Đáp ứng miễn dịch đối với vaccine cúm a

Generated by Foxit PDF Creator © Foxit Software http://www.foxitsoftware.com For evaluation only Đại Học Quốc Gia Tp Hồ Chí Minh TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA š&› HUỲNH CƠ TẤN ĐÁP ỨNG MIỄN DỊCH ĐỐI VỚI VACCINE CÚM A/H5N1 ĐƯỢC NUÔI CẤY TRÊN TẾ BÀO CHUYÊN NGÀNH: CÔNG NGHỆ SINH HỌC LUẬN VĂN THẠC SĨ TP HỒ CHÍ MINH, 08/2008 Generated by Foxit PDF Creator © Foxit Software http://www.foxitsoftware.com For evaluation only CƠNG TRÌNH ĐƯỢC HỒN THÀNH TẠI TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA ĐẠI HỌC QUỐC GIA TP HỒ CHÍ MINH Cán hướng dẫn khoa học: ………………………………………………………… (Họ, tên, học hàm, học vị chữ ký) Cán chấm nhận xét 1: ……………………………………………………………… (Họ, tên, học hàm, học vị chữ ký) Cán chấm nhận xét 2: ……………………………………………………………… (Họ, tên, học hàm, học vị chữ ký) Luận văn thạc sĩ bảo vệ HỘI ĐỒNG CHẤM BẢO VỆ LUẬN VĂN THẠC SĨ TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA Tp HCM, ngày……tháng……năm ……… Generated by Foxit PDF Creator © Foxit Software http://www.foxitsoftware.com For evaluation only ĐẠI HỌC QUỐC GIA TP HCM TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA CỘNG HÒA XÃ HỘI CHỦ NGHIÃ VIỆT NAM Độc Lập - Tự Do - Hạnh Phúc -oOo Tp HCM, ngày tháng năm NHIỆM VỤ LUẬN VĂN THẠC SĨ Họ tên học viên: HUỲNH CƠ TẤN Giới tính : Nam Ngày, tháng, năm sinh : 13 – 08 – 1983 Nơi sinh : Bình Định Chuyên ngành Cơng Nghệ Sinh Học Khố: 2006 – 2008 1- TÊN ĐỀ TÀI Đáp ứng miễn dịch vaccine cúm A/H5N1 sản xuất nuôi cấy tế bào 2- NHIỆM VỤ LUẬN VĂN Đánh giá đáp ứng miễn dịch vaccine cúm A/H5N1 mơ hình động vật thí nghiệm nhằm mục đích tối ưu hóa hiệu bảo vệ độ an toàn vaccine 3- NGÀY GIAO NHIỆM VỤ: 21-01-2008 4- NGÀY HOÀN THÀNH NHIỆM VỤ: 30-06-2008 5- HỌ VÀ TÊN CÁN BỘ HƯỚNG DẪN: TS CAO THỊ BẢO VÂN Nội dung đề cương Luận văn thạc sĩ Hội Đồng Chuyên Ngành thông qua CÁN BỘ HƯỚNG DẪN (Họ tên chữ ký) CHỦ NHIỆM BỘ MÔN QUẢN LÝ CHUYÊN NGÀNH (Họ tên chữ ký) Generated by Foxit PDF Creator © Foxit Software http://www.foxitsoftware.com For evaluation only Em xin gửi lời cảm ơn chân thành cô Cao Bảo Vân, người tận tình hướng dẫn, bảo em thời gian thực tập Viện Pasteur TP.HCM Em xin cảm ơn thầy cô môn Công nghệ sinh học dạy dỗ, truyền đạt kiến thức cho em hai năm học qua Xin chân thành cảm ơn anh, chị bạn đồng nghiệp phòng Sinh học phân tử Viện Pasteur TP.HCM tận tình giúp đỡ tạo điều kiện thuận lợi cho hoàn thành nghiên cứu Cám ơn tập thể bạn khoá 2006 rèn luyện năm học vừa qua Cuối cùng, xin cảm ơn gia đình chăm sóc, động viên lúc khó khăn Gia đình chỗ dựa vững Generated by Foxit PDF Creator © Foxit Software http://www.foxitsoftware.com For evaluation only Tóm tắt Nghiên cứu sản xuất vaccine cúm an toàn, hiệu lực cao tăng cường lực sản xuất (nuôi cấy virus tế bào) hay tiết kiệm kháng nguyên (dùng chất bổ trợ) đẩy mạnh nghiên cứu Nghiên cứu đánh giá đáp ứng miễn dịch vaccine cúm A/H5N1 Viện Pasteur nghiên cứu sản xuất tế bào Vero, chúng tơi nhận thấy có đáp ứng miễn dịch tốt chuột thử nghiệm tiêm vaccine thử nghiệm có chất