BÀI 4: NHÂN SINH KHỐI SACCHAROMYCES CEREVISIAE ĐỂ THU NHẬN ENZYME INVERTASE I II MỤC ĐÍCH THÍ NGHIỆM Quan sát hình thái đếm số lượng tế bào Saccharomyces cerevisiae Cố định nấm men gel alginate Xác định hiệu suất cố định nấm men NGUYÊN TẮC Sinh khối nấm men Saccharomyces cerevisiae tế bào sống ứng dụng trong: sản xuất đồ uống lên men, sản xuất bánh mì, sữa chua y học sản xuất thuốc hỗ trợ tiêu hóa biolactovin Ngồi S.cerevisiae quan tâm nhiều lĩnh vực thu nhận enzyme invertase để thủy phân đường saccharose thành đường nghịch đảo Saccharomyces cerevisiae Eukaryote đơn bào có kích thước 5-10μm nên tiến hành thí nghiệm vi khuẩn, ni mơi trường lỏng đặc tạo khuẩn lạc môi trường thạch Thích nghi với mơi trường chứa đường cao, tính acid cao Có thể ni tế bào nấm men quy mô lớn nồi lên men dễ dàng thu nhận sinh khối tế bào Nấm men bia thuộc lồi Saccharomyces cerevisiae, có hoạt tính enzyme invertase (EC 3.2.1.26) Enzyme thường tập trung chủ yếu lớp không gian chu chất tế bào nấm men Ngành công nghiệp sản xuất bia hàng năm thải lượng lớn bã nấm men bia Trung bình sản xuất 100 lít bia thu lít bã nấm men với độ ẩm 88% Hiện nay, bã nấm men bia sử dụng để sản xuất bột chiết nấm men (yeast extract) làm thức ăn gia súc Alginate loại polymer sinh học phổ biến nhiều thứ hai giới sau cellulose Nguồn alginate chủ yếu tìm thấy thành tế bào gian bào tảo nâu sống biển dạng muối alginate Alginate tồn dạng không tan alginate canxi magie (AlgCa, AlgMg) bền vững thành tế bào rong Cấu tạo hóa học alginate gồm gốc β-D-manuronat α-L-guluronat liên kết với 1,4-glucosit Phân tử alginate tạo thành liên kết loại block khác block polyguluronat, block mannuronat block xen kẽ có độ dài ngắn khác trình tự xếp khác Chính điều tạo nên tính chất đặc thù alginate làm cho ứng dụng nhiều lĩnh vực khác nhau: thực phẩm, mỹ phẩm, in vải, giấy… Ngày nay, việc cố định tế bào sống gel alginate canxi trở thành kỹ thuật ứng dụng rộng rãi Kỹ thuật cố định tế bào gel alginate mơ tả hình đây: Hình II.1: Cố định tế bào gel alginate III TIẾN TRÌNH THÍ NGHIỆM Quan sát hình thái đếm số lượng tế bào Saccharomyces cerevisiae Cân 1g nấm men khơ hòa tan 99 ml nước cất để thu dung dịch nấm men pha loãng 100 lần Sau lấy ml dung dịch thêm vào 99 ml nước ta thu dịch nấm men với độ pha loãng 104 Cho giọt thuốc nhuộm xanh methylene lên buồng đếm rối cho dịch pha loãng 104 với lượng vừa đủ lên đậy lamelle lại cho khơng có bọt khí quan sát vật kính 40X đếm số lượng tế bào nấm men tính mật độ tế bào Sau lấy dịch pha lỗng để lên lamelle khác chuyển sang vật kính 100X quan sát hình thái nấm men Cố định nấm men gel alginate Cân 0,2g nấm men hòa tan 20 ml nước cất tạo thành dung dịch tế bào nấm men 1% Sau bổ sung vào dung dịch 20 ml dung dịch alginate 2% Hút dung dịch nhỏ từ từ giọt vào 50 ml dung dịch CaCl 2% tạo thành hạt nhỏ ngâm 30 phút Sau lọc lấy hạt ngâm dung dịch muối sinh lý để bảo quản Đếm số lượng nấm men dung dịch CaCl ngâm hạt trước lọc để xác định hiệu suất cố định, ta có độ pha lỗng 102 IV GIẢI THÍCH THÍ NGHIỆM Quan sát hình thái đếm số lượng tế bào Saccharomyces cerevisiae Các tế bào nấm men sống không bắt màu, tế bào chết có màu xanh thuốc nhuộm Từ quan sát tế bào sống chết tính mật độ tế bào Cố định nấm men gel alginate Alginate kết hợp với kim loại có hóa trị II tạo thành hợp chất có độ cao, khó thấm nước Khi alginate Na tiếp xúc với dung dịch CaCl 2, xảy phản ứng trao đổi ion hai dung dịch theo phản ứng 2[C5H7O4COONa]n + nCaCl2 > [(C5H7O4COO)2Ca]n + 2nNaCl Alginate Na Alginate Ca Ở dạng