh c ớt nht Đại học Bách khoa Hà Nội Bùi Thị Hồng Phương Luận văn Thạc sỹ Khoa học Chuyên ngành: Công nghệ sinh häc 40 hợp chất ức chế ACE chúng nghiên cứu cấp phép sử dụng [2] 1.1 Enzim chuyển angiotensin (ACE) 1.1.1 Hệ thống renin-angiotensin (RAS) Huyết áp thể kiểm sốt số đường sinh hóa khác có quan hệ tương tác với Tuy khơng phải hệ thống điều hịa huyết áp độc quyền, hệ thống rennin – angiotensin (RAS) đóng vai trị quan trọng then chốt việc kiểm sốt huyết áp, cân chất điện phân, tiết, thận, nội tiết, thần kinh chức liên quan tới việc kiểm soát hoạt động tim mạch thể người động vật có vú khác [15] Đối với chức điều hòa huyết áp, hệ thống renin – angiotensin ảnh hưởng theo ba đường: - Renin enzim α 2-globulin máy bên cầu thận tiết hoạt hoá chuyển angiotensinogen protein sẵn có huyết tương gan tiết thành angiotensin I peptit trơ có 10 gốc axít amin (decameric peptide) : Asp-Arg-Val-Tyr-Ile- His-Pro-Phe-His-Leu có hoạt tính sinh học yếu - AngiotensinI tiếp tục bị thuỷ phân enzim chuyển angiotensin (Angiotensin Converting Enzyme – ACE) thành angiotensin II peptit vận chuyển máu, tiết aldosteron thận giữ lại nước Natri, có gốc axít amin (octapeptid) : Asp-Arg-Val-Tyr-Ile-His-Pro-Phe Angiotensin II chất gây tăng huyết áp chất có tác dụng co mạch mạnh, đồng thời cịn kích thích làm cho hệ thần kinh giao cảm hoạt động mạnh lên tăng tổng hợp catecholamin làm co mạch, kích thích vùng đồi yên tiết hocmon chống lợi tiểu vasopressin, làm cho ứ nước ion natri, kớch thớch v thng thn tng tit aldosteron lm Đại học Bách khoa Hà Nội Bùi Thị Hồng Phương Luận văn Thạc sỹ Khoa học Chuyên ngành: Công nghệ sinh häc tăng tái hấp thụ ion natri nước, kết làm tăng khối lượng máu tuần hoàn làm tăng huyết áp - Enzim chuyển angiotensin thủy phân làm vô hoạt chất dãn mạch bradykinin, peptit có gốc axit amin là: Arg - Pro - Pro - Gly - Phe - Ser - Pro - Phe – Arg cách loại peptit đầu cacbon cuối Như vậy, hoạt hoá hệ thống renin – angiotensin với tham gia enzim chuyển angiotensin nguyên nhân làm tăng huyết áp thể Cơ chế làm tăng huyết áp hệ thống renin – angiotensin tóm tắt sơ đồ Angiotensinog Reni Angiotensin I AC Angiotensin II Kích thích hệ thần kinh giao cảm, tăng tổng hợp catecholamin Kích thích vỏ thượng thận thượng thận tiết Tăng tái hấp thụ Na+ H2 O Kích thích đồi yên tăng tiết vasopressin chống lợi tiểu Giữ H2 O Làm co mạch Tăng khối lng tun hon Tăng huyết áp S C chế hoạt động gây bệnh tăng huyết áp hệ thng renin angiotensin Đại học Bách khoa Hà Nội Bùi Thị Hồng Phương Luận văn Thạc sỹ Khoa học Chuyên ngành: Công nghệ sinh học 1.1.2.c tớnh ca enzim chuyển angiotensin (ACE) – cấu tạo, tính chất, chế tác động gây bệnh cao huyết áp, tim mạch 1.1.2.1 Angiotensin: Angiotensin peptit tạo thành thủy phân chuyển hóa angiotensinogen (là protein gan tiết ra) enzyme thể Angotensin có nhiều dạng, quan trọng angiotensin I angiotensin II - Angiotensin I: chuỗi peptit trơ có 10 gốc axit amin: Asp-Arg-Val-TyrIle- His-Pro-Phe-His-Leu - Angiotensin II: chuỗi peptit gồm gốc axit amin: Asp-Arg-Val-Tyr-IleHis-Pro-Phe Angiotensin II gây nhiều tác hại lên hệ thống tim mạch: làm co mạch máu, gây tăng áp suất máu, tăng hoạt động tim để bơm máu nuôi thể Trong nhiều bệnh lý tim mạch, lượng angiotensin II thường thấy có nhiều bình thường Nồng độ angiotensin