Thu nhận enzyme invertase từ saccharomyces cerevisiae

ĐẠI HỌC QUỐC GIA THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA  BÙI SƠN LÂM ĐỀ TÀI THU NHẬN ENZYME INVERTASE TỪ SACCHAROMYCES CEREVISIAE GVHD CHUYÊN NGÀNH : PGS.TS NGUYỄN ĐỨC LƯỢNG : CÔNG NGHỆ THỰC PHẨM VÀ ĐỒ UỐNG LUẬN VĂN THẠC SĨ TP HỒ CHÍ MINH, tháng 12 năm 2007 CƠNG TRÌNH ĐƯỢC HỒN THÀNH TẠI TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA ĐẠI HỌC QUỐC GIA TP HỒ CHÍ MINH Cán hướng dẫn khoa học: PGS.TS Nguyễn Đức Lượng Cán chấm nhận xét 1: PGS.TS Đồng Thị Thanh Thu Cán chấm nhận xét 2: TS Lê Thị Phú Luận văn thạc sĩ bảo vệ HỘI ĐỒNG CHẤM BẢO VỆ LUẬN VĂN THẠC SĨ TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA TP HCM, ngày…… tháng…… năm……… TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA PHÒNG ĐÀO TẠO SĐH CỘNG HÒA XÃ HỘI CHỦ NGHĨA VIỆT NAM ĐỘC LẬP-TỰ DO-HẠNH PHÚC  Tp HCM, ngày……tháng… năm 2007 NHIỆM VỤ LUẬN VĂN THẠC SĨ Họ tên: Bùi Sơn Lâm Ngày, tháng, năm sinh: 26-12-1980 Chuyên ngành: Công nghệ thực phẩm đồ uống I Phái: Nam Nơi sinh: Tp BMT MSHV: 01105263 TÊN ĐỀ TÀI: “Thu nhận enzyme invertase từ Saccharomyces cerevisiae” II NHIỆM VỤ VÀ NỘI DUNG: - Khảo sát trình tự phân nấm men bia để thu nhận enzyme invertase trường hợp có bổ sung khơng bổ sung enzyme hỗ trợ cho trình tự phân - Khảo sát trình tinh chế phẩm enzyme thơ thu sau trình tự phân - Khảo sát số đặc tính chế phẩm enzyme III NGÀY GIAO NHIỆM VỤ: IV NGÀY HOÀN THÀNH NHIỆM VỤ: V HỌ VÀ TÊN CÁN BỘ HƯỚNG DẪN: PGS TS Nguyễn Đức Lượng CÁN BỘ HƯỚNG DẪN CN BỘ MÔN QL CHUYÊN NGÀNH PGS.TS Nguyễn Đức Lượng Nội dung đề cương luận văn thạc sĩ Hội đồng chuyên ngành thông qua Ngày …….tháng …… năm 2007 TRƯỞNG PHÒNG ĐT-SĐH TRƯỞNG KHOA QL NGÀNH LỜI CẢM ƠN Em xin chân thành cảm ơn thầy cô môn Công nghệ thực phẩm trường Đại học Bách Khoa giúp đỡ tạo điều kiện thuận lợi để em hoàn thành luận văn Đặc biệt em xin cảm ơn hướng dẫn tận tình thầy Nguyễn Đức Lượng xuyên suốt trình thực luận văn Xin cảm ơn bạn bè, đồng nghiệp người thân luôn động viên giúp đỡ vượt qua lúc khó khăn để làm tốt luận văn Tp.HCM, tháng 12 năm 2007 Bùi Sơn Lâm TĨM TẮT Ngồi amylase glucose-isomerase, invertase enzyme quan trọng sử dụng phổ biến công nghiệp sản xuất dịch syrup, bánh kẹo kỹ thuật phân tích Do enzyme hoạt động điều kiện ơn hịa, cho sản phẩm thủy phân có chất lượng cao Nấm men bia thuộc lồi Saccharomyces cerevisiae, chứa enzyme invertase, thường chủ yếu tập trung lớp không gian chu chất tế bào Lượng bã nấm men bia từ nhà máy thải hàng năm ngày tăng nguồn nguyên liệu dồi tận dụng để thu nhận enzyme invertase Nghiên cứu trình tự phân, sử dụng chế phẩm 𝛽glucanase (Viscozyme) hãng Novozyme giúp cho việc phá vỡ màng tế bào nhanh hoạt tính invertase thu gấp 1.84 lần so với không bổ sung Tìm thơng số q trình hàm lượng Viscozyme bổ sung 2% (so với chất khô nấm men), pH 5,5 nhiệt độ 500C Sử dụng phương pháp kết tủa enzyme muối anmonium sulfate, ethanol, propanol-2 kết hợp phương pháp sắc ký trao đổi ion để tinh enzyme Kết cho thấy phương pháp kết tủa Ethanol sau chạy sắc ký trao đổi ion (với DEAE-Sephadex) cho