nghiên cứu ứng dụng enzym protease để tạo sản phẩm thuỷ phân nấm men

Tuy nhiên ở Việt Nam hiện nay cácnhà máy sản xuất bia vẫn chưa ứng dụng men bia thải ra ngoài một cáchhiệu quả, men thải ra từ các nhà máy bia được sử dụng chủ yếu làm thức ănchăn nuôi,

Luận văn Nghiên cứu ứng dụng enzym protease để tạo sản phẩm thuỷ

phân nấm men

LỜI CẢM ƠN

Em xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới cô giáo – Tiến Sỹ Quản Lê

Hà - Người đã trực tiếp hướng dẫn và dìu dắt em trong suốt quá trình thựchiện đề tài

Em xin chân thành cảm ơn các thầy cô giáo trong viện Công nghệ sinhhọc – Công nghệ thực phẩm, các cán bộ phòng thí nghiệm Vi sinh đã tạođiều kiện thuận lợi và giúp đỡ em tiến hành thí nghiệm và hoàn thành đềtài

Em xin chân thành cảm ơn các cán bộ phòng thí nghiệm Hoá sinh đã

hỗ trợ em thực hiện một số thí nghiệm trong thời gian triển khai đề tài

Em xin chân thành cảm ơn sự động viên, chia sẻ, giúp đỡ của gia đình,bạn bè trong suốt thời gian vừa qua

Hà Nội, ngày 29 tháng 05 năm 2008

Sinh viên

Trịnh thị Thuỳ

DANH MỤC BẢNG BIỂU, HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ

Hình 1.1 Hình dạng tế bào nấm men Saccharomyces cerevisiae

Hình 1.2 Cấu tạo tế bào nấm men Saccharomyces

Bảng 1.1 Ảnh hưởng của NaCl đến sự phân bố độ ẩm của nấm

bảng 1.2 Thành phần của nấm men trích ly sản xuất bằng phương pháp thuỷ phân

Bảng 3.1 Kết quả đo độ ẩm

Bảng 3.2 Ảnh hưởng của nồng độ flavourzyme đến khả năng thuỷ phân protein nấm men

Bảng 3.3 Ảnh hưỏng của nhiệt độ đến khả năng thuỷ phân protein nấm men bằng chế phẩm Flavourzyme

Bảng 3.4 Ảnh hưởng của xử lý tế bào bằng chế phẩm enzym cereflo đến khả năng thuỷ phân protein nấm men

Bảng 3.5 Ảnh hưởng của quá trình xử lý nhiệt tế bào đến khả năng thuỷ phân protein nấm men

Bảng 3.6 Ảnh hưởng của nhiệt độ đến khả năng thuỷ phân protein nấm men bằng chế phẩm neutrase 0.8L

Bảng 3.7 Ảnh hưởng của nồng độ neutrase đến khả năng thuỷ phân

protein nấm men

Bảng 3.8 So sánh khả năng thuỷ phân của flavourzyme, neutrase, phương pháp tự phân nấm men

MỤC LỤC

MỞ ĐẦU

Ngành công nghệ sản xuất bia ở Việt Nam ngày càng phát triển Sảnlượng bia ở Việt Nam đã tăng từ 1,29 tỷ lít vào năm 2003; 1,37 tỷ lít năm2004; 1,5 tỷ lít năm 2005 và đạt 1,7 tỷ lít vào năm 2006 Nấm men bia làmột tác nhân quan trọng không thể thiếu tham gia trực tiếp vào quá trìnhlên men bia Sau khi lên men, một lượng lớn nấm men thải ra Trung bình

cứ sản xuất ra được 100 lít bia sẽ thải ra môi trường 2 lít men có thuỷ phần88% Men bia có hàm lượng protein cao trung bình khoảng 50% (tính theochất khô), trong thành phần protein có đầy đủ các acid amin, đặc biệt là cácacid amin không thay thế Ngoài ra, nó còn chứa các chất khoáng, giàuvitamin nhóm B, nhóm D và các chất kích thích sinh trưởng Trong 1 gchất khô của nấm men chứa 300 μg vitamin B1, 40 μg vitamin B2, 50μgvitamin B6, 600μg vitamin PP, 80μg axit pantoteic, 25μg axit folic, 1μgbiotin và 500μg inozit Trên thế giới, nấm men bia được quan tâm nghiêncứu tận dụng với nhiều mục đích khác nhau như làm thực phẩm, làm nguồnthuốc bổ giàu axit amin và vitamin Tuy nhiên ở Việt Nam hiện nay cácnhà máy sản xuất bia vẫn chưa ứng dụng men bia thải ra ngoài một cáchhiệu quả, men thải ra từ các nhà máy bia được sử dụng chủ yếu làm thức ănchăn nuôi, khả năng khai thác các thành phần có giá trị sinh học trong menbia để tạo ra các sản phẩm ứng dụng cho con người còn rất hạn chế Hơnnữa, nếu không được sử dụng triệt để thì nguồn bã nấm men này còn là mộttrong những nguyên nhân gây ô nhiễm môi trường Xuất phát từ nhữngđiều đó cùng với sự gợi ý của giáo viên hướng dẫn, để góp phần tạo sảnphẩm có giá trị dinh dưỡng cho người bằng nguồn tận thu nấm men bia, emtiến hành nghiên cứu đề tài “Nghiên cứu ứng dụng enzym protease để tạosản phẩm thuỷ phân nấm men”

Nội dung chính bao gồm:

- Nghiên cứu tìm điều kiện thích hợp để thuỷ phân nấm men bia bằngcác chế phẩm enzim Neutrase và Flavourzyme (điều kiện nhiệt độ, nồng độenzim, thời gian) và so sánh với quá trình tự phân nấm men

- Nghiên cứu xử lý tế bào bằng chế phẩm enzym cereflo

- Nghiên cứu ảnh hưởng của quá trình xử lý nhiệt tế bào đến khả năngthuỷ phân protein nấm men của enzym

- Định tính một số thành phần axit amin quan trọng trong sản phẩmthuỷ phân.

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN

1.1 Nấm men Saccharomyces và ứng dụng

1.1.1 Giới thiệu về Saccharomyces

Saccharomyces thuộc họ Saccharomycetaceae, lớp Ascomycetes,

ngành nấm Là vi sinh vật có cấu tạo đơn bào, không di động, có khả năngsinh sản nhanh, sinh sản chủ yếu bằng phương pháp nảy chồi Sinh khốicủa chúng rất giàu protein, vitamin và lipit Tế bào nấm men thuộc loạiEucaryot (nhân thật), có khả năng hô hấp yếm khí tuỳ tiện

Chúng phân bố rất rộng rãi trong thiên nhiên nhất là trong đất, có thểnói đất là môi trường tự nhiên để giữ giống nấm men và đặc biệt là trên bềmặt của rất nhiều loại lá cây, các loại quả hay các loại cây lương thực thựcphẩm khác

Nấm men có khả năng lên men các loại đường để tạo thành rượu trongđiều kiện yếm khí, còn trong điều kiện hiếu khí thì chúng tạo thành sinhkhối tế bào Vì thế, nấm men được ứng dụng rộng rãi trong công nghiệpthực phẩm để sản xuất rượu, bia, nước giải khát lên men, sản xuất menbánh mì, sản xuất protein sinh khối, tạo hương nước chấm, sản xuất chấtbéo,… [18], [23], [25], [26], [34]

1.1.1.1 Hình dạng và kích thước tế bào nấm men

Nấm men thuộc các loài khác nhau thường có hình dạng khác nhau.Ngay trong cùng một loài, hình dạng tế bào cũng thay đổi tuỳ thuộc vàođiều kiện sống và tuổi đời Trong môi trường đặc biệt thì nấm men có hìnhdạng rất ổn định Đa số nấm men có hình ovan, hình bầu dục, hình tròn

Nấm men có hình tròn, hình trứng như Saccharomyces cerevisiae, hình elip như Saccharomyces ellipsoideus, hình quả chanh như Saccharomyces apiculatus, đôi khi có hình chai như Saccharomyces ludwigii.