II tăng tác hại làm tăng áp suất máu làm dày lên số cấu trúc tim Sự dày lên tim lâu dần làm tăng nguy tử vong bệnh tim mạch Nồng độ angiotensin II cao tác động lên thành mạch máu làm chúng dày lên, cứng hơn, dẫn tới làm lắng đọng cholesterol gây tác mạch máu, chế dẫn tới nhồi máu tim tai biến mạch máu não Tác động angiotensin II mạch máu, tim áp lực bên cầu thận th hin hỡnh Đại học Bách khoa Hà Nội Bùi Thị Hồng Phương Luận văn Thạc sỹ Khoa học Chuyên ngành: Công nghệ sinh học (A) (B) Hình Tác động angiotensin II áp lực bên cầu thận (A), mạch máu tim (B) 1.1.2.2 Enzim chuyển angiotensin (ACE) Enzim chuyển angiotensin (Angiotensin Converting Enzyme – ACE) hay hay gọi enzim kininaza (peptidyldipeptidehydrolase/metallocarboxylpeptidase, EC 3.4.15.1) tồn bề mặt tế bào thành mạch máu quan thể não, tim, phổi, gan, ruột non, tuỵ, tuyến thượng thận,…[13] Enzim chuyển angiotensin metallocarboxylpeptidaza, phân tử có chứa nhóm kẽm (Zn2+), xúc tác thủy phân gốc carboxyl cuối mạch, yêu cầu chất mang điện tích âm Ở động vật có vú có dạng ACE xác định: ACE thuộc thể xôma (somatic ACE), ACE tế bào sinh dục (Germinal/testicular ACE), ACE tương đồng (Homologue ACE) Chúng isoenzim riêng biệt hoạt động enzim ngoại bào Các peptit với vị trí C cuối tự chất thích hợp cuả ACE Đầu C cuối phải giữ chặt điện tích dương kìm hãm Đại học Bách khoa Hà Nội Bùi Thị Hồng Phương Luận văn Thạc sỹ Khoa học Chuyên ngành: Công nghƯ sinh häc hai vị trí hoạt động Zn2+[4] Hình dạng liên kết chất ACE củ lạc Hai đầu (buồng) phồng to nối vùng hẹp nhỏ Hai đầu khơng kích thước chất angioteinsin I liên kết với ACE Peptit tiểu phần N liên kết với đầu lớn, dipeptit tiểu phần C kết khối lại đầu nhỏ Ion Zn định vị vị trí hẹp nối hai đầu ACE Những mạch ức chế bị trói buộc vùng hẹp Vỏ lạc có cấu trúc đặc thù cho peptit nhỏ Kích thước buồng không đủ lớn cho peptit dài hay protein hình cầu.(Hình 3) Hình Hình dạng vỏ lạc túi tích cực ACE ACE thuộc thể xơma: có trọng lượng phân tử 170 kDa tìm thấy bề mặt phổi, thận, ruột, thai, đám rối tràng mạch ACE thuộc thể xơma có vai trị điều khiển áp suất máu cấu trúc, chức thận, enzim chứa vị trí hoạt động cộng hợp vùng vùng cacbon nitơ, vùng gồm có kiểu gắn kẽm đặc thù His-Glu-X-X-His tâm hoạt động Hai Histidin cung cấp cho số ligand kết hợp kẽm nhóm cacboxyl glutamat tác nhân cung cấp sở phản ứng xúc tác ACE tế bào sinh dục: có trọng lượng phân tử 100 kDa có phận sinh dục, tương ứng với vùng cacbon ACE thuộc thể xôma chứa tâm hoạt động kiểu gắn kẽm [61] ACE sinh dục có vai trị chủ yếu sinh sản Đại học Bách khoa Hà Nội Bùi Thị Hồng Phương Luận văn Thạc sỹ Khoa học Chuyên ngành: Công nghƯ sinh häc ACE tương đồng: chứa vị trí hoạt động có khả phân cắt angiotensin I angiotensin II không thủy phân bradykinin Cấu trúc không gian ACE: ACE cố định màng huyết tương nhờ khu vực màng vận chuyển cacbon tận định hướng theo cách mà vị trí xúc tác đặt lộ bề mặt bên ngồi tế bào [Hình 4] Hình Hình Cấu trúc không gian enzim chuyển angiotensin 1.1.2.3 Cơ chế thuỷ phân peptit enzim chuyển angiotensin Cơ chế thủy phân peptit ACE chưa hiểu cách rõ ràng Nó đề xướng chế tương tự chế thủy phân thermolysin, chúng có cấu trúc giống trình tự chúng khác Thermolysin endopeptidaza tế bào chịu nhiệt, liên kết peptit bên hydrolyze đặc biệt cạnh imino đầu