Góp phần nghiên cứu lên men tổng hợp kháng sinh nhờ streptomyces 52 13​

BỘ Y TÊ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI NGUYỄN THANH TÂM GĨP PHẦN NGHIÊN CỨU LÊN MEN TỞNG HỢP KHÁNG SINH NHỜ STREPTOMYCES 52.13 KHĨA ḶN TỚT NGHIỆP DƯỢC SI HÀ NỘI-2013 BỘỘ̣ Y TÊ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỢI NGUYỄN THANH TÂM GĨĨ́P PHẦN NGHIÊN CỨU LÊN MEN TỞNG HỢP KHÁNG SINH NHỜ STREPTOMYCES 52.13 KHĨA ḶN TỐT NGHIỆP DƯỢC SI Người hướng dẫn: DS Tạ Thu Lan Nơi thực hiện: Bộ môn Vi sinh & Sinh học HÀ NỢI-2013 LỜỜ̀I CẢM ƠN Tơi xin gửi lời c ảm ơn sâu sắc nhất đến cô giáo DS -Tạ Thu Lan người đã tận tình hướng dẫn từ những bước đầu tiên cho đến hoàn thiện khóa luận này Tôi xin chân thành cảm ơn các thầy cô giáo , các cán bộ , kỹ thuật viên giảng day , công tác tai Bộ môn Vi sinh - Sinh học, Bộ môn Công nghiệp dược trườ ng Đai học Dược Hà Nợi, Bợộ̣ mơn Hóó́a vậộ̣t liệộ̣u- khoa Hóó́a trườờ̀ng Đại họộ̣c Khoa họộ̣c tự nhiên Hàờ̀ Nộộ̣i đã giúp đỡ thời gian làm thưc nghiệm Nhân dịp này cũng xin gửi lời cảm ơn đến Ban giám hiệu cùng toàn thể các thầy cô giáo trường Đai học Dược Hà Nội đã day dỗ và tao mọi điều kiện thuận lợ i cho thời gian học tập tai trường Và cuối cùng là lời cảm ơn gửi tới gia đình và ban bè đã động viên , giúp đỡ suốt thời gian thưc hiện khóa luận Do thời gian làm thưc nghiệm cũng kiến thứ c của bản thân có han, khóa luận không thểể̉ tráó́nh khỏi nhiều thiếu sót Tơi rất mong nhận được sư góp ý của các thầy cô , ban bè để khóa luận được hoàn thiện Tôi xin chân thành cảm ơn! Hà Nội, ngày 18, tháng 5, năm 2013 Sinh viên Nguyễn Thanh Tâm Mục lục ĐẶT VẤN ĐỀ CHƯƠNG I: TỔNG QUAN 1.1.Đại cương vềờ̀ kháó́ng sinh 1.1.1 Địộ̣nh nghĩa kháó́ng sinh 1.1.2.Tiêu chuẩn đớó́i vớó́i mợộ̣t kháó́ng sinh 1.1.3.Đáó́nh giáó́ táó́c dụng: 1.1.4 Phân loại kháó́ng sinh 1.1.5 Cơ chếó́ táó́c dụng củể̉a kháó́ng sinh 1.1.6.Cáó́c ứó́ng dụng củể̉a kháó́ng sinh 1.2.Đặc điểể̉m củể̉a xạ khuẩn chi Streptomyces 1.2.1.Đặc điểể̉m hìờ̀nh tháó́i: 1.2.2.Đặc điểể̉m sinh lýó́: 1.2.3.Đặc điểể̉m cấó́u tạo: 1.2.4.Khảể̉ tạo sắó́c tớó́: .7 1.3.Tuyểể̉n chọộ̣n, cảể̉i tạo vàờ̀ bảể̉o quảể̉n giớó́ng xạ khuẩn 1.3.1.Chọộ̣n chủể̉ng cóó́ HTKS cao sàờ̀ng lọộ̣c ngẫẫ̃u nhiên 1.3.2.