này, alginate Ca kết tủa, trở thành dạng khơng tan, tạo thành màng khơng thấm nước Tồn bề mặt giọt hỗn hợp bao bọc lớp áo alginate Ca không thấm nước tạo thành hạt Khi dung dịch alginate tiếm xúc với dung dịch CaCl2 hình thành lớp màng bao bên ngồi ngăn khơng cho dịch nấm men bên tràn dung dịch ngồi nhỏ giọt dung dịch alginate xuống dung dịch CaCl2 hình thành hạt tròn giọt nước Khi nồng độ alginate không phù hợp tức nồng độ alginate thấp khơng tạo hạt CaCl2 hạt không làm cứng nên không giữ nấm men bên khơng cố định nấm men Với nồng độ ta kiểm tra xem hiệu suất cố định nấm men V KẾT QUẢ Kết đếm số lượng quan sát hình thái nấm men nhuộm Hình 1.a: cấu tạo lưới đếm vị trí ô đếm Kết đếm số lượng nấm men Hình 1.1: Ơ - 12 tế bào Hình 1.2: Ơ - 11 tế bào Hình 1.3: Ơ – tế bào Hình 1.4: Ơ – tế bào Hình 1.5: Ơ – 14 tế bào Tổng số tế bào ô là: 12+11+14+9+6=52 (tế bào) Tính mật độ tế bào (mật độ tế bào trước cố định) Số lượng tế bào 1mm3 tính theo cơng thức A: số lượng tế bào 80 ô nhỏ (A=52) 4000 = 400 x 10 (1/400 mm2: diện tích ô nhỏ; 1/10 mm: chiều cao từ mặt buồng đếm đến lamelle) ĐPL: độ pha loãng (104) Số tế bào ml 26 x 109 Theo quan sát khơng có tế bào nấm men bắt màu thuốc nhuộm kết luận khơng có tế bào chết Vậy mật độ tế bào nấm men 26 x 109 tế bào/ml Kết quan sát hình thái nấm men vật kính 100X Hình 1.6: hình thái nấm men vật kính 100X Cố định nấm men gel alginate Hình 2.1: gel alginate chứa nấm men tạo hạt dung dịch CaCl2 Hình 2.2: Nấm men sau cố định bảo quản nước muối sinh lý Kết số lượng nấm men dung dịch CaCl2 sau cố định Hình 2.3: Ơ – tế bào Hình 2.4: Ơ – 10 tế bào Hình 2.5: Ơ – tế bào Hình 2.6: Ô – tế bào Hình 2.7: Ô – tế bào Tổng số tế bào là: 8+10+5+2+7=32 (tế bào) Tính mật độ tế bào (mật độ tế bào sau cố định) Số lượng tế bào 1mm3 tính theo cơng thức A: số lượng tế bào 80 ô nhỏ (A=32) 4000 = 400 x 10 (1/400 mm2: diện tích nhỏ; 1/10 mm: chiều cao từ mặt buồng đếm đến lamelle) ĐPL: độ pha loãng (102) Số tế bào ml 16 x 106 Hiệu suất cố định nấm men TCĐ: mật độ tế bào trước cố định = 26 x 109 SCĐ: mật độ tế bào sau cố định = 16 x 106 Kết quan sát nấm men sau cố định gel alginate Hình 3.1: Quan sát nấm men sau cố định gel vật kính 40X VI KẾT LUẬN Quan sát tế bào nấm men vật kính 40X đếm số lượng ta nhận thấy khơng có tế bào bắt màu với thuốc nhuộm nguyên nhân do: Thao tác nhuộm khơng xác lượng thuốc nhuộm không đủ để bắt màu Thời gian nhuộm chưa đủ để tế bào bắt màu Không có tế bào chết Hiệu suất cố định nấm men gel alginate 99,94% cố định nấm men gel alginate cho hiệu suất cao Nồng độ gel phù hợp cho việc tạo màng hạt cố định Thao tác tạo hạt dung dịch CaCl2 xác gây thất Hình thái nấm men vật kính 100X kết dính nhiều khơng quan sát riêng lẻ tế bào nguyên nhân mật độ pha loãng dày Kết quan sát nấm men cố định gel thấy sau thời gian số lượng nấm men nhân lên nhiều dày đặc Do lớp cắt từ hạt cố định dày nên chưa quan sát rõ nấm men cố định mạng lưới gel ... 40X đếm số lượng ta nhận thấy khơng có tế bào bắt màu với thu c nhuộm nguyên nhân do: Thao tác nhuộm khơng xác lượng thu c nhuộm không đủ để bắt màu Thời gian nhuộm chưa đủ để tế bào bắt màu... đếm số lượng tế bào Saccharomyces cerevisiae Cân 1g nấm men khơ hòa tan 99 ml nước cất để thu dung dịch nấm men pha loãng 100 lần Sau lấy ml dung dịch thêm vào 99 ml nước ta thu dịch nấm men với... THÍCH THÍ NGHIỆM Quan sát hình thái đếm số lượng tế bào Saccharomyces cerevisiae Các tế bào nấm men sống không bắt màu, tế bào chết có màu xanh thu c nhuộm Từ quan sát tế bào sống chết tính mật độ