So với các vi sinh vật khác (đối với vi khuẩn chẳng hạn), nấm men cókích thước tương đối lớn Một số nấm men được sử dụng trong công nghệthực phẩm thường có kích thước khoảng 3 ÷ 5 × 5 ÷ 10µm [34] Kíchthước này cũng thay đổi nhiều tuỳ thuộc vào điều kiện môi trường sống,…

Tế bào nấm men trong tự nhiên có thể đứng riêng lẻ hoặc sau khi nảy chồivẫn dính vào nhau tạo thành chuỗi.

Hình 1.1 Hình dạng tế bào nấm men Saccharomyces cerevisiae

Hiện nay trên Thế Giới và ở Việt Nam đang sử dụng hai loại nấm men

bia, đó là nấm men nổi (Saccharomyces cerevisiae) và nấm men chìm (Saccharomyces carlbergensis), là tế bào hình cầu hay hình trứng, có kích

thước 2.5-10 µm chiều rộng và 4.5-21 µm chiều dài

1.1.1.2 Cấu tạo tế bào nấm men

Nấm men là sinh vật đơn bào, hiển vi, tế bào cơ bản giống như ở độngvật, thực vật So sánh cấu tạo tế bào nấm men với vi khuẩn ta thấy có sự tiếnhoá nhảy vọt từ nhân sơ đến nhân chuẩn Cùng với sự tiến hoá về nhân và cơchế phân chia nhân (nhân có màng, có các thể nhiễm sắc, phân bào có tơ,…),

ở cơ thể nhân chuẩn xuất hiện nhiều thể không thấy ở thể nhân sơ như: Ti thể,lục lạp,… [26]

Hình 1.2 Cấu tạo tế bào nấm men Saccharomyces

Tế bào nấm men có thành phần và cấu tạo phức tạp Trong tế bào cócác cấu tử tiểu thể và có thể chia thành: Các cơ quan nội bào hay cơ quan

tử của tế bào và các chất chứa trong tế bào hay các thể vùi của tế bào(inclusion)

Thành tế bào

Thành tế bào dày khoảng 25 nm và chiếm khoảng 25-30 % khối lượngkhô tế bào, là lớp vỏ bao quanh tế bào nấm men, tạo hình dáng tế bào.Thành tế bào gồm 3 lớp: Lớp trong cùng cấu tạo từ β-glucan không tantrong kiềm, lớp giữa cấu tạo từ β-glucan hoà tan, lớp ngoài cùng là mannanphotphoryl Giữa hai lớp màng phía ngoài có chứa các enzym invertaza,photphataza axit, β-glucosidaza, proteaza,…Thành tế bào chứa khoảng 15kitin cần thiết cho sẹo nảy chồi

Glucan (chủ yếu) và mannan chiếm tới 90% chất khô của vỏ tế bào.Glucan là một polyme phức tạp, có cấu tạo phân nhánh từ các tiểu phần làD-glucoza, phân nhánh có liên kết β-1,6 và β-1,3 Glucan là thành phầnchính cấu tạo nên vỏ tế bào, nếu thành phần này bị phá hỏng thì tế bào bị phá

vỡ hoàn toàn Mannan là polyme phân nhánh của đường D-mannanoza, mỗiphân tử thường chứa từ 200-400 gốc mannanoza, có phân tử lượng là5.9×104, không phải là thành phần quyết định của vỏ tế bào Nếu bỏ phầnmannan hình dáng tế bào không bị biến đổi

Thành tế bào nấm men chứa 6-7 % protein, phần protein của nó thườngliên kết vững chắc với phần hidratcacbon và tạo thành các phức chất giàu lưuhuỳnh Ngoài protein, thành tế bào nấm men còn chứa lipit, đường khử, nitơ,các axitamin, và các chất khoáng,…Thành phần hoá học của thành tế bào nấmmen có thể thay đổi phụ thuộc vào chủng, điều kiện môi trường sống và tuổiđời [26], [34].

Màng nguyên sinh chất: Màng nguyên sinh chất là một lớp màng rất

mỏng, dày không quá 0.1nm, dính chặt với tế bào chất, nằm sát vách tếbào Màng nguyên sinh chất có cấu tạo 3 lớp: Lớp giữa là lipid vàphotpholipid, hai lớp còn lại là protein Hai lớp này đóng vai trò quan trọngtrong quá trình vận chuyển các chất hoà tan và hoạt động của các enzym

Nguyên sinh chất: Nguyên sinh chất của tế bào nấm men là một hệ thống

keo cấu tạo bởi protit, lipit, lipoit, polysacarit, muối khoáng, nước Nguyênsinh chất nằm ngay bên dưới thành tế bào, dày khoảng 80A0, có độ nhớtcao (gấp 800 lần độ nhớt của nước) và chứa tất cả các cấu trúc cơ bản của

tế bào

Nhân tế bào: Khác với vi khuẩn, tế bào nấm men có nhân thật Mỗi tế bào

nấm men có một nhân hình tròn hoặc hình bầu dục, được bao bọc bởi mộtmàng nhân Trong nhân là nhân con Hình dáng và kích thước của nhân cóthể thay đổi phụ thuộc vào tuổi và trạng thái sinh lý tế bào Trong các tếbào nấm men đang hoạt động mạnh, nhân có kích thước khá lớn Cũng nhưcác sinh vật khác, nhân tế bào nấm men có cấu tạo bởi protein, AND, ARN

và nhiều enzym Nhân quyết định tính di truyền và tham gia điều khiển mọihoạt động sống của tế bào Trong nhân có chứa nhiễm sắc thể, có quá trìnhgiảm phân khi sinh sản và đôi khi cũng có thể phân cắt theo kiểu trực phân

Không bào: Không bào có tính thẩm thấu cao, là nơi tích luỹ các sản phẩm

trao đổi chất Glycogen có thể chiếm tới 12 % chất khô của tế bào.Trehaloza là một hydratcacbon dự trữ, có thể chiếm tới 16 % lượng chấtkhô trong tế bào Chính không bào là nơi chứa axit amin tự do Ngoài rakhông bào còn chứa purin, ortophotphat polyme hoá và các enzym thuỷphân

Ty thể: Ty thể nấm men chứa AND, ARN, ARN polymeraza, các enzym

hô hấp, chúng suy biến thành các tiền ty thể (promitochondries) trong quátrình lên men khi môi trường chứa hơn 5 % glucoza Màng ty thể có chứalipid, photpholipid, ergosterol

1.1.1.3 Thành phần hoá học của tế bào nấm men

Thành phần hoá học của tế bào nấm men tuỳ thuộc điều kiện môitrường nuôi, thành phần chất dinh dưỡng, tình trạng sinh lý của tế bào.Trong tế bào có chứa hầu hết các chất cần thiết như protein, glucid,lipid, các enzym, các axit nucleic, chất khoáng [26]

Cũng như các cơ thể sống khác, thành phần cơ bản và chủ yếu của tếbào nấm men là nước (khoảng 70-75 % khối lượng chung) Thành phầnsinh khối khô của nấm men như sau (%):

a Nước trong tế bào nấm men

Nấm men ép có chứa 70 – 75 % là nước, và 25 – 30 % còn lại là chấtkhô

Nước bao gồm phần nước ngoài tế bào (ngoại bào) là phần nước nằmtrong khoảng trống giữa tế bào, và nước trong tế bào (nội bào) là phầnnước nằm trong tế bào chất của tế bào Lượng nước khác nhau còn tuỳchủng nấm men, kỹ thuật nuôi và phương pháp thu tế bào Ví dụ: khi nuôitrong môi trường có NaCl, lượng nước trong tế bào giảm, điều này thể hiện

ở bảng 1.1

Bảng 1.1 Ảnh hưởng của NaCl đến sự phân bố độ ẩm của nấm men

Phương pháp nuôi Phân bố trong nấm

men, %

Phân bố độ ẩm trong

men ép

lượng chấtkhô độ ẩm ngoại bào nội bào

Thêm NaCl vào môi

Thay đổi độ ẩm của nấm men sẽ kéo theo thay đổi tỉ lệ nước nội bào

và nước ngoại bào Khi loại bỏ 85 % lượng nước từ nấm men ở nhiệt độdưới 500C hầu như không ảnh hưởng đến hoạt động của chúng [25]

b Chất khô trong tế bào nấm men

Chất khô của tế bào nấm men gồm có (tính theo % khối lượng nấm menép): 23 – 28 là chất hữu cơ và 5 – 7 là tro Chất hữu cơ ở đây gồm có:Protein 13-14%, glycogen 6 – 8 %, xenluloza 1.8 – 2 %, Chất béo 0.5 – 2

