Nghiên cứu sản xuất một số bánh ăn liền từ gạo tẻ

LỜI CÁM ƠN Tôi xin chân thành cám ơn: Ư Ban giám hiệu, Phòng Quản lý sau đại học, Khoa Công nghệ hoá học & dầu khí, Bộ môn Công nghệ thực phẩm – Trường Đại học Bách khoa Tp.Hồ Chí Minh Ư Ban giám hiệu, khoa Công nghệ thực phẩm – Trường Cao đẳng Công nghiệp thực phẩm Tp.Hồ Chí Minh tạo điều kiện thuận lợi cho theo học lớp Cao học K.13 thực đề tài Ư TS Trần Đình Yến – người thầy tận tâm hướng dẫn suốt trình thực luận văn Ư Nhóm sinh viên lớp CĐ2TP, 21THTP – Trường Cao đẳng Công nghiệp thực phẩm Thực phẩm.Hồ Chí Minh tham gia thực đề tài Ư Bạn bè gia đình động viên, chia sẻ giúp đỡ hoàn thành tốt luận văn TÓM TẮT LUẬN ÁN Gạo loại thực phẩm phổ biến, thông dụng, biết đến toàn giới Ngoài cơm thức ăn cung cấp gluxít cho bao gia đình người Việt từ hạt gạo, người nông dân nước ta chế biến nhiều sản phẩm truyền thống khác bánh tráng, bánh bèo, bún Tuy nhiên sản phẩm hạn chế, chưa đa dạng Hiện giới, sản phẩm bánh gạo phát triển mạnh mẽ xâm nhập vào thị trường Việt Nam Đây loại bánh giòn, khô, cứng làm từ bột gạo dây chuyền công nghiệp Giá thành loại bánh cao so với sản phẩm bánh bích qui khối lượng Trên sở đó, thực đề tài nghiên cứu ứng dụng với nội dung “ Nghiên cứu sản xuất số bánh ăn liền từ gạo tẻ” Trong nghiên cứu này, gạo xay, hấp chín, nhào giã tạo hình theo hai cách làm lạnh, cắt cán, cắt Sau bánh sấy khô nướng Kết nghiên cứu xác lập qui trình sản xuất hai dạng bánh gạo theo hai phương pháp làm lạnh cán cắt có chất lượng cao, tương đương với số sản phẩm nhập loại thị trường có giá thành thấp Mặt khác công nghệ sản xuất bánh gạo dễ giới hoá, sản phẩm hấp dẫn, bảo quản lâu, đáp ứng nhu cầu đa dạng hoá sản phẩm người tiêu dùng Việt Nam ABSTRACT Rice is a widespread, common and well-known food all over the world Beside cooking rice as a main source of carbohydrate for Vietnamese families, many traditional products from rice were produced by our farmers, such as banh trang, banh beo, bun (wet rice noodles)… However the range of products is still limited Nowadays many rice products are developed and imported to Vietnam market These are crispy, dried, hard products made from rice on the industrial line The price of such rice crackers are relatively high, compared to the biscuit products with the same weight This is the justification of our applied research subject on “production of several instant rice crackers from ordinary rice” In this study, rice was grinded, steamed, kneaded and formed by two ways, either by cooling, followed by cutting or by rolling, followed by cutting After that the crackers were dried and baked It was found out that the rice crackers made by the latter method had high quality, similar to commercial imported products, however with lower price On the other hand, the technology is easy to mechanized, the product is attractive, long self-life, meeting the demand of product diversification in Vietnam MỤC LỤC LỜI CẢM ƠN TÓM TẮT LUẬN ÁN ABSTRACT MỤC LỤC DANH MỤC CÁC BẢNG DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ 10 MỞ ĐẦU 11 PHẦN 1: TỔNG QUAN 12 1.NGUỒN GỐC VÀ PHÂN LOẠI LÚA 12 1.1 Nguồn gốc 12 1.2 Phân loại 13 TÌNH HÌNH SẢN XUẤT LÚA GẠO TRÊN THẾ GIỚI VÀ Ở VIỆT NAM15 2.1 Vị trí lúa gạo nguồn lương thực giới 2.2 Năng suất lúa giới 15 16 2.3 Tình hình nhập gạo giới 2.4 Tình hình xuất gạo giới THỊ HIẾU