Góp phần nghiên cứu lên men tổng hợp kháng sinh từ streptomyces 156 11​

BỘYTẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI NGÔ NGUYỄN QUỲNH ANH GÓP PHẦN NGHIÊN CỨU LÊN MEN TỔNG HỢP KHÁNG SINH TỪSTREPTOMYCES 156.11 KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ HÀ NỘI - 2013 BỘYTẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI NGƠ NGUYỄN QUỲNH ANH GĨP PHẦN NGHIÊN CỨU LÊN MEN TỔNG HỢP KHÁNG SINH TỪSTREPTOMYCES 156.11 KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ Người hướng dẫn: PGS.TS Cao Văn Thu Nơi thực hiện: Bộ môn Vi sinh Sinh học Trường Đại học Dược Hà Nội HÀ NỘI - 2013 LỜI CẢM ƠN Với lịng biết ơn sâu sắc, tơi xin gửi lời cảm ơn chân thành đên thầy giáo PGS TS Cao Văn Thu– môn Vi sinh - Sinh học, đã tận tình hương dẫn tư những bươc đầu tiên cho đên hoan thành khóa luận Tôi xin chân thành cam ơn các thầy cô giáo, các cán bô, kỹ thuật viên giang dạy, công tác tại Bô môn Vi sinh - Sinh hoc, Bộ môn Công Nghiệp Dược trường Đạạ̣i học Dược Hà Nội, Bộ mơn Hóó́a vậạ̣t liệu - khoa Hóó́a trường Đạạ̣i học Khoa học tự nhiên Hà Nội đã giúp đỡ thơi gian lam thưc nghiêm Nhân dịp cũng xin gưi lơi cam ơn đên Ban giám hiêu cùng toan thể các thầy cô giáo trương Đại hoc Dươc Ha Nôi đã dạy dỗ va tạo moi điều kiên thuận lơi cho thơi gian hoc tập tại trương Va cuối cùng la lơi cam ơn gưi tơi gia đình va bạn bè đã đông viên , giúp đỡ suốt thơi gian thưc hiên khóa luận Do hạạ̣n chế vềề̀ thời gian, điềề̀u kiện trang thiết bịạ̣ phương tiện nghiên cứu, khóa luận có nhiều thiêu sót Tôi rất mong nhận đươc sư góp ý của các thầy cô, bạn bè để khóa luận đươc hoan thiên Tôi xin chân cam ơn! Ha Nôi, 15 tháng 5năm 2013 Sinh viên Ngô Nguyễn Quỳnh Anh MỤC LỤC ĐẶT VẤN ĐỀ CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN 1.1 Đạạ̣i cương vềề̀ kháó́ng sinh 1.1.1.Lịạ̣ch sử nghiên cứu kháó́ng sinh 1.1.2 Địạ̣nh nghĩa kháó́ng sinh 1.1.3 Phân loạạ̣i kháó́ng sinh 1.1.4 Cơ chế táó́c dụng củủ̉a kháó́ng sinh 1.1.5 Ứng dụng củủ̉a kháó́ng sinh 1.1.6 Sơ đồ tổng quáó́t lên men sản xuấó́t kháng sinh 1.1.7 Kháó́ng sinh chớó́ng ung thư 1.1.8 Kháó́i niệm vềề̀ tính kháó́ng kháó́ng sinh 1.2.Đạạ̣i cương vềề̀ xạạ̣ khuẩn 1.2.1 Xạạ̣ khuẩnvà hìề̀nh thành chấó́t kháó́ng sinh tưề̀ xạạ̣ khuẩn 1.2.2 Đặc điểủ̉m củủ̉a xạạ̣ khuẩn chi Streptomyces 1.2.3.Phương pháó́p phân loạạ̣i xạạ̣ khuẩn thuộc chi Streptomyces 1.3.Tủủ̉n chọn, cải tạạ̣o bảo quản giớó́ng xạạ̣ khuẩn 1.3.1.Chọn chủủ̉ng cóó́ HTKS cao phép chọn lọc ngẫẫ̃u nhiên 1.3.2 Đột biến cải tạạ̣o giớó́ng 1.3.3 Bảo quản giớó́ng xạạ̣ khuẩn 1.4 Lên men sinh tổng hợp kháó́ng sinh 1.4.1.Cáó́c phương pháó́p lên men 10 1.4.3 Một sớó́ yếu tớó́ ảnh hưởng