%

Protein

Trong các chất hữu cơ của tế bào nấm men thì protein là thành phần cógiá trị nhất Thành phần protein nấm men phụ thuộc vào loài giống, thànhphần môi trường và điều kiện nuôi cấy [26], [38]

Nấm men có hàm lượng protein nguyên liệu trung bình khoảng 50 %(tính theo chất khô), trong đó có khoảng 45 % protein hoàn chỉnh Các dẫnxuất của axit nucleic như bazơ purin và pyrimidin, các axit amin tự do đềuđược coi là protein nguyên liệu Trong thành phần protein có đầy đủ các axitamin và đặc biệt là axit amin không thay thế Hàm lượng các axit amin trong

tế bào nấm men ở giai đoạn cuối lên men như sau (mg/g men khô): Lizin –7.5; arginin – 1.3; histidin – 11.0; axit asparaginic – 2.9; serin – 2.7; glyxin –1.5; axit glutamic – 3.9; alanin – 8.7; prolin – 2.0; tirozin – 2.8; metionin –2.9; lơxin – 5.4; sistein - vết,… [26]

Vitamin

Nấm men có thể tổng hợp được tất cả các vitamin trong chừng mựcnào đó (nhiều hoặc ít), ngoại trừ biotin (vitamin H) Thực tế cho thấy, tếbào nấm men rất giàu vitamin, nhất là vitamin nhóm B và tiền vitamin D2

là ergosterol

Hàm lượng vitamin trong tế bào nấm men như sau (μg/g chất khô):Inozit 6000 – 15000; biotin (vitamin H) 0.6 ÷ 0.7; riboflavin (vitamin B2)

30 ÷ 60; axit pantotenic (vitamin B3) 2.0 ÷ 19.0; thiamin (vitamin B1) 24 ÷50; pyridoxine (vitamin B6) 14 ÷ 39; nicotinamit (vitamin B5) 370 ÷ 750.

Chất béo: Chất béo trong tế bào nấm men có các axit oleic, linoelic,

palmitic Trong chất béo có tới 30 – 40 % phosphatit

Tro: Trong tro nấm men thấy có các oxyt sau đây (%): P2O5 25 ÷ 60; CaO – 1 ÷8; MgO – 4 ÷ 6; Na2O – 0.5 ÷ 2; SO3 - 0.5 ÷ 6; SiO2 – 1 ÷ 2; Fe2O3 – 0.05 ÷ 0.7

Các nguyên tố vi lượng: Chúng tham gia vào thành phần của nhiều enzym,

vitamin và nhiều hợp chất khác nữa trong quá trình sinh tổng hợp các sảnphẩm của tế bào Các nguyên tố vi lượng (mg/kg): Fe 90 ÷ 350, Cu – 20 ÷

135, Zn – 100 ÷ 160, Mo – 15 ÷ 65

Glycogen: Là những chất dự trữ nguồn cacbon (hydratcacbon của nấm men).

Khi trong môi trường thiếu nguồn cacbon dinh dưỡng, glycogen sẽ được huyđộng tham gia vào quá trình tiêu hoá của nấm men và giải phóng ra nước, khícacbonic

Trehaloza: Hợp chất thường kết hợp với hàng loạt hạt glycogen làm nguồn

dự trữ cacbon rất cơ động Ở cùng một giá trị pH, hàm lượng Trehalozatăng thì nitơ giảm

Như vậy, protein là thành phần chủ yếu trong chất khô tế bào nấmmen Nếu ta tận dụng thuỷ phân nguồn thứ phẩm này thải ra từ các nhàmáy bia sẽ thu được dịch thuỷ phân protein nấm men có giá trị dinh dưỡngrất cao, với các thành phần axit amin không thay thế như lizin, metionin,…

bổ sung vào thực phẩm thiếu hụt các axit amin này (như các protein cónguồn gốc thực vật,…) và tạo ra nhiều sản phẩm có giá trị khác

1.1.2 Các ứng dụng của nấm men trong ngành công nghiệp thực phẩm

1.1.2.1 Ứng dụng trong sản xuất các đồ uống lên men

Lên men là một trong những kỹ thuật lâu đời nhất trong chế biến thựcphẩm và mang tầm quan trọng kinh tế to lớn Các sản phẩm lên men phổbiến là rượu, bia, nước giải khát,…Các sản phẩm này ngày càng nhiều vàdường như chưa bao giờ đáp ứng đủ nhu cầu của con người

Nấm men đóng vai trò là tác nhân lên men, nó hấp thụ các hydratcacbonthấp phân tử và các chất dinh dưỡng khác trong môi trường vào tế bào, rồithực hiện quá trình trao đổi chất trong điều kiện kỵ khí qua một chuỗi các biến

đổi phức tạp tạo thành sản phẩm mà chủ yếu là rượu etylic, CO2 và một số sảnphẩm phụ khác

Nấm men thường được sử dụng trong quá trình lên men rượu là

Saccharomyces.

1.1.2.2 Ứng dụng để tạo sản phẩm thuỷ phân nấm men

Men được hoà với nước theo tỉ lệ thích hợp, có thể bổ sung enzymthuỷ phân hoặc không, giữ ở 50 – 550C, đây là nhiệt độ thích hợp choenzym protease có sẵn trong tế bào nấm men và enzym protease bổ sungvào hoạt động thuỷ phân protein thành các đạm thấp phân tử, đồng thời giảiphóng ra nhiều thành phần có giá trị khác Dịch thuỷ phân chứa rất nhiềuaxit amin đặc biệt là các axit amin không thay thế, peptid, vitamin nhóm B,các hydratcacbon,…

bảng 1.2 Thành phần của nấm men trích ly sản xuất bằng phương

pháp thuỷ phân [27]

Các axit amin (% so với khối lượng ban đầu) Các vitamin

(mg/kg, ppm)

Alanin 3.4 Isoleucin 2.0 prolin 1.9

Arginin 2.1 Leucin 2.9 Serin 1.6 Thiamin

20-30Asparagi

n

3.8 Lizin 3.2 Treonin 1.9 Riboflavin

50-70Cistin 0.3 Methionin 0.5 Tirozin 0.8 Piridoxin 25-

35Glycin 1.6 Ornithin 0.3 Histidin 0.9 Niacinamd 600Axit

trầm trọng hơn là đói protein nói chung Vì vậy, việc tận dụng nguồnprotein nấm men để tạo ra dịch thuỷ phân có giá trị dinh dưỡng và giá trịsinh học cao mà lại an toàn cho người và gia súc là rất cần thiết.

Thu nhận enzym superoxit dismutaza: Sử dụng công nghệ nghiền tế

bào Saccharomyces cerevisiae kết hợp với xử lý kiềm [6].

