Góp phần nghiên cứu lên men tổng hợp kháng sinh từ streptomyces 155 16​

BỘYTẾ TRƢỜNG ĐẠI HỌC DƢỢC HÀ NỘI VƢƠNG THỊ THẮM GÓP PHẦN NGHIÊN CỨU LÊN MEN TỔNG HỢP KHÁNG SINH TỪ Streptomyces 155.16 KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƢỢC SĨ HÀ NỘI - 2013 BỘYTẾ TRƢỜNG ĐẠI HỌC DƢỢC HÀ NỘI VƢƠNG THỊ THẮM GÓP PHẦN NGHIÊN CỨU LÊN MEN TỔNG HỢP KHÁNG SINH TỪ Streptomyces 155.16 KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƢỢC SĨ Ngƣời hƣớng dẫn ThS Lê Thị Thu Hương TS Bùi Quang Phúc Nơi thực Bộ môn Vi sinh – Sinh học Viện sốt rét – kí sinh trùng trung ương HÀ NỘI - 2013 LỜI CẢM ƠN Tơi xin bày tỏ lịng biết ơn sâu sắc đến Thạc sỹ Lê Thị Thu Hƣơng, TS Bùi Quang Phúc trực tiếp hƣớng dẫn, ân cần bảo tơi thực hồn thành khóa luận Tôi xin chân thành cảm ơn thầy, cô giáo, cán bộ, kỹ thuật viên giảng dạy, công tác môn Vi sinh – Sinh học, viện sốt rét – kí sinh trùng trung ƣơng, khoa Hóa – trƣờng Đại học Quốc gia Hà Nội, Viện Hóa học tạo điều kiện, giúp đỡ thời gian tơi thực khóa luận Tơi xin gửi lời cảm ơn tới Ban giám hiệu thầy cô giáo trƣờng Đại học Dƣợc Hà Nội tạo điều kiện thuận lợi cho tơi q trình học tập trƣờng Tôi xin gửi lời cảm ơn tới gia đình, bạn bè động viên, quan tâm, giúp đỡ suốt thời gian qua Do điều kiện hạn hẹp thời gian, phƣơng tiện nghiên cứu trình độ thân cịn hạn chế, khóa luận khơng tránh khỏi thiếu sót Rất mong nhận đƣợc ý kiến đóng góp từ thầy bạn bè để khóa luận đƣợc hồn thiện Tôi xin chân thành cảm ơn! Hà Nội, ngày 20/05/2013 Sinh viên Vƣơng Thị Thắm MỤC LỤC ĐẶT VẤN ĐỀ………………………………………………………………………1 CHƢƠNG TỔNG QUAN…….………………………………………………….2 1.1.Đại cƣơng kháng sinh.……………………………………………………….2 1.1.1 Định nghĩa kháng sinh ……….………………………………….2 1.1.2 Đặc tính kháng sinh … 1.1.3 Phân loại kháng sinh ……………………………………………….2 1.1.3 Cơ chế tác dụng kháng sinh…………………………………… 1.1.4 Ứng dụng kháng sinh…………………………………… 1.2 Đại cƣơng xạ khuẩn………………………………………………… …….4 1.2.1 Đặc điểm chung xạ khuẩn……… 1.2.2 Đặc điểm xạ khuẩn chi Streptpmyces 1.2.3 Các yếu tố ảnh hƣởng đến khả khuẩn ……………………………………………………………………… 1.3.Tuyển chọn, cải tạo giống bảo quản giống xạ khuẩn…………………… …7 1.3.1 Mục đích……………………………… 1.3.2 Chọn chủng có HTKS cao phép 1.3.3 Đột biến cải tạo giống …………………………………… … 1.3.4 Bảo quản giống xạ khuẩn …………………………………… … 1.4.Lên men sinh tổng hợp kháng sinh 1.4.1 Đại cƣơng ………………………………… …… …… …………………………… ………………… 1.4.2 Các phƣơng pháp lên men ………………………………… …… 1.5.Chiết tách tinh chế kháng sinh từ dịch lên men ………………………… 10 1.5.1 Lọc chiết xuất………………………………………………… 10 1.5.2 Tách tinh chế ……………………………………………… 10 1.6.Bƣớc đầu nghiên cứu cấu trúc kháng sinh ………………………………….11 1.6.1 Phổ tử ngoại - khả kiến……………………………… … ……….11 1.6.2 Phổ hồng ngoại ……………………………………………… 11 1.6.3 Phổ khối… ……………………………………………………… 11 1.7.Một số nghiên cứu