bổ trợ muối nhơm Với liều tiêm kháng nguyên 7.5 μgHA, lần tiêm vaccine có khoảng thời gian cách tuần, kết thí nghiệm cho thấy có đáp ứng miễn dịch với hiệu giá kháng thể 1/40 90-100% chuột thí nghiệm ngày thứ 35, 42 cịn 80% ngày thứ 49 Hiệu giá kháng thể cao 1/640 Vacinne có chất bổ trợ cho đáp ứng miễn dịch tốt vaccine không dùng chất bổ trợ Ngồi ra, huyết vaccine thử nghiệm có khả trung hòa virus lưu hành số tỉnh Việt Nam năm 2008 Summary The rapid spread and the transmission to humans of avian influenza virus (H5N1) have induced world-wide fears of a new pandemic The influenza vaccine research now is still continue on along with production methods to rapidly supply sufficient amounts of an effective vaccine This thesis showed that the NIBRG14 vaccine was well tolerated Mice were intraperitoneally immunized twice at 3-week intervals by vaccine with formulation containing 7.5 μg HA with alum adjuvant And 90-100% of them at day 35, 42 after immunization produced the desired immune respones, protective levels (geometric mean titer (GMT) ≥1:40) Antibody titer was measured by hemagglutination inhibition (HI) and neutralization test (NT) The higest HI titre is 1/640 These antisera neutralized antigenically of different H5N1 viruses in some provinces in Vietnam, in 2008 Generated by Foxit PDF Creator © Foxit Software http://www.foxitsoftware.com For evaluation only MỤC LỤC Trang DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT i DANH MỤC HÌNH ii DANH MỤC BẢNG iii ĐẶT VẤN ĐỀ PHẦN I TỔNG QUAN Lịch sử bệnh cúm Đại cương virus cúm A 2.1 Phân loại 2.2 Tên gọi 2.3 Đặc điểm sinh thái 2.4 Đặc điểm hình thái - Cấu trúc hạt virus 2.5 Đặc điểm vật chất di truyền 2.6 Chu trình sinh sản virus Tình hình dịch tễ 3.1 Tình hình dịch tễ nước 3.2 Tình hình dịch tễ nước Vaccine cúm 4.1 Vaccine cúm bất hoạt 4.1.1 Vaccine toàn thân virus 4.1.2 Vaccine tiểu phần virus 4.1.3 Vaccine kháng nguyên bề mặt tinh chế 10 4.2 Vaccine sống, nhược độc 10 Generated by Foxit PDF Creator © Foxit Software http://www.foxitsoftware.com For evaluation only 4.3 Vaccine tái tổ hợp 10 4.4 Liều tiêm kháng nguyên 11 Chất bổ trợ vaccine cúm 11 5.1 Định nghĩa 11 5.2 Phân loại 12 5.3 Một số chất bổ trợ thông dụng vaccine cúm 12 5.3.1 Muối nhôm 12 5.3.2 MF59 13 5.3.3 Một số chất bổ trợ khác vaccine cúm 13 Miễn dịch học virus H5N1 động vật 14 6.1 Đáp ứng miễn dịch dịch thể 14 6.2 Đáp ứng miễn dịch qua trung gian tế bào 14 Một số phương pháp đánh giá hiệu lực vaccine 16 7.1 Phương pháp tính hiệu giá kháng nguyên hiệu giá kháng thể số tới hạn (endpoint) 50% 16 7.2 Kĩ thuật ngưng kết 16 7.2.1 Phương pháp ngưng kết hồng cầu (HA) 17 7.2.2 Phương pháp ngăn ngưng kết hồng cầu (HI) 17 7.2.3 Phương pháp khếch tán miễn dịch vòng đơn (SRID) 17 7.3 Kĩ thuật miễn dịch liên kết enzyme (ELISA) 18 7.3.1 Indirect ELISA 19 7.3.2 Sandwich ELISA 19 7.3.3 Competitive ELISA 19 7.4 Kĩ thuật trung hòa (NT) 20 7.5 Kĩ thuật vi trung hòa (MN) 21 Tình hình nghiên cứu sản xuất vaccine cúm A/H5N1 21 Generated by Foxit PDF Creator © Foxit Software