đến quáó́ trìề̀nh lên men 10 1.5.Chiết táó́ch tinh chế kháó́ng sinh tưề̀ dịạ̣ch lên men 10 1.5.1.Vai trị củủ̉a chiết táó́ch tinh chế kháó́ng sinh 11 1.5.2 Cáó́c phương pháó́p chiết táó́ch .11 1.6.Bước đầề̀u nghiên cứu cấó́u trúc kháng sinh 11 1.6.1.Phổ tử ngoạạ̣i - khả kiến 11 1.6.2.Phổ hồng ngoạạ̣i 11 1.6.3 Phân tích khớó́i phổ 12 1.6.4 Phổ cộng hưởng tưề̀ hạạ̣t nhân 12 1.7 Sàng lọc gen hoạạ̣t hóó́a Streptomycesnâng cao hiệu suấó́t sinh tổng hợp kháó́ng sinh 12 1.8 Quáó́ trìề̀nh tiến hoáó́ củủ̉a Dps cảm ứng cóó́ tính thấó́m chi Streptomyces .13 CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 14 2.1 Nguyên vậạ̣t liệu thiết bịạ̣ 14 2.1.1 Nguyên vậạ̣t liệu 14 2.1.2 Máó́y móó́c thiết bịạ̣ 16 2.2 Nội dung nghiên cứu 17 2.2.1.Chọn lọc, cải tạạ̣o giớó́ng 17 2.2.2.Lên men, chiết táó́ch kháó́ng sinh tớó́i ưu .17 2.2.3.Sơ xáó́c địạ̣nh sớó́ tính chấó́t củủ̉a kháó́ng sinh thu 17 2.3 Phương pháó́p thực nghiệm 17 2.3.1.Ni cấó́y giữẫ̃ giớó́ng xạạ̣ khuẩn 17 2.3.2.Đáó́nh giáó́ hoạạ̣t tính kháó́ng sinh phương pháó́p khuếch táó́n 18 2.3.3.Chọn lọc ngẫẫ̃u nhiên 18 2.3.4 Đột biến UV 19 2.3.5.Phương pháó́p đột biến hóó́a học 20 2.3.6 Lên men chìề̀m tổng hợp kháó́ng sinh 21 2.3.7 Chiết kháó́ng sinh tưề̀ dịạ̣ch lên men dung mơi hữẫ̃u 22 2.3.8 Táó́ch cáó́c thành phầề̀n kháó́ng sinh sắc kýó́ lớp mỏng 22 2.3.9.Thu kháó́ng sinh thơ phương pháó́p cấó́t quay .23 2.3.10.Tinh chế kháó́ng sinh thơ sắc kýó́ cột 23 2.3.11 Sơ xáó́c địạ̣nh kháó́ng sinh tinh khiết thu .24 CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ THỰC NGHIỆM VÀ NHẬN XÉT 25 3.1 Kết sàng lọc ngẫẫ̃u nhiên 25 3.2 Kết đột biến cải tạạ̣o giớó́ng lầề̀n 25 3.3 Kết đột biến cải tạạ̣o giớó́ng lầề̀n 26 3.4 Kết đột biến cải tạạ̣o giớó́ng lầề̀n 27 3.5 Kết chọn môi trường lên men chìề̀m 28 3.6 Kết chọn chủủ̉ng lên men 29 3.7 Kết chọn pH chiết 30 3.8 Kết sắc kýó́ lớp mỏng chọn hệ dung môi 31 3.9 Kết táó́ch tinh chế kháó́ng sinh 32 3.9.1 Kết sắc kýó́ cột lầề̀n 32 3.9.2 Kết sắc kýó́ cột lầề̀n 35 3.10 Kết đo nhiệt độ nóó́ng chảy, đo phổ củủ̉a kháó́ng sinh tinh khiết 39 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 40 DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT ISP International Streptomyces Project (Chương trìề̀nh Streptomyces q́ó́c tế) B subtilis Bacillus subtilis P mirabilis Proteus mirabilis KS HTKS Kháng sinh Hoạạ̣t tính kháó́ng sinh MT Môi trường MT2dt Môi trường dịạ̣ch thểủ̉ ATCC American type culture collection (Trung tâm giữẫ̃ giớó́ng q́ó́c gia Mỹẫ̃) ADN Acid deoxyribonucleic ARN Acid ribonucleic VSV Vi sinh vậạ̣t MC Mẫẫ̃u chứng SLNN Sàng lọc ngẫẫ̃u nhiên ĐB1 Đột biến lầề̀n ĐB2 Đột biến lầề̀n ĐBHH Đột biến hóó́a