Streptomyces sinh tổng hợp kháng sinh… 11 1.7.1 Phân loại, lên men, tinh chế xác định hoạt tính sinh học kháng sinh Sparsomycin- đƣợc sản xuất Streptomyces sp.AZ-NIOFD1 ……11 1.7.2 Phân lập, định tên tối ƣu hóa trình sản xuất kháng sinh từ xạ khuẩn Streptomyces phân lập từ đất vùng Wady El Natron- Ai Cập ……12 CHƢƠNG II: ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ………… 14 2.1 Nguyên vật liệu thiết bị ……………………………………………… 14 2.1.1 Chủng xạ khuẩn… ……………………………………………… 14 2.1.2 Chủng vi sinh vật kiểm định ………………………………….14 2.1.3 Môi trƣờng ……………………………………………………… 14 2.1.4 Dung môi ……………………………………………………… 15 2.1.5 Vật liệu chạy sắc ký: 2.1.6 Máy móc thiết bị …………………………………………16 ……………………………………………… 16 2.2 Nội dung nghiên cứu ……………………………………………………… 17 2.2.1 Chọn lọc, cải tạo giống…………… 2.2.2 Lên men, chiết tách kháng sinh tối 2.2.3 Sơ xác định số tính chất củ 2.3 Phƣơng pháp nghiên cứu ……………………………………………… 18 2.3.1 Nuôi cấy giữ giống xạ khuẩn ống nghiệm… ……………18 2.3.2 Phƣơng pháp sàng lọc ngẫu nhiên ………………………………… 18 2.3.3 Đánh giá hoạt tính kháng sinh phƣơng pháp khuếch tán … 18 2.3.4 Đột biến ánh sáng UV…… …………………………… … 19 2.3.4 Phƣơng pháp đột biến hóa học…… 2.3.5 Lên men chìm tổng hợp kháng sin 2.3.6 Chiết kháng sinh từ dịch lên men b 2.3.7 Tách thành phần kháng sinh sắc ký lớp mỏng…… 22 2.3.8 Thu kháng sinh thô phƣơ 2.3.9 Tinh chế kháng sinh thô s 2.3.10 Sơ xác định kháng sinh tinh CHƢƠNG III: KẾT QUẢ THỰC NGHIỆM VÀ NHẬN XÉT ………………… 24 3.1.Nghiên cứu cải tạo giống lên men sinh tổng hợp kháng sinh …………….24 3.1.1 Kết sàng lọc ngẫu nhiên………… 3.1.2 Kết đột biến cải tạo giống lần 3.1.3 Kết đột biến cải tạo giống lần 3.1.4 Kết đột biến cải tạo giống lần 3.1.5 Kết chọn môi trƣờng lên men ch 3.1.6 Kết chọn chủng lên men………… 3.2 Chiết tách, tinh chế kháng sinh …………………………………………29 3.2.1 Kết sắc ký lớp mỏng chọn hệ dung môi… ………………… 29 3.2.2 Kết tinh chế kháng sinh SK cột…… ……………………29 3.3 Kết đo nhiệt độ nóng chảy, đo phổ kháng sinh tinh khiết … ………34 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT ……………………………………………… 36 KẾT LUẬN ………………………………………………………………………36 ĐỀ XUẤT ………………………………………………………………………37 DANH M ATCC American Type Cu ADN Acid 2’-deoxyribo BLAST Basic Local Alignment Search Tool CFU Colony Forming U DM Dung môi ĐB Đột biến ĐBHH Đột biến hóa học HTKS Hoạt tính kháng si IR Infrared ( hồng ng ISP International Strep KS Kháng sinh MS Mass Spectroscop MT Môi trƣờng MTdt Môi trƣờng dịch t MW Moleculer Weight NMR Nuclear magnetic rRNA ribosome Ribonuc SK Sắc kí SKLM Sắc kí lớp mỏng SLNN Sàng lọc ngẫu nh T UV n/c Nhiệt độ nóng chả Ultra violet ( tử ng VK Vi khuẩn VSV Vi sinh vật DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 2.1: Các MT nuôi cấy VSV kiểm định Bảng 2.2: Các MT nuôi cấy xạ khuẩn Bảng 2.3: Các dung môi sử dụng nghiên