http://www.foxitsoftware.com For evaluation only PHẦN II VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP Sơ đồ bố trí thí nghiệm 23 Vật liệu 24 Hóa chất, sinh phẩm 24 Phương pháp nghiên cứu 25 3.1 Một số thao tác động vật thí nghiệm 25 3.2 Xử lí mẫu 26 3.2.1 Xử lí hồng cầu gà 0,5% 26 3.2.2 Xử lí mẫu bệnh phẩm gan, lách 26 3.2.3 Xử lí huyết sơ 27 3.2.4 Xử lí mẫu huyết RDE 27 3.3 Xác định số tới hạn 50% 27 3.3.1 Chỉ số TCID50 27 3.3.2 Chỉ số LD50 29 3.3.3 Xác định hiệu giá kháng thể trung hòa 29 3.4 Định lượng kháng nguyên HA vaccine 29 3.4.1 Phương pháp HA 29 3.4.2 Phương pháp SRID 31 3.5 Định lượng hiệu giá kháng thể 32 3.5.1 Phương pháp HI 32 3.5.2 Phương pháp trung hòa 33 3.6 Phân lập, giám định virus 35 3.6.1 Phân lập trứng gà có phơi 35 3.6.2 Giám định virus 35 Generated by Foxit PDF Creator © Foxit Software http://www.foxitsoftware.com For evaluation only PHẦN III KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN TN 1: Định lượng kháng nguyên HA vaccine thử nghiệm 36 TN 2: Đáp ứng miễn dịch vaccine không dùng chất bổ trợ 37 TN 3: Đáp ứng miễn dịch vaccine có chất bổ trợ Al(PO4) 39 TN 4: Đáp ứng miễn dịch vaccine có chất bổ trợ Al(OH)3 41 TN 5: Khoảng thời gian tiêm nhắc vaccine 43 TN 6: Tính trung hịa huyết thí nghiệm với chủng virus H5N1 lưu hành thực địa năm 2008 46 TN 7: So sánh hiệu giá kháng thể phương pháp HI trung hòa 47 Một số kết thí nghiệm khác 48 8.1 Xác định số TCID50 48 8.2 Xác định số LD50 49 PHẦN IV KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ Kết luận 51 Đề nghị 51 Phụ lục Generated by Foxit PDF Creator © Foxit Software http://www.foxitsoftware.com For evaluation only DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT APCs CDC CPE CTL ELISA EMEM GMT HA HA titre HI HI titre IL-2 LD50 MDCK MHC MN NT NT titre RDE RNP RT-PCR SRID TC TCID50 TH TLR TNF Vero VIM WHO : tế bào trình diện kháng nguyên (Antigen-Presenting Cells) : trung tâm kiểm soát dịch bệnh Mỹ (Centers for Desease Control) : hủy hoại tế bào (Cytopathic effect) : tế bào lympho T độc (Cytotoxic T-lymphocyte) : kĩ thuật miễn dịch liên kết enzyme (Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay) : môi trường nuôi cấy tế bào (Eagle’s Minimum Essential Medium) : hiệu giá trung bình (geometric mean titer) : phản ứng ngưng kết hồng cầu (hemagglutinin) : hiệu giá kháng nguyên HA (Hemagglutinin titre) : phản ứng ngăn ngưng kết hồng cầu (Hemagglutinin Inhibition) : hiệu giá kháng thể, HI : interleukin-2 : liều virus gây chết 50% động vật thí nghiệm (Lethal Dose) : tế bào thận chó (Madin–Darby canine kidney) : phức hợp phù hợp mơ (Major Histocompatibility Complex) : phản ứng vi trung hòa (mirconeutralization) : phản ứng trung hòa (neutralization test) : hiệu giá kháng thể trung hòa (Neutralise titre) : enzyme phân giải yếu tố không đặc hiệu RDE(receptor-destroying enzyme) : ribonucleoprotein : phản ứng khuếch đại gen phiên mã ngược (Reverse Transcriptase Polymerase Chain Reaction) : khếch tán miễn dịch vòng đơn (single-radial immunodiffusion) : tế bào T độc (cytotoxic T