Góp phần nghiên cứu lên men tổng hợp kháng sinh từ streptomyces 119 112​

BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI LÊ THỊ NGỌC HIỆP GĨP PHẦN NGHIÊN CỨU LÊN MENTỞNG HỢP KHÁNG SINH TỪSTREPTOMYCES 119.112 KHĨA ḶN TỚT NGHIỆP DƯỢC SĨ HÀ NỘI-2013 BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỢI LÊ THỊ NGỌC HIỆP GĨP PHẦN NGHIÊN CỨU LÊN MEN TỞNG HỢP KHÁNG SINH TỪ STREPTOMYCES 119.112 KHĨA ḶN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ Người hướng dẫn: Ths Võ Thị Thu Thủy Nơi thực hiện: Bộ môn Vi sinh& Sinh học Trường Đại học Dược Hà Nợi HÀ NỢI-2013 LỜI CẢM ƠN Tôi xin gửi lời cảm ơn sâu sắc đến cô giáo Ths Võ Thị Thu Thủy người đã tận tình hướng dẫn từ những bước đầu tiên cho đến hoàn thiện khóa luận này Tôi xin chân thành cảm ơn các thầy cô giáo, các cán bộ, kỹ thuật viên giảng dạy, công tác tại Bộ môn Vi sinh - Sinh học , Bộ môn Công nghiệp dược trường Đại học Dược Hà Nội , Bộ môn Hóa vật liệu - khoa Hóa trường Đại học Khoa học tự nhiên Hà Nội đã giúp đỡ thời gian làm thực nghiệm Nhân dịp này cũng xin gửi lời cảm ơn đến Ban giám hiệu cùng toàn thể các thầy cô giáo trường Đại học Dược Hà Nội đã dạy dỗ và tạo mọi điều kiện thuận lợi cho thời gian học tập tại trường Và cuối cùng là lời cảm ơn gửi tới gia đình và bạn bè đã động viên , giúp đỡ suốt thời gian thực hiện khóa luận Do thời gian làm thực nghiệm cũng kiến thức bản thân có hạn , khóa luận này còn có nhiều thiếu sót Tôi mong nhận được góp ý các thầy cô , bạn bè để khóa luận được hoàn thiện Tôi xin chân thành cảm ơn! Hà Nội, ngày 10, tháng 5, năm 2013 Sinh viên LÊ THỊ NGỌC HIỆP MỤC LỤC ĐẶT VẤN ĐỀ CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN 1.1 Đại cương về kháng sinh 1.1.1 Định nghĩa kháng sinh 1.1.2 Phân loại kháng sinh .2 1.1.3 Cơ chế tác dụng kháng sinh 1.2.Đại cương về xạ khuẩn .3 1.2.1 Đặc điểm hình thái xạ khuẩn .4 1.2.2 Đặc điểm xạ khuẩn chi Streptomyces 1.3 Sơ đồ tổng quát sinh tổng hợp kháng sinh……………………………………….…6 1.4.Tuyển chọn, cải tạo và bảo quản giống xạ khuẩn .6 1.4.1 Mục đích 1.4.2 Chọn chủng có HTKS cao sáng lọc ngẫu nhiên .7 1.4.3 Đột biến cải tạo giống… 1.4.4 Bảo quản giống xạ khuẩn …………………………………………………… 1.5 Lên men sinh tổng hợp kháng sinh 1.5.1 Các phương pháp lên men 1.5.2 Một số yếu tố ảnh hưởng đến quá trình lên men .10 1.6 Chiết tách và tinh chế kháng sinh từ dịch lên men 10 1.6.1 Vai trò chiết tách và tinh chế kháng sinh 10 1.6.2 Các phương pháp chiết tách 11 1.7.Bước đầu nghiên cứu cấu trúc kháng sinh 12 1.7.1 Phổ tử ngoại - khả kiến 12 1.7.2 Phổ hồng ngoại .12 1.7.3 Khối phổ 13 1.8 Một số nghiên cứu liên quan…………………………………………………… 13 1.8.1 So sánh glucose glycerol làm nguồn carbon cho sản xuất