Thu nhận chế phẩm invertase: Tự phân nấm men bia ở 500C, pH 5.5,thời gian 50 giờ Khi đó hoạt tính invertase thu được là 120.9 U/g chất khônấm men [23]

1.1.2.6 Sử dụng sinh khối nấm men làm thức ăn chăn nuôi

Trong hoàn cảnh nhiều nước trên thế giới (chủ yếu ở châu Phi và châuÁ) còn bị đói protein trầm trọng, các nước châu Âu hằng năm vẫn phảinhập đậu tương cho chăn nuôi, thì protein vi sinh vật là một nguồn hấp dẫn.Sinh khối nấm men làm nguồn protein – vitamin bổ sung vào thức ăn

chăn nuôi, đây là các tế bào của các giống Saccharomyces, Candida,… đã

sấy khô, đã chết, không còn hoạt tính lên men rượu Protein vi sinh vật đặcbiệt giàu lizin, đây là một lợi thế khi bổ sung vào thức ăn chăn nuôi Men

bia khô có thành phần protein 44.5 %, chất béo 1.2 %, xơ 1.3 %, nước 10.9

%

Cho thức ăn tinh ngô, cám, khoai vào thùng, chum, pha nước vừa đủsền sệt Trộn 2 – 4 % bánh men đã bóp vụn, bổ sung thêm ure 200 g và lân150g/100kg bột, khuấy đều, đậy lại, ủ ấm và cứ 6-8 giờ đảo 1 lần Sau vàingày, men sẽ mọc trắng, có mùi thơm Thức ăn được ủ men bia làm tăngprotein lên 9-14 % Thức ăn ủ men trộn vào khẩu phần của lợn con 40 %,lợn choai 50-60 %, lợn nái chửa hai tháng cuối và lợn nái mới đẻkhông trộn thức ăn ủ men này vì có thể thiếu khoáng, nhất là canxi cho cấutạo phát triển xương của thai và lợn con [18]

1.1.2.7 Ứng dụng nấm men tạo các sản phẩm chữa bệnh

Men bia sống thường được sử dụng làm thuốc trong các trường hợp cơthể mệt mỏi, kiệt sức, thiếu máu, kém ăn, chậm tăng trưởng, stress, rối loạnthần kinh Khi kết hợp với selen, nó tạo thành phân tử selen hữu cơ có tácdụng ra tăng hiệu năng chống các gốc tự do, làm chậm quá trình lão hoá và

là yếu tố quan trọng trong nhóm các chất chống oxy hoá cần thiết cho sứckhoẻ

Men bia sống có tác dụng chống nhiễm trùng bằng cách tăng cường hệthống miễn dịch Các loại thuốc uống chứa men bia thường kết hợp menbia 400 g với men bia selen – 75 mg, silice 25 mg, giúp tăng cường sứckhoẻ, chống nhiễm trùng (trong các trường hợp bị cảm, ho, nóng sốt) Menbia còn được sử dụng làm thực phẩm bổ sung cho phụ nữ mang thai và chocon bú

Men bia sống dùng làm thuốc thường có 20 tỷ tế bào sốngSaccharomyces cerevisiae/1g, chứa trong 2 viên nang với hàm lượng 16axit amin, 17 vitamin, 14 muối khoáng Nó được xem là loại thực phẩm cógiá trị dinh dưỡng cao và là vectơ dẫn đường cho sự hấp thu các loạivitamin khác vào cơ thể [14]

Chế phẩm YeaSacc 1026 bao gồm các tế bào nấm men của dòng men

Saccharomyces cerevisiae 1026, là một dạng men sống dùng để trộn vào

thức ăn Có tác dụng kích thích tăng trưởng và hoạt động của các loại vikhuẩn có lợi cho đường ruột [1]

1.1.3 Ứng dụng của dịch thuỷ phân nấm men

1.1.3.1 Sử dụng làm chất điều vị

Sử dụng một lượng nhỏ dịch thuỷ phân nấm men vào một số thực phẩmnhư súp, nước xốt, trứng, snack, bánh quy,…sẽ góp phần tích cực vào việctăng giá trị cảm quan và giá trị dinh dưỡng cho sản phẩm Đây là kết quả củacác axit amin và các peptide phân tử lượng thấp trong dịch thuỷ phân nấmmen.

1.1.3.2 Sản xuất một số sản phẩm truyền thống

Dịch thuỷ phân nấm men giàu axit amin đặc biệt là các axit amin khôngthay thế, vitamin nhóm B, khoáng,… được sử dụng để tạo rất nhiều sản phẩmthơm ngon, bổ dưỡng như vegemite, marmite, oxo, cenovis, recipe,…

1) MARMITE: Sản phẩm này có xuất xứ từ nước Anh, thành phần chính

của Marmite là YE Sản phẩm dính, có dạng sệt, màu nâu, vị mạnh, cực kỳmặn, có vị thịt Mùi vị của nó được so sánh với nước tương (xì dầu) Ngoài ra,marmite còn có một sản phẩm tương tự ở New Zealand, Úc

Marmite là món ăn truyền thống ở Anh, được ăn với bánh mỳ, bánh bíchquy Các nhà hàng Trung Quốc, Singapore sử dụng marmite trong các mónxào thịt lợn để làm tăng vị ngọt cho thức ăn Nó cũng được cho vào cháo yến

để bổ sung hương thơm cho cháo

Hình 1.3 Sản phẩm Marmit

Thông tin dinh dưỡng của Marmite loại 100g được sản xuất ở Anh:

- Năng lượng: 219 kcal - Protein: 38.4 g

- Cacbonhydrat: 19.2 g - Đường: 0.5 g

- Chất béo: 0.1 g - Natri: 4.3g

- Thiamin: 5.8 mg - Riboflavin: 7 mg

- Niacin: 160 mg - Axit folic: 2500µg

- Vitamin B12: 15 μg

2) VEGEMITE: Là sản phẩm được làm từ YE, trông rất mịn, dính Sử

dụng để phết lên bánh sandwich, bánh mì nướng, bánh bích quy,…Sản phẩm

có vị mặn, hơi đắng, có vị mạch nha, gần giống vị canh thang thịt bò.Vegemite được coi là món ăn truyền thống ở Úc, New Zealand Vegemite rấtgiàu vitamin nhóm B

Hình 1.4 Sản phẩm Vegemite

Thông tin dinh dưỡng của vegemite loại 5g:

- Năng lượng 9.76 kcal - Protein: 1.3g

1.1.3.3 Sử dụng làm môi trường vi sinh vật

Chiết lấy phần trong từ dịch thuỷ phân nấm men, bỏ cặn, trung hoà vàđun sôi Từ dịch men thuỷ phân ta có thể pha thành môi trường thạch -nước men - đường (nước men được thêm 0.5 % muối ăn, 1- 2 % glucoza và

2 % thạch) pH 6,8 Thanh trùng ở 0.5at trong 30 phút Có thể thay glucozabằng 5 % sacaroza, pH = 6.0 – 6.5 [26]

Dịch men thuỷ phân có thể cô đặc thành cao men, đem dùng dần đểpha môi trường với tư cách là nguồn nitơ hữu cơ (peptone, peptid, axitamin, nucleotide,…) và nguồn vitamin đặc biệt là vitamin nhóm B

Thành phần môi trường để nuôi cấy nấm mốc Aspergillus oryzae sinh

tổng hợp protease là môi trường lỏng có các thành phần như sau: dextrin2.5 g, bột đậu nành 5 g, saccharose 3 g, Na2CO3 0.9 g, NaHCO3 0.3 g,

Na3PO4 0.3 g, chất chiết nấm men 0.1 g, đong vừa đủ 100ml nước Môitrường này thích hợp cho nấm mốc phát triển và sinh tổng hợp protease[13]

1.1.3.4 Bổ sung vào quá trình nấu bia

Chất chiết nấm men được xem là nguồn nitơ tốt nhất bổ sung vào dịchnha trong sản xuất bia với kỹ thuật lên men nồng độ cao đối với dịch nha

220 pt, hàm lượng chất chiết nấm men cần bổ sung là 40 mg/lit Làm giảmthời gian lên men, nồng độ cồn trong bia non tăng lên [22]

1.1.3.5 Sử dụng tạo ra một số sản phẩm chữa bệnh

Thuốc ống uống BIOFIL: Đây là sản phẩm của công ty cổ phần Dược

- Vật tư Y tế Thanh Hoá, đi từ nguyên liệu sinh khối nấm men bia Qua quátrình lắng lọc tinh chế, thuỷ phân axit kiềm với men đặc hiệu, áp dụng côngnghệ mới tạo sản phẩm ống uống BIOFIL 10 ml đóng hộp 10 ống và hộp

20 ống Là thuốc bổ dưỡng giàu axit amin và vitamin nhóm B Với giá bánbằng 30 % thuốc nước ngoài cùng loại Với mức sản xuất năm 2004, làmlợi cho xã hội và người tiêu dùng 19.500 triệu đồng [29]