cell) : liều virus gây chết 50% tế bào (Tissue Culture Infections Dose) : tế bào T hỗ trợ (T helper) : thụ thể toll-like (Toll-like receptor) : nhân tố hủy hoại khối u ( Tumor Necrosis Factor) : tế bào thận khỉ : môi trường virus xâm nhiễm tế bào (Virus Infection Medium) : Tổ chức Y tế Thế giới (World Health Organization) i Generated by Foxit PDF Creator © Foxit Software http://www.foxitsoftware.com For evaluation only PHẦN III KẾT QUẢ BÀN LUẬN Generated by Foxit PDF Creator © Foxit Software http://www.foxitsoftware.com For evaluation only PHẦN IV KẾT LUẬN ĐỀ NGHỊ Generated by Foxit PDF Creator © Foxit Software http://www.foxitsoftware.com For evaluation only Luận văn tốt nghiệp Vật liệu phương pháp Sơ đồ bố trí thí nghiệm Virus NIBRG14 Xử lí, tinh Virus sống Xác định hiệu giá virus TCID50 Vaccine thử nghiệm Đánh giá Xác định số LD50 Định lượng kháng nguyên HA (SRID) Kết luận Tiến hành thí nghiệm Lơ A Đáp ứng miễn dịch vaccine khơng dùng chất bổ trợ Lô B Đáp ứng miễn dịch vaccine có chất bổ trợ Al(PO4) Lơ C Đáp ứng miễn dịch vaccine có chất bổ trợ Al(OH)3 Kết luận Lơ D Thí nghiệm khoảng thời gian tiêm nhắc vaccine Kết luận Kết luận Sơ đồ thời gian thí nghiệm Tiêm vaccine lần Tiêm vaccine lần tuần Ngày Thử thách (challenge) với 10-100 LD50 tuần Ngày 21 Độ dài miễn dịch Theo dõi, ghi nhận kết HVTH: Huỳnh Cơ Tấn 23 Generated by Foxit PDF Creator © Foxit Software http://www.foxitsoftware.com For evaluation only Luận văn tốt nghiệp Vật liệu phương pháp Vật liệu 1.1 Vật liệu sinh học • Kháng ngun cúm (vaccine thí nghiệm) Viện Pasteur nghiên cứu sản xuất • Một số mẫu virus H5N1 phân lập từ thực địa năm 2008 • Chuột thí nghiệm 4-6 tuần tuổi • Hồng cầu gà • Tế bào MDCK 1.2 Dụng cụ, thiết bị thí nghiệm Các dụng cụ như: pipette, micropipette, eppendorf, erlen, … số vật liệu chuyên dùng như: • Cân điện tử • Bộ nguồn buồng điện di EC 105 • Máy chụp hình gel ChemiDoc (Bio-Rad) • Máy ly tâm (Centrifuge 5417C, Eppendorf) • Máy chạy PCR (GeneAmpđ PCR System9700) ã Mỏy Vortex ã T m có CO2 • Kính hiển vi soi ngược (Olympus CKX41) Hóa chất, sinh phẩm Một số sinh phẩm dùng nhiều như: nước cất lần, đệm PBS (0,01M, pH 7,2), enzyme phân giải yếu tố không đặc hiệu RDE (Denka seiken, Nhật),… 2.1 Phương pháp HA, HI - Huyết xử lý RDE có độ pha lỗng 1:10 - Kháng nguyên virus chuẩn - Hồng cầu gà 0,5% HVTH: Huỳnh Cơ Tấn 24 Generated by Foxit PDF Creator © Foxit Software http://www.foxitsoftware.com For evaluation only Luận văn tốt nghiệp 2.2 2.3 2.4 Vật liệu phương pháp Plate chữ V, 96 giếng (Nunc) Phương pháp SRID - Kit phát kháng nguyên, 05/204 (NIBSC, Anh) - Agarose tinh khiết - Bộ khung gel - Film nhựa - Cây đục lỗ gel (Þ 2-2,5mm) Phương pháp TCID50 - Tế bào MDCK 1,5x105 tb/ml, lớp đơn - Môi trường VIM, EMEM - Kháng nguyên virus - Flask, plate 96 giếng (Nunc) Phương pháp LD50 - Chuột nhắt trắng 6-7 tuần tuổi - Chủng virus NIBRG14 sống (NIBSC, Anh) - Khu ni động vật thí nghiệm riêng biệt, bảo đảm tính an tồn cao cho bên lẫn bên ngoài, tiêu chuẩn an toàn 2+ (BSL 2+) 2.5 2.6 Syringe 1ml (Vinahankook) Phương