ε-poly- L-Lysin từStreptomyces sp M-Z18………………………………………………………… 13 1.8.2 Tinh chế ái lực Phosphoprotein xác định protein tham gia vào Sadenosyl-L-methionine làm tăng cường sản xuất kháng sinh Streptomycescoelicolor……………………………………………………………… .14 1.8.3 Xác định định hoạt tính sinh học mợt nhóm gồm 51 macrolide cách kích hoạt enzyme tổng hợp polyketide Streptomyces ambofaciens……… .14 CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .16 2.1 Nguyên vật liệu và thiết bị 16 2.1.1 Nguyên vật liệu .16 2.1.2 Máy móc thiết bị 18 2.2 Nội dung nghiên cứu .18 2.2.1 Chọn lọc, cải tạo giống 18 2.2.2 Lên men, chiết tách kháng sinh tối ưu 18 2.2.3 Sơ bộ xác định mợt sớ tính chất kháng sinh thu được .19 2.3 Phương pháp thực nghiệm 19 2.3.1 Nuôi cấy và giữ giống xạ khuẩn 19 2.3.2 Đánh giá hoạt tính kháng sinh phương pháp khuếch tán 19 2.3.3 Chọn lọc ngẫu nhiên 20 2.3.4 Đột biến ……………………… 21 2.3.5 Lên men chìm tổng hợp kháng sinh .22 2.3.6 Chiết kháng sinh từ dịch lên men dung môi hữu 23 2.3.7 Tách các thành phần kháng sinh sắc ký lớp mỏng .23 2.3.8 Thu kháng sinh thô phương pháp cất quay 24 2.3.9 Tinh chế kháng sinh thô sắc ký cột .24 2.3.10 Phương pháp xác định kháng sinh tinh khiết thu được .25 CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ THỰC NGHIỆM VÀ NHẬN XÉT 26 3.1 Kết quả sàng lọc ngẫu nhiên 26 3.2 Kết quả đột biến cải tạo giống lần .27 3.3 Kết quả đột biến cải tạo giống lần .27 3.4 Kết quả đột biến hóa học HNO2 28 3.5 Kết quả chọn môi trường lên men chìm 29 3.6 Kết quả chọn chủng lên men 30 3.7 Kết quả chọn dung môi và pH chiết .30 3.8 Kết quả sắc ký lớp mỏng chọn hệ dung môi 31 3.9 Kết quả sắc kí cợt………………… .32 3.9.1 Kết quả sắc ký cột lần 32 3.9.2 Kết quả sắc ký cột lần 34 3.9.3 Kết quả sắc ký cột lần 36 3.10 Kết quả đo nhiệt độ nóng chảy, đo phổ kháng sinh tinh khiết 39 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 41 DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT ISP International Streptomyces Project (Chương trình Streptomyces quốc tế) ADN Acid deoxyribonucleic ARN Acid ribonucleic ATCC 6633 Trung tâm giữ giống Hoa Kỳ BV 108 Bệnh viện 108 B.subtilis Bacillussubtilis ATCC 6633 ĐB1 Đột biến lần ĐB2 Đột biến lần ĐBHH Đột biến hóa học G(+) Gram dương G(-) Gram âm HTKS Hoạt tính kháng sinh MC Mẫu chứng MT Môi trường MT1dt Môi trường dịch thể MT2dt Môi trường dịch thể MT6dt Môi trường dịch thể P mirabilis Proteus mirabilis BV 108 SLNN Sàng lọc ngẫu nhiên VSV Vi sinh vật DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 1: Các vi khuẩn kiểm định Bảng 2: Các MT nuôi cấy xạ khuẩn Bảng 3: Các MT nuôi cấy VSV kiểm định Bảng 4: Các dung môi đã sử dụng Bảng 5: Kết quả thử HTKS sàng học ngẫu nhiên Bảng 6: Kết quả thử HTKS đột biến lần Bảng 7: Kết quả thử HTKS đột biến lần Bảng 8: Kết quả thử HTKS đột biến hóa học Bảng 9: Kết quả chọn môi trường lên men chìm Bảng 10: Kết quả chọn chủng lên men Bảng 11: Kết quả chọn dung môi và pH chiết Bảng 12: Kết quả SKLM chọn hệ dung môi Bảng 13: Kết quả thử HTKS các phân đoạn sau chạy sắc ký lần Bảng 14: Kết quả SKLM sau chạy cột lần Bảng 15: Kết quả thử HTKS các phân đoạn sau chạy sắc ký lần Bảng 16: Kết quả SKLM các phân đoạn sau chạy cột lần Bảng 17: Kết quả thử HTKS nhóm sau chạy cột Bảng 18: Kết quả SKLM nhóm sau chạy cột Bảng 19: Kết quả thử HTKS nhóm sau chạy cột Bảng 20: Kết quả SKLM nhóm sau chạy cột Bảng 21: Kết quả IR DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ Hình 1: Sơ đồ chế tác dụng các họ kháng sinh Hình 2: Sơ bợ phân loại xạ khuẩn Hình 3: Các khuẩn ty xạ khuẩn Hình 4: Sơ đồ tổng quát lên men sản xuất kháng sinh Hình 5: Đường cong sinh trưởng phát triển xạ khuẩn Hình 6: Pic sắc ký cột lần Hình 7: Pic sắc ký cột lần Hình 8: Pic sắc ký cột lần nhóm Hình 9: Pic sắc ký cột lần nhóm Hình PL1: Xạ khuẩn giai đoạn phát triển 5-6 ngày Hình PL2: Kết quả đột biến ánh sáng UV Hình PL3: Thử HTKS phương pháp khối thạch(P mirabilis) Hình PL4: Thử HTKS phương pháp giếng thạch (B subtilis) Hình PL5: Thử HTKS phương pháp khoanh giấy lọc(B subtilis) Hình PL6: Kết quả chọn MT lên men chìm Hình PL7: Kết quả chọn chủng lên men Hình PL8: Kết quả SKLM sau chạy cột lần Hình PL9: Kết quả chạy sắc ký cột Hình PL10: Kết quả đo phổ UV kháng sinh Hình PL11: Kết quả đo phổ IR kháng sinh Hình PL12: Kết quả đo phổ khối kháng sinh ĐẶT VẤN ĐỀ Việc khám phá và phát triển các kháng sinh đã tạo các thế lực vũ khí hữu hiệu giúp người chống lại vi khuẩn Phạm vi điều trị kháng sinh hiện không dừng lại các bệnh nhiễm khuẩn, mà kháng sinh còn được dùng ngày một nhiều để điều trị ung thư Tuy nhiên, việc nghiên cứu phát triển kháng sinh mới có xu hướng giảm theo thời gian Trong đó, mô hình các bệnh nhiễm khuẩn ngày càng đa dạng, việc sử dụng kháng sinh ngày một tràn lan, tình hình kháng kháng sinh ngày càng gia tăng và là mối lo ngại toàn cầu Hiện trạng đó là tiếng chuông cảnh báo, người thua cuộc chiến chống vi khuẩn Vì vậy, đẩy mạnh nghiên cứu, sản xuất các kháng sinh có hiệu quả điều trị cao, đợc tính thấp và bị kháng th́c là một yêu cầu tất yếu và cấp thiết công cuộc bảo vệ và chăm sóc sức khỏe người dân Trong tất cả các kháng sinh được biết đến hiện thì có khoảng 55% có nguồn gốc từ xạ khuẩn và 60% số đó thuộc chi Streptomyces Đó là sở để các nhà khoa học nước ta hiện tập trung nghiên cứu vào chi xạ khuẩn này Chính vì vậy, em chọn đề tài: “Góp phần nghiên cứu lên men tổng hợp kháng sinh