kết tốt với hiệu suất thu hồi enzyme 70,47% độ tinh 66,29% Chế phẩm enzyme invertase thu có đặc tính sau: Km=40,927 Vm=0.997 đồng thời tìm pH thích hợp 5,5 nhiệt độ 550C ABSTRACT Besides amylase and glucose-isomerase, invertase is an important enzyme which is most popular used in syrup and confectionery industry, and analysis technology because of its mild medium environment and giving high quality hydrolytic products Yeast, Saccharomyces cerevisiae, contains invertase which focuses mainly in yeast periplasm The yeast cells quantity is discharged from factories increase yearly and this profuse raw material is salvaged to receive invertase Researching in self-metabolism, when using ß-glucanase (Viscozyme) of Novozyme company the breaking cell process is faster and obtaining invertase activity is 1.84 times than the process without ßglucanase The parameters we get through this process: the additional Viscozyme is 2% (against with yeast mass), pH 5.5 at 500C We use ammonium sulfate, ethanol and propanol-2 to precipitate invertase and combine with ion-exchange chromatography to purify enzyme The enzyme precipitating method by Ethanol then using ion-exchange chromatography (with DEAE-Sephadex) gives the best result with enzyme recovered productivity is 70.47% and the purity 66.29% The obtaining purifying enzyme has the characteristics as below: Km= 40.927 and Vm= 0.997 optimal pH is 5.5 at 550C TÓM TẮT LÝ LỊCH I LÝ LỊCH TRÍCH NGANG: Họ tên: Bùi Sơn Lâm Phái: Nam Ngày tháng năm sinh: 26/12/1980 Tại: Tp Buôn Ma Thuột Nguyên quán: Trung Lộc, Can Lộc, Hà Tĩnh Địa chỉ: 9C Hồng Diệu, Tp Bn Ma Thuột Dân tộc: Kinh Tơn giáo: Khơng II Q TRÌNH ĐÀO TẠO TRUNG HỌC: Chế độ học: Chính qui Thời gian học: từ 1995 đến 1998 Nơi học: Trường PTTH Buôn Ma Thuột, Tp Bn Ma Thuột ĐẠI HỌC: Chế độ học: Chính qui Thời gian học: từ 1998 đến 2003 Nơi học: Trường Đại Học Kỹ Thuật Đà Nẵng Ngành học: Công nghệ thực phẩm Ngày nơi bảo vệ luận án tốt nghiệp: năm 2003 trường Đại học Kỹ Thuật Đà Nẵng Người hướng dẫn: GS.TSKH Lê Văn Hoàng TRÊN ĐẠI HỌC: Cao học từ năm 2005 đến 2007 Trường Đại học Bách Khoa Tp.HCM Tên luận án: Thu nhận enzyme invertase từ Saccharomyces cerevisiae Ngày nơi bảo vệ: 01/2008 trường Đại học Bách Khoa Tp.HCM Người hướng dẫn: PGS.TS Nguyễn Đức Lượng Trang MỤC LỤC DANH MỤC CÁC BẢNG DANH MỤC CÁC HÌNH Phần I: MỞ ĐẦU LỜI MỞ ĐẦU Phần II: TỔNG QUAN 10 2.1 Nguồn thu nhận enzyme Invertase 11 2.1.1 Thu nhận enzyme invertase từ thực vật bậc cao 11 2.1.2 Thu nhận enzyme invertase từ vi sinh vật 11 2.2 Nấm men 12 2.2.1 Hình thái nấm men 12 2.2.2 Cấu tạo tế bào nấm men 13 2.2.2.1 Thành tế bào 13 2.2.2.2 Lớp không gian chu chất 13 2.2.2.3 Màng tế bào chất 14 2.2.2.4 Tế bào chất 14 2.2.2.5 Nhân tế bào 14 2.2.2.6 Không bào 15 2.2.2.7 Volutin 15 2.2.2.8 Ty thể 15 2.2.2.9 Ribosome 16 2.3 Enzyme invertase 16 2.3.1 Khái niệm 16 2.3.2 Đặc điểm Enzyme invertase từ Saccharomyces cerevisiae 18 2.3.2 Ứng dụng enzyme invertase 20 2.3.2.1 Sản xuất đường nghịch đảo 20 2.3.2.2 Sản xuất mứt kẹo 21 2.4 Quá trình thu nhận enzyme invertase 23 Học viên: Bùi