pháp trung hòa - Tế bào MDCK 1,5x105 tb/ml, lớp đơn - Môi trường VIM, EMEM - Kháng nguyên virus chuẩn - Huyết xử lý RDE - Flask, plate 96 giếng (Nunc) Phương pháp giám định virus - Kit RT-PCR (Promega) - Trứng gà phôi 10 ngày tuổi Phương pháp nghiên cứu 3.1 Một số thao tác động vật thí nghiệm HVTH: Huỳnh Cơ Tấn 25 Generated by Foxit PDF Creator © Foxit Software http://www.foxitsoftware.com For evaluation only Luận văn tốt nghiệp Vật liệu phương pháp Ø Tiêm động vật thí nghiệm ● Tiêm ổ bụng: đưa mũi tiêm vào thẳng ổ bụng chuột thử nghiệm ● Tiêm đường mũi: thí nghiệm cơng độc chuột thử nghiệm Ø Lấy máu tim, phổi, lách ● Lấy máu tim: chuột trước lấy máu tim gây mê sâu chloroform (trichloromethane, Chồng cầul3), dùng syringe 1ml đưa thẳng vào vùng xương ức đến tim chuột ● Lấy mẫu gan, lách: dùng kéo, cặp mổ lấy bệnh phẩm 3.2 Xử lí mẫu [43] Tất vật liệu, sinh phẩm xử lí theo tiêu chuẩn WHO 3.2.1 Xử lí hồng cầu gà 0,5% - Lọc khoảng 5ml máu tươi qua miếng gạc vào ống ly tâm - Ly tâm 1200vòng/phút 10 phút - Hút phần lớp đệm tế bào bạch cầu - Bổ sung PBS, trộn nhẹ - Ly tâm 1200vòng/phút phút Hút bỏ phần dịch - Lặp lại bước rửa PBS hai lần - Ước lượng thể tích khối tế bào hồng cầu pha loãng đến nồng độ thích hợp - Xác định nồng độ buồng đếm hồng cầu theo cơng thức tính WHO Thể tích cuối cho 0,5% dịch huyền phù tế bào chim (X): X= Tổng số tế bào đếm x thể tích huyền phù hồng cầu ban đầu 160 3.2.2 Xử lí mẫu bệnh phẩm gani, lách - Mổ lấy mẫu, nghiền mẫu mơi trường vận chuyển có bổ sung chất kháng sinh (1g mẫu, 9ml dịch môi trường) - Chuyển mẫu sang tube ly tâm, ly tâm 400xg 10 phút HVTH: Huỳnh Cơ Tấn 26 Generated by Foxit PDF Creator © Foxit Software http://www.foxitsoftware.com For evaluation only Luận văn tốt nghiệp - Vật liệu phương pháp Lấy dịch huyền phù, bỏ cặn, lưu mẫu -70 0C 3.2.3 Xử lí huyết sơ - Sau lấy máu chuột nhắt trắng xong, để nghiêng ống nghiệm chờ cho máu đông lại - Cho vào tủ ấm 370C 30 phút - Lấy cho vào tủ lạnh 40C - Ly tâm lạnh 0C, tốc độ 3000vòng/phút, 10 phút - Hút dịch phần huyết cần lấy - Sau hút lấy dịch huyết thanh, thấy đỏ nhiều ly tâm lạnh 40C, 3000vịng/phút 10 phút lần trước sử dụng - Trữ huyết tủ -200C 3.2.4 Xử lí mẫu huyết RDE - Mấu huyết (huyết thanh) xử lý với RDE theo độ pha loãng 1:5 (1 huyết thanh, RDE) 3.3 - Ủ 370C, qua đêm - Ủ tiếp 560C 30 phút - Làm thí nghiệm hay trữ -200C Xác định số tới hạn 50% [2, 17, 29] 3.3.1 Chỉ số TCID50 3.3.1.1 Định nghĩa TCID50 nồng độ virus mà có 50% số tế bào bị xâm nhiễm virus Đây phương pháp phục vụ cho công việc nghiên cứu virus, nhằm đánh giá sức sống khả xâm nhiễm lên tế bào xác định nguồn virus chuẩn cho phản ứng trung hịa kháng thể Cơng thức tính dựa phương pháp Reed & Muech LgTCID50 = Lg(liều thấp gây chết 50%) – LgA x pd tỉ lệ gây chết 50% thấp – 50% pd = tỉ lệ gây chết 50% thấp – 50% cao HVTH: Huỳnh Cơ Tấn 27 Generated by Foxit PDF Creator © Foxit Software http://www.foxitsoftware.com For evaluation only Luận văn tốt nghiệp Vật liệu phương pháp pd: proportionate distance, khoảng cách tỉ lệ A: bậc pha loãng 