Đợộ̣t biếó́n cảể̉i tạo giớó́ng 1.3.3.Bảể̉o quảể̉n giớó́ng xạ khuẩn 1.4.Sự sinh tổng hợộ̣p kháó́ng sinh xạ khuẩn .9 1.4.1 Sự hìờ̀nh thàờ̀nh KS xạ khuẩn 1.4.2.Mộộ̣t sớó́ ́ó́u tớó́ ảể̉nh hưởng tớó́i quáó́ trìờ̀nh sinh tổng hợộ̣p KS 10 1.4.3.Lên men sinh tổng hợộ̣p kháó́ng sinh từờ̀ Streptomyces 11 1.5.Chiếó́t táó́ch vàờ̀ tinh chếó́ kháó́ng sinh từờ̀ dịộ̣ch lên men 12 1.5.1.Vai trị củể̉a chiếó́t táó́ch vàờ̀ tinh chếó́ kháó́ng sinh .12 1.5.2.Cáó́c phương pháó́p chiếó́t táó́ch 13 1.6.Bướó́c đầờ̀u nghiên cứó́u cấó́u trúó́c kháó́ng sinh 14 1.6.1.Phổ tửể̉ ngoại - khảể̉ kiếó́n 144 1.6.2.Phổ hồng ngoại 14 1.6.3.Khớó́i phổ 14 1.7 Mợộ̣t sớó́ kếó́t quảể̉ nghiên cứó́u vềờ̀ KS .15 1.7.1.Ảnh hưởng củể̉a Panamycin - 607 lên cáó́c sảể̉n phẩm chuyểể̉n hóó́a thứó́ cấó́p sảể̉n xuấó́t Streptomyces spp 155 1.7.2 Cáó́c polyene macrolid mớó́i họộ̣ hàờ̀ng vớó́i nystatin cóó́ vùờ̀ng polyol cảể̉i biếó́n thơng qua cơng nghệộ̣ sinh tổng hợộ̣p S noursei 15 1.7.3.Acid pivalic- đơn vịộ̣ khởi đầờ̀u sinh tổng hợộ̣p acid béo vàờ̀ kháó́ng sinh Alicyclobacillus, Rhodococcus Streptomyces 166 CHƯƠNG II: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .177 2.1 Nguyên vậộ̣t liệộ̣u vàờ̀ thiếó́t bịộ̣ 177 2.1.1Nguyên vậộ̣t liệộ̣u 177 2.1.2Máó́y móó́c thiếó́t bịộ̣ 199 2.2 Nợộ̣i dung nghiên cứó́u 20 2.2.1 Sàờ̀ng lọộ̣c, cảể̉i tạo giớó́ng 20 2.2.2 Lên men, chiếó́t táó́ch kháó́ng sinh 20 2.2.3 Sơ bợộ̣ xáó́c địộ̣nh mợộ̣t sớó́ tính chấó́t củể̉a kháó́ng sinh tinh khiếó́t thu đượộ̣c 20 2.3 Phương pháó́p thực nghiệộ̣m 20 2.3.1Ni cấó́y vàờ̀ giữẫ̃ giớó́ng xạ khuẩn 20 2.3.2.Đáó́nh giáó́ hoạt tính kháó́ng sinh phương pháó́p kh́ó́ch táó́n 21 2.3.3.Phương pháó́p cảể̉i tạo giớó́ng 222 2.3.4.Lên men chìờ̀m tổng hợộ̣p kháó́ng sinh 244 2.3.5.Chiếó́t kháó́ng sinh từờ̀ dịộ̣ch lên men dung mơi hữẫ̃u 255 2.3.6 Sơ bợộ̣ xáó́c địộ̣nh thàờ̀nh phầờ̀n kháó́ng sinh sắó́c kýó́ lớó́p mỏng 255 2.3.7 Thu kháó́ng sinh thơ phương pháó́p cấó́t quay 266 2.3.8 Tinh chếó́ kháó́ng sinh thơ sắó́c kýó́ cợộ̣t 266 2.3.9.Kếó́t tinh lại KS 277 2.3.10 Sơ bộộ̣ xáó́c địộ̣nh kháó́ng sinh tinh khiếó́t thu đượộ̣c .277 Chương 3: THỰC NGHIỆM, KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 278 3.1.Nâng cao khảể̉ sinh tổng hợộ̣p KS củể̉a chủể̉ng Streptomyces 52.13 288 3.1.1.Kếó́t quảể̉ sàờ̀ng lọộ̣c ngẫẫ̃u nhiên 288 3.1.2.Kếó́t quảể̉ đợộ̣t biếó́n nâng cao khảể̉ sinh tổng hợộ̣p kháó́ng sinh củể̉a Streptomyces 52.13 299 3.1.2.1.