Sơn Lâm Luận văn cao học Trang 2.4.1 Rửa nấm men thu sinh khối nấm men 24 2.4.2 Phá vỡ tế bào 24 2.4.2.1 Các phương pháp học 24 2.4.2.2 Các phương pháp phi học 26 2.4.2.3 Quá trình tự phân 26 2.4.3 Tinh enzyme 27 2.4.3.1 Phương pháp kết tủa 27 2.4.3.2 Phương pháp siêu lọc (Ultrafiltration) 28 2.4.3.3 Phương pháp sắc ký 29 2.5 Tình hình số lượng bã nấm men số nhà máy bia 31 Phần III: NỘI DUNG NGHIÊN CỨU 32 3.1 Mục đích 33 3.2 Sơ đồ nghiên cứu 33 3.3 Nguyên liệu 34 3.3.1 Nấm men 34 3.3.2 Đường 34 3.3.3 Enzyme 34 3.4 Phương pháp nghiên cứu 35 3.4.1 Khảo sát số phương pháp phá vỡ màng tế bào 35 3.4.2 Quá trình tinh enzyme invertase 35 3.5 Các phương pháp phân tích 36 3.5.1 Xác định hàm lượng chất khô nấm men 36 3.5.2 Xác định hàm lượng đường khử phương pháp DNS (acid 3,5DinitroSalicylic) 37 3.5.3 Xác định protein phương pháp so màu Lowry 37 3.5.4 Xác định hoạt tính invertase 38 3.6 Xử lý số liệu thực nghiệm 40 Phần IV :KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 41 4.1 Phá vỡ tế bào phương pháp tự phân 42 Học viên: Bùi Sơn Lâm Luận văn cao học Trang 4.1.1 Khảo sát tỷ lệ sinh khối nấm men/ dung môi 42 4.1.3 Khảo sát ảnh hưởng pH 44 4.2 Phương pháp tự phân có bổ sung enzyme 46 4.2.1 Xác định hàm lượng chế phẩm Viscozyme bổ sung 47 4.2.2 Xác định pH ban đầu dịch nấm men có bổ sung Viscozyme 48 4.2.3 Xác định nhiệt độ ban đầu của nấm men 49 4.3.1 Phương pháp kết tủa enzyme 51 4.3.1.1 Kết tủa muối ammonium sulfate, (NH4)2SO4 51 4.3.1.2 Kết tủa dung môi Ethanol 52 4.3.1.3 Kết tủa dung môi propanol-2 54 4.3.2 Tinh enzyme phương pháp sắc ký trao đổi ion 55 4.4 Khảo sát số tính chất chế phẩm enzyme 60 4.4.1 Xác định nhiệt độ thích hợp chế phẩm 60 4.4.2 Xác định pH thích hợp chế phẩm 62 4.4.3 Khảo sát động học chế phẩm invertase 63 Phần V: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 67 5.1 Kết luận 68 5.2 Đề nghị 68 TÀI LIỆU THAM KHẢO 69 Học viên: Bùi Sơn Lâm Luận văn cao học Trang 57 phân đoạn dung dịch muối (NaCl) đệm phosphat 10mM, Hoạt tính invertase (UI/ml ) 1 Hàm lượng protein (mg/ml) pH=6,5 với gradient nồng độ muối từ 0,1÷0,4M, ứng phân đoạn 5ml 0.9 0.9 0.8 0.8 0.7 0.7 0.6 0.6 0.5 0.5 0.4 0.4 0.4 0.3 0.3 0.3 0.2 0.2 0.2 0.1 0.1 0.1 0 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 Hoạt tính enzyme Phân đoạn Nồng độ NaCl Hàm lượng protein Nồng độ NaCl (M) Hình 4.9 Giản đồ thu invertase cột sắc ký trao đổi ion DEAE-Sephadex A25 Do khơng có thiết bị phối trộn để tạo gradient nồng độ muối NaCl nên tiến hành rửa giải nồng độ muối theo phương pháp bậc thang Dung dịch phân đoạn từ đến cho thấy trình rửa cột dung dịch đệm phosphat cho thấy lượng lớn protein không liên kết với hạt DEAE-Sephadex rửa trơi chúng khơng có hoạt tính invertase mà hoạt tính enzyme invertase tập trung phân đoạn từ đến 10 nồng độ muối từ 0,1M đến 0,2M Từ phân đoạn 11 trở chứa lượng protein định khơng có hoạt tính thấp Các phân đoạn có hoạt tính cao gộp chung lại chế phẩm enzyme invertase Các bước q trình tinh tóm tắt bảng sau: Học viên: Bùi Sơn Lâm Luận văn cao học Trang 58 Bảng 4.11 Hiệu tinh enzyme invertase sắc ký