kị nước Thermolysin cịn kẽm peptidaza chứa trình tự HEXXH Vài chế đề xướng cho thermolysin Hình cho thấy chế hoạt động Thermolysin giống chế ACE Ion kẽm nhóm penta- kết hợp ba tiểu phần lại, nhóm carboxylate phân tử nước chất ức chế Nước nucleophile kích hoạt Ion Zn E384 384, ngun tử hyđrơ đến nhóm imino, nhóm OH cơng nhóm carbonyl Điều đặc biệt ca c ch ny l nú Đại học Bách khoa Hà Nội Bùi Thị Hồng Phương Luận văn Thạc sỹ Khoa học No Chuyên ngành: Công nghệ sinh học pH Peptit (mg/ml) Hoạt tính ACEI% 0.451 56.2 0.474 61.5 0.582 67.4 0.479 72.6 0.395 85.7 0.582 87.1 3.3.3 Độ bền theo thời gian Sau xác định độ bền pH, nhiệt độ peptit tiến hành nghiên cứu tiếp ảnh hưởng thời gian Dịch whey có chứa peptit lấy vào ống hafs ống 10ml Sau khoảng thời gian định tuần lấy mẫu kiểm tra lần sau xác định hoạt tính ACEI hàm lượng peptit Kết nghiên cứu thể bảng sau: Bảng 3.7 No Thời Peptit (mg/ml) Hoạt tính ACEI% gian tuần 0,439 86,2 tuần 0,482 88,1 tuần 0,471 85,9 tuần 0,485 86,4 tuần 0,489 88,9 tuần 0,491 85,5 tun 0,481 86,8 Đại học Bách khoa Hà Nội Bùi Thị Hồng Phương 72 Luận văn Thạc sỹ Khoa học Chuyên ngành: Công nghệ sinh học Nhỡn vào bảng ta thấy độ bền peptit hoạt tính ACEI% khơng thay đổi khoảng tháng 3.4 Nghiên cứu tạo sản phẩm thực phẩm chức giàu peptit ức chế enzim chuyển angiotensin từ nguồn protein sữa bò 3.4.1Nghiên cứu lựa chọn chất mang Dịch whey có chứa peptit trộn với phụ gia khác để tạo nên có tác dụng làm bền sản phẩm cố định sản phẩm phụ gia lựa chọn matodextrin cyclodextrin chat đwocj chấp nhận dung dựơc học Số liệu từ bảng 3.8 cho thấy nồng độACEI thu cao hiệu suất thu hồi Bảng 3.8: lựa chọn chất mang tạo sản phẩm No Chất mang Hiệu suất thu Hoạt tính ACEI% phối trộn hồi (%) maltodextrin 92 89,3 cyclodextrin 80 80,5 3.4.2 Lựa chon tỷ lệ phối trộn chất mang Sau lựa chọn chất mang tiến hành nghiên cứu tiếp xem chọn lựa chất mang với tỉ lệ để thu hiệu hoạt tính ACEI cao bước đầu lựa chọn với tỷ lệ 7,5: 10; 12; 14; 15; 18% chất mang đem sấy phun nhiệt độ đầu vào 1400C, lưu lượng 1,4 lít /giờ, nhiệt độ đầu sản phẩm 800C, nhiệt độ tâm sấy 1800C sau sấy phun sản phẩm thu màu trắng sữa, mùi thơm Số liệu từ bảng 3.8 cho thấy với nồng độ chất mang l 10% l tt hn c Đại học Bách khoa Hà Nội Bùi Thị Hồng Phương 73 Luận văn Thạc sỹ Khoa học No Chuyên ngành: Công nghệ sinh häc Nồng độ Peptit (mg/ml) Hoạt tính ACEI% chất mang phối trộn 7.5% 0,519 81,9 10% 0,542 92,8 12,5% 0,531 90,1 15% 0,469 87,4 18% 0,451 86,2 Kiểm tra chất lượng, vệ sinh an toàn thực phẩm sản phẩm chứa ACEIs Sản phẩm bột sau sấy phun đem kiểm tra phân tích thành phần, độc tốtại Viện kiểm nghiệm - Bộ Y tế kết trình bày bảng 3.9 cho thấy sản phẩm sử dụng ứng dụng làm thuốc Bảng 3.9 Kết kiểm tra mu bt sa cú cha ACEIs Đại học Bách khoa Hà Nội Bùi Thị Hồng Phương 74 Luận văn Thạc sỹ Khoa học Chuyên ngành: Công nghệ sinh học STT Chỉ tiêu phân tích Đơn vị tính Kết Độ ẩm % Gluxit % 15 Lipid % Protein % 38,7 Kết phân tích kiểm tra tiêu vi sinh Đếm số lượng vi sinh vật Tiến hành thử nghiệm theo phương pháp đếm trực tiếp đĩa thạch Bảng 3.10 Kết phân tích tiêu vi sinh- đếm số lượng vi sinh vật Môi trường Vi khuÈn hiÕu khÝ Vi nÊm MT Thạch thường MT Sabouraud Độ PL Đĩa 10-1 10-2 Nhiều Nhiều Đĩa Nhiều Nhiều Kếtquả 10-3 10-1 10-2 Khơng có C«ng thøc tÝnh SL VSV 10-3