Góp phần nghiên cứu lên men tổng hợp kháng sinh từ streptomyces 156 11​

BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI NGÔ NGUYỄN QUỲNH ANH GÓP PHẦN NGHIÊN CỨU LÊN MEN TỔNG HỢP KHÁNG SINH TỪSTREPTOMYCES 156.11 KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ HÀ NỘI - 2013 BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI NGƠ NGUYỄN QUỲNH ANH GĨP PHẦN NGHIÊN CỨU LÊN MEN TỔNG HỢP KHÁNG SINH TỪSTREPTOMYCES 156.11 KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ Người hướng dẫn: PGS.TS Cao Văn Thu Nơi thực hiện: Bộ môn Vi sinh Sinh học Trường Đại học Dược Hà Nội HÀ NỘI - 2013 LỜI CẢM ƠN Với lòng biết ơn sâu sắc, xin gửi lời cảm ơn chân thành đến thầy giáo PGS TS Cao Văn Thu– môn Vi sinh - Sinh học, người đã tận tình hướng dẫn từ những bước đầu tiên tơi hồn thành khóa ḷn Tơi xin chân thành cảm ơn các thầy cô giáo, các cán bộ, kỹ thuật viên giảng dạy, công tác tại Bộ môn Vi sinh - Sinh học, Bộ môn Công Nghiệp Dược trường Đại học Dược Hà Nội, Bộ môn Hóa vật liệu - khoa Hóa trường Đại học Khoa học tự nhiên Hà Nội đã giúp đỡ thời gian làm thực nghiệm Nhân dịp cũng xin gửi lời cảm ơn đến Ban giám hiệu cùng toàn thể thầy cô giáo trường Đại học Dược Hà Nội đã dạy dỗ tạo điều kiện thuận lợi cho thời gian học tập tại trường Và cuối cùng lời cảm ơn gửi tới gia đình bạn bè đã động viên , giúp đỡ suốt thời gian thực khóa luận Do hạn chế về thời gian, điều kiện trang thiết bị phương tiện nghiên cứu, khóa luận có nhiều thiếu sót Tôi rất mong nhận góp ý của các thầy cô, bạn bè để khóa ḷn hồn thiện Tơi xin chân thành cảm ơn! Hà Nội, ngày 15 tháng 5năm 2013 Sinh viên Ngô Nguyễn Quỳnh Anh MỤC LỤC ĐẶT VẤN ĐỀ .1 CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN 1.1 Đại cương về kháng sinh 1.1.1.Lịch sử nghiên cứu kháng sinh .2 1.1.2 Định nghĩa kháng sinh 1.1.3 Phân loại kháng sinh .2 1.1.4 Cơ chế tác dụng của kháng sinh 1.1.5 Ứng dụng của kháng sinh 1.1.6 Sơ đồ tổng quát lên men sản xuất kháng sinh 1.1.7 Kháng sinh chống ung thư .4 1.1.8 Khái niệm về tính kháng kháng sinh .5 1.2.Đại cương về xạ khuẩn .5 1.2.1 Xạ khuẩnvà hình thành chất kháng sinh từ xạ khuẩn 1.2.2 Đặc điểm của xạ khuẩn chi Streptomyces 1.2.3.Phương pháp phân loại xạ khuẩn thuộc chi Streptomyces .7 1.3.Tuyển chọn, cải tạo bảo quản giống xạ khuẩn 1.3.1.Chọn chủng có HTKS cao phép chọn lọc ngẫu nhiên 1.3.2 Đột biến cải tạo giống 1.3.3 Bảo quản giống xạ khuẩn 1.4 Lên men sinh tổng hợp kháng sinh 1.4.1.Các phương pháp lên men .10 1.4.3 Một số yếu tố ảnh hưởng đến quá trình lên men 10 1.5.Chiết tách tinh chế kháng sinh từ dịch lên men 10 1.5.1.Vai trò của chiết tách tinh chế kháng sinh 11 1.5.2 Các phương pháp chiết tách 11 1.6.Bước đầu nghiên cứu cấu trúc kháng sinh .11 1.6.1.Phổ tử ngoại - khả kiến 11 1.6.2.Phổ hồng ngoại .11 1.6.3 Phân tích khối phổ 12 1.6.4 Phổ cộng hưởng từ hạt nhân 12 1.7 Sàng lọc gen hoạt hóa Streptomycesnâng cao hiệu suất sinh tổng hợp kháng sinh 12 1.8 Quá trình tiến hoá của Dps cảm ứng có tính thấm chi Streptomyces 13 CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 14 2.1 Nguyên vật liệu thiết bị .14 2.1.1 Nguyên vật liệu 14 2.1.2 Máy móc thiết bị 16 2.2 Nội dung nghiên cứu 17 2.2.1.Chọn lọc, cải tạo giống 17 2.2.2.Lên men, chiết tách kháng sinh tối ưu 17 2.2.3.Sơ xác định sớ tính chất của kháng sinh thu 17 2.3 Phương pháp thực nghiệm .17 2.3.1.Nuôi cấy giữ giống xạ khuẩn 17 2.3.2.