trao đổi ion Gai đoạn Protein Tổng hoạt tính Hiệu suất Độ tinh (mg) invertase (UI) thu hồi (%) Dịch thô 202,72 21,22 100 Sephadex G100 124,86 15,28 72,00 1,17 DEAE-Sephadex 9,22 15,02 70,77 15,56 Qua cho thấy hiệu tinh cột DEAE-sephadex tốt (15,56 lần) khả giữ lại hoạt tính cao đạt 70,77% Thí nghiệm II: Trong thí nghiệm lấy 20ml dung dịch enzyme sau kết tủa dung môi ethanol propanol-2 cho chạy qua cột DEAE-Sephadex với điều kiện giống làm thí nghiệm I, tiến hành 1.8 1.8 1.6 1.6 1.4 1.4 1.2 1.2 1 Hàm lượng protein (mg/ml) Hoạt tính invertase (UI/ml ) thu phân đoạn 5ml, ta giản đồ 0.8 0.8 0.6 0.6 0.4 0.4 0.2 0.2 0.2 0.1 0 0 Hoạt tính enzyme Phân đoạn 10 11 12 Nồng độ NaCl (M) NaCl Hàm lượng protein Hình 4.10 Giản đồ thu invertase cột DEAE-Sephadex sau tủa với Ethanol Học viên: Bùi Sơn Lâm Luận văn cao học Trang 59 Dựa vào giản đồ cho thấy, hoạt tính enzyme invertase thu cao phân đoạn 5, phân đoạn Sự diện rõ ràng peak hoạt tính cho thấy khả tách DEAE-Sephadex tốt 1.8 1.8 1.6 1.6 1.4 1.4 1.2 1.2 1 Hàm lượng protein (mg/ml) Hoạt tính invertase (UI/ml ) kết tủa phần ethanol 0.8 0.8 0.6 0.6 0.4 0.4 0.2 0.2 0.2 0.1 0 Hoạt tính invertase NaCl Hàm lượng protein 10 11 Phân đoạn 12 Nồng độ NaCl (M) Hình 4.11 Giản đồ thu invertase cột DEAE-Sephadex sau tủa với Propanol-2 Cũng giống thí nghiệm I peak cho hoạt tính enzyme invertase xuất phân đoạn có nồng độ muối từ 0,1÷0,2M mà thơi hai giản đồ hình 4.10 4.11 biển phân đoạn đến cuối nồng độ muối 0,2M mà thơi Các peak hoạt tính enzyme invertase giản đồ bắt đầu xuất phân đoạn kết thúc phân đoạn 10, kéo dài từ nồng độ muối 0,1÷0,2M Nhưng dung dịch enzyme thô kết tủa dung môi trước chạy qua cột DEAE-Sephadex xuất peak hoạt tính enzyme invertase chứng tỏ xử lý qua dung môi loại bỏ bớt tạp chất dịch thô chạy qua cột DEAE-Sephadex cho peak có hoạt tính invertase rõ ràng Tóm tắt bước trình tinh bảng Học viên: Bùi Sơn Lâm Luận văn cao học Trang 60 Bảng 4.12 Hiệu tinh enzyme invertase sắc ký trao đổi ion sau xử lý dung mơi Ethanol Propanol-2 Gai đoạn Protein Tổng hoạt tính Hiệu suất Độ tinh (mg) invertase (UI) thu hồi (%) Ethanol Dịch thô 202,72 24,637 100 Kết tủa 11,205 22,989 93,31 16,88 2,15 17,36 70,47 66,29 DEAE-Sephadex Propanol-2 Dịch thô 202,72 24,637 100 Kết tủa 26,15 23,75 96,40 7,47 DEAE-Sephadex 6,43 17,40 70,62 22,25 Kết luận: Qua thí nghiệm I II cho thấy sử dụng dung môi ethanol để tinh sơ trước tinh qua cột DEAE-Sephadex cho kết tốt nhất, độ tinh tồn q trình 66,29 lần với hiệu suất thu hồi 70,47% sử dụng propanol-2 cho hiệu suất thu hồi 70,62% cho độ tinh có 22,25 Kết cho thấy hiệu hẳn so với chạy sắc ký trao đổi ion mà khơng có tiền xử lý với dung môi bảng 4.11 (hiệu suất thu hồi 70,77%, độ tinh 15,56) 4.4 Khảo sát số tính chất chế phẩm enzyme 4.4.1 Xác định nhiệt độ thích hợp chế phẩm Sau trình tinh sạch, phân đoạn có chứa hoạt tính enzyme invertase gộp lại với ta chế phẩm enzyme invertase Khảo sát ảnh hưởng nhiệt độ đến hoạt tính chế phẩm thu chúng tơi tiến hành thay đổi nhiệt độ q trình thủy phân từ 300C đến 700C với pH=4,5 thời gian tiến hành phản ứng 15 phút Học