cứu Bảng 3.1: Kết thử HTKS sau sàng lọc ngẫu nhiên Bảng 3.2: Kết thử HTKS sau đột biến lần Bảng 3.3: Kết thử HTKS sau đột biến lần Bảng 3.4: Kết thử HTKS sau đột biến lần Bảng 3.5: Kết chọn mơi trƣờng lên men chìm Bảng 3.6: Kết chọn chủng lên men Bảng 3.7: Kết chọn hệ dung môi chạy sắc ký Bảng 3.8: Kết thử nghiệm sau sắc kí cột lần Bảng 3.9: Kết thử nghiệm sau sắc kí cột lần 2(cho hỗn hợp 1) Bảng 3.10: Kết thử nghiệm sau sắc kí cột lần 2(cho hỗn hợp 2) Bảng 3.11: Kết thử nghiệm sau sắc kí cột lần Bảng 3.12: Kết dự đoán từ phổ MS Bảng 3.13 : Kết IR DANH MỤC CÁC HÌNH VÀ PHỤ LỤC Hình 1.1 : Sơ đồ phân loại xạ khuẩn Hình 1.2 : Các loại khuẩn ti xạ khuẩn Hình P1: Kết thử HTKS biến chủng sau ĐBHH phƣơng pháp khối thạch (VSV kiểm định : S flexneri) Hình P2: Kết thử HTKS dịch lên men phƣơng pháp giếng thạch (VSV kiểm định : S flexneri) Hình P3: Kết thử HTKS phân đoạn chạy sắc ký cột lần phƣơng pháp khoanh giấy lọc Phụ lục : Phổ UV- VIS kháng sinh Phụ lục 2: Phổ IR kháng sinh Phụ lục 3: Phổ MS kháng sinh -1- ĐẶT VẤN ĐỀ Bước sang kỷ 21, người tiếp tục phải đối mặt với nguy tử vong cao đến từ bệnh nhiễm khuẩn Việc kiểm soát bệnh vấp phải tác động bất lợi tình trạng kháng kháng sinh ngày tăng, đặc biệt quốc gia phát triển Nhu cầu việc tìm loại thuốc kháng sinh với phổ tác dụng rộng, độ an tồn cao, làm giảm chi phí y tế, mối quan tâm cộng đồng Tuy nhiên việc nghiên cứu bị bỏ ngỏ, chí hãng dược phẩm lớn vấn đề kinh phí Do đặt yêu cầu tìm loại kháng sinh tận dụng nguồn lực sẵn có để chi phí sản suất thấp Thực tế, có khoảng 80% số kháng sinh sử dụng sinh tổng hợp từ xạ khuẩn, 55% chi Streptomyces tạo ra; 50% số 20 000 chất chuyển hóa thứ cấp có hoạt tính sinh học sản xuất từ xạ khuẩn có nguồn gốc từ đất Trong phân lập dễ từ đất chi xạ khuẩn Streptomyces Từ nghiên cứu ban đầu cho thấy, chủng xạ khuẩn Streptomyces 155.16 môn Vi sinh – Sinh học – trường Đại học Dược Hà Nội cung cấp, cho kháng sinh có hoạt tính mạnh, ổn định, có nhiều tiềm thực tế, nên chúng tơi lựa chọn đề tài: “Góp phần nghiên cứu lên men tổng hợp kháng sinh từ Streptomyces 155.16” Khóa luận mong muốn đạt mục tiêu sau đây: Nâng cao hiệu suất sinh tổng hợp kháng sinh thông qua chọn lọc cải tạo giống Xác định điều kiện lên men, chiết tách kháng sinh với hiệu suất cao, chi phí thấp Sơ xác định cấu trúc kháng sinh thu -32- Bảng 3.10: Kết thử nghiệm sau sắc kí cột lần 2(cho hỗn hợp 2) Kết Phân đoạn 1->8 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29->35 Nhận xét : hỗn hợp 1, phân đoạn – 29 – 35 khơng có HTKS Ở hỗn hợp 2, phân đoạn 1- 29 – 35 khơng có HTKS Khi chạy SK cột cho hỗn hợp 2, từ phân đoạn 19 bắt đầu xuất chất thứ 3, nhiên so sánh kết thu bảng 3.12 bảng 3.13, nhận thấy chất không ảnh hưởng đến HTKS hỗn hợp Do đó, gộp phân đoạn 8-22 hỗn hợp phân đoạn từ - 