Đợộ̣t biếó́n áó́nh sáó́ng UV 29 3.1.2.2.Đợộ̣t biếó́n hóó́a chấó́t: 311 3.2.Kếó́t quảể̉ chọộ̣n dung mơi hữẫ̃u vàờ̀ pH chiếó́t KS từờ̀ dịộ̣ch lọộ̣c 322 3.3 Lên men dịộ̣ch thểể̉ sinh tổng hợộ̣p kháó́ng sinh 333 3.3.1 Chọộ̣n mơi trườờ̀ng lên men tớó́t nhấó́t 333 3.3.2.Chọộ̣n biếó́n chủể̉ng lên men tớó́t nhấó́t: 333 3.4.Chiếó́t xuấó́t vàờ̀ bướó́c đầờ̀u tinh chếó́ chấó́t kháó́ng sinh từờ̀ dịộ̣ch lên men .344 3.4.1.Kếó́t quảể̉ sắó́c kýó́ lớó́p mỏng 344 3.4.2.Kếó́t quảể̉ tinh chếó́ kháó́ng sinh sắó́c kýó́ cợộ̣t .355 3.4.3.Kếó́t quảể̉ kếó́t tinh: 40 3.4.4.Kếó́t quảể̉ đo phổ xáó́c địộ̣nh cấó́u trúó́c củể̉a KS tinh khiếó́t 40 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 411 1.Kếó́t luậộ̣n: 411 2.Kiếó́n nghịộ̣ .422 Tàờ̀i liệộ̣u tham khảể̉o Phụ lục DANH MỤC CÁÓ́C CHỮ VIÊÓ́T TẮT ADN Acid 2’- deoxyribonucleic B.subtilis Bacillus subtilis ATCC 6633 CLNN Chọộ̣n lọộ̣c ngẫẫ̃u nhiên CW Thàờ̀nh tếó́ bàờ̀o- Cell wall DM Dung mơi DMHC Dung mơi hữẫ̃u ĐB Đợộ̣t biếó́n Gr Gram IR Hồng ngoại- Infrared KS Kháng sinh L-DAP L- diaminopimelat MTdt Môi trườờ̀ng dịộ̣ch thểể̉ P.mirabilis Proteus mirabilis BV 108 SKLM Sắó́c kýó́ lớó́p mỏng SLNN Sàng lọộ̣c ngẫẫ̃u nhiên TB Tếó́ bàờ̀o TĐC Trao đổi chấó́t VK Vi khuẩn VSV Vi sinh vậộ̣t UV Tửể̉ ngoại ultra violet DANH MỤC CÁĨ́C BẢNG Bảể̉ng 2.1: Cáó́c VSV kiểể̉m địộ̣nh Bảể̉ng 2.2: Mơi trườờ̀ng ni cấó́y xạ khuẩn Bảể̉ng 2.3: Cáó́c mơi trườờ̀ng ni cấó́y VSV kiểể̉m địộ̣nh Bảể̉ng 2.4: Các dung mơi đãẫ̃ sửể̉ dụng Bảể̉ng 3.1: Kếó́t quảể̉ thửể̉ HTKS sàờ̀ng lọộ̣c ngẫẫ̃u nhiên chủể̉ng Streptomyces 52.13 Bảể̉ng 3.2: Kếó́t quảể̉ thửể̉ HTKS đợộ̣t biếó́n UV lầờ̀n Bảể̉ng 3.3: Kếó́t quảể̉ thửể̉ HTKS đợộ̣t biếó́n UV lầờ̀n Bảể̉ng 3.4: Kếó́t quảể̉ thửể̉ HTKS đợộ̣t biếó́n hóó́a họộ̣c Bảể̉ng 3.5: Kếó́t quảể̉ chọộ̣n dung mơi vàờ̀ pH chiếó́t Bảể̉ng 3.6: Kếó́t quảể̉ chọộ̣n mơi trườờ̀ng lên men chìờ̀m Bảể̉ng 3.7: Kếó́t quảể̉ chọộ̣n biếó́n chủể̉ng lên men chìờ̀m tớó́t nhấó́t Bảể̉ng 3.8: Kếó́t quảể̉ chạy sắó́c kí lớó́p mỏng Bảể̉ng 3.9: Kếó́t quảể̉ thửể̉ HTKS cáó́c phân đoạn sau chạy sắó́c kí cợộ̣t lầờ̀n Bảể̉ng 3.10: Kếó́t quảể̉ sắó́c kí lớó́p mỏng cáó́c phân đoạn sau chạy sắó́c kí cợộ̣t lầờ̀n Bảể̉ng 3.11: Kếó́t quảể̉ thửể̉ HTKS cáó́c phân đoạn sau chạy cợộ̣t lầờ̀n Bảể̉ng 3.12: Kếó́t quảể̉ sắó́c kí cáó́c phân đoạn sau chạy sắó́c kí cợộ̣t lầờ̀n DANH MỤC CÁĨ́C HÌNH Hình 1.1: Sơ đồ chếó́ táó́c dụng củể̉a cáó́c họộ̣ KS Hình 1.2: Cáó́c khuẩn ty xạ khuẩn Hình 1.3: Đườờ̀ng cong biểể̉u diễn sinh trưởng vàờ̀ pháó́t triểể̉n củể̉a xạ khuẩn ĐẶT VẤN ĐỀ Sự pháó́t hiệộ̣n táó́c dụng củể̉a kháó́ng sinh lầờ̀n đầờ̀u tiên củể̉a nhàờ̀ báó́c sĩ ngườờ̀i Anh Alexander Flaming vàờ̀o tháó́ng 10 năm 1928 làờ̀ mợộ̣t thàờ̀nh tựu vĩ đại củể̉a y họộ̣c Sự xuấó́t hiệộ̣n củể̉a kháó́ng sinh đãẫ̃ giúó́p ngườờ̀i chớó́ng lại tấó́n cơng củể̉a cáó́c loàờ̀i vi khuẩn nguy hiểể̉m vàờ̀ làờ̀m giảể̉m tỉ lệộ̣ tửể̉ vong cho ngườờ̀i bệộ̣nh Song, bảể̉n sinh tồn, vi khuẩn tìờ̀m mọộ̣i cáó́ch biếó́n đổi đểể̉ trở nên kháó́ng th́ó́c Mợộ̣t ví dụ điểể̉n hìờ̀nh cóó́ thểể̉ kểể̉ đếó́n làờ̀ việộ̣c vi khuẩn cóó́ thểể̉ tạo β- lactamase mợộ̣t loại enzym vi khuẩn tiếó́t cóó́ thểể̉ pháó́ hủể̉y cấó́u trúó́c củể̉a penicillin vàờ̀ vơ hiệộ̣u hóó́a táó́c dụng kháó́ng khuẩn củể̉a cáó́c kháó́ng sinh cóó́ cấó́u trúó́c vịng β-lactam Tớó́c đợộ̣ biếó́n đổi vũẫ̃ bãẫ̃o hiệộ̣n củể̉a vi khuẩn cóó́ thểể̉ tạo hàờ̀ng loạt cáó́c loại siêu vi khuẩn đa kháó́ng th́ó́c khiếó́n cho thếó́ giớó́i lâm vàờ̀o tìờ̀nh trạng khơng cóó́ phương pháó́p cứó́u chữẫ̃a cho nhiềờ̀u loại bệộ̣nh.Chính vìờ̀ vậộ̣y việộ̣c tìờ̀m ra, pháó́t triểể̉n cáó́c loại kháó́ng sinh mớó́i cóó́ hoạt tính kháó́ng khuẩn vàờ̀ hiệộ̣u quảể̉ điềờ̀u trịộ̣ cao làờ̀ mộộ̣t vấó́n đềờ̀ hếó́t sứó́c bứó́c thiếó́t củể̉a ngàờ̀nh cơng nghiệộ̣p kháó́ng sinh hiệộ̣n Như chúó́ng ta đãẫ̃ biếó́t sớó́ cáó́c kháó́ng sinh đượộ̣c biếó́t đếó́n hiệộ̣n mợộ̣t tỉ lệộ̣ lớó́n đềờ̀u cóó́ nguồn gớó́c từờ̀ xạ khuẩn Bên cạnh đóó́ theo cáó́c kếó́t quảể̉ điềờ̀u tra 65% kháó́ng sinh nguồn gớó́c xạ khuẩn làờ̀ chi Streptomyces sảể̉n xuấó́t Đóó́ làờ̀ sở đểể̉ cáó́c nhàờ̀ khoa họộ̣c nướó́c ta hiệộ̣n tậộ̣p trung nghiên cứó́u vàờ̀o chi xạ khuẩn nàờ̀y Tại bộộ̣ môn Vi sinh – sinh họộ̣c trườờ̀ng đại họộ̣c Dượộ̣c Hàờ̀ Nợộ̣i chúó́ng tơi đãẫ̃ chọộ̣n đềờ̀ tàờ̀i : “Góó́p phầờ̀n vàờ̀o nghiên cứó́u lên men tổng hợộ̣p kháó́ng sinh từờ̀ Streptomyces 52.13” Nợộ̣i dung củể̉a khóó́a ḷộ̣n mong ḿó́n đạt đượộ̣c cáó́c mục tiêu sau đây: - Nghiên cứó́u cáó́c biệộ̣n pháó́p cảể̉i tạo giớó́ng