học Gr(+) Gram dương Gr(-) Gram âm DMHC Dung môi hữẫ̃u DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 1: Cáó́c kháó́ng sinh tự nhiên ứng dụng củủ̉a chúó́ng Bảng 2: Cáó́c vi khuẩn kiểủ̉m địạ̣nh Bảng 3: Cáó́c mơi trường ni cấó́y xạạ̣ khuẩn Bảng 4: Cáó́c mơi trường ni cấó́y VSV kiểủ̉m địạ̣nh Bảng 5: Các dung môi đãẫ̃ sử dụng Bảng 6: Kết thử HTKS sàng lọc ngẫẫ̃u nhiên Bảng 7: Kết thử HTKS đột biến lầề̀n Bảng 8: Kết thử HTKS đột biến lầề̀n Bảng 9: Kết thử HTKS đột biến lầề̀n Bảng 10: Kết chọn môi trường lên men chìề̀m Bảng 11: Kết chọn chủủ̉ng lên men Bảng 12: Kết chọn pH chiết Bảng 13: Kết chọn hệ dung mơi chạạ̣y sắc kýó́(VSV kiểủ̉m địạ̣nh P mirabilis) Bảng 14: Kết chạạ̣y sắc kýó́ cột lầề̀n Bảng 15: Kết sắc kýó́ lớp mỏng cáó́c phân đoạạ̣n 1, 2, (VSV kiểủ̉m địạ̣nh P mirabilis) Bảng 16: Kết chạạ̣y sắc kýó́ cột lầề̀n – nhóm Bảng 17: Kết sắc kýó́ lớp mỏng sau chạạ̣y cột nhóm (VSV kiểủ̉m địạ̣nh P mirabilis) Bảng 18: Kết chạạ̣y sắc kýó́ cột lầề̀n – nhóm Bảng 19: Kết sắc kýó́ lớp mỏng sau chạạ̣y cột nhóó́m Bảng 20: Kết IR DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ Hìề̀nh 1.1: Kháó́ng sinh pháó́t qua cáó́c năm Hình 1.2: Sơ đồ chế táó́c dụng củủ̉a cáó́c họ kháó́ng sinh Hình 1.3: Sơ đồ tổng quáó́t lên men sản xuấó́t kháó́ng sinh Hình 1.4: Hìề̀nh ảnh vềề̀ VSV kháó́ng kháó́ng sinh Hình 1.5: Phân loạạ̣i Actinomycetales Hình 1.6: Cấó́u trúó́c khuẩn ty xạạ̣ khuẩn Hình 1.7: Đường cong sinh trưởng pháó́t triểủ̉n củủ̉a xạạ̣ khuẩn Hình 1.8: Bản đồ vịạ̣ trí DPS sớó́ 17 nhiễm sắc thểủ̉ Streptomycetales Hìề̀nh 3.9: Kết chọn chủủ̉ng lên men chìề̀m tớó́t nhấó́t Hìề̀nh 3.10: Biểủ̉u đồ kết chọn pH chiết với dung môi n - butanol Hình 3.11: Sắc kýó́ cột lầề̀n Hình 3.12: Sắc kýó́ cột lầề̀n - nhóm Hìề̀nh 3.13: Sắc kýó́ cột lầề̀n - nhóm Hình P.14: Khuẩn lạạ̣c xạạ̣ khuẩn sau - ngày Hình P.15: Đĩa cấó́y zigzag sau – ngày Hình P.16: Kết thử HTKS đột biến lầề̀n phương pháó́p khớó́i thạạ̣ch (VSV kiểủ̉m địạ̣nh P mirabilis) Hình P.17: Hìề̀nh ảnh sau lên men chìề̀m tổng hợp kháó́ng sinh chủủ̉ng Streptomyces156.11 Hình P.18: Kết thử hoạạ̣t tính kháó́ng sinh dịạ̣ch lên men sau lên men chìề̀m phương pháó́p giếng thạạ̣ch (VSV kiểủ̉m địạ̣nh P mirabilis) Hình P.19: Kết hìề̀nh vi sinh vậạ̣t (VSV kiểủ̉m địạ̣nh P mirabilis) Hình P.20: Phổ UV củủ̉a kháó́ng sinh Streptomyces 156.11 sinh tổng hợp Hình P.21: Phổ IR củủ̉a kháó́ng sinh Streptomyces 156.11 sinh tổng hợp Hình P.22: Phổ MS củủ̉a kháó́ng sinh Streptomyces 156.11 sinh tổng hợp 41 - Tiếp tục đột biến chủủ̉ng Streptomyces 156.11(bằng UV, hóó́a chấó́t, …) đểủ̉ tạạ̣o chủủ̉ng cóó́ khả sinh tổng hợp kháó́ng sinh cao - Khảo sáó́t tìề̀m điềề̀u kiện lên