18 hỗn hợp 2, thu hỗn hợp gồm thành phần có R f SKLM có HTKS mạnh -33- Đem cất quay hỗn hợp để thu kháng sinh, tiếp tục tiến hành tách riêng thành phần hỗn hợp Tiến hành SK cột cho hỗn hợp KS với hệ dung môi khai triển ethylacetat : n-hexan : methanol (13 : 10 : 1) Lấy 38 phân đoạn, phân đoạn 2,5 ml Thử HTKS phân đoạn phương pháp khoanh giấy lọc (với VSV kiểm định S.flexneri) tiến hành SKLM cho phân đoạn Kết thu trình bày bảng 3.11 Bảng 3.11: Kết thử nghiệm sau sắc kí cột lần Kết Phân đoạn 1->10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35->38 -34- Nhận xét : Các phân đoạn 1-10, 35- 38 khơng có HTKS Các phân đoạn từ 1123 có thành phần Rf gộp lại, tiến hành cất quay ta thu kháng sinh tinh khiết Hịa kháng sinh khơ thu vào dung môi ethylacetat, tiến hành chấm SKLM với hệ dung môi khác, nhận thấy thu vết Như vậy, kháng sinh thu tinh khiết Tiến hành kết tinh lại để kháng sinh thu đạt độ tinh khiết cao 3.3 Kết đo nhiệt độ nóng chảy, đo phổ kháng sinh tinh khiết Nhiệt độ nóng chảy kháng sinh: 161,95ºC Phổ tử ngoại: tiến hành đo phổ UV-VIS phịng Hóa phân tích – Khoa Hóa học- Đại học Quốc gia Hà Nội, cho kết kháng sinh có đỉnh hấp thụ tử ngoại ở: 208nm, 333nm 442,5 nm Từ đó, dự đốn cấu trúc KS có, nối đơi liên hợp, dị tố, kết hợp đặc điểm (PL1) Phổ khối (PL3) : tiến hành đo phịng phân tích cấu trúc phân tử -Viện Hóa học – Viện Hàn lâm khoa học công nghệ Việt Nam, đo máy với độ phân giải cao, cho phép xác định số xác tới chữ số hàng thập phân Kết dự đoán khối lượng phân tử kháng sinh 1291.697290 đvC Trong phân tử kháng sinh có chứa nguyên tố bảng 3.12 Bảng 3.12 : Kết dự đoán từ phổ MS Các nguyên tố C H N O S Na -35- Phổ hồng ngoại: (PL2) mẫu kháng sinh tinh khiết tiến hành đo độ hấp thụ hồng ngoại Viện Hóa học – Viện Hàn lâm khoa học công nghệ Việt Nam, cho thấy bước sóng hấp thụ cực đại nhóm chức dự đốn tương ứng trình bày bảng 3.13 Bảng 3.13: Kết IR Đỉnh hấp thụ -1 (cm ) 3346.03 2938.18 2874.89 1668.68 1742.91 1583.45 1369 1270.02 1195.79 1096.82 692.67 610.19 552.45 483.72 -36- KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT KẾT LUẬN Qua nghiên cứu, hoàn thành mục tiêu ban đầu khóa luận tốt nghiệpvà rút số kết luận cụ thể sau: Tiến hành ĐB cải tạo giống theo phương pháp khác giúp tăng HTKS KS sinh tổng hợp chủng xạ khuẩn Streptomyces 155.16 Môi trường lên men chìm tốt MT1dt Kháng sinh thơ thu sau chiết từ dịch lọc dịch lên men dung môi ethylacetat pH = 7, tách tốt sắc kí cột với hệ dung mơi (Butylacetat : ethanol : triethylamin (1: 2: 1)) Để thu kháng sinh tinh khiết cần tiếp tục chạy sắc kí lần với hệ dung mơi ethylacetat : methanol (13:1) lần với hệ dung môi ethylacetat : n-hexan : methanol ( 13 : 10 : 1) Có thành phần hỗn hợp kháng sinh thô Hiệu suất tinh chế kháng sinh lần 57,01% Kháng sinh thứ tinh khiết