Đánh giá hoạt tính kháng sinh phương pháp khuếch tán 18 2.3.3.Chọn lọc ngẫu nhiên 18 2.3.4 Đột biến UV 19 2.3.5.Phương pháp đột biến hóa học .20 2.3.6 Lên men chìm tổng hợp kháng sinh .21 2.3.7 Chiết kháng sinh từ dịch lên men dung môi hữu 22 2.3.8 Tách các thành phần kháng sinh sắc ký lớp mỏng 22 2.3.9.Thu kháng sinh thô phương pháp cất quay 23 2.3.10.Tinh chế kháng sinh thô sắc ký cột 23 2.3.11 Sơ xác định kháng sinh tinh khiết thu 24 CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ THỰC NGHIỆM VÀ NHẬN XÉT 25 3.1 Kết sàng lọc ngẫu nhiên 25 3.2 Kết đột biến cải tạo giống lần .25 3.3 Kết đột biến cải tạo giống lần .26 3.4 Kết đột biến cải tạo giống lần .27 3.5 Kết chọn môi trường lên men chìm 28 3.6 Kết chọn chủng lên men 29 3.7 Kết chọn pH chiết 30 3.8 Kết sắc ký lớp mỏng chọn hệ dung môi 31 3.9 Kết tách tinh chế kháng sinh .32 3.9.1 Kết sắc ký cột lần 32 3.9.2 Kết sắc ký cột lần 35 3.10 Kết đo nhiệt độ nóng chảy, đo phổ của kháng sinh tinh khiết 39 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 40 DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT ISP International Streptomyces Project (Chương trình Streptomyces quốc tế) B subtilis Bacillus subtilis P mirabilis Proteus mirabilis KS HTKS Kháng sinh Hoạt tính kháng sinh MT Mơi trường MT2dt Mơi trường dịch thể ATCC American type culture collection (Trung tâm giữ giống quốc gia Mỹ) ADN Acid deoxyribonucleic ARN Acid ribonucleic VSV Vi sinh vật MC Mẫu chứng SLNN Sàng lọc ngẫu nhiên ĐB1 Đột biến lần ĐB2 Đột biến lần ĐBHH Đột biến hóa học Gr(+) Gram dương Gr(-) Gram âm DMHC Dung môi hữu DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 1: Các kháng sinh tự nhiên ứng dụng của chúng Bảng 2: Các vi khuẩn kiểm định Bảng 3: Các môi trường nuôi cấy xạ khuẩn Bảng 4: Các môi trường nuôi cấy VSV kiểm định Bảng 5: Các dung môi đã sử dụng Bảng 6: Kết thử HTKS sàng lọc ngẫu nhiên Bảng 7: Kết thử HTKS đột biến lần Bảng 8: Kết thử HTKS đột biến lần Bảng 9: Kết thử HTKS đột biến lần Bảng 10: Kết chọn môi trường lên men chìm Bảng 11: Kết chọn chủng lên men Bảng 12: Kết chọn pH chiết Bảng 13: Kết chọn hệ dung môi chạy sắc ký(VSV kiểm định P mirabilis) Bảng 14: Kết chạy sắc ký cột lần Bảng 15: Kết sắc ký lớp mỏng các phân đoạn 1, 2, (VSV kiểm định P mirabilis) Bảng 16: Kết chạy sắc ký cột lần – nhóm Bảng 17: Kết sắc ký lớp mỏng sau chạy cột nhóm (VSV kiểm định P mirabilis) Bảng 18: Kết chạy sắc ký cột lần – nhóm Bảng 19: Kết sắc ký lớp mỏng sau chạy cột nhóm Bảng 20: Kết IR DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ Hình 1.1: Kháng sinh phát qua các năm Hình 1.2: Sơ đồ chế tác dụng của các họ kháng sinh Hình 1.3: Sơ đồ tổng quát lên men sản xuất kháng sinh Hình 1.4: Hình ảnh về VSV kháng kháng sinh Hình 1.5: Phân loại Actinomycetales Hình 1.6: Cấu trúc khuẩn ty xạ khuẩn Hình 1.7: Đường cong sinh trưởng phát triển của xạ khuẩn Hình 1.8: Bản đồ vị trí DPS sớ 17 nhiễm sắc thể Streptomycetales Hình 3.9: Kết chọn chủng lên men chìm tốt nhất Hình 3.10: Biểu đồ kết chọn pH chiết với dung mơi n - butanol Hình 3.11: Sắc ký cột lần Hình 