viên: Bùi Sơn Lâm Luận văn cao học Trang 61 Bảng 4.13 Ảnh hưởng nhiệt độ đến hoạt tính chế phẩm Nhiệt độ Hoạt tính enzyme So với hoạt tính cực đại (0C) (UI/ml) (%) 30 0,394 69,50 35 0,417 73,53 40 0,463 81,68 45 0,501 88,28 50 0,545 96,08 55 0,567 100 60 0,531 93,57 65 0,397 69,94 70 0,070 12,29 Ta có đồ thị: Hoạt tính invertase (so với hoạt tính cực đại, % ) 120.00 100.00 80.00 60.00 40.00 20.00 0.00 20 25 30 35 40 45 Nhiệt độ, 50 55 60 65 70 75 0C Hình 4.13 Ảnh hưởng nhiệt độ đến hoạt tính chế phẩm invertase Trên đồ thị cho thấy ảnh hưởng nhiệt độ hoàn toàn phù hợp với quy luật ảnh hưởng nhiệt độ đến enzyme, chế phẩm chúng tơi có Học viên: Bùi Sơn Lâm Luận văn cao học Trang 62 vùng nhiệt độ hoạt động rộng, tăng nhiệt độ từ 30÷550C hoạt tính chế phẩm tăng đến cực đại, điều giải thích nhiệt độ tăng tốc độ chuyển động phân tử tăng làm tăng khả tiếp xúc chất với enzyme dẫn đến tốc độ phân giải chất nhanh Nhưng tăng nhiệt độ lên ảnh hưởng lớn đến hoạt tính chế phẩm, nhiệt độ tăng từ 600C đến 700C hoạt tính chế phẩm giảm nhanh từ 93,57% xuống 12,28% Đó nhiệt độ 700C làm protein enzyme thay đổi cấu trúc khơng gian, biến tính khơng thuận nghịch dẫn đến làm hoạt tính chế phẩm invertase Qua khảo sát tìm nhiệt độ thích hợp chế phẩm 550C 4.4.2 Xác định pH thích hợp chế phẩm Khảo sát ảnh hưởng pH đến hoạt tính chế phẩm cách thay đổi pH dung dịch đệm acetate từ 3,0÷6,5 tiến hành cho phản ứng nhiệt độ tìm thấy 550C thời gian phản ứng 15 phút Bảng 4.14 Ảnh hưởng pH đến hoạt tính chế phẩm Hoạt tính enzyme So với hoạt tính cực đại (UI/ml) (%) 3.0 0,203 33,70 3,5 0,358 59,59 4,0 0,428 71,21 4,5 0,568 94,44 5.0 0,601 100 5,5 0,553 92,09 6.0 0,521 86,75 6.5 0,481d 79,99 pH Các giá trị khơng ký tự (bảng 4.6) khác chúng có nghĩa (p= 0,05) Học viên: Bùi Sơn Lâm Luận văn cao học Trang 63 Ta có: Hoạt tính invertase (so với hoạt tính cực đại, % ) 120.00 100.00 80.00 60.00 40.00 20.00 0.00 2.0 2.5 3.0 3.5 4.0 4.5 5.0 5.5 6.0 6.5 7.0 pH Hình 4.12 Sự ảnh hưởng pH đến hoạt tính chế phẩm invertase Trên đồ thị cho thấy pH có ảnh hưởng đến hoạt tính chế phẩm enzyme invertase, tăng pH phản ứng từ 3,0÷5,0 hoạt tính chế phẩm tăng nhanh đạt cực đại pH= 5,0 với hoạt tính chế phẩm 0,601 UI/ml pH= 5,5 trở có giảm hoạt tính tốc độ giảm có chậm Chế phẩm enzyme thu có pH hoạt động tốt 5,0 4.4.3 Khảo sát động học chế phẩm invertase Ta có phương trình Linearweaver Burk Km 1    v Vm [ S ] Vm Trong đó: Km : số phân ly biểu kiến phức enzyme-cơ chất Giá trị Km thể lực enzyme chất, Km nhỏ lực enzyme chất lớn ngược lại Học viên: Bùi Sơn Lâm Luận văn cao học Trang 64 Vm : vận tốc phản ứng cực đại, đơn vị M/phút Để xác định thông số Km Vm chế phẩm invertase, thực thí nghiệm với nồng độ chất khác nhau, là: 2g/L, 5g/L, 10g/L, 15g/L, 20g/L 25g/L tương ứng với 5,85mM, 14,71mM, 43,48mM, 58,82mM, 71,43mM Tiến hành thủy phân điều kiện pH= 5,0 nhiệt độ 550C, nồng độ enzyme, 15 phút lấy mẫu đem xác định hàm lượng đường khử, từ xác định hàm lượng chất thủy phân Tổng số lần lấy 10 lần Từ kết thu ta có đồ thị biểu diễn thay đổi nồng độ chất theo thời gian, ứng với