từ Streptomyces 119.112” làm khóa luận tốt nghiệp Chủng Streptomyces 119.112 Bộ môn Vi sinh – Sinh học trường đại học Dược Hà Nội phân lập và cung cấp Khóa luận mong muốn đạt được các mục tiêu sau đây: - Nâng cao hiệu suất sinh tổng hợp kháng sinh từ chủng Streptomyces 119.112bằng sàng lọc ngẫu nhiên và đột biến cải tạo giống - Lựa chọn môi trường và biến chủng thích hợp cho quá trình lên men - Chiết tách và tinh chế kháng sinh thu được - Từng bước xác định đánh giá tính chất vật lý và cấu trúc hóa học kháng sinh chủng Streptomyces 119.112 41 18,45 0,09 18 18,72 0,06 18,62 0,50 19 19,57 0,62 17,54 0,46 20 17,57 0,02 19,02 1,00 21 14,64 0,09 10 19,36 0,20 22 13,02 0,20 11 19,42 0,08 23 11,36 0,15 12 19,56 0,21 24-26 00,00 0,00 Hình 9: Pic sắc ký cột lần nhóm Tiến hành sắc ký lớp mỏng các phân đoạn hệ dung môi Ethylacetat: Methanol (10:1).Kết quả được trình bày bảng 20 Bảng 20: Kết SKLM nhóm sau chạy cột Phân đoạn Vết 1(Rf1) Vết 2(Rf2) Phân đoạn Vết 1(Rf1) Vết 2(Rf2) 0,66 0,58 11 - 0,56 0,67 0,58 12 - 0,54 42 0,71 0,60 13 - 0,57 0,68 0,57 14 - 0,54 0,66 0,54 15 - 0,58 0,64 0,58 16 - 0,58 0,68 0,54 17 - 0,60 10 - 0,56 18-23 - - Nhận xét: Từ kết quả bảng 19, 20 ta thấy có chất KS thứ phân đoạn (1017), gộp lại đem cô được 0,002g bột KS màu đỏ Hiệu suất chất là Hchất 2%=11,17% Như vậy: sau tách sắc ký cột thu được: chất KS thứ 1(chất chính), hỡn hợp KS và chất KS thứ HKS1%=H2+H3=16,91+3,29=20,20% bột KS màu đỏ, bột KS này dùng để đo phổ UV, IR, MS, nhiệt độ nóng chảy HKS2%=11,17% bột KS màu đỏ cam 3.10 Kết đo nhiệt độ nóng chảy, đo phổ kháng sinh tinh khiết Nhiệt độ nóng chảy kháng sinh: 216ºC Phổ tử ngoại: cho các đỉnh hấp thụ ở: 208,50nm; 230nm và 442,50 nm Từ đó, dự đoán cấu trúc KS có nhân thơm, nối đôi liên hợp, dị tố, kết hợp các đặc điểm trên.(xem PL10) Phổ hồng ngoại: cho thấy các bước sóng hấp thụ cực đại cùng các nhóm chức dự đoán tương ứng được trình bày bảng 21.(xem PL11) Bảng 21: Kết IR Đỉnh hấp thụ (cm-1) Nhóm chức đặc trưng 43 3265 2956, 2925,2854 1740 1668,1648 Amin (> N-H) Alkan (C-H) C-O aldehyd C=O ester C=C alken C=O amid, nitro-NO2 1583 Nitro (-NO2) 1466,1409 Imin (>C=N-) 1377 Nhóm nitro, alkyl fluorid 1268 Nhóm nitro, alkyl fluorid, ether thơm 1192, 1121, 1074 949, 823,722 644 C-O C-N amin C-F alkyl florid Alkan (C-H) C-H C-Cl anlky chlorid Phổ khối(MS): Khối lượng phân tử là 1268,42 đvC (hình PL12) 44 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ KẾT LUẬN Sau một thời gian nghiên cứu, chúng đã bản hoàn thành được mục tiêu ban đầu khóa luận tốt nghiệp Các kết luận cụ thể sau: - Qua lần đợt biến UV thì hoạt tính kháng sinh Streptomyces 119.112tăng lên đáng kể -Tìm được MT nuôi cấy bề mặt