3.3.1.2 Thực - Chọn plate 96 có MDCK/HK lớp - Lấy plate U96 mới, pha loãng virus 1/2 log, từ 10-0,5 đến 10-6 - Rỏ VIM 230µl/giếng vào cỏc ging t A1A12 Đ R 105àl Stock virus ly t -800C vo A1 Đ Trn u A1, chuyn 105àl sang A2 pha loãng tới 10-6, thay tip sang giếng c) 105µl a) 230µl VIM to b) 105µl Virus stock to A1 Virus dil -0.5 -1 -1.5 -2 -2.5 -3 -3.5 -4 -4.5 -5 -5.5 -6 Hình 2.1: Minh họa phương pháp TCID50 - Rửa tế bào EMEM 200µl/giếng - Rỏ virus pha lỗng 50µl/giếng vào bốn hàng giếng tương ứng có tế bào (ví dụ A1-12, B1-12, C1-12, D1-12) ủ 350C - Rỏ VIM 130 µl/giếng vào tất giếng - Ủ plate 350C ngày HVTH: Huỳnh Cơ Tấn 28 Generated by Foxit PDF Creator © Foxit Software http://www.foxitsoftware.com For evaluation only Luận văn tốt nghiệp - Vật liệu phương pháp Đọc CPE tính TCID50 3.3.2 Chỉ số LD50 3.3.2.1 Định nghĩa Chỉ số LD50 nồng độ virus có khả gây chết 50% động vật thí nghiệm Cơng thức tính dựa phương pháp Reed & Muech trên, tương tự cách tính TCID50 Xác định số LD50 nhằm phục vụ cho nghiên cứu tính hiệu lực bảo vệ vaccine qua thí nghiệm thử thách (challenge) động vật tiêm vaccine 3.3.2.2 Thực - Chuột thí nghiệm chuột khỏe mạnh, bệnh, có nguồn gốc rõ ràng 7-8 tuần tuổi - Phân lơ thí nghiệm, lô từ 8-10 chuột - Chuột tiêm virus qua đường mũi, liều tiêm 20µl/lần, tiêm lần - Quan sát triệu chứng lâm sàng (rối loạn vận động, chán ăn …), ghi nhận chết tuần - Chuột chết mổ lấy lách, gan Giám định virus cách phân lập trứng phản ứng RT-PCR 3.3.3 Xác định hiệu giá kháng thể trung hòa Hiệu giá kháng thể trung hịa, mà có khả trung hịa lượng virus 100TCID50 Cơng thức tính: LgNT = Lg(liều cao gây CPE 50%) + LgA x pd 50% – 50% cao pd = tỉ lệ gây chết 50% thấp – 50% cao A: hệ số pha loãng 3.4 Định lượng kháng nguyên HA vaccine 3.4.1 Phương pháp HA 3.4.1.1 Mục đich HVTH: Huỳnh Cơ Tấn 29 Generated by Foxit PDF Creator © Foxit Software http://www.foxitsoftware.com For evaluation only Luận văn tốt nghiệp Vật liệu phương pháp Xác định hiệu giá kháng nguyên virus dịch nuôi cấy virus hay vaccine 3.4.1.2 Thực - Dùng plate 96 giếng đáy chữ V Mỗi plate dùng cho kháng nguyên - Bổ sung 50µl PBS vào giếng từ A2 → H12 - Bổ sung 100µl kháng nguyên thứ vào A1 B1, kháng nguyên thứ hai vào C1 D1, kháng nguyên thứ ba vào E1 F1 - Cho 100µl PBS vào giếng H1 Hình 2.2: Hình minh họa HA - Thực pha lỗng bậc 2: Hút 50µl dịch A1 chuyển qua A2, trộn đều, hút 50µl dịch A2 chuyển qua A3, tiếp tục đến A11, hút 50µl dịch A11 chuyển qua A12, trộn đều, hút 50µl dịch A12 bỏ Thực tương tự với hàng B, C,… F - Cho 50µl huyền phù hồng cầu vào tất giếng trừ H1 - Trộn - Ủ nhiệt độ phòng (22-250C) quan sát - Đọc kết hồng cầu đối chứng định vị Đọc kết quả: HVTH: Huỳnh Cơ Tấn 30 Generated by Foxit PDF Creator © Foxit Software http://www.foxitsoftware.com For evaluation only Luận văn tốt nghiệp Vật liệu phương pháp - Nếu xảy ngưng kết hồng cầu đánh dấu + - Nếu ngưng kết khơng hồn tồn đánh dấu +/- - Nếu không xảy ngưng kết hồng cầu đánh dấu – 3.4.2 Phương pháp SRID Được thực theo kit 05/204 NIBSC (Anh) Phương pháp nhằm kiểm định hàm