Streptomyces 52.13 nhằm làờ̀m tăng khảể̉ sinh tổng hợộ̣p kháó́ng sinh - Nghiên cứó́u điềờ̀u kiệộ̣n lên men, ni cấó́y vàờ̀ chiếó́t x́ó́t thích hợộ̣p - Tìm điềờ̀u kiệộ̣n tinh chếó́ KS thích hợộ̣p, bướó́c đầờ̀u nghiên cứó́u cấó́u trúó́c củể̉a KS 17 18 19 20 39 21 22 23 24 25 26 27 28-32 Cáó́c phân đoạn – 15 cóó́ hoạt tính KS kháó́ cao Tiếó́n hàờ̀nh sắó́c kýó́ lớó́p mỏng cáó́c phân đoạn từờ̀ 1-15 hệộ̣ dung môi ethylacetat: n-hexan :methanol (12:5:1) thu đượộ̣c kếó́t quảể̉ bảể̉ng 3.12 dướó́i đây: Bảng 3.12: Kết sắc kí lớp mỏng phân đoạn sau sắc kí cột lần Cáó́c phân đoạn 10 11-13 14 15 40 Nhận xét: - Phân đoạn làờ̀ cáó́c phân đoạn 1-8 - Phân đoạn 9,10 chứó́a chấó́t cóó́ HTKS :KS vàờ̀ KS phụ, đóó́ KS chiếó́m hàờ̀m lượộ̣ng chủể̉ ́ó́u - Cáó́c phân đoạn cịn lại kểể̉ từờ̀ phân đoạn 11 chứó́a chấó́t cóó́ HTKS đóó́ KS phụ làờ̀ chủể̉ yếó́u, KS chiếó́m lượộ̣ng Gợộ̣p cáó́c phân đoạn 1-8 lại, đem cô chân không thu đượộ̣c bộộ̣t KS Sau lại ta thu đượộ̣c m’=0,0205g bợộ̣t kháó́ng sinh Hiệộ̣u śó́t Hiệộ̣u śó́t tinh chếó́ KS sắó́c kí cợộ̣t làờ̀: H1×H2 = 51,41% × 38,75 % = 19,92% 3.4.3.Kết kết tinh: Kháó́ng sinh tinh khiếó́t đượộ̣c kếó́t tinh lại Sau kếó́t tinh ta thu đượộ̣c 0,0193g tinh thểể̉ kháó́ng sinh tinh khiếó́t Hiệộ̣u suấó́t củể̉a quáó́ trìờ̀nh kếó́t tinh làờ̀: H3=94,15% Vậộ̣y hiệộ̣u suấó́t củể̉a cảể̉ quáó́ trìờ̀nh tinh chếó́ kháó́ng sinh làờ̀: H=H1×H2×H3=18,75% Bợộ̣t KS tinh khiếó́t đượộ̣c đem đo phổ UV, IR , MS , nhiệộ̣t đợộ̣ nóó́ng chảể̉y 3.4.4.Kết đo phổ xác định cấu trúc KS tinh khiết - Nhiệộ̣t đợộ̣ nóó́ng chảể̉y củể̉a KS đo đượộ̣c làờ̀ 242,3ºC - Phổ tửể̉ ngoại cho cáó́c đỉnh hấó́p thụ cáó́c bướó́c sóó́ng 442,5 nm; 235,5nm; 212 nm Từờ̀ đóó́ cóó́ thểể̉ sơ bợộ̣ kếó́t ḷộ̣n KS cóó́ cáó́c cấó́u trúó́c nhân thơm, dịộ̣ tớó́ vàờ̀ dịộ̣ vịng - Phổ khớó́i: phân tửể̉ lượộ̣ng củể̉a KS thu đượộ̣c dự kiếó́n làờ̀ 1268,65433 đvC - Phổ hồng ngoại: cóó́ cáó́c dảể̉i hấó́p phụ đặc trưng sau: -1 + 3434 cm đặc trưng cho lien kếó́t N-H ( giữẫ̃a amin b1 b2, amid) 41 -1 + 2958; 2928 cm đặc cho liên kếó́t C – H củể̉a alkan + 1737 cm đặc trưng cho liên kếó́t C = O (ester, aldehyd ceton ) -1 + 1648 cm đặc trưng cho nhóó́m chứó́c amid ( R- CO – NR’R”) imin (C=N) -1 + 1582 cm đặc trưng cho nhóó́m nitro ( -NO2 ) -1 + 1475 cm đặc