Ngoài các thành phần có giá trị trong dịch chiết nấm men như đã nêu ởtrên thì phần bã rắn không bị thuỷ phân bao gồm chủ yếu là thành tế bàocũng có rất nhiều ứng dụng

- β–glucan là hỗn hợp sinh học tự nhiên bao gồm β 1-3, 1- 6 glucan vàmanna oligosaccharide được chiết suất từ thành tế bào nấm men

Saccharomyces cerevisiae β–glucan giúp kích thích hệ thống miễn dịch tự

nhiên, tăng cường hoạt động của các đại thực bào và kích thích tiết nhiều

cytokines (chất hoạt hoá tế bào) nhằm tiêu diệt các mầm bệnh xâm nhấp từbên ngoài Vì vậy, β-glucan đã được ứng dụng để bào chế các loại thuốcchữa vết thương, thuốc chống u bướu

β–glucan giúp giảm hệ số chuyển đổi thức ăn, kích thích tiêu hoá,phòng các bệnh đường ruột, nhiễm trùng do vi khuẩn, virut, làm giảmcholesterol trong máu β–glucan là giải pháp thay thế kháng sinh trongphòng trị bệnh vật nuôi an toàn và hiệu quả β–glucan chịu được nhiệt độ

1200C nên có thể dùng làm thức ăn ép viên [29] Hiện nay, trên thị trường

có một số sản phẩm: BETA CLUCAN 25, BETA GLUCAN 40

Thực phẩm bổ sung B complex (100 viên) 205.700 vnd Mỗi viêncung cấp đầy đủ 7 loại vitamin B từ tự nhiên (B1, B2, B3, B5, B6, axit folic

và B12) cần thiết cho cả phụ nữ và nam giới Tất cả được chiết xuất từ nấmmen.

1.1.3.6 Sử dụng làm thức ăn chăn nuôi

Tuy thành phần của các axit amin trong protein nấm men không cânđối và có giá trị sinh học như axit amin từ protein động vật, nhưng giá trịdinh dưỡng của nó cũng gần giống protein động vật Sử dụng dịch thuỷphân nấm men sẽ góp phần bổ sung các axit amin không thay thế bị thiếuhụt trong thức ăn hàng ngày như lizin, metionin,…Ngoài ra, các vitaminnhóm B, các hydratcacbon, các chất kích thích sinh trưởng,…làm vật nuôilớn rất nhanh Hiện nay, trên thị trường có các sản phẩm của Altech sửdụng trong nuôi thuỷ sản,…

1.2 Tổng quan về protease

1.2.1 Khái quát về protease

Enzym protease là nhóm men thuỷ phân liên kết peptit (-CO-NH-)trong phân tử protein và các cơ chất tương tự

Trong các enzym công nghiệp, enzym thuỷ phân chiếm 75 % vàprotease chiếm khoảng 60 % tổng lượng enzym được tiêu thụ trên thế giới

1.2.1.1 Phân loại protease

Người ta phân loại nhóm enzym này theo nhiều cách khác nhau [8]

- Dựa vào vị trí của liên kết peptit ở nội mạch hay ở đầu mạch thìenzym protease được chia thành 2 nhóm: endopeptidase và exopeptidase

- Dựa vào quá trình thuỷ phân có thể chia thành proteinase vàpeptidase Sơ đồ ước lệ của quá trình thuỷ phân protein có thể biểu diễnnhư sau:

Proteinase peptidase

protein → albumoza → pepton → polypeptit → peptit → axit amin

Proteinase: Là enzym thuỷ phân liên kết peptit ở giữa chuỗi mạch

polypeptit Vì vậy, nó cắt phân tử protit thành những đoạn protein có phân

tử lượng nhỏ hơn (pepton, polypeptit) Enzym này xúc tác cho quá trìnhthuỷ phân liên kết peptit bên trong phân tử protit Hoạt độ tối ưu đạt đượckhi pH = 4.6 – 4.9, nhiệt độ tối ưu là 50 – 600C, nhóm enzym này chỉ bị vô

hoạt khi nhiệt độ lớn hơn 700C Ở 500C, dưới tác dụng của enzym này sảnphẩm tạo thành chủ yếu là các pha thấp phân tử (peptit, polypeptit), còn ở

600C thì sản phẩm chủ yếu thuộc nhóm phân tử lượng trung bình

Peptidase: Là nhóm enzym không ít hơn 2 cấu tử Thuỷ phân liên kết

peptit ở 2 đầu của phân tử protit Đầu tiên tạo thành các dipeptit rồi thànhaxit amin tự do Trong quá trình thủy phân mối liên kết peptit ở đầu aminhoặc đầu cacboxyl sẽ dần dần bị thuỷ phân Các enzym này có tính đặc hiệurất cao Ví dụ: Dipeptidase thì thuỷ phân dipeptit, còn polypeptidase thì thuỷphân polypeptit có từ 3 axit amin trở lên Aminopeptidase chỉ thể hiện hoạtlực xúc tác khi cơ chất có nhóm – NH2 tự do, còn cacboxylpeptidase chỉ hoạtđộng thuỷ phân khi cơ chất có nhóm –COOH tự do Tất cả các peptidasekém bền nhiệt hơn proteinase nhưng lại hoạt động tốt trong môi trườngkiềm Hoạt động tốt nhất ở pH = 7 – 8 và nhiệt độ khoảng 40 – 420C.Trong dung dịch nước, enzym này hoạt động yếu dần khi tăng nhiệt độ lên

500C và biến tính phi thuận nghịch nhanh chóng ở nhiệt độ 600C

- Dựa vào tính chất của môi trường hoạt động có thể chia thành:protease kiềm tính (pH = 8 - 11), protease trung tính (pH = 6.0 – 7.5) vàprotease axit tính (pH < 6.0) Tuy nhiên cách phân loại này chỉ có ý nghĩathực dụng, không thực sự chính xác vì pH tối thích của mỗi enzym còn phụthuộc vào bản chất của cơ chất và nhiều yếu tố khác nữa

- Dựa vào nhóm chức năng ở trung tâm hoạt động có 4 loại: serineprotease, cysteine protease, aspartic protease và metallo protease Đây làcách phân loại phổ biến hiện nay

+ Serine protease: Là những proteinase có nhóm –OH của gốc serintrong trung tâm hoạt động có vai trò đặc biệt quan trọng đối với hoạt độngxúc tác của enzym Enzym thuộc nhóm này thường hoạt động mạnh ở vùngkiềm tính và thể hiện tính đặc hiệu cơ chất tương đối rộng Lớp enzym nàyđược chia thành 2 nhóm nhỏ hơn đó là chymotrypsin và substilisin Nhómchymotrypsin bao gồm các enzym của động vật có vú như: chymotrypsin,trypsin, elastase hay kallikrein Nhóm enzym substilisin gồm các enzymcủa vi khuẩn như substilisin

+ Cysteine protease: Là những proteinase có nhóm – SH trong trungtâm hoạt động Các enzym thuộc nhóm này thường hoạt động mạnh ở pHtrung tính, có tính đặc hiệu rộng và chỉ hoạt động được khi nhóm –SHkhông bị bao vây như papain, bromelain,…

+ Aspartic protease: Là những enzym có chứa nhóm cacboxyl trongtrung tâm hoạt động, thường hoạt động mạnh ở pH trung tính như pepsin,renin, cathepsin,…

+ Metallo protease: Là nhóm enzym được tìm thấy ở vi khuẩn, nấmmốc cũng như các sinh vật bậc cao hơn Các metallo proteinase thườnghoạt động mạnh nhất ở vùng pH trung tính và hoạt độ giảm mạnh dưới tácdụng của EDTA

- Chymotrypsin: Được tìm thấy ở dịch tuỵ Nó đặc hiệu với mối liênkết peptit có các nhóm cacboxyl của các axit amin thơm như phenylalanine,tryrosine hoặc tryptophan

- Pepsin: Là một proteinase axit, hoạt động thích hợp ở pH = 1.3 – 2.2.Thu được từ dịch dạ dày heo Enzym này thuỷ phân mối liên kết peptit giữahai axit amin ưa béo Được sử dụng trong quá trình làm lạnh bia và mục đíchtiêu hoá