lượng kháng nguyên vaccine khảo sát tính đáp ứng miễn dịch mức nồng độ kháng nguyên khác Thực ● Tạo gel - Lắp film nhựa vào khung gel - Đun thạch, để ấm 45-500C, cho kháng huyết chuẩn vào lắc - Nhỏ thạch vào khuôn gel - Để yên nhiệt độ phịng tủ lạnh để thạch đơng cứng lại - Đục lỗ gel ● Phản ứng kháng nguyên – kháng thể - Ủ kháng nguyên chuẩn vacine cần kiểm tra với chất tẩy swittergent - Pha loãng nồng độ kháng nguyên chuẩn, mẫu vaccine - Rỏ 15 µl/giếng - Ủ 20-250C ngày - Rửa gel nước cất - Tráng lỗ giếng thạch 1% tan chảy (30µl/giếng) - Ép vào giấy thấm để qua đêm ● Nhuộm gel - Chùi gel khô - Ngâm thuốc nhuộm Coomassie blue 15 phút - Tẩy dung dịch tẩy 1-2 - Để khô tự nhiên nhiệt độ phịng ● Tính tốn kết HVTH: Huỳnh Cơ Tấn 31 Generated by Foxit PDF Creator © Foxit Software http://www.foxitsoftware.com For evaluation only Luận văn tốt nghiệp - Vật liệu phương pháp Xác định đường chuẩn tuyến tính y = ax + b phần mềm Excel dựa vào thông số - Đường kính kháng ngun chuẩn bậc pha lỗng (mm) Nội suy hàm lượng HA có vaccine 3.5 Định lượng hiệu giá kháng thể 3.5.1 Phản pháp ngăn ngưng kết hồng cầu, HI 3.5.1.1 Chuẩn bị kháng nguyên chuẩn cho HI test (chuẩn độ ngược) Trong HI test, phản ứng cần đơn vị HA/25µl tương đương đơn vị HA/50µl Một HA đơn vị định nghĩa lượng virus cần thiết để ngưng tụ thể tích tương đương huyền phù hồng cầu tiêu chuẩn Ví dụ: phản ứng ngưng kết hồng cầu diện giếng thứ (A5) hiệu giá 16 phải pha loãng bậc để đơn vị/50µl Thực chuẩn độ ngược, kiểm chứng lại test HA ● Nếu pha chuẩn: Kết ngưng kết xảy giếng đầu ● Nếu pha không chuẩn: - Kháng nguyên đặc: Nếu ngưng kết đến giếng thứ tức thừa kháng nguyên Như vậy, kháng nguyên 8HA phải pha loãng (có thể gấp đơi) để có ngưng kết đến giếng thứ - Kháng nguyên loãng: Nếu ngưng kết đến giếng thứ tức thiếu kháng nguyên Như vậy, ta thêm lượng kháng nguyên (bằng với lượng kháng nguyên pha ban đầu) để có ngưng kết đến giếng thứ 3.5.1.2 Thực Sau làm chuẩn độ ngược, phần kháng nguyên để 0C có hiệu giá đơn vị/25µl, sử dụng cho HI test Mỗi plate dùng cho kháng nguyên - Chuẩn bị plate 96 - Bổ sung 25µl PBS vào giếng từ A2 → H12 - Bổ sung 50µl huyết H5 vào giếng A1 → H1 - Pha lỗng bậc huyết Hút 25µl A1 chuyển qua A2, A2 chuyển qua A3, … A12 Bỏ 25µl cuối A12 Tương tự với hàng B, C, H HVTH: Huỳnh Cơ Tấn 32 Generated by Foxit PDF Creator © Foxit Software http://www.foxitsoftware.com For evaluation only Luận văn tốt nghiệp - Vật liệu phương pháp Bổ sung 25µl kháng nguyên vào giếng từ A1 → G12 Mỗi hàng kháng nguyên - Bổ sung 25µl PBS vào giếng hàng H (H1 → H12) - Trộn hỗn dịch máy lắc - Bao plate nylon ủ nhiệt độ phòng (22-250C) 15 phút - Bổ sung 50µl hồng cầu vào tất giếng Trộn - Bao plate nylon để nhiệt độ phòng, quan sát, đọc kết Đọc kết - Nếu xảy ngưng kết hồng cầu đánh dấu + - Nếu ngưng kết khơng hồn tồn đánh dấu +/- - Nếu khơng xảy ngưng kết hồng cầu đánh dấu – 3.5.2 Phản pháp trung hòa (neutralization test) Phản ứng trung hịa phản ứng dùng để tính hiệu giá kháng thể trung hòa huyết Trước thực phản ứng này, cần xác định số TCID50 