thí nghiệm 45 Nồng độ đường bị thủy phân (mM) 40 35 2g/L 30 5g/L 25 10g/L 15g/L 20 20g/L 15 25g/L 10 0 15 30 45 60 75 90 105 120 135 150 Thời gian (phút) Hình 4.14 Hàm lượng đường bị thủy phân theo thời gian nồng độ chất khác Áp dụng phương trình bảng tính Excel ta có: Bảng 4.15 Phương trình biểu diễn mối quan nồng độ chất theo thời gian phản ứng với nồng độ chất khác Học viên: Bùi Sơn Lâm Luận văn cao học Trang 65 Nồng độ chất Tốc độ ban đầu phản Phương trình (g/L) ứng (mM/phút) Y=3.10-6x3-0,001x2+0,125x+0,08 0,125 Y=5.10-6x3-0,001x2+0,262x+0,068 0,262 10 Y=6.10-6x3-0,002x2+0,400x+0,087 0,400 15 Y=8.10-6x3-0,003x2+0,512x+0,055 0,512 20 Y=9.10-6x3-0,003x2+0,584x+0,011 0,584 25 Y=10.10-6x3-0,004x2+0,685x+0,203 0,685 Ta có: Bảng 4.16 Các giá trị 1/[S] 1/V tương ứng với nồng độ chất Nồng độ chất 1/[S] 1/V (g/L) (mM)-1 (mM/phút)-1 0,171 8,000 0,068 3,817 10 0,034 2,500 15 0,023 1,953 20 0,017 1,712 25 0,014 1,460 Suy ra: 9.00 8.00 1/V (mM/phút)-1 7.00 6.00 5.00 y = 41.053x + 1.0035 R² = 0.9992 4.00 3.00 2.00 1.00 0.00 0.05 0.1 0.15 0.2 1/[S], (mM)-1 Hình 4.15 Đường biểu diễn mối quan hệ 1/[S] 1/V Học viên: Bùi Sơn Lâm Luận văn cao học Trang 66 Ta có phương trình biểu diễn mối quan hệ 1/[S] 1/V là: 1  41,053   1,0035 V [S ] So sánh với phương trình Lineaweaver Burk ta có: Km 1    v Vm [ S ] Vm Suy ra: Km = 40,927 mM Vm = 0,997 mM/phút Vậy chế phẩm enzyme invertase sau trình tinh thu có Km=40,927 mM Vm= 0,997 mM/phút Học viên: Bùi Sơn Lâm Luận văn cao học Trang 67 Phần V KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ Học viên: Bùi Sơn Lâm Luận văn cao học Trang 68 5.1 Kết luận Qua trình thực nghiệm cho thấy trình tự phân có bổ sung enzyme hỗ trợ Viscozyme L-hãng Novozymes cho hoạt tính invertase gấp 1.84 lần so với trường hợp không sử dụng enzyme hỗ trợ tìm thơng số thích hợp tỷ lệ nấm men/dung môi 1/5 (w/v), nhiệt độ trình tự phân 500C, pH= 5,5, thời gian 48 giờ, lượng enzyme bổ sung 2% (chất khô nấm men) 2.Trong phương pháp tinh sạch, phương pháp tiền xử lý với dung mơi ethanol sau chạy sắc ký trao đổi ion qua cột DEAE-Sephadex cho kết tốt với hiệu suất thu hồi enzyme 70,47% độ tinh 66,29 Chế phẩm enzyme thu sau q trình tinh có Km=40,927 Vm=0,997 đồng thời tìm nhiệt độ thích hợp 550C pH= 5,0 5.2 Đề nghị - Khảo sát thêm phương pháp khác để hỗ trợ trình phá vỡ màng tế bào như: phương pháp nghiền bi, đồng hóa áp suất cao… So sánh hiệu với trình tự phân - Tiếp tục tiến hành biện pháp loại muối cô đặc để thu chế phẩm enzyme dạng rắn - Nghiên cứu khảo sát độ bền nhiệt độ pH tác nhân hoạt hóa hay ức chế hoạt tính chế phẩm enzyme thu - Nghiên cứu biện pháp nhằm bảo quản chế phẩm dạng rắn lỏng thời gian dài - Nghiên cứu biện pháp cố định enzyme để tăng hiệu sử dụng enzyme - Nghiên cứu sản xuất chế phẩm quy mô lớn nhằm áp dụng vào thực tiễn cách dễ dàng Học viên: Bùi Sơn Lâm Luận văn cao học Trang 69 TÀI LIỆU THAM KHẢO Kiều Hữu Ảnh, 1999 Giáo trình vi sinh vật học cơng nghiệp, NXB KH&KT, Hà Nội Phạm Luận, Nguyễn Xuân Dũng, 1987 Sách tra cứu pha chế dung dịch (tập 1), NXB KH&KT Hà Nội Nguyễn Đức Lượng, 2004 Công