- Renin: Là protease giống pepsin được sinh ra ở dạng tiền enzymkhông hoạt động trong ngăn thứ tư của dạ dày bê, và được chuyển thànhdạng renin hoạt động do sự hoạt động của pepsin hoặc do quá trình tự xúctác của chúng Renin làm biến đổi casein thành paracasein đây là chất kếttủa để hình thành vụn sữa đông trong điều kiện có canxi trong môi trường

Do đa số nguồn protease động vật phải thu nhận từ nội tạng, khôngmang lại hiệu quả kinh tế cao nên các nghiên cứu về chúng rất hạn chế sovới protease từ thực vật và vi sinh vật

Protease thực vật được phát hiện muộn hơn protease động vật (bắt đầu

từ cuối thế kỉ 18) Việc sử dụng thực vật làm nguồn protease bị chi phối bởi

nhiều yếu tố như thổ nhưỡng, khí hậu Các protease có trong đu đủ(papain), trong dứa (bromelin), trong các cây sung, si thuộc họ ficus (fixin)

là những protease thực vật được biết đến nhiều nhất [2], [8]

- Papain: Là enzym được tách từ nhựa đu đủ, rất bền với nhiệt Nóchịu được nhiệt độ 700C ở pH 7.0 tới 30 phút, dưới dạng bột nó chịu được

1000C trong 3 giờ Nhiệt độ tối thích 60 – 700C và pH tối thích thường giữa5.0 và 7.0

- Bromelin: Thu được từ thân cây và dịch chiết của cây dứa Enzymnày có tính chất như một cystein proteinase Enzym này có nhiệt độ tốithích là 50 – 600C, pH tối thích là 5 – 8 Nhiệt độ bất hoạt củaenzym này là 700C, thấp hơn so với papain Bromelin được sử dụng nhiềutrong y dược và công nghiệp, được dùng thay cho papain

- Focin: Thu được từ mủ một loại sung có màu vàng kem đến màuhồng và pH axit (pH = 3- 4)

- Keratinase: Một vài nhóm thực vật sản xuất các protease thuỷ phânđược lông và tóc Sự phân giải lông và tóc có tầm quan trọng trong sản xuấtaxit amin thiết yếu Lysine và để tránh sự tắc nghẽn của hệ thống nước thải.Nhiều công bố ở trong nước và trên thế giới đã phát hiện được nguồnprotease trong hạt, thịt quả, thân của các loại cây khác nhau

Các enzym protease có mặt ở nhiều loài thực vật và phân bố trong các

mô khác nhau Nhưng cho đến nay, ở Việt Nam các tác giả chỉ tập trungnghiên cứu ở dứa và đu đủ Vì vậy việc mở rộng phạm vi nghiên cứu trêncác loài thực vật khác nhau là rất cần thiết

• Protease vi sinh vật

Protease vi sinh vật được phát hiện từ năm 1918, nhưng được chú ýnghiên cứu nhiều hơn từ năm 1950 Protease vi sinh vật chiếm khoảng 40

% tổng lượng enzym bán trên thế giới [2], [8], [33]

Protease của động vật hay thực vật chỉ chứa một trong hai loạiendoprotease hoặc exoprotease Còn vi sinh vật có khả năng sinh ra cả hailoại trên, do đó protease của vi sinh vật có tính đặc hiệu khác thường,chúng có thể phân huỷ tới 80 % liên kết peptit có trong phân tử protein Nókhông những phá huỷ hoàn toàn và nhanh chóng các liên kết peptit mà còn

có khả năng phá huỷ chậm một số liên kết không đặc trưng khác Như vậy

trong từng trường hợp cụ thể, cần nghiên cứu chọn lọc loài vi sinh vật thíchhợp và những điều kiện tối ưu cho hoạt độ của nó.

Các protease vi sinh vật có thể được thu nhận từ vi khuẩn và nấm

- Vi khuẩn: Hầu hết các protease thương mại, chủ yếu là kiềm tính

và trung tính được sản xuất từ vi sinh vật thuộc chi Bacillus như Bacillus subtilis, Bacillus amyloliquefaciens, B.licheniformis, B.cereus Các

protease trung tính vi khuẩn hoạt động ở khoảng pH hẹp (pH 5 - 8) và cókhả năng chịu nhiệt độ thấp Các proteinase kiềm tính của vi khuẩn có khảnăng hoạt động ở pH kiềm tính và có tính đặc hiệu rộng, nhiệt độ thích hợpcủa chúng khoảng 600C

- Nấm: Nấm tạo ra nhiều loại enzym hơn so với vi khuẩn Chẳng hạn

như Aspergillus oryzae sinh ra các protease trung tính, kiềm tính và axit

tính Các proteinase của nấm hoạt động trong vùng pH khá rộng (pH 4 11) và thể hiện tính đặc hiệu cơ chất cao Tuy nhiên, chúng có tốc độ phảnứng thấp hơn và mức độ chịu nhiệt kém hơn so với các enzym của vikhuẩn

-Như vậy, các chế phẩm protease được sản xuất từ vi sinh vật rất đadạng, phong phú về chủng loại và tính chất Các proteinase của vi khuẩn cótốc độ phản ứng nhanh và độ bền nhiệt lớn

Protease vi sinh vật được chia làm 3 nhóm: Protease kiềm tính,protease trung tính, protease axit tính

Protease kiềm tính: Có nhiều loài vi khuẩn có khả năng sinh tổng hợp

protease kiềm tính Quan trọng nhất là các loài thuộc chi Bacillus như Bacillus licheniformis, Bacillus amyloliquefaciens, Bacillus firmus,…Các

loài nấm mốc có khả năng sinh tổng hợp protease kiềm tính được sử dụng

rộng rãi nhất là A niger, A oryzae, A flavus, A sojae,…Protease kiềm

tính bền ở nhiệt độ cao và bền trong môi trường kiềm pH = 9 – 11 Protease

kiềm tính của B subtilis thuỷ phân hàng loạt các liên kết peptit Protein

được thuỷ phân ở mức độ nhiều hơn so với protease trung tính

Protease trung tính: Vi sinh vật sinh tổng hợp nhóm protease này là các

loài vi khuẩn B.subtilis, B.cereus, B megaterium, Pseudomonas aeruginosa, Streptomyces griseus, và nấm mốc A oryzae, A sojae,…

Protease trung tính thường không ổn định và các ion Ca2+, Na+, Cl- có tácdụng làm tăng tính ổn định của các enzym này Khoảng pH tối thích

thường hẹp, ở điều kiện nhiệt độ 370C hoạt độ protease là 100 % thì ở nhiệt

độ 500C, sau 30 phút, hoạt độ enzym giảm xuống còn 80 % Cũng saukhoảng thời gian đó, ở 600C hoạt độ chỉ còn 20 % và ở 700C thì chỉ sau 10phút enzym bị vô hoạt hoàn toàn

Protease trung tính của B subtilis thuỷ phân mối liên kết peptit vốn

được tạo thành từ nhóm cacboxyl của alanin, serin, histidin và nhóm amincủa valin, loxin hay phenylalanine

Protease axit tính:

- Các vi khuẩn có khả năng sinh tổng hợp protease nhóm này là loài

Alcaligenes, Bacillus, Corynebacterium, Lactobacillus, Pseudomonas, Serratia, Streptococcus, Streptomyces Trong các loài thuộc chi Bacillus phổ biến là B.subtilis, B polymyxa, B.mensentericus.