3.12: Sắc ký cột lần - nhóm Hình 3.13: Sắc ký cột lần - nhóm Hình P.14: Khuẩn lạc xạ khuẩn sau - ngày Hình P.15: Đĩa cấy zigzag sau – ngày Hình P.16: Kết thử HTKS đột biến lần phương pháp khối thạch (VSV kiểm định P mirabilis) Hình P.17: Hình ảnh sau lên men chìm tổng hợp kháng sinh chủng Streptomyces156.11 Hình P.18: Kết thử hoạt tính kháng sinh dịch lên men sau lên men chìm phương pháp giếng thạch (VSV kiểm định P mirabilis) Hình P.19: Kết hình vi sinh vật (VSV kiểm định P mirabilis) Hình P.20: Phổ UV của kháng sinh Streptomyces 156.11 sinh tổng hợp Hình P.21: Phổ IR của kháng sinh Streptomyces 156.11 sinh tổng hợp Hình P.22: Phổ MS của kháng sinh Streptomyces 156.11 sinh tổng hợp 41 - Tiếp tục đột biến chủng Streptomyces 156.11(bằng UV, hóa chất, …) để tạo chủng có khả sinh tổng hợp kháng sinh cao - Khảo sát tìm điều kiện lên men tối ưu - Nghiên cứu các phương pháp chiết, tách để tạo kháng sinh với độ tinh khiết hiệu suất cao Chiết tách để thu lấy các kháng sinh phụ nghiên cứu sâu - Tiến hành phổ khối, cộng hưởng từ hạt nhân, xác định các tính chất lý, hóa, … để xác định xác cấu trúc hóa học tên khoa học của kháng sinh Streptomyces 156.11sinh tổng hợp TÀI LIỆU THAM KHẢO Tiếng Việt: Bộ Y Tế (2008),Dược lý học tập 2, NXBY học, Hà Nội Bộ Y Tế (2008),Hóa phân tích tập 2, NXB Y học, Hà Nội Bộ Y Tế (2008),Kỹ thuật sản xuất dược phẩm tập II,, NXB Y học, Hà Nội Bộ Y Tế (2009),Kiểm nghiệm dược phẩm, NXB Y học, Hà Nội Bộ Y Tế (2008),Vi sinh vật họcNXB Giáo dục, Hà Nội, trang 26 – 36, 80 – 95 Trần Thị Hồng Anh (1993),Quang phổ hấp thụ tử ngoại– khả kiến ứng dụng định lượng kháng sinh, NXB Khoa học kỹ thuật Nguyễn Văn Cách (2008),Công nghệ lên men kháng sinh, NXB Khoa học kỹ thuật Nguyễn Lân Dũng (2001),Vi sinh vật học,NXB Giáo dục, tr 39– 67 Phạm Thị Lam Giang (2011),Nghiên cứu lên men tổng hợp kháng sinh từ Streptomyces 156.11, khóa luận tốt nghiệp dược sĩ khóa 2006 – 2011, Trường Đại học Dược Hà Nội 10 Hy Thanh Hà (2001), Khảo sát tình hình sử dụng kháng sinh phản ứng có hại kháng sinh số khoa bệnh viện Bạch Mai từ 1998 – 2000, khóa ḷn tớt nghiệp dược sĩ khóa 1996 – 2001, Trường Đại học Dược Hà Nội 11 Đoàn Thị Nguyện (2009),Vi sinh vật, NXB Giáo dục Việt Nam, tr 7–37 12 Lương Đức Phẩm (1999),Công nghệ vi sinh vật, NXB Nông nghiệp 13 Nguyễn Văn Thạch (2009),Công nghệ sinh học dược, NXB Giáo dục, tr 35–57 14 Khuất Hữu Thanh (2005),Cơ sở di truyền phân tử vàkỹ thuật gen, Nhà xuất Khoa học kỹ thuật, Hà Nội, tr 185-191 15 Trần Thị Thanh (2001),Công nghệ vi sinh, Nhà xuất Giáo dục, Hà Nội, tr 9-49 16 Cao Văn Thu (1998),Bài giảng kháng sinh vitamin, Hà Nội Tài liệu Tiếng Anh: 17 Mohammad T Alam (2010), “Metabolic modeling and analysis of the metabolic switch in Streptomyces coelicolor”, BMC Genomics 11 18 Nina M Haste, Varahenage R Perera, Katherine N Maloney, Dan N Tran, Paul Jensen, William Fencial, Victor Nizet and Mary E Hensler (2010), “Activity of the streptogramin antibiotic etamycin against methicillin – resistant Staphylococcus aureus”, The Journal of Antibiotics 22 19 Charusanti P, Fong NL, Nagarajan H, Pereira AR, Li HJ, Abate EA, Su Y, Gerwich WH, Palsson BO (2012), “Exploiting Adaptive Laboratory Evolution of Streptomyces clavuligerus