trưng cho liên kếó́t C=O -1 + 1294; 1270 cm đặc trưng cho liên kếó́t C – CO – C -1 + 1192; 1098 cm đặc trưng cho liên kếó́t C – O (cóó́ thểể̉ cóó́ nhóó́m alcol, ether, anhydride…) -1 + 793 ; 732 ; 637 cm đặc trưng cho nhóó́m alkyl bromide (R-Br) alkyl clorid (R-Cl) KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 1.Kết luận: Sau quáó́ trìờ̀nh nghiên cứó́u vềờ̀ bảể̉n khóó́a luậộ̣n đãẫ̃ giảể̉i quyếó́t đượộ̣c cáó́c mục tiêu đềờ̀ vàờ̀ thu đượộ̣c kếó́t quảể̉ sau: - Chủể̉ng Streptomyces 52.13 đượộ̣c sàờ̀ng lọộ̣c ngẫẫ̃u nhiên vàờ̀ đợộ̣t biếó́n cảể̉i tạo giớó́ng lầờ̀n tia UV vàờ̀ sau đóó́ ĐB phương pháó́p hóó́a họộ̣c MT ni cấó́y bềờ̀ mặt MT1 đãẫ̃ tạo mợộ̣t sớó́ biếó́n chủể̉ng cóó́ HTKS tăng lên đáó́ng kểể̉ - Lên men, chiếó́t xuấó́t vàờ̀ tinh chếó́ kháó́ng sinh: + Chọộ̣n đượộ̣c mơi trườờ̀ng lên men tớó́t nhấó́t cho Streptomyces 52.13 là MT1dt, biếó́n chủể̉ng lên men tớó́t nhấó́t làờ̀ ĐBHH 25 + Chiếó́t xuấó́t: kháó́ng sinh Streptomyces 52.13 tổng hợộ̣p đượộ̣c chiếó́t từờ̀ dịộ̣ch lên men Ethylacetat pH=3 42 + Tinh chếó́: phương pháó́p rửể̉a giảể̉i cợộ̣t Hệộ̣ dung mơi chạy lầờ̀n butylacetat:aceton:triethylamin (1:2:1).Hệộ̣ dung môi chạy lầờ̀n ethylacetat:n-hexan:methanol (12:5:1) Sau quáó́ trìờ̀nh tinh chếó́ chạy cợộ̣t vàờ̀ kếó́t tinh đãẫ̃ thu đượộ̣c kháng sinh tinh khiếó́t Kháng sinh tinh khiếó́t thu đượộ̣c 0,0193g vớó́i hiệộ̣u śó́t 18,75% - Phân tích sơ bợộ̣ cấó́u trúó́c củể̉a KS thu đượộ̣c kếó́t quảể̉ sau: +Nhiệộ̣t đợộ̣ nóó́ng chảể̉y củể̉a KS làờ̀ 242.3 ºC +Phân tửể̉ lượộ̣ng củể̉a KS tinh khiếó́t đo đượộ̣c cóó́ dự kiếó́n làờ̀ 1268,65433 đvC +Phân tích phổ UV vàờ̀ IR cho phép sơ bợộ̣ xáó́c địộ̣nh mợộ̣t sớó́ nhóó́m chứó́c đặc trưng củể̉a KS Kháó́ng sinh cóó́ chứó́a nhân thơm, nớó́i đơi liên hợộ̣p, dịộ̣ vịng vàờ̀ dịộ̣ tớó́ Mợộ̣t sớó́ liên kếó́t đặc trưng cóó́ phân tửể̉ C – O, C = O, N –H, - NO2, amid, alkylbromid Nhận xét: So sáó́nh vớó́i KS đượộ̣c tinh chếó́ cáó́ch năm ta cóó́ thểể̉ thấó́y kháó́ng sinh tinh khiếó́t thu đượộ̣c cóó́ nhiệộ̣t đợộ̣ nóó́ng chảể̉y cao hơn, phổ IR cóó́ đỉnh hấó́p phụ nhọộ̣n hơn, vậộ̣y sơ bợộ̣ khẳng địộ̣nh KS thu đượộ̣c cóó́ đợộ̣ tinh khiếó́t cao Ngoàờ̀i ra, đãẫ̃ chọộ̣n đượộ̣c dung mơi chiếó́t mớó́i làờ̀ ethylacetat, so vớó́i nbutanol đãẫ̃ đượộ̣c dùờ̀ng khóó́a luậộ̣n trướó́c