- Các loài nấm mốc có khả năng sinh tổng hợp enzym làm đông sữa:

Aspergillus, Candida, Corilus, Endothia, Enthomophthora, Mucor, Penicillium, Rhizopus, Sclerotium, Torulopsis Trong số đó chỉ có ba loại được sử dụng rộng rãi để sản xuất enzym là Mucor pusillus varlindt (nuôi cấy bằng phương pháp bề mặt) và Endothia parasita, Mucor miehei

(phương pháp bề sâu)

Protease axit có pH tối thích 4.0 – 5.5

Như vậy, các chế phẩm enzym được sản xuất từ các nguồn khác nhauthì khác nhau về điều kiện hoạt động như pH, nhiệt độ, cơ chất đặc hiệu,đặc hiệu liên kết phân cắt Vì vậy việc lựa chọn chế phẩm áp dụng trongsản xuất phải được cân nhắc để đạt được mục đích công nghệ đặt ra

1.2.1.3 Các yếu tố chính ảnh hưởng đến hoạt động của enzym

Nói chung trong điều kiện thừa cơ chất vận tốc phản ứng phụ thuộctuyến tính vào nồng độ enzym [2]

• Ảnh hưởng của nồng độ cơ chất

Ở nồng độ cơ chất thấp, vận tốc phản ứng phụ thuộc tuyến tính vào

nồng độ cơ chất

khi nồng độ cơ chất đã đủ lớn đến một mức nào đó, nếu tiếp tục tăngthì vận tốc phản ứng sẽ không tăng theo

Ở các nhiệt độ khác nhau, hoạt độ của enzym cũng khác nhau Nhiệt

độ ứng với hoạt độ enzym cao nhất được gọi là nhiệt độ tối ưu của enzym.Mỗi enzym có giá trị nhiệt độ tối ưu khác nhau Tuy nhiên nhiệt độ tối ưucủa mỗi enzym không cố định mà có thể thay đổi tuỳ cơ chất, pH môitrường, thời gian phản ứng,…

Nhiệt độ mà enzym bị mất hoàn toàn hoạt tính gọi là nhiệt độ tới hạn,thường nhiệt độ tới hạn khoảng 700C Ở nhiệt độ tới hạn enzym bị biếntính, ít có khả năng phục hồi được hoạt độ Ngược lại, ở nhiệt độ dưới 00Choạt độ enzym tuy bị giảm nhưng lại có thể tăng lên khi đưa về nhiệt độbình thường

• Ảnh hưởng của pH môi trường

pH môi trường có ảnh hưởng rõ rệt đến phản ứng enzym vì nó ảnhhưởng đến mức độ ion hoá cơ chất, enzym và ảnh hưởng đến độ bềnprotein enzym Đa số enzym bền trong giới hạn pH giữa 5.0 và 9.0

pH tối ưu cho hoạt động của nhiều enzym vào khoảng 7.0 Tuy nhiêncũng có một số enzym có pH tối ưu rất thấp (pepsin, proteinaza axit của visinh vật,…) hoặc khá cao (substilizin có pH tối ưu > 10) pH tối ưu của mộtenzym cũng không cố định mà phụ thuộc vào nhiều yếu tố khác như cơchất, tính chất dung dịch đệm, nhiệt độ,…

Tính hoạt động của một số enzym protease còn phụ thuộc vào sự cómặt của các ion kim loại và một số hợp chất khác Một số trong những chất

đó có tác dụng làm tăng tính hoạt động của enzym, còn một số khác lại cótác dụng kìm hãm hoạt động của các enzym [8]

Protease của Aspergillus awamori 78 – 2 bị kìm hãm bởi các ion Co2+,

Fe2+, Cu2+, Hg2+, Ca2+, Mg2+,Mn2+, Zn2+, Ni2+ và EDTA (etylen diamintetraaxetic)

Protease I, II,III của Aspergillus oryzae không bị kìm hãm bởi các ion

Ba2+, Ca2+, Mn2+, Mg2+, Zn2+, nhưng bị kìm hãm bởi các ion kim loại khácnhư Cu2+, Co2+,Cd2+,Fe3+ Protease của Bacillus subtilis bị mất hoạt tính bởi

hợp chất tạo phức và khi nồng độ ure cao, ngoài ra nó bị kìm hãm bởiEDTA Conovalov và Dorokhow nghiên cứu ảnh hưởng của thành phầnnước quả đến hoạt độ của enzym protease nhận thấy ion Na+ và Ca2+ là chấthoạt hoá enzym protease Đường có tác dụng kích thích enzym protease,ngược lại axit có tác dụng ức chế enzym protease Chất chát có nồng độ0.02 % có tác dụng kìm hãm sự hoạt động của enzym protease

1.2.2 Ứng dụng của protease trong thuỷ phân protein

Với nguồn gốc thu nhận phong phú đa dạng, protease được ứng dụngrộng rãi trong nhiều ngành công nghiệp: Công nghiệp thực phẩm, Côngnghiệp nhẹ, công nghiệp dược,…Trong đó ứng dụng rộng rãi nhất củaprotease là trong ngành công nghiệp thực phẩm

1.2.2.1 Ứng dụng trong điều chế các dịch đạm thuỷ phân

Hiện nay, sử dụng protease để thu dịch thuỷ phân protein được ứngdụng rất rộng rãi như sản xuất nước giải khát, thức ăn kiêng, xì dầu, điềuchế các dịch đạm thuỷ phân dùng làm chất dinh dưỡng, chất tăng vị trongthực phẩm, bổ sung vào thức ăn gia súc,…hoặc các sản phẩm thuỷ phânprotein thực phẩm chứa các peptit chống tăng huyết áp, làm giảm đau, kíchthích miễn dịch, peptit tăng khả năng hấp thụ canxi,…Khó khăn gặp phảitrong thuỷ phân protein là tạo ra các peptit đắng Thuỷ phân thái quáprotein thường dẫn đến hình thành các sản phẩm thuỷ phân có vị đắng cao

Các serine proteinase của Bacillus subtilis đặc hiệu ở vị trí amino axit thơm

hoặc amino axit kỵ nước Vì vậy, chúng có khả năng làm giảm vị đắng củadịch thuỷ phân

Nấm men cũng là một nguồn protein đang được nghiên cứu nhiều đểtạo sản phẩm thuỷ phân Do lượng men thải ra từ công nghiệp bia rượungày càng tăng mà con người vẫn chưa tận dụng hết được

Các protease sử dụng trong chế biến dịch đạm thuỷ phân nhưNeutrase, Flavourzyme, Viscozyme, Protamex, Alcalas

1.2.2.2 Ứng dụng trong sản xuất nước mắm

Để sản xuất nước mắm ngắn ngày từ cá, người ta phải tiến hành ủ lênmen ít nhất từ 6 tháng đến một năm Nhưng với công nghệ enzym, người ta

có thể nghiền sơ bộ cá nguyên liệu đồng thời phối trộn với các chế phẩmprotease Như vậy, thời gian thuỷ phân giảm xuống chỉ còn 30 ngày

Sử dụng enzym protease (Neutrase) với tỷ lệ 0.025% với cá tươi,0.035% với cá ướp 10-15% muối và 0.075% với cá mặn 25-30% muối.Đưa enzym vào chế biến chượp cá mặn hầu như không làm tăng giá thànhsản phẩm vì hiệu suất sử dụng đạm cao Đạm thuỷ phân bình quân tăng10.7%, đạm sử dụng trong sản xuất bình quân tăng 13.8% Hiệu suất sửdụng đạm tăng 2.6% Tiêu hao nguyên liệu giảm 12.1% [21]

1.2.2.3 Ứng dụng trong quá trình sản xuất bia

Việc ứng dụng các chế phẩm proteolitic trong sản xuất bia giúp chongười sản xuất có thể sử dụng hoàn toàn protein đại mạch do các enzymnày chuyển protein thành trạng thái hoà tan, ổn định vào dịch đường, chophép nâng cao giá trị sinh học của bia

Enzym protease sản xuất từ chủng Aspergillus oryzae 938/2 theo

phương pháp bề mặt có hoạt lực 145 U/ml có tác dụng tốt đến quá trình lênmen của nấm men ở tỷ lệ sử dụng nguyên liệu thay thế 50 %, hàm lượngtổng nitơ hoà tan tăng 16-28 %, nitơ amin tự do tăng 18-26 % Làm giảmgiá thành 100.900 đồng cho 1000 lít bia, mà chất lượng bia vẫn đạt chỉ tiêuhoá lý và cảm quan tương đương mẫu dùng 30 % nguyên liệu thay thế.Việc ứng dụng các chế phẩm enzym protease vào quá trình sản xuất bia cónhững ưu điểm sau: Tăng tỉ lệ nguyên liệu thay thế (từ 30 % lên 50 %),giảm thời gian lên men chính (1 ngày), giống nấm men kết lắng tốt chohiệu suất thu hồi tăng 2.5 %, bia thành phẩm đạt các chỉ tiêu hoá lý quyđịnh, nâng cao hiệu quả kinh tế [12]