kháng nguyên virus chuẩn, phục vụ cho phản ứng trung hòa lượng virus 100TCID50 3.5.2.1 Thực phản ứng trung hòa Phản ứng trung hòa thực sau thực phản ứng TCID50 • Xử lý huyết - Pha loãng huyết 1:5, lấy 28µl huyết trộn với 112µl RDE (đủ làm với kháng nguyên), ủ 370C qua đêm bất hoạt 560C - 30 phút Mỗi huyết thực lần - Lấy plate U96 mới, rỏ 125µl EMEM vào tất giếng trừ hàng A12 → H12 Ở hàng rỏ 250µl/giếng để làm chứng tế bào - Rỏ 125µl huyết thứ xử lý vào giếng A1, huyết thứ hai vào giếng B1, tiếp tục rỏ huyết khác tới H1 - Pha loãng huyết bậc cách cho 125µl từ giéng A1-H1 sang A2-H2 Tiếp tục đến hàng 10 bỏ 125µl HVTH: Huỳnh Cơ Tấn 33 Generated by Foxit PDF Creator © Foxit Software http://www.foxitsoftware.com For evaluation only Luận văn tốt nghiệp Vật liệu phương pháp • Rỏ virus - Pha 12ml Working Dilution (WD) có 100 TCID50 virus/50µl VIM (đủ cho plate có huyết thanh) 5- 125µl 2- 125µl EMEM to 1- 125µl EMEM to 3- 125µl Serum (1/5) to No serum 4- 125µl Serum → (1/5) Serum dil 10 20 40 No virus 80 160 320 640 1280 2560 5120 Hình 2.3: Hình minh họa phương pháp trung hịa - Rỏ 125µl WD vào tất giếng plate huyết thanh, trừ hàng 12 - Chuẩn độ ngược WD, pha loãng bậc 10-0,5 WD plate U96 khác (105µl WD + 230µl VIM) - Ủ hỗn hợp huyết thanh+virus chuẩn độ ngược giờ, 350C (RT0) • Rỏ hỗn dịch huyết virus vào tế bào - Đổ bỏ môi trường plate MDCK Rửa plate lần với EMEM, 200µl/giếng - Rỏ huyết thanh+virus vào plate tế bào, 50µl/giếng Mỗi độ pha lỗng hỗn dịch huyết thanh+virus cấy giếng - Ủ 350C (RT0) - Thêm 130µl VIM/giếng ủ plates 350C HVTH: Huỳnh Cơ Tấn 34 Generated by Foxit PDF Creator © Foxit Software http://www.foxitsoftware.com For evaluation only Luận văn tốt nghiệp 3.6 Vật liệu phương pháp - Ủ 350C với 5% CO2 ngày - Đọc CPE tính hiệu giá kháng thể trung hịa huyết Phân lập, giám định virus Thí nghiệm xác định số LD50, chuột chết giám định nguyên chết qua mẫu bệnh phẩm như: gan, lách,… nhằm phát virus gây chết 3.6.1 Phân lập trứng gà có phơi Dịch virus bệnh phẩm cấy trứng gà phôi 10 ngày tuổi Ủ 37 C, sau ngày, thu dịch virus để tách RNA thưc phản ứng RT-PCR 3.6.2 Giám định virus 3.6.2.1 Phương pháp HA Phương pháp HA thực 3.6.2.2 Phương pháp RT-PCR Tách chiết RNA Việc xử lý, tách chiết RNA từ dịch trứng tiến hành kit QIAamp Viral RNA Mini (QUIAGEN) theo hướng dẫn nhà sản xuất Phản ứng RT-PCR Phản ứng RT-PCR phát virus H5N1 (gene H5) tiến hành với kit Access RT-PCR system (Promega) HVTH: Huỳnh Cơ Tấn 35 ... 3.7 : Thí nghiệm đáp ứng miễn dịch vaccine có chất bổ trợ Al(OH)3 Bảng 3.8 : Kết đáp ứng miễn dịch vaccine có chất bổ trợ Al(OH)3 Bảng 3.9 : Thí nghiệm đáp ứng miễn dịch vaccine với lịch tiêm nhắc... 3.4 : Kết đáp ứng miễn dịch vaccine không dùng chất bổ trợ Bảng 3.5 : Thí nghiệm đáp ứng miễn dịch vaccine có chất bổ trợ Al(PO4) Bảng 3.6 : Kết đáp ứng miễn dịch vaccine có chất bổ trợ Al(PO4)... vaccines), vaccine tiểu phần (split vaccine) vaccine kháng nguyên tinh chế (subunit vaccine) Ở bệnh cúm, vaccine toàn thân virus đánh giá cao cả, tính sinh miễn dịch cao dễ sản xuất 4.1.1 Vaccine