for Antibiotic Discovery and Overproduction”, PLoS One, 2012, vol.7 (3) 20 Wulf crueger anneliese crueger (1987), Biotechnology, agricultural publishing house, Budapest Hungary 21 Saga T, Yamaguchi K (2008), “History of antimicrobial agents and resistant bacteria”, J Japan Med Assoc, 137, pp 513 – 517 22 Westley J.W., Evans R.H., Sello L.H., Troupe N., Liu C.M., Blount J.F (1979), “Isolation and characterization of antibiotic X-14547A, a novel monocarboxylic acid inophore produced by Streptomyces antibiotics NRRL 8167”, J Antibiot, 32, pp 100 – 107 23 United State Pharmacopoeia USP 30 – NF 25.(2007), vol 1, pp 1041 – 1047 Tài liệu online: 24 http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC3370547/ 25 http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/23355697 PHỤ LỤC Bảng 1: Các kháng sinh tự nhiên ứng dụng chúng Hình 1.1: Kháng sinh phát qua năm 1940 – 2000 Hình 1.2: Sơ đồ chế tác dụng họ kháng sinh Giớng trùn ủ phịng thí nghiệm Bình nhân giớng phịng thí nghiệm Bình nhân giống thiết bị nhân giống Bình lên men tạo kháng sinh Dịch lên men Sinh khối Dịch lọc Sinh khối thô Dịch chiết kháng sinh Dịch chiết sinh khối Dịch chiết đậm đặc Sản phẩm tinh chế Sản phẩm tinh chế Sản phẩm đã kiểm nghiệm Sản phẩm đóng gói Hình 1.3: Sơ đồ tổng quát quy trình sản xuất kháng sinh Actinomycetes VSV giống xạ khuẩn Actinomycetales Actinoplanaceae Streptoverticulum Streptomycetaceae Streptomyces Actinomycetaceae … Themostreptomyces … Hình 1.5: Phân loại Actinomycetales Hình 1.8: Bản đồ vị trí DPS số 17 nhiễm sắc thể Streptomycetales Hình P.14: Khuẩn lạc xạ khuẩn sau thời gian – ngày Hình P.15: Đĩa cấy zigzag xạ khuẩn sau – ngày Hình P.16: Kết thử hoạt tính kháng sinh sau đột biến lần phương pháp khối thạch (VSV kiểm định P mirabilis) Hình P.17: Hình ảnh sau lên men chìm tổng hợp kháng sinh chủng Streptomyces 156.11 Hình P.18: Kết thử hoạt tính kháng sinh dịch lên men sau lên men chìm phương pháp giếng thạch (VSV kiểm định P mirabilis) Hình P.19: Kết hình VSV (VSV kiểm định P mirabilis) Hình P.20: Phổ UV kháng sinh Streptomyces 156.11 sinh tổng hợp BO MON HOA VAT LIEU-KHOA HOA-TRUONG DHKHTN Ten may: GX-PerkinElmer-USA Nguoi do: Nguyen Thi Son Resolution: 4cm-1 Mail: sonhuco@yahoo.com DT: 0912140352 Date: 3/13/2013 Mau Q 100.0 95 90 85 609 80 75 70 1407 1362 1296 65 1097 1195 60 55 1484 50 1743 %T 2964 2929 45 1585 40 35 1630 30 3432 25 20 15 10 0.0 4000.0 3600 3200 2800 2400 2000 1800 cm-1 1600 1400 1200 1000 Hình P.21: Phổ IR kháng sinh Streptomyces 156.11 sinh tổng hợp 800 600.0 Hình P.22: Phổ MS kháng sinh Streptomyces 156.11 sinh tổng hợp ... NGUYỄN QUỲNH ANH GÓP PHẦN NGHIÊN CỨU LÊN MEN TỔNG HỢP KHÁNG SINH T? ?STREPTOMYCES 156. 11 KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ Người hướng dẫn: PGS.TS Cao Văn Thu Nơi thực hiện: Bộ môn Vi sinh Sinh học Trường... nâng cao khả sinh tổng hợp kháng sinh của chủng xạ khuẩn 2.2.2 Lênmen, chiết tách kháng sinh - Từ MT lên men bề mặt tốt nhất, chọn MT lên men chìm tốt nhất - Thực lên men từ các... các nghiên cứu về sau 3.5 Kết chọn mơi trường lên men chìm - Mục đích: Chọn môi trường lên men để Streptomyces 156. 11 sinh tổng hợp KS hiệu nhất - Tiến hành: Tiến hành lên men chìm Streptomyces