Trắc nghiệm, bài giảng pptx các môn chuyên ngành Y dược hay nhất có tại “tài liệu ngành Y dược hay nhất”; https://123doc.net/users/home/user_home.php?use_id=7046916. Slide kiểm nghiệm seminar về sắc ký hiện đại ppt dành cho sinh viên ngành Y dược. Trong bộ sưu tập có trắc nghiệm kèm đáp án chi tiết các môn, giúp sinh viên tự ôn tập và học tập tốt môn kiểm nghiệm seminar về sắc ký hiện đại bậc cao đẳng đại học ngành Y dược và các ngành khác
ỨNG ỨNG DỤNG DỤNG KỸ KỸ THUẬT THUẬT UPLC-MS UPLC-MS TRONG TRONG PHÂN PHÂN TÍCH TÍCH ĐỊNH ĐỊNH LƯỢNG LƯỢNG FLAVONOLIGNAN FLAVONOLIGNAN TRONG TRONG CHIẾT CHIẾT XUẤT XUẤT CÂY CÂY KẾ KẾ SỮA SỮA (( SILYBUM SILYBUM MARIANUM) MARIANUM) Tyler N Graf, Nadja B Cech, Stephen J Polyak, Nicholas H Oberliesa (2016), «A Validated UHPLC-Tandem Mass Spectrometry Method for Quantitative Analysis of Flavonolignans in Milk Thistle (Silybum marianum) Extracts», J Pharm Biomed anal, (126), 26-33 Nội dung Giới thiệu Thử nghiệm Kết bàn luận Kết luận GIỚI THIỆU KẾ SỮA Silybum marianum (L.) Gaertn (Asteraceae) Được sử dụng điều trị : • Các bệnh gan ( vàng da gan, xơ gan, viêm gan mãn,…) • Phì đại tuyến tiền liệt • Ung thư tuyến tiền liệt • Rối loạn ám ảnh cưỡng chế (OCD) GIỚI THIỆU KẾ SỮA Silybum marianum (L.) Gaertn (Asteraceae) Chiết xuất từ hạt Kế sữa - chế phẩm - hợp chất có hoạt tính sinh học Silymarin Silybin/Silibinin - Taxifolin falvonolignan Silybin A: Silybin B tỷ lệ 1:1 GIỚI THIỆU (2) Isosilychristin (4) Silydianin (1) Taxifolin (3) Silychristin (6) Silybin B (5) Silybin A (7) Isosilybin A (8) Isosilybin B GIỚI THIỆU Các nghiên cứu bật đặc tính hóa học Kế sữa: - Phương pháp HPLC-MS 40 phút để phân tích silibinin huyết tương ( 2008) - Phương pháp HPLC phút (sử dụng cột nguyên khối) để phân tích hợp chất từ silymarin ( 2009) - Phương pháp UHPLC - (ESI-MS) để xác định hợp chất từ silymarin (2010) Ưu điểm bật phương pháp trình bày so với phương pháp trên: - Thời gian phân tích rút ngắn phút Là phương pháp vừa phân tích định tính định lượng chất có hoạt tính sinh học chiết xuất từ hạt Kế sữa THỬ NGHIỆM Hóa chất, nguyên vật liệu - Mẫu thử nghiệm: Các lô Silymarin riêng biệt từ NSX Madaus (2), Indena (1), Sigma-Aldrich (2) - Acetonitril, Caffein dùng phân tích HPLC - Acid formic dùng phân tích MS - Nước (Fisher Scientific, USA) THỬ NGHIỆM Chuẩn bị mẫu thử mẫu chuẩn Dung môi CH3CN : H2O (1:1) Mẫu chuẩn (1) dd gốc 5,24 mM Trộn (2) Dd có nồng độ riêng chất 655 µM Pha lỗng theo cấp số (3) 17 dd có nồng độ 0,005 µM – 328 µM Mẫu QC Dd (2) Các mẫu QC cao 16,4 µM TB 1,64 µM thấp 0,164 µM Mẫu thử Các mẫu Silymarin 2,53 mg/mL Pha lỗng 100 lần 10 THÍ NGHIỆM: Thiết bị GHÉP NỐI Hệ thống Waters Acquity UHPLC Hệ thống đầu dò khối phổ tứ cực TSQ Quantum (Milford, MA, USA) Access (Waltham, MA, USA ) THỬ NGHIỆM Thẩm định phương pháp Độ tuyến tính phương pháp: Độ tuyến tính đường cong hiệu chuẩn đánh giá phân tích bình phương nhỏ ● Độ độ xác: Độ xác xác định cách tính độ lệch chuẩn tương đối (RSD) sai số tương đối (RE) lần tiêm lặp lại - Độ lặp lại: lần/ngày - Độ xác trung gian: liên ngày 17 THỬ NGHIỆM Thẩm định phương pháp ● LLOQ ULOQ: - LLOQ: nồng độ thấp chất phân tích đo với độ xác ngày 15% - ULOQ: + phân tích liệu MS, ULOQ = nồng độ cao mối quan hệ tín hiệu MS nồng độ tuyến tính + phân tích liệu UV, ULOQ = nồng độ cao đo thử nghiệm • • Đường cong hiệu chuẩn: vẽ nồng độ mẫu chuẩn giữa, LLOQ ULOQ Khoảng động tuyến tính = tất nồng độ giữa, LLOQ ULOQ 18 THỬ NGHIỆM Hiệu ứng Matrix Hiệu ứng Matrix kiểm tra cách so sánh kết định lượng mẫu Silymarin dung môi trắng với kết định lượng mẫu dung mơi có chứa chất chuẩn %ME 19 20 THỬ NGHIỆM Đánh giá độ ổn định DMSO - Sử dụng hệ thống UHPLC phần định lượng Các mẫu thử nghiệm có nguồn gốc lô với mẫu thử thử nghiệm thẩm định phương pháp Xây dựng điều kiện bảo quản trước phân tích: Trong Bảo quản DMSO khơ Nồng độ 500 µM o C Nhiệt độ phịng tháng tháng 21 KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN Độ tuyến tính phương pháp: Mẫu Độ dốc(±SD)x10 R LLOQ (µM) ULOQ (µM) MS UV MS UV MS UV MS UV 973.8 (2.9) 4495.3 (2.6) 0.9998 1,0000 0,0800 0,0400 10,2 328 315.0 (1.7) 5068.8 (2.8) 0.9995 1,0000 0,0800 0,0400 10,2 328 1379.5 (4.4) 5412.3 (3.4) 0.9997 1,0000 0,0800 0,0400 10,2 328 376.5 (1.4) 4460.8 (6.3) 0.9995 0,9999 0,1600 0,1600 10,2 328 822.9 (1.9) 5474.8 (2.3) 0.9997 1,0000 0,0800 0,0400 10,2 328 831.4 (3.5) 5790.5 (2.8) 0.9995 1,0000 0,0800 0,0400 10,2 328 798,6 (3.5) 5937.4 (2.9) 0.9996 1,0000 0,0800 0,0400 10,2 328 748.5 (2.4) 5156.0 (2.4) 0.9996 1,0000 0,0800 0,0400 10,2 328 KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN Độ tuyến tính phương pháp: Kết MS R ≥ 0,9995 UV R ≥ 0,9999 Phương pháp đạt yêu cầu độ tuyến tính 22 KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN Tính đặc hiệu: đánh giá độ phân giải Sắc ký đồ MS UV chất phân tích với nồng độ 10,24µM chuẩn nội Caffein Nhận xét: phương pháp cho sắc ký đồ với pic tách hoàn toàn Kết luận: Các phương pháp đạt yêu cầu tính đặc hiệu 23 24 KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN Độ độ xác RSD MS UV RSD yêu cầu RE Trong ngày < 12% < 7,8% Liên ngày < 7% < 6,3% Trong ngày < 7,2% Liên ngày < 8,4% ≤ 15% Kết luận: Các phương pháp đạt yêu cầu độ độ xác < 12% < 9,2% RE yêu cầu ≤ 15% 25 KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN Khoảng tuyến tính Đầu dị MS Đầu dị UV Silydianin 0.160-10.2 μM 0.160–328 μM Các hợp chất lại 0.0800–10.2 μM 0.0400–328 μM So sánh ưu nhược điểm loại đầu dò Đầu dị MS Đầu dị UV Tỷ lệ tính hiệu nhiễu (S/N) ++ + Độ lặp lại/ nồng độ thấp + ++ LLOQ Cao Thấp 26 KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN Kết phân tích định lượng Có khác biệt đáng kể nhà sx lô từ nhà sx Hàm lượng flavonlignan tổng Hàm lượng Silydianin Madaus 62% 70% 7,8% Sigma 47% 54% 2,5% Indine 57% 7,0% Giải thích : + Khác biệt điều kiện tăng trưởng + không quán chung quy trình chiết xuất / chế biến KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN Tính quán kết MS UV - Trong hầu hết trường hợp, liệu MS UV cung cấp kết giống cho tổng hàm lượng hợp chất - chiết xuất silymarin - Đối với tất hợp chất, ngoại trừ hợp chất (Silydianin), khơng thấy khác biệt có ý nghĩa thống kê nồng độ xác định MS UV (ở mức độ tin cậy 95%, theo thử nghiệm t-student) - Sự khác biệt đáng kể quan sát liệu MS UV cho Silydianin, nhiễu liệu UV 27 KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN Hiệu ứng Matrix - Các hiệu ứng khơng xuất phân tích MS UV với tất hợp chất, ngoại trừ Silydianin cho thấy hiệu ứng matrix rõ ràng phân tích UV Ngun nhân: chất gây nhiễm có khả hấp thụ tia UV phía trước peak Silydianin Các chất có khối lượng khác với Silydianin tách máy dị MS khơng ảnh hưởng q trình phân tích Đầu dị MS ưu tiên để phân tích định lượng Silydianin 28 KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN Độ ổn định DMSO Sử dụng kỹ thuật UPLC-UV với mẫu hợp chất tinh khiết Silymarin : -Mẫu tiếp xúc DMSO: xuất peak phân hủy, diện tích peak phân hủy chiếm 8% so với tổng diện tích peak mẫu Silychristin, Silybin A, Isosilybin B -Mẫu dạng bột : Không xuất peak phân hủy Các thành phần Silymarin phù hợp lưu trữ khô lưu trữ DMSO 29 KẾT LUẬN - Cả đầu dò MS UV hiệu để phân tích định lượng pp ứng dụng cho nhiều phịng thí nghiệm với thiết bị khác - Phương pháp phát UV có lợi khoảng động tuyến tính rộng, phương pháp MS bị nhiễu matrix hợp chất Silydianin - Tầm quan trọng phương pháp lưu trữ để trì tính tồn vẹn hoạt động sinh học thành phần silymarin - Khác biệt nồng độ thành phần hoạt tính sinh học chế phẩm chiết xuất silymarin từ nhà sản xuất khác từ lô khác Pp phân tích quan trọng để thiết lập mức độ cấu thành chế phẩm silymarin trước tiến hành đánh giá sinh học 30 XIN CHÂN THÀNH CẢM ƠN SỰ QUAN TÂM THEO DÕI CỦA QUÝ THẦY CÔ VÀ CÁC BẠN ... lượng khác với Silydianin tách máy dị MS khơng ảnh hưởng q trình phân tích Đầu dị MS ưu tiên để phân tích định lượng Silydianin 28 KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN Độ ổn định DMSO Sử dụng kỹ thuật UPLC- UV... kiện MS – Nguồn ion 13 14 THỬ NGHIỆM Điều kiện MS – Bộ phận phân tích khối tứ cực THỬ NGHIỆM 15 KỸ THUẬT PHÂN TÍCH ĐỊNH LƯỢNG Thực đồng thời với đầu dị UV MS - UV: bước sóng 288 nm MS: sử dụng. .. quán chung quy trình chiết xuất / chế biến KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN Tính quán kết MS UV - Trong hầu hết trường hợp, liệu MS UV cung cấp kết giống cho tổng hàm lượng hợp chất - chiết xuất silymarin - Đối