thu có số đặc điểm sau: Kháng sinh có màu cam, tan tốt methanol, ethylacetat, butanol Có phổ tác dụng rộng, vi khuẩn Gram (+) Gram(-) Trong dung môi methanol, kháng sinh hấp thụ ánh sáng tử ngoại cho đỉnh hấp thụ λ1 = 208nm, λ2 = 333nm λ3 = 442,5nm Như kháng sinh chưa nối đơi liên hợp, có dị tố tổng hợp yếu tố Biện giải phổ hồng ngoại, sơ dự đoán kháng sinh có nhóm chức : amin, acid carboxylic, ceton, ester, muối amin bậc Nhiệt độ nóng chảy kháng sinh T phân tử lượng 1291,697290 đvC nc = 161,95 C Kháng sinh có -37- ĐỀ XUẤT Từ kết thu được, đề xuất tiếp tục phát triển đề tài nghiên cứu sâu theo hướng sau: Tiếp tục đột biến chủng Streptomyces 155.16 (bằng UV, hóa chất, phương pháp đột biến bậc thang, kỹ thuật gen …) để tạo chủng có khả siêu sinh tổng hợp kháng sinh Nghiên cứu cụ thể ảnh hưởng yếu tố thuộc môi trường lên men để tăng hiệu suất sinh tổng hợp kháng sinh; điều kiện để tăng hiệu suất kháng sinh hỗn hợp Tiếp tục nghiên cứu điều kiện chiết tách để thu kháng sinh tinh khiết có hiệu suất cao hơn, dung mơi an toàn Tiến hành biện giải phổ cộng hưởng từ hạt nhân ( H-NMR 13 C- NMR) kết hợp với phổ khác để xác định cấu trúc kháng sinh tổng hợp Giải trình tự gen để nhận biết phân loại chủng Streptomyces 155.16 TÀI LIỆU THAM KHẢO Tài liệu tham khảo tiếng Việt: [1] Trần Tử An (2007), Hóa phân tích, NXB Y học, tập [2] Trần Thị Hồng Anh (1993), Quang phổ hấp thụ tử ngoại-khả kiến ứng dụng định lượng kháng sinh, NXB Khoa học kỹ thuật [3] Nguyễn Văn Cách (2004), Công nghệ lên men kháng sinh, NXB Khoa học kỹ thuật [4] Lê Huy Chính (2007), Vi sinh vật y học, NXB Y học, tr 25-57 [5] Nguyễn Lân Dũng (2001), Vi sinh vật học, NXB Giáo dục, tr 39-67 [6] Nguyễn Lân Dũng , Nguyễn Nữ Kim Thảo , Các nhóm vi khuẩn chủ yếu, Phân loại xạ khuẩn http://vietsciences.free.fr/khaocuu/nguyenlandung/phanloaixakhuan01.htm [7] Bùi Thị Hà ( 2008), Nghiên cứu xạ khuẩn thuộc chi Streptomyces sinh chất kháng sinh chống nấm chè Thái Nguyên, Luận văn thạc sĩ, trường Đại học Sư phạm, Đại học Thái Nguyên, tr.3-16 [8] Trần Đức Hậu (2006), Hóa dược, NXB Y học, tập [9] Từ Minh Koóng (2006), Kỹ thuật sản xuất dược phẩm II, NXB Y học, tập [10] Lương Đức Phẩm (1999), Công nghệ vi sinh vật, NXB Nông nghiệp [11] Nguyễn Văn Thạch (2009), Công nghệ sinh học dược, NXB Giáo dục Việt Nam, tr 35-57 [12] Cao Văn Thu (1998), Bài giảng kháng sinh vitamin [13] Cao Văn Thu, Trần Trịnh Công, Kiều Khắc Đôn, Nguyễn Liên Hương, Nguyễn Lệ Phi, (2008), Vi sinh vật học, NXB Y học, Hà Nội [14] Mai Tất Tố, Vũ Thị Trâm (2007), Dược lý học, NXB Y học, tập [15] Nguyễn Thị Cẩm Vân (2011), Nghiên cứu trình sinh tổng hợp kháng sinh nhờ Streptomyces 155.16, Luận văn thạc sĩ, Trường Đại học Dược Hà Nội Tài liệu tham khảo tiếng Anh [16]H.M Atta, S.M Dabour and S.G Desoukey (2009), “Sp production