tốt là MT1 và MT lên men chìm tốt với chủng Streptomyces 119.112 là MT1dt, biến chủng ĐB2.18 có khả sinh tổng hợp KS mạnh - Chiết kháng sinh từ dịch lên men dung môi ethylacetat pH cho hiệu quả tốt nhất, sử dụng hệ dung môi butylacetat: ethanol: triethylamin (1: 2: 1) và hệ ethylacetat: methanol (10: 1) để tách các thành phần kháng sinh - Kháng sinh Streptomyces 119.112sinh tổng hợp có một số đặc điểm sau: + Là kháng sinh có phổ tác dụng rộng, cả vi khuẩn Gram(+) và vi khuẩn Gram(-) + Tương đối bền với nhiệt độ + Tách riêng được thành phần kháng sinh thô thu được: hỗn hợp kháng sinh, kháng sinh 1(KS1) KS chính, kháng sinh (KS2) + Kháng sinh thơ thu được có thành phần + Hiệu suất tinh chế kháng sinh: - HKS1%=20,20% - HKS2%=11,17% + Kháng sinh tinh khiết có nhiệt độ nóng chảy 216ºC, hấp thụ ánh sáng tử ngoại, hồng ngoại, phổ khối Cấu trúc phân tử kháng sinh được dự đoán có thể có chứa nhân thơm, nối đôi liên hợp, dị tố, các nhóm chức có kháng sinh là: ester, alkyl clorid, alkyl flourid, amin, nitro, … 45 ĐỀ XUẤT Từ những kết quả đã thu được, chúng đề xuất tiếp tục phát triển đề tài nghiên cứu sâu theo các hướng sau: - Tiến hành giải trình tự gen để xác định xác tên khoa học Streptomyces 119.112 - Tiếp tục đột biến chủng Streptomyces 119.112(bằng UV, hóa chất, phương pháp đột biến bậc thang, …) để tạo chủng có khả siêu sinh tổng hợp kháng sinh - Khảo sát tìm điều kiện lên men tối ưu - Nghiên cứu các phương pháp chiết, tách để tạo kháng sinh với độ tinh khiết và hiệu suất cao Chiết tách để thu lấy các kháng sinh phụ và nghiên cứu sâu - Tiến hành phổ khối, cộng hưởng từ hạt nhân, xác định các tính chất lý, hóa, … để xác định xác cấu trúc hóa học kháng sinh Streptomyces 119.112sinh tổng TÀI LIỆU THAM KHẢO Tiếng Việt: Trần Tử An (2007), Hóa phân tích, NXB Y học, tập 2 Trần Thị Hồng Anh (1993), Quang phổ hấp thụ tử ngoại-khả kiến ứng dụng định lượng kháng sinh, NXB Khoa học và kỹ thuật Bộ Y Tế (2009), Dược điển Việt Nam IV, tr PL129-PL131 Nguyễn Văn Cách, Công nghệ lên men kháng sinh, NXB Khoa học và kỹ thuật Lê Huy Chính (2007), Vi sinh vật y học, NXB Y học, tr 25-57 Nguyễn Lân Dũng (2001), Vi sinh vật học, NXB Giáo dục, tr 39-67 Trần Đức Hậu (2006), Hóa dược, NXB Y học, tập Võ Thị Bạch Ḥ (2008) ,Hóa phân tích, NXB y học, tập 2, tr 58-122, tr 205-225 Từ Minh Koóng (2006), Kỹ thuật sản xuất dược phẩm II, NXB Y học, tập 10 Đoàn Thị Nguyện (2009), Vi sinh vật, NXB Giáo dục Việt Nam, tr 737 11 Lương Đức Phẩm (1999), Công nghệ vi sinh vật, NXB Nông nghiệp 12 Trịnh Mai Phương, Góp phần nâng cao sinh tổng hợp khángsinh nhờStreptomyces 119.112, khóa luận tốt nghiệp Dược sĩ khóa 2006-2012, Trường ĐH Dược Hà Nội 13 Nguyễn Văn