Đang tải... (xem toàn văn)
Trắc nghiệm, bài giảng pptx các môn chuyên ngành Y dược hay nhất có tại “tài liệu ngành Y dược hay nhất”; https://123doc.net/users/home/user_home.php?use_id=7046916. Slide kiểm nghiệm seminar về sắc ký hiện đại ppt dành cho sinh viên ngành Y dược. Trong bộ sưu tập có trắc nghiệm kèm đáp án chi tiết các môn, giúp sinh viên tự ôn tập và học tập tốt môn kiểm nghiệm seminar về sắc ký hiện đại bậc cao đẳng đại học ngành Y dược và các ngành khác
ỨNG DỤNG KỸ THUẬT SẮC KÝ LỎNG HIỆN ĐẠI UPLC – MS/MS Giới thiệu Vật liệu phương pháp nghiên cứu Kết bàn luận Kết luận Giới thiệu Bài báo khoa học: Ren-ai Xu et al., UPLC-MS/MS method for the simultaneous determination of imatinib, voriconazole and their metabolites concentrations in rat plasma Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis (2019) Sử dụng phương pháp UPLC-MS/MS xác định đồng thời imatinib, voriconazole chất chuyển hóa chúng huyết tương chuột CYP3A4 Imatinib N-desmethyl imatinib CYP2C19 CYP2C9, CYP3A4 Voriconazole N-oxide voriconazole Giới thiệu - + - Thuốc điều trị đầu tay cho bệnh bạch cầu mạn dòng tủy (CML) Cần theo dõi nồng độ trị liệu (TDM) Điều trị ung thư làm ức chế miễn dịch, dễ nhiễm khuẩn nấm Nhiễm aspergillosis xâm lấn loại nhiễm nấm nghiêm trọng Voriconazole thuốc chống nấm phổ rộng, điều trị bệnh nấm xâm lấn • • • Cần TDM UPLC-MS/MS phương pháp thích hợp Thử nghiệm huyết tương chuột 2 Vật liệu & phương pháp nghiên cứu 2.1 Hóa chất: • • Imatinib, N-desmethyl imatinib, Voriconazole, N-oxide voriconazole với độ tinh khiết > 98% Diazepam với độ tinh khiết > 98% sử dụng làm chuẩn nội 2.2 Điều kiện UPLC-MS/MS Pha động: hệ gradient ACN : a.formic 0.1% 0.0 – 1.0 phút: 20 –> 90% ACN 1.0 – 2.0 phút: 90 –> 90% ACN 2.0 – 2.1 phút: 90 –> 20% ACN 2.1 – 4.0 phút: 20 –> 20% ACN Tốc độ dòng: 0.4 ml/phút Thời gian sắc ký: phút Cột Acquity BEH C18 (2.1 mm ì 50 mm, 1.7 àm) o Nhit độ 45 C Vật liệu & phương pháp nghiên cứu 2.2 Điều kiện UPLC-MS/MS: XEVO TQ -S Phân mảnh ion phun ion (ESI) Kỹ thuật ghi phổ MRM Giới thiệu Imatinib N-desmethyl imatinib m/z 494.3 → 394.2 m/z 480.3 → 394.2 Hình 1.1 Phổ MS/MS Imatinib, N-desmethyl imatinib Giới thiệu Voriconazole N-oxide voriconazole m/z 350.1 → 281.1 m/z 366.1 → 224.1 Hình 1.2 Phổ MS/MS Voriconazole, N-oxide voriconazole Giới thiệu Diazepam Hình 1.3 Phổ MS/MS Diazepam m/z 285.0 → 154.0 10 Vật liệu & phương pháp nghiên cứu 2.3 Dung dịch chuẩn, hiệu chuẩn mẫu kiểm soát chất lượng (QC) Imatinib, Voriconazole, chất chuyển hóa, Diazepam + MeOH Chuẩn gốc + ACN + MeOH Dung dịch chuẩn: Dung dịch chuẩn: Imatinib, Voriconazole,2 chất chuyển hóa Diazepam (Chuẩn nội) 10 µl Dung dịch chuẩn: đường TT, mẫu QC Đường tuyến tính: + điểm từ -> 5000 ng/ml huyết tương: imatinib, voriconazole, N-oxide voriconazole + điểm từ -> 500 ng/ml huyết tương: N-desmethyl imatinib + Mẫu QC huyết tương: + Nồng độ 10, 800, 4000 ng/ml imatinib, voriconazole, N-oxide voriconazole + Nồng độ 10, 80, 400 ng/ ml N-desmethyl imatinib 90 µl Huyết tương trắng chuột 11 Vật liệu & phương pháp nghiên cứu 2.4 Chuẩn bị mẫu tiêm 100 µl huyết tương Vortex phút Ly tâm 15 phút Thể tích tiêm µl + 200 µl dung dịch 15000 xg chuẩn nội 2.5 Thẩm định phương pháp Theo FDA thẩm định phương pháp phân tích sinh học cơng nghiệp: • • Độ đặc hiệu: Đường tuyến tính: y= ax + b LLOQ • • • Hiệu ứng Độ phục hồi Độ xác , độ xác trung gian, độ đúng: Mẫu QC, lần lặp lại/ ngày Mẫu QC, lần lặp lại/ ngày ngày • Độ ổn định: o chu trình đơng lạnh – xả đơng: -80 C đến nhiệt độ phòng o Ổn định sau pha mẫu: C 12h (bộ phận tiêm mẫu) Ổn định ngắn hạn: nhiệt độ phòng 6h o Ổn định dài hạn: -80 C 28 ngày Vật liệu & phương pháp nghiên cứu 2.6 Ứng dụng nghiên cứu dược động học • • • • Chuột Sprague-Dawley, đực m = 200 ± 20 g Số lượng Liều 20 mg/kg Imatinib 20 mg/kg Voriconazole, 300 µl máu Ly tâm Mẫu huyết tương 11 thời điểm sau uống thuốc: 0,5h đến 36h phút, lực ly tâm 4000 xg o 100 µl huyết tương, đơng lạnh – 80 C 12 13 Kết & bàn luận 3.1 Phát triển tối ưu hóa phương pháp - Đánh giá cột sắc ký: cột Accquity BEH C 18 cho peak, khả đáp ứng kết sắc ký phù hợp CSH C18 HSS C18 - Các thông số mẫu thử, thông số phương pháp cho đáp ứng tốt Dễ dàng Chiết lỏng – lỏng DMHC Chiết Chiết chất phân tích kết tủa huyết tương protein Nhanh chóng Tiềm Với acetonitrile cho khả kết tủa cao hơn, hiệu suất chiết cao 14 Kết & bàn luận 3.2 Độ đặc hiệu (1) (2) Sắc ký đồ chất phân tích, chuẩn nội mẫu huyết (3) tương trắng (4) (5) Thời gian lưu (phút) (1) (2) Imatinib: 0.94 N-desmethyl imatinib: 0.93 (3) Voriconazole 1.19 (1) Sắc ký đồ mẫu thử: huyết tương chuột sau 4h uống 20 mg/kg imatinib 20mg/kg voriconazole (2) (3) (4) (5) (4) N-oxide voriconazole :0.98 (5) Diazepam: 1.37 Kết & bàn luận 3.3 Đường tuyến tính độ nhạy Phương trình hồi quy tuyến tính: Imatinib y = 2.70755x + 166.088, r = 0,99818 N-desmethyl imatinib, y = 248.161x + 178.966, r = 0.99957 Voriconazole y = 5.20704x + 3.45498, r = 0,99939 N-oxit voriconazole y = 0,380534x + 0,084044, r = 0,999933 Với y: tỉ lệ diện tích peak chất phân tích/chuẩn nội x: nồng độ chất phân tích huyết tương Giới hạn định lượng (LLOQ) với chất ng/ml Đủ để định lượng, đáp ứng với độ xác độ 15 Kết & bàn luận 3.4 Độ xác, độ đúng, độ phục hồi hiệu ứng - Được đo lần lặp lại với nồng độ mẫu QC khác Độ độ xác thẩm định ngày liên tiếp Bảng 3.1 Kết độ xác, độ phương pháp định lượng chất phân tích huyết tương chuột 16 Kết & bàn luận 17 3.4 Độ xác, độ đúng, độ phục hồi hiệu ứng Độ phục hồi đánh giá cách so sánh diện tích peak mẫu huyết tương mẫu QC trước sau kết tủa protein Bảng 3.2 Kết độ phục hồi, hiệu ứng chất phân tích huyết tương chuột 18 Kết & bàn luận 3.5 Độ ổn định Nghiên cứu độ ổn định khác huyết tương chuột, bao gồm điều kiện: ba chu trình đơng lạnh – xả đông, ổn định sau chuẩn bị mẫu, ổn định ngắn hạn ổn định lâu dài Bảng 3.3 Kết độ ổn định chất phân tích huyết tương (n= ) Analytes Added (ng/mL) Room temperature, 6h o Autosampler C, 12h o -80 C, 28 days RSD (%) RE (%) RSD (%) RE (%) RSD (%) RE (%) RSD (%) RE (%) Three freeze -thaw Imatinib 10 4.4 -9.8 12.3 -0.1 12.1 -1.3 12.0 4.3 800 5.3 -0.1 8.7 4.8 4.3 3.2 12.7 7.1 4000 3.8 2.8 14.3 2.5 4.4 -6.9 8.7 -4.2 N-desmethyl 10 6.9 3.5 10.3 5.0 5.6 -2.3 14.7 6.1 imatinib 80 5.9 6.9 8.8 9.5 4.5 9.2 14.0 0.6 400 4.9 -8.8 6.6 11.8 4.5 1.2 8.5 -5.3 10 5.0 -7.1 11.9 1.6 5.1 -4.5 14.6 7.0 800 5.5 4.4 4.8 8.0 4.9 6.7 12.1 -3.1 4000 3.4 -11.3 9.5 14.8 3.0 -1.2 12.8 -11.1 N-oxide 10 7.4 7.1 9.8 9.0 6.5 -3.5 9.0 -3.4 voriconazole 800 4.3 -2.6 9.8 4.9 3.4 6.7 10.4 3.9 4000 4.7 -9.6 8.4 8.4 4.2 0.6 7.9 -4.7 Voriconazole Kết & bàn luận 3.6 Áp dụng phương pháp nghiên cứu dược động học Hình 3.4 Đường biểu diễn nồng độ imatinib, N-desmethyl imatinib huyết tương 19 Kết & bàn luận 3.6 Áp dụng phương pháp nghiên cứu dược động học Hình 3.5 Đường biểu diễn nồng độ Voriconazole, N-oxide voriconazole huyết tương 20 21 Kết & bàn luận 3.6 Áp dụng phương pháp nghiên cứu dược động học Bảng 3.4 Thông số dược động học thu từ chuột nghiên cứu Parameter Imatinib N-desmethyl Voriconazole imatinib N-oxide voriconazole T½ (h) 4.90 ± 0.45 6.77 ± 0.71 3.76 ± 0.40 7.46 ± 0.35 Tmax (h) 5.50 ± 0.76 5.20 ± 0.95 3.00 ± 0.12 6.50 ± 0.47 Cmax 3.40 ± 0.52 0.25 ± 0.04 4.37 ± 0.18 1.80 ± 0.37 AUCo→t (μg/mL.h) 44.70 ± 8.84 3.50 ± 0.60 61.01 ± 4.63 21.30 ± 5.43 AUCo→∞ 45.09 ± 8.85 3.61 ± 0.61 61.13 ± 4.65 22.20 ± 5.82 Vd (L/kg) 3.26 ± 0.74 55.18 ± 9.30 1.79 ± 0.27 10.42 ± 1.95 CL (L/h) 0.46 ± 0.07 5.66 ± 0.94 0.33 ± 0.02 1.30 ± 0.25 MRTo→t (h) 9.17 ± 0.41 10.54 ± 0.61 7.89 ± 0.22 9.98 ± 0.93 MRTo→∞ (h) 9.47 ± 0.43 11.94 ± 0.65 7.96 ± 0.22 10.06 ± 0.98 (μg/mL.h) Nhận xét: • • Imatinib, Voriconazole thể biến động lớn tính chất dược động học N-oxide voriconazole có khả kháng nấm yếu Voriconazole 100 lần -> thông số dược động học không cho quan trọng • • T1/2 , Tmax Imatinib, Voriconazole có khác biệt so với nghiên cứu Maher Sự khác biệt thay đổi giống chuột đa dạng cá thể Kết luận - 22 Nghiên cứu phương pháp xác định đồng thời imatinib, voriconazole chất chuyển hóa chúng huyết tương - Chứng minh UPLC-MS/MS có độ phục hồi cao, hiệu ứng không ảnh hưởng sau bước kết tủa protein acetonitrile - Thời gian sắc ký ngắn (4 phút), thuận lợi cho việc nghiên cứu 23 ... 98% sử dụng làm chuẩn nội 2.2 Điều kiện UPLC- MS/MS Pha động: hệ gradient ACN : a.formic 0.1% 0.0 – 1.0 phút: 20 –> 90% ACN 1.0 – 2.0 phút: 90 –> 90% ACN 2.0 – 2.1 phút: 90 –> 20% ACN 2.1 – 4.0... µl huyết tương, đơng lạnh – 80 C 12 13 Kết & bàn luận 3.1 Phát triển tối ưu hóa phương pháp - Đánh giá cột sắc ký: cột Accquity BEH C 18 cho peak, khả đáp ứng kết sắc ký phù hợp CSH C18 HSS C18... chất chuyển hóa chúng huyết tương - Chứng minh UPLC- MS/MS có độ phục hồi cao, hiệu ứng không ảnh hưởng sau bước kết tủa protein acetonitrile - Thời gian sắc ký ngắn (4 phút), thuận lợi cho việc