TIÊU DÙNG 17 18 21 CHẾ BIẾN LÚA GẠO CẤU TẠO CỦA HẠT THÓC 5.1 Thành phần hoá học thóc gạo 5.1.1 Nước 5.1.2 Gluxit 23 25 27 27 27 5.1.2.1 Tinh bột 5.1.2.2 Xenlulo Hemixenlulo 28 30 5.1.2.3 Đường 5.1.3 Protein 5.1.4 Lipit 5.1.5 Vitamin 5.1.6 Chất khoáng 30 30 31 31 32 5.1.7 Enzyme 5.2 Yêu cầu kỹ thuật thóc CÔNG NGHỆ SẢN XUẤT GẠO 32 33 33 MỘT SỐ SẢN PHẨM TỪ GẠO TẺ 7.1 Bánh giò 7.2 Bánh 7.3 Bánh bèo 7.4 Bánh đa 7.5 Bánh đúc 7.6 Bánh hỏi 35 35 37 37 38 39 40 7.7 Bún SỰ PHÁT TRIỂN CỦA BÁNH GẠO TRÊN THẾ GIỚI 8.1 Bánh snack gạo Mỹ 8.1.1 Bánh gạo 8.1.2 Bánh phồng gạo 8.1.3 Cơm chiên 8.1.4 Bánh putding gạo 41 42 43 43 43 44 44 8.2 Các loại bánh snack gạo châu Á 8.2.1 Bánh gạo cracker (rice cracker) 8.2.1.1 Nguyên liệu gạo 8.2.1.2 Nước tương nguyên liệu khác 8.2.2 Phương pháp chế biến 8.2.3 Ảnh hưởng tính chất gạo lên trình sản xuất 44 45 46 47 48 48 PHẦN 2: NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 49 NGUYÊN LIỆU 1.1 Nguyên liệu 49 49 1.2 Nguyên liệu phụ NÔI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 49 49 2.1 Các bước tiến hành nghiên cứu 2.2 Nội dung nghiên cứu 2.2.1 Nghiên cứu lựa chọn nguyên liệu thích hợp 2.2.2 Thiết lập quy trình công nghệ thích hợp 2.2.3 Nghiên cứu thông số cho trình 2.2.4 Nghiên cứu đánh giá chất lượng sản phẩm 49 49 50 50 52 53 PHẦN 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 57 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU LỰA CHỌN NGUỒN NGUYÊN LIỆU KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU CHẾ ĐỘ NGÂM GẠO KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU THỜI GIAN LÀM CHÍN NGUYÊN LIỆU 57 57 59 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU THỜI GIAN NHÀO, GIÃ KHỐI BỘT SAU KHI HẤP CHÍN KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU QUÁ TRÌNH CÁN CẮT TẠO HÌNH KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU QUÁ TRÌNH VÀO KHUÔN LÀM LẠNH 60 62 ĐỂ TẠO HÌNH 63 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU QUÁ TRÌNH LÀM LẠNH 64 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU BỀ DÀY LÁT CẮT VÀ BỀ DÀY TẤM BỘT CÁN 65 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU CHẾ ĐỘ SẤY ĐỂ THU ĐƯC BÁNH KHÔ 68 10 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU CHẾ ĐỘ NƯỚNG 70 11 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU CHẾ ĐỘ SẤY LẠI SAU KHI TẨM GIA VỊ 12 ĐÁNH GIÁ CHẤT LƯNG SẢN PHẨM 12.1 Đánh giá chất lượng cảm quan 12.1.1 Người thử 12.1.2 Nguyên liệu 12.1.3 Tổ chức thí nghiệm 12.1.4 Kết luận 12.2 Các tiêu hóa lyù, vi sinh 77 78 78 78 78 78 79 80 PHẦN 4: KẾT LUẬN 82 PHỤ LỤC 84 TÀI LIỆU THAM KHẢO 100 TÓM TẮT LÝ LỊCH TRÍCH NGANG 102 DANH MỤC CÁC BẢNG STT Bảng số Tên bảng 1.1 Năng suất lúa giới thời kỳ 1976 - 2000 17 1.2 Sản lượng, tiêu dùng dự trữ gạo giới 19 1.3 Mậu dịch gạo giới (triệu tấn) 20 1.4 Các yếu tố ảnh hưởng đến chất lượng lúa gạo sau thu hoạch 23 1.5 Hàm lượng trung bình chất có thóc sản phẩm từ thóc 27 1.6 Độ ẩm cân thóc gạo độ ẩm tương đối không khí khác nhiệt độ 200C 27 1.7 Tỷ lệ tiểu phần Protein phận hạt gạo (% tổng số protein) 30 1.8 Thành phần hàm lượng amino acid protein loại hạt 30 1.9 Hàm lượng acid béo có gạo 31 10 1.10 Hàm lượng vitamin có gạo 31 11 1.11 Hàm lượng chất khoáng có gạo 32 12 1.12 Các yêu cầu kỹ thuật thóc 33 13 1.13 Tỷ lệ nở số loại tinh bột 46 14 2.1 Yêu cầu cảm quan sản phẩm bánh dạng cán cắt BCC 53 15 2.2 Yêu