cóó́ nhiềờ̀u ơu điểể̉m đợộ̣c, tạo nhũẫ̃ Mơi trườờ̀ng lên men thích hợộ̣p chọộ̣n đượộ̣c làờ̀ MT1dt (khóó́a ḷộ̣n trướó́c làờ̀ MT2dt) 2.Kiến nghị - Tiếó́p tục nghiên cứó́u cảể̉i tạo giớó́ng nhiềờ̀u phương pháó́p kháó́c đểể̉ tạo cáó́c biếó́n chủể̉ng cóó́ khảể̉ tổng hợộ̣p kháó́ng sinh cóó́ hoạt tính mạnh nữẫ̃a 43 - Nghiên cứó́u điềờ̀u kiệộ̣n tớó́i ưu đểể̉ lên men nhằm nâng cao hiệộ̣u suấó́t lên men Streptomyces 52.13 - Nghiên cứó́u hoàờ̀n thiệộ̣n qui trìờ̀nh chiếó́t táó́ch tinh chếó́ nhằm thu sảể̉n phẩm cóó́ đợộ̣ tinh khiếó́t cao hoạt tính KS mạnh, táó́ch đượộ̣c cáó́c thàờ̀nh phầờ̀n KS kháó́c - Tiếó́p tục đo phổ cợộ̣ng hưởng từờ̀ hạt nhân đểể̉ xáó́c địộ̣nh cấó́u trúó́c hóó́a họộ̣c củể̉a KS TÀỜ̀I LIỆỘ̣U THAM KHẢO Tiếng ViệỘ̣t: Trầờ̀n Tửể̉ An (2007), Hóa phân tích, NXB Y họộ̣c, tậộ̣p Trầờ̀n Thịộ̣ Hồng Anh (1993), Quang phổ hấp thụ tử ngoại-khả kiến ứng dụng định lượng kháng sinh, NXB Khoa họộ̣c vàờ̀ kỹẫ̃ tḥộ̣t Bợộ̣ Y tếó́ (2007): Kỹ thuật bào chế sinh dược học dạng thuốc, nhàờ̀ x́ó́t bảể̉n Y họộ̣c, Hàờ̀ Nợộ̣i, Tr 62 – 68, 115 – 133 – 87 Bộộ̣ Y Tếó́ (2008), Vi sinh vật học, nhàờ̀ xuấó́t bảể̉n giáó́o dục , Hàờ̀ Nợộ̣i, Tr 22 Nguyễn Văn Cáó́ch, Công nghệ lên men kháng sinh, NXB Khoa họộ̣c vàờ̀ kỹẫ̃ thuậộ̣t 15 – Lê Huy Chính (2007), Vi sinh vật y học, nhàờ̀ xuấó́t bảể̉n Y họộ̣c, Hàờ̀ Nộộ̣i, tr 16, 50 – 56 Nguyễn Lân Dũẫ̃ng (2001), Vi sinh vật học, NXB Giáó́o dục, tr 39-67 Trầờ̀n Đứó́c Hậộ̣u (2006), Hóa dược, NXB Y họộ̣c, tậộ̣p Võ Thịộ̣ Bạch Huệộ̣ (2008) , Hóa phân tích, NXB y họộ̣c, tậộ̣p 2, tr 58-122, tr 205225 10 Từờ̀ Minh Koóó́ng (2006), Kỹ thuật sản xuất dược phẩm I, NXB Y họộ̣c, tậộ̣p 11 Từờ̀ Minh Koóó́ng (2006), Kỹ thuật sản xuất dược phẩm II, NXB Y họộ̣c, tậộ̣p 12 Lương Đứó́c Phẩm (1999), Công nghệ vi sinh vật, NXB Nông nghiệộ̣p 13 Việộ̣t Nguyễn Văn Thạch (2009), Công nghệ sinh học dược, NXB Giáó́o dục Nam, tr 35-57 14 Nguyễn Văn Thanh (2007), Sinh học phân tử, NXB Giáó́o dục, tr 40-52 15 Cao Văn Thu (1998), Bài giảng kháng sinh vitamin 16 Cao Văn Thu (2008), Sinh học đại cương, NXB giáo dục, tr.153 – 156 17 Cao Văn Thu (2008), Vi sinh vật học, NXB Y họộ̣c, Hàờ̀ Nợộ̣i 18 Mai Tấó́t Tớó́, Vũẫ̃ Thịộ̣ Trâm (2007), Dược lý học, NXB Y họộ̣c, tậộ̣p 19 Hồ Viếó́t Quýó́ (2002), Chiết, tách, phân chia, xác