nghệ enzym, NXB Đại học Quốc gia Tp HCM Nguyễn Đức Lượng, 2003 Thí nghiệm hóa sinh học, NXB Đại học Quốc gia Tp HCM Nguyễn Đức Lượng, 1996 Công nghệ vi sinh vật (Tập 1), Trường ĐH Bách Khoa Tp HCM Nguyễn Văn Mùi, 2001 Thực hành hóa sinh học, NXB KH&KT Hà Nội Lê Ngọc Tú, 2000 Hóa sinh cơng nghiệp, NXB KH&KT Anton P.J.Middelberg, 1995 Process-scale disruption of microorganisms Biotechnology Advances, vol 13,No 3, p 491-551 Anthony Reddy and Frank Maley, 1996 Studies on Identifying the Catalytic Role of Glu-204 in the Active Site of Yeast Invertase The journal of biological chemistry, vol 271, No.24, p 13953-13958 10 Beatrice B Abrams, Richard Hackel, Takemitsu Mizunaga and J.Oliver Lampen, 1978 Relationship of large and small invertase in Saccharomyces: Mutant selectively deficient in small invertase Journal of Bacteriology, p 809-817 11 Carl A.Neuberg and Irene S.Roberts, 1943 Process of manufacturing invertase preparations United States Patent Office, Serial No.475178 12 Chia-Chen Liu, Li-Chun Huang, Chen-Tien Chang, Hsien-Yi Sung, 2005 Purification and characterization of soluble invertases from suspensioncultured bamboo (Bambusa edulis) cells Food Chemistry, p 621-631 13 Everett L.Saul and J.M.Nelson, 1935 The influence of proteins on the activity of yeast invertase The journal of Biologiccal Chemistry 14 Fernando Moreno, Amparo G.Ochoa, Santiago Gascon, and Julio R.Villanueva, 1974 Molecular form of yeast invertase Eur.J.Biochem, 50, p 571-579 15 Frederick K.Chu, Robert B.Trimble and Frank Maley, 1978 The effect of Carbohydrate depleption on the properties of Yeast external invertase The Journal of Biological Chemistry, vol.153, No.24, p 8691-8693 Học viên: Bùi Sơn Lâm Luận văn cao học Trang 70 16 Gunther Kern, Dorothee Kern, Rainer Jaenicke and Robert Seckler, 1993 Kineticsof folding and association of differently glycosylated variants of invertase from Saccharomyces cerevisiae Protein Science, 2, p 1862-1868 17 Helmut Hustedt et al, 1990 Process for obtaining invertase from yeast United States Patent Office, Serial No.573222 18 Kazuhiro Fukui, Yoshio Fukui and Takafumi Moriyama, 1973 Purification and properties of dextransucrase and invertase from Streptococus mutan Journal of Bacteriology, p 796-807 19 Kiran Shafig, Sikander Ali and Ikram-ul-Haq, 2003 Time Course study for yeast invertase production by submerged fermentation Journal of Biological Sciences 3, p 984-988 20 Ludwig Lehle, Robert E.Cohen and Clinton E.Balou, 1979 Carbohydrate structure of Yeast Invertase The Journal of Biological Chemistry, vol 254, No.23, p 12209-12218 21 M Habibur Rahman, A S M Aynul Haque Akand, Tanzima Yeasmin, Md Salim Uddin and Mahbubur Rahman, 2001 Purification and Properties of Invertase from Mango Fruit Pakistan Journal of Biological Sciences (10), p 1271-1274 22 Magaret T.Maynard and Howard K.Kuramitsu, 1973 Purification and Antigenic Properties of Intracellular Invertase from Streptococcus mutans Infection and Immunity, vol.23, No.3, p 873-883 23 Markku Tammi, Lun Ballou, Alice Taylor and Clinton E.Ballou, 