2.1. Nguyên vật liệu và thiết bị
2.1.1. Nguyên vật liệu
2.2. Nội dung nghiên cứu
2.3. Phương pháp thực nghiệm
2.3.1. Nuôi cấy và giữ giống xạ khuẩn
2.3.3. Sàng lọc ngẫu nhiên
2.3.4. Đột biến bằng ánh sáng UV
2.3.6. Lên men chìm tổng hợp kháng sinh
2.3.8. Tách các thành phần trong kháng sinh bằng sắc ký lớp mỏng
2.3.9. Thu kháng sinh thô bằng phương pháp cất quay
2.3.10. Tinh chế kháng sinh thô bằng sắc ký cột
2.3.11. Sơ bộ xác định cấu trúc kháng sinh tinh khiết thu được
3.2. Kết quả đột biến cải tạo giống lần 1
- Mục đích: Tạo biến chủng có khả năng sinh tổng hợp KS cao hơn.
- Tiến hành:Đem đột biến chủng SLNN.11 bằng ánh sáng UV (λ=254nm), khoảng cách chiếu 60 cm, thời gian 5 phút, tỷ lệ sống sót là 0,32%. Thử HTKS 32 biến chủng sau đột biến bằng phương pháp khối thạch.Kết quả được trình bày ở bảng 7.
3.3. Kết quả đột biến cải tạo giống lần 2
3.4. Kết quả đột biến cải tạo giống lần 3
- Mục đích: Tạo biến chủng có khả năng sinh tổng hợp kháng sinh cao hơn.
- Tiến hành: Tiếp tục tiến hành đột biến các bào tử của biến chủng ĐB2.26bằng phương pháp đột biến hoá học. Tỷ lệ sống sót sau đột biến là 0,11%. Thử hoạt tính kháng sinh bằng phương pháp khối thạch.
Kết quả 7 biến chủng tiêu biểu được trình bày ở bảng 9.
Bảng 9: Kết quả thử hoạt tính kháng sinh sau đột biến lần 3
Nhận xét: Chọn 3 biến chủng có HTKS tốt nhất là biến chủng thứ 01, 12, 28 (ĐB3.01, ĐB3.12, ĐB3.28) để nhân giống, lưu giữ cho các nghiên cứu về sau.
3.5. Kết quả chọn môi trường lên men chìm
- Mục đích: Chọn môi trường lên men để Streptomyces 156.11 sinh tổng hợp KS hiệu quả nhất.
- Tiến hành: Tiến hành lên men chìm Streptomyces 156.11trên 3 MTdt tương ứng là MT1dt, MT2dt và MT5dt. Lọc dịch lên men qua giấy lọc để bỏ sinh khối. Thử HTKS theo phương pháp giếng thạch. Kết quả cụ thể được trình bày ở bảng 10.
3.6. Kết quả chọn chủng lên men
- Mục đích: Chọn dạng chủng, biến chủng lên men cho HTKS cao nhất.
- Tiến hành: Từ các thí nghiệm sàng lọc ngẫu nhiên, đột biến lần 1, lần 2, lần 3 đã chọn lựa và lưu giữ được 12 dạng chủng và biến chủng của Streptomyces 156.11. Thực hiện lên men chìm riêng rẽ các biến chủng này trong MT2dt. Dịch lên men được lọc qua...
3.8. Kết quả sắc ký lớp mỏng chọn hệ dung môi
- Mục đích: Chọn hệ dung môi có khả năng tách các thành phần trong dịch chiết tốt nhất để chạy cột, tinh chế KS. Xác định các thành phần trong dịch chiết DMHC.
- Tiến hành:Dịch chiết DMHC được dùng để chạy sắc ký. Tiến hành sắc ký lớp mỏng, thử triển khai với 4 hệ dung môi. Phát hiện vết bằng hiện hình VSV (vi khuẩn sử dụng làB. subtilis). Thành phần các hệ dung môi và kết quả thử được thể hiện ở bảng 13.
3.9. Kết quả tách và tinh chế kháng sinh
- Mục đích: Tinh chế, loại tạp nhằm thu KS tinh khiết.
- Tiến hành: Dịch lọc của dịch lên men gộp lại được khoảng 6,1 lít, đem chiết bằng n – butanol ở pH 3 thu được 820 ml dung môi hữu cơ. Lượng dung môi này mang cất quay bằng máy cất chân không Buchi Waterbath, thu được 0,3594 (g) bột kháng sinh thô.
3.10. Kết quả đo nhiệt độ nóng chảy, đo phổ của kháng sinh tinh khiết
- Nhiệt độ nóng chảy của KS: 198,2 C
- Phổ hồng ngoại: phổ IR cho thấy các bước sóng hấp thụ cực đại cùng các nhóm chức dự đoán tương ứng được trình bày trong bảng 20.
- Phổ khối: Phân tử lượng của KS2 1255,42 đvC.
Từ các kết quả biện giải sơ bộ, có thể dự đoán KS2 liên quan tới Actinomycin D.
KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT
1. KẾT LUẬN