Thạch (2009), Công nghệ sinh học dược, NXB Giáo dục Việt Nam, tr 35-57 14 Trần Thị Thanh (2001), Công nghệ vi sinh, NXB Giáo dục, tr 40-52 15 Cao Văn Thu (2008), Vi sinh vật học, NXB Y học, Hà Nội 16 Mai Tất Tố, Vũ Thị Trâm (2007), Dược lý học, NXB Y học, tập Tiếng Anh: 17 Chen XS, Mao ZG (2013), ‘‘Comparison of Glucose and Glycerol as Carbon Sources for ε-Poly-L-Lysine Production by Streptomyces sp M-Z18’’ The Key Laboratory of Industrial Biotechnology, Ministry of Education, School of Biotechnology, Jiangnan University 18 Meng L, Yang SH, Palaniyandi SA, Lee SK, Lee IA, Kim TJ, Suh JW (2013), ‘‘Phosphoprotein affinity purification identifies proteins involved in Sadenosyl-L-methionine-induced enhancement of antibiotic production in Streptomyces coelicolor’’, Division of Bioscience and Bioinformatics, College of Natural Science, Myongji University, Gyeonggi-Do, Korea 19 Laureti L, Song L, Huang S, Corre C, Leblond P, Challis GL, Aigle B (2013), ‘‘Identification of a bioactive 51-membered macrolide complex by activation of a silent polyketide synthase in Streptomyces ambofaciens’’Unité Mixte de Recherche1128 Génétique et Microbiologie, Université Henri Poincaré, France PHỤ LỤC Hình PL1: Xạ khuẩn giai đoạn phát triển 5-6 ngày Hình PL2: Kết đột biến ánh sáng UV Hình PL3: Thử HTKS phương pháp khối thạch(P mirabilis) Hình PL4: Thử HTKS phương pháp giếng thạch(B subtilis) Hình PL5: Thử HTKS phương pháp khoanh giấy lọc (B subtilis) Hình PL6: Kết chọn MT lên men chìm Hình PL7: Kết chọn chủng lên men Hình PL8: Kết sắc ký lớp mỏng sau chạy cột lần Hình PL9: Kết chạy sắc ký cột Hình PL10: Kết đo phổ UV kháng sinh BO MON HOA VAT LIEU-KHOA HOA-TRUONG DHKHTN Ten may: GX-PerkinElmer-USA Nguoi do: Nguyen Thi Son DT: 0912140352 Resolution: 4cm-1 Mail: sonhuco@yahoo.com Date: 3/13/2013 Mau Hp 100.0 95 644 90 823 744 85 949 80 75 70 3265 1409 1377 65 1074 1121 60 55 1192 1268 50 1583 1668 1648 %T 45 2854 2956 40 1466 1740 35 30 25 2925 20 15 10 0.0 4000.0 3600 3200 2800 2400 2000 1800 cm-1 1600 1400 1200 1000 800 Hình PL11: Kết đo phổ IR kháng sinh 600.0 Hình PL12: Kết đo phổ khối ... vậy, em chọn đề tài: ? ?Góp phần nghiên cứu lên men tổng hợp kháng sinh từ Streptomyces 119. 112” làm khóa luận tốt nghiệp Chủng Streptomyces 119. 112 Bộ môn Vi sinh – Sinh học trường đại... thạch nghiêng thích hợp, cất ớng thạch nghiêng tủ lạnh 2°C và định kỳ 3-6 tháng cấy lại lần [9], [13] 1.5 Lên men sinh tổng hợp kháng sinh Lên men là quá trình trao đổi chất sinh học... quá trình lên men cao • Nhược điểm: Đầu tư trang thiết bị kỹ thuật ban đầu lớn • Các phương pháp lên men chìm: Lên men mẻ, lên men có bổ sung, lên men bán liên tục, lên men liên tục