định chất dung môi 1, NXB khoa họộ̣c vàờ̀ kĩ thuậộ̣t, tr 9- Tiếng Anh: 20 Donald L Pavia, Gary M Lampman, George S Kriz (1996), Introduction to Spectroscopy, Thomson Learning, Washington, USA 21 Makoto Hashimoto, Hirotaka Katsura, Risako Kato, Hiroshi KaWaide and Masahiro Natsume (2011), “ Effect of Panamycin – 607 on Secondary Metabolite Production by Streptomyces spp”, Biosci Biostechnol.Bioschem, 75(9), pp 1722 – 1726 22 Rezanka T, Siristova L, Schreiberová O, Rezanka M, Masák J, Melzoch K, Sigler K, (2011) ,“Pivalic acid acts as a starter unit in a fatty acid and antibiotic biosynthetic pathway in Alicyclobacillus, Rhodococcus and Streptomyces”, Envirol of Microbiol, 13(6), pp 1577 – 1589 23.Trygve Brautaset, Havard Sletta, Kristin F.Degnes, Olga N.Sekurova, Ingrid Bakke, Olga Volokhan, trygve Andreassen, Trond E Ellingsen, and Sergey B Zotchev (2011), “New nystatin – related antifungal polyene macrolides with altered polyol region generated via biosynthetic engineering of Streptomyces noursei”, Appl Environ Microbiol, 77 (18), pp.6636 – 6643 24 Weinberrg E.D (1973), “Secondary metabolism Control by temperature and inorganic photphate”, Ind Microbiol, 15, pp 1- 14 PHỤ LỤC Hình P4: Khuẩn lạc xạ khuẩn sau đợỘ̣t biến hóa họỘ̣c Hình P5: Thử HTKS biến chủng sau ĐBHH Hình P6: Thử HTKS MT lên men phương pháp giếng thạch Hình P7: Thử HTKS phân đoạn sắc kí cợỘ̣t lần phương pháp khoanh giấy lọỘ̣c Hình P8: Sắc kí lớĨ́p mỏng hiệỘ̣n hình VSV BO MON HOA VAT LIEU-KHOA HOA-TRUONG DHKHTN Ten may: GX-PerkinElmer-USA Resolution: 4cm-1 Date: 3/13/2013 101.6 90 80 70 60 50 %T 40 30 20 10 0.0 4000.0 Hình P9: Kết đo phổ hồng ngoại Hình P10: Kết đo khối phổ ... ethylacetat 3.3 Lên men dịch thể sinh tổng hợp kháng sinh 3.3.1 ChọỘ̣n mơi trườỜ̀ng lên men tốt Tiếó́n hàờ̀nh thửể̉ nghiệộ̣m khảể̉ sinh tổng hợộ̣p kháó́ng sinh củể̉a Streptomyces 52. 13 MT1dt,... cao khảể̉ sinh tổng hợộ̣p kháó́ng sinh củể̉a chủể̉ng xạ khuẩn 2.2.2 Lên men, chiết tách kháng sinh 2.2.2.1 .Lên men - Từờ̀ MT lên men bềờ̀ mặt tớó́t nhấó́t, chọộ̣n MT lên men chìờ̀m... thay đổi đáó́ng kểể̉ khảể̉ sinh tổng hợộ̣p củể̉a KS củể̉a nhiềờ̀u loại xạ khuẩn 1.4.3 .Lên men sinh tổng hợp kháng sinh từ Streptomyces a.Định nghĩa: Lên men làờ̀ quáó́ trìờ̀nh phân