1.2.2.4 Ứng dụng trong chế biến thịt cá

Trong công nghiệp thịt cá, protease giúp làm mềm thịt nhờ thuỷ phânmột phần protein trong thịt, kết quả làm cho thịt mềm và có vị tốt hơn.Protease dùng trong công nghiệp chế biến thịt thường là protease thực vậtnhư: papain, bromelin, fixin,… và enzym vi sinh vật từ nấm mốc, xạkhuẩn

1.2.2.5 Ứng dụng trong các ngành công nghiệp khác

Trong sản xuất bột giặt, enzym chiếm 0.2-2 % khối lượng và chiếm

5-10 % giá thành nguyên liệu Công dụng của protease là phân huỷ vết bẩndạng protein trên vải như máu, lòng đỏ trứng, sữa, nước rau, đậu, nước xốtthức ăn,… [36]

1.2.3 Một số chế phẩm enzym protease từ vi sinh vật

1.2.3.1 Chế phẩm neutrase 0.8L

Neutrase 0.8L là chế phẩm protease thương mại của hãng NovoNordisk Đan mạch, được sản xuất nhờ quá trình lên men chìm chủng

Bacillus amyloliquefaciens [17].

Neutrase thuộc loại metallo proteinase xúc tác thuỷ phân các liên kết

peptit ở bên trong phân tử protein, polypeptit,…

Neutrase là một protease trung tính, trong khi hầu hết các chế phẩmthương mại khác đều chứa cả phần proteinase kiềm tính Dải pH hoạt động5,5 – 7,5; dải nhiệt độ hoạt động 45 - 550C Chế phẩm này không chứaamylase, chứa một lượng β-glucanase không xác định Cần ion kẽm chohoạt động của nó, ion Ca2+ có tác dụng làm bền enzym, enzym bị ức chế

bởi EDTA Neutrase bị vô hoạt ở 850C trong 2 phút Sự ổn định củaneutrase ở nhiệt độ nhất định phụ thuộc vào loại và nồng độ cơ chất

Neutrase 0.8L có màu nâu sáng, trạng thái lỏng Nhiệt độ bảo quản 0–

100C, bảo quản trong bao bì khô, kín, tránh ánh sáng mặt trời, vi sinh vậttổng số ≤ 50000 TB/g, coliform ≤30 TB/g Neutrase 0.8L có hoạt độ là0.8AU/g (Anson Units per gram) Các thành phần của enzym neutrase dễdàng hoà tan trong nước

Vị trí hoạt động của neutrase khi tham gia xúc tác thuỷ phân cơ chất

có chứa nhóm hydroxyl Serine195, imidazol của histidin57, và nhómcacboxyl của Aspartic102

Hình 1.6 Vị trí xúc tác của neutrase

Trung tâm hoạt động của enzym gồm 3 gốc Asp102, His57, Ser195.

Khi cho enzym và cơ chất tiếp xúc với nhau thì tâm ái nhân của enzym

sẽ tương tác trực tiếp với nguyên tử tích điện dương của liên kết bị thuỷphân

Cụ thể là dưới sự giúp đỡ của gốc Asp102, His57 sẽ cho ra mộtproton, nguyên tử oxy của nhóm – OH của gốc Ser 195 của enzym nhậnthêm một electron

Gốc này sẽ tương tác trực tiếp với nguyên tử C của nhóm CO của liênkết peptit cần phân cắt và tạo phức chất trung gian giữa cơ chất và trungtâm hoạt động của enzym.

Tiếp đến, phức chất này sẽ bị phá huỷ do sự sắp xếp lại các liên kết,khi này một phần của cơ chất được tách ra ngoài, 1 phần còn lại của cơ chấtvẫn liên kết với gốc Ser của trung tâm hoạt động của enzym và tạo ra chấtmới Acyl-enzym, chất này được hình thành giữa nhóm CO với nguyên tửoxy của nhóm –OH của gốc Ser 195 của enzym

Dưới sự trợ giúp của Asp102, His57 sẽ cho phân tử nước 1 proton,nguyên tử oxy của nước sẽ tấn công vào Acyl-enzym, để hình thành mộtphức chất trung gian mới

Phức chất này giải phóng sản phẩm thứ 2, lúc này liên kết giữa C của

CO của phần còn lại của cơ chất với nguyên tử oxy của nhóm –OH của gốcSer195 bị phá vỡ Enzym giải phóng ra và bắt đầu hành trình mới

1.2.3.2 Chế phẩm enzym Flavourzyme

Flavourzyme là chế phẩm protease thương mại của hãng Novo

Nordisk Đan mạch được sản xuất từ chủng Aspergillus oryzae [17].

Flavourzyme là một hỗn hợp peptidase, vừa có hoạt tính endoprotease,vừa có hoạt tính exoprotease Có thể thuỷ phân trên 70 % mối liên kếtpeptit, sản phẩm thuỷ phân của flavourzyme thơm ngon, không có vị đắngkhi thuỷ phân ở mức độ vừa phải Sản phẩm không có các chất độc hại,hàm lượng muối thấp

Nhiệt độ tối ưu cho hỗn hợp enzym cũng như cho exopeptidase là

500C Thuỷ phân trong điều kiện axit nhẹ hoặc trong điều kiện trung tính,dải pH hoạt động 5.0 – 7.0; pH tối ưu cho exopeptidase 7.0 Flavourzyme

bị vô hoạt ở nhiệt độ 850C trong 5 phút hoặc ở 1200C trong 5 giây

Flavourzyme 500 MG có màu nâu, có 2 loại:

Loại A: Tạo thành hạt trong NaCl

Loại B: Tạo thành hạt trong yến mạch

Các thành phần của Flavourzyme 500MG dễ dàng hoà tan trong nước.Flavourzyme 500 MG có hoạt độ 500 LAPU/g 1 LAPU (đơn vịLeucine Aminopeptidase) là lượng enzym thuỷ phân được 1μmol L-leucine-p-nitroanilide trong 1 phút theo phương pháp phân tích của NovoNordisk AF 298/1 [17]

Chế phẩm dạng bột, màu nâu Sản phẩm được bảo quản trong điềukiện khô, lạnh, bảo quản ở 50C sản phẩm có thể duy trì được hoạt độ trong

ít nhất 3 tháng

1.3 Các phương pháp thủy phân nấm men

Bản chất của quá trình thuỷ phân protein là sự thuỷ phân liên kếtpeptit Do liên kết peptit là liên kết mạnh, thuỷ phân xảy ra trong điều kiện

có xúc tác Tác nhân xúc tác có thể là tác nhân hoá học hoặc tác nhân sinhhọc

Các sản phẩm thuỷ phân chưa hoàn toàn thường hay bị đắng Sảnphẩm bị đắng khi mức độ thuỷ phân đạt từ 4 – 40% Vị đắng liên quan tớicác peptit chứa các axit amin kỵ nước Vị đắng chỉ ảnh hưởng đến tính chấtcảm quan, không ảnh hưởng đến giá trị dinh dưỡng

1.3.1 Phương pháp hoá học

1.3.1.1 Thuỷ phân bằng axit

Nguyên tắc: Dùng HCl nồng độ 6 – 10 N, nhiệt độ 100 – 1800C, thời gianthuỷ phân 24 – 72 giờ Nếu gia tăng áp suất sẽ giảm được thời gian Sauthuỷ phân, axit trong dịch thuỷ phân được trung hoà bằng NaOH hoặc

Na2CO3 [15]

Ưu điểm: Rẻ tiền, nhanh và hiệu suất thuỷ phân cao từ 85 – 90 %, sản

phẩm giàu axit amin và dễ bảo quản

Nhược điểm:

- Do nhiệt độ cao và nồng độ axit đặc, một số axit amin bị phá huỷtrong quá trình thuỷ phân Tryptophan bị phá huỷ hoàn toàn, các axit amin