1986 Effect of Glycosylation on yeast invertase oligomer Stability The Journal of Biological Chemistry, vol 262, No.9, p 4395-4401 24 J.George Lutz and J.M.Nelson, 1934 Preparation of highly active yeast invertase The Journal of Biologic Chemistry 25 Paloma Liras and Santiago Gascon, 1971 Biosynthesis and Secretion of Yeast Invertase, Effect of Cycloheximide and 8-Deoxy-D-glucose Eur.J.Biochem, vol.23, p 160-165 26 Peter N Lipke and Rafael Ovalle, 1998 Cell Wall Architecture in Yeast: New Structure and New Challenges Journal of Bacteriology, vol 180, No.15, p 3735-3740 27 Robert B.Trimble and Frank Maley, 1977 Subunit Structure of External invertase from Saccharomyces cerevisiae The Journal of Biological Chemistry, vol 252, No.12, p 4409-4412 28 Rodney F.Boyer, 1993 Modern Experimental Biochemistry, 2th The Benjamin / Cummings Publishing Company, Inc 29 S C Kuo and J.O.lampen, 1971 Osmotic regulation invertase formation and secretion by protoplast of Saccharomyces Journal of Bacteriology, vol 106, No.1, p 183-191 Học viên: Bùi Sơn Lâm Luận văn cao học Trang 71 30 Salvado Mormeneo and Rafael Sentandreu, 1982 Regulation of invertase synthesis by glucose in Sacharomyces cerevisiae Journal of Bacteriology, p14-18 31 Santana de Almeida,A et al, 2005 Sucrose hydrolysis catalyzed by autoimmobilized invertase into intact cells of Cladosporium Cladosporioides Electronic Journal of Biotechnology, vol 8, No.1 32 Santiago Gascón, Norbert P.Neuman and J.Oliver Lampen, 1968 Comparative Study of the properties of the purified Internal and External Invertases from yeast The journal of Biologiacal chemistry, vol 248, No.7, p 1573-1577 33 Santiago Gascón and Oliver Lampen, 1967 Purification of internal invertase of yeast The Journal of Biological Chemistry, vol 243, No.7, p 1567-1572 34 Sergio Moreno, Yolanda Sanchez and Luis Rodriguez, 1990 Purification and characterization of the invertase from Schizosaccharomyces pombe Biochem J, 267, p 697-702 35 V.Anthony Reddy, Richard S.Johnson and others, 1987 Characterization of the glycosylation site in yeast external invertase The Journal of Biological Chemistry, vol 263, No.15, p 6978-6985 36 http://biochemie.web.med.uni-muenchen.de/Yeast_Biol/ 37 http://www.britishsugar.co.uk/RVE8c65eef1771741df814105fe91a6a687,,.as px 38 http://www.eng.umd.edu/~nsw/ench485/lab14.htm 39 http://www.lsbu.ac.uk/biology/enztech/determination.html 40 http://www.mapsenzymes.com/History_of_Enzymes.asp Học viên: Bùi Sơn Lâm Luận văn cao học ... 2.1 Nguồn thu nhận enzyme Invertase Enzyme invertase thu nhận chủ yếu từ vi sinh vật thực vật bậc cao 2.1.1 Thu nhận enzyme invertase từ thực vật bậc cao [12, 21, 34] Invertase thu nhận từ thực... TỔNG QUAN 10 2.1 Nguồn thu nhận enzyme Invertase 11 2.1.1 Thu nhận enzyme invertase từ thực vật bậc cao 11 2.1.2 Thu nhận enzyme invertase từ vi sinh vật 11 2.2 Nấm men... TÀI: ? ?Thu nhận enzyme invertase từ Saccharomyces cerevisiae? ?? II NHIỆM VỤ VÀ NỘI DUNG: - Khảo sát trình tự phân nấm men bia để thu nhận enzyme invertase trường hợp có bổ sung khơng bổ sung enzyme