by Streptomyces Sp AZ-NIOFD1:Taxonom Purification and Biological Activities”, American-Eur Environ Sci., page 368-377 [17] Kino T, Hatanaka H, Hasimo , Kohsaka M, Aoki H, Imanaka H (1987), FK-506 immunosuppressant isolated from a Streptomyces I Fer and physico-chemical and biological characteristics”, antibiotics, vol XL , pages 1249 – 1255 [18] Kekuda, T.R.P., K.S Shobha diversity and potent biological activities of Actinomy Pharm Res., page 250-256 [19]Mervyn Bibb and Andrew Hesketh (2009), “Analyzing t Antibiotic Production in Streptomycetes”, Methods in En 458, page 93-116 [20]Mohamed E Osman, Fath Allah H Ahmed, Walla S.M “Antibiotic Production from Local Streptomyces Isola Soil at Wady El Natron: Isolation, Identification and Australian Journal of Basic and Applied Sciences, pag [21]Peter F Stanbury (1988), Fermentation Technology, pag [22]Rudi Emerson de Lima Procópio, Ingrid Reis da Silva, M Martins, João Lúcio de Azevedo, Janete “Antibiotics produced by Streptomyces”, The Brazilian J Diseases, 16(5), Pages 466–471 [23] Skorska, C., J Sitkowska, E Dutkiewicz (2005), Exposure to endotoxin during processing of peppermint and chamomiles herbs in farms, Ann Agric Environ Med., 12: 281-288 [24] Vladislav Běhal (2000), “Bioactive Products from Streptomyces” , Adv Appl Microbiol 47, page 113-156 [25] Waksman, S.A.(1961), The Actinomycetes Classification, identification and description of genera and species, vol 2, The Williams & Wilkins Co., Baltimore, USA [26] Watve MG, Tickoo R, Jog MM, Bhole BD (2001), “How many antibiotics are produced by the genus Streptomyces?”, Archives Microbiology, 176(5), page 386-390 [27] Weinberrg E.D ( 1973) , “Secondary metabolism Control by temperature and inorganic phosphate” , Ind Microbiol 15 , pages 1- 14 Hình P1: Kết thử HTKS biến chủng sau ĐBHH phương pháp khối thạch (VSV kiểm định : S flexneri) Hình P2: Kết thử HTKS dịch lên men chọn chủng phương pháp giếng thạch (VSV kiểm định : S.flexneri) Hình P3 : Kết thử HTKS phân đoạn chạy sắc ký cột lần1 phương pháp khoanh giấy lọc ( VSV kiểm định : S.flexneri) PHỤ LỤC : PHỔ UV – VIS PHỤ LỤC : PHỔ IR PHỤ LỤC : PHỔ MS ... nên lựa chọn đề tài: ? ?Góp phần nghiên cứu lên men tổng hợp kháng sinh từ Streptomyces 155. 16” Khóa luận mong muốn đạt mục tiêu sau đây: Nâng cao hiệu suất sinh tổng hợp kháng sinh thông qua chọn... THẮM GÓP PHẦN NGHIÊN CỨU LÊN MEN TỔNG HỢP KHÁNG SINH TỪ Streptomyces 155. 16 KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƢỢC SĨ Ngƣời hƣớng dẫn ThS Lê Thị Thu Hương TS Bùi Quang Phúc Nơi thực Bộ môn Vi sinh – Sinh. .. cấu tạo chất nghiên cứu; dùng phân tích định lượng.[1] 1.7 Một số nghiên cứu Streptomyces sinh tổng hợp kháng sinh 1.7.1 Phân loại, lên men, tinh chế xác định hoạt tính sinh học kháng sinh Sparsomycin-