men tớó́i ưu - Nghiên cứu cáó́c phương pháó́p chiết, táó́ch đểủ̉ tạạ̣o kháó́ng sinh với độ tinh khiết hiệu suấó́t cao Chiết táó́ch đểủ̉ thu lấó́y cáó́c kháó́ng sinh phụ nghiên cứu sâu - Tiến hành phổ khớó́i, cộng hưởng tưề̀ hạạ̣t nhân, xáó́c địạ̣nh cáó́c tính chấó́t lýó́, hóó́a, … đểủ̉ xáó́c địạ̣nh xáó́c cấó́u trúó́c hóó́a học tên khoa học củủ̉a kháó́ng sinh Streptomyces 156.11sinh tổng hợp TÀI LIỆU THAM KHẢO Tiếng Việt: Bộ Y Tế (2008),Dược lý học tập 2, NXBY học, Hà Nội Bộ Y Tế (2008),Hóa phân tích tập 2, NXB Y học, Hà Nội Bộ Y Tế (2008),Kỹ thuật sản xuất dược phẩm tập II,, NXB Y học, Hà Nội Bộ Y Tế (2009),Kiểm nghiệm dược phẩm, NXB Y học, Hà Nội Bộ Y Tế (2008),Vi sinh vật họcNXB Giáó́o dục, Hà Nội, trang 26 – 36, 80 – 95 Trần Thị Hồng Anh (1993),Quang phổ hấp thụ tử ngoại– khả kiến ứng dụng định lượng kháng sinh, NXB Khoa học kỹẫ̃ thuậạ̣t Nguyễn Văn Cách (2008),Công nghệ lên men kháng sinh, NXB Khoa học kỹẫ̃ thuậạ̣t Nguyễn Lân Dũng (2001),Vi sinh vật học,NXB Giáó́o dục, tr 39– Phạm Thị Lam Giang (2011),Nghiên cứu lên men tổng hợp kháng 67 sinh từ Streptomyces 156.11, khóó́a ḷạ̣n tớó́t nghiệp dược sĩ khóó́a 2006 – 2011, Trường Đạạ̣i học Dược Hà Nội 10 Hy Thanh Hà (2001), Khảo sát tình hình sử dụng kháng sinh phản ứng có hại kháng sinh số khoa bệnh viện Bạch Mai từ 1998 – 2000, khóa ḷạ̣n tớó́t nghiệp dược sĩ khóó́a 1996 – 2001, Trường Đạạ̣i học Dược Hà Nội 11 Đoàn Thị Nguyện (2009),Vi sinh vật, NXB Giáó́o dục Việt Nam, tr 12 Lương Đức Phẩm (1999),Công nghệ vi sinh vật, NXB Nông 7–37 nghiệp 13 Nguyễn Văn Thạch (2009),Công nghệ sinh học dược, NXB Giáo dục, tr 35–57 14 Khuất Hữu Thanh (2005),Cơ sở di truyền phân tử vàkỹ thuật gen, Nhà xuấó́t Khoa học kỹẫ̃ thuậạ̣t, Hà Nội, tr 185-191 15 Trần Thị Thanh (2001),Công nghệ vi sinh, Nhà xuấó́t Giáo dục, Hà Nội, tr 9-49 16 Cao Văn Thu (1998),Bài giảng kháng sinh vitamin, Hà Nội Tài liệu Tiếng Anh: 17 Mohammad T Alam (2010), “Metabolic modeling and analysis of the metabolic switch in Streptomyces coelicolor”, BMC Genomics 11 18 Nina M Haste, Varahenage R Perera, Katherine N Maloney, Dan N Tran, Paul Jensen, William Fencial, Victor Nizet and Mary E Hensler (2010), “Activity of the streptogramin antibiotic etamycin against methicillin – resistant Staphylococcus aureus”, The Journal of Antibiotics 22 19 Charusanti P, Fong NL, Nagarajan H, Pereira AR, Li HJ, Abate EA, Su Y, Gerwich WH, Palsson BO (2012), “Exploiting Adaptive Laboratory Evolution of Streptomyces clavuligerus for Antibiotic Discovery and Overproduction”, PLoS One, 2012, vol.7 (3) 20 Wulf crueger anneliese crueger (1987), Biotechnology, agricultural publishing house, Budapest Hungary 21 Saga T, Yamaguchi K (2008), “History of antimicrobial agents and resistant bacteria”, J Japan Med Assoc, 137, pp 513 – 517 22 Westley J.W., Evans R.H., Sello L.H., Troupe N., Liu C.M., Blount J.F (1979), “Isolation and characterization of antibiotic X-14547A, a novel monocarboxylic acid inophore produced by Streptomyces antibiotics NRRL 8167”, J Antibiot, 32, pp 100 – 107 23 United State Pharmacopoeia USP 30 – NF 25.(2007), vol 1, pp 1041 – 1047 Tài liệu online: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC3370547/ http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/23355697 24 25 PHỤ LỤC Bảng 1: Các kháng sinh tự nhiên ứng dụng chúng Hình 1.1: Kháng sinh phát qua năm 1940 – 2000 Hình 1.2: Sơ đồ chế tác dụng họ kháng sinh Giớó́ng trùề̀n ủủ̉ phịng thí nghiệm Bìề̀nh nhân giớó́ng phịng thí nghiệm Bìề̀nh nhân giớó́ng thiết bịạ̣ nhân giớó́ng Bìề̀nh lên men tạạ̣o kháó́ng sinh Dịạ̣ch lên men Sản phẩm đãẫ̃ kiểủ̉m nghiệm Sản phẩm đóó́ng góó́i Hình 1.3: Sơ đồ tổng qt quy trình sản xuất kháng sinh Actinomycetes Actinomycetales Actinoplanaceae Streptoverticulum Hình 1.5: Phân loại Actinomycetales Hình 1.8: Bản đồ vị trí DPS số 17 nhiễm sắc thể Streptomycetales Hình P.14: Khuẩn lạc xạ khuẩn sau thời gian – ngày Hình P.15: Đĩa cấy zigzag xạ khuẩn sau – ngày Hình P.16: Kết thử hoạt tính kháng sinh sau đột biến lần phương pháp khối thạch (VSV kiểm định P mirabilis) Hình P.17: Hình ảnh sau lên men chìm tổng hợp kháng sinh chủng Streptomyces 156.11 Hình P.18: Kết thử hoạt tính kháng sinh dịch lên men sau lên men chìm phương pháp giếng thạch (VSV kiểm định P mirabilis) Hình P.19: Kết hình VSV (VSV kiểm định P mirabilis) Hình P.20: Phổ UV kháng sinh Streptomyces 156.11 sinh tổng hợp Ten may: GX-PerkinElmer-USA Resolution: 4cm-1 Date: 3/13/2013 100.0 95 90 85 80 75 70 65 60 55 %T 50 45 40 35 30 3432 25 20 15 10 0.0 4000.0 Hình P.21: Phổ IR kháng sinh Streptomyces 156.11 sinh tổng hợp 3600 Hình P.22: Phổ MS kháng sinh Streptomyces 156.11 sinh tổng hợp ... NGUYỄN QUỲNH ANH GÓP PHẦN NGHIÊN CỨU LÊN MEN TỔNG HỢP KHÁNG SINH T? ?STREPTOMYCES 156. 11 KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ Người hướng dẫn: PGS.TS Cao Văn Thu Nơi thực hiện: Bộ môn Vi sinh Sinh học Trường... khả sinh tổng hợp kháó́ng sinh củủ̉a chủủ̉ng xạạ̣ khuẩn 2.2.2 Lênmen, chiết tách kháng sinh - Tưề̀ MT lên men bềề̀ mặt tớó́t nhấó́t, chọn MT lên men chìề̀m tớó́t nhấó́t - Thực lên men. .. nghiên cứu vềề̀ sau 3.5 Kết chọn mơi trường lên men chìm - Mục đích: Chọn mơi trường lên men đểủ̉ Streptomyces 156. 11 sinh tổng hợp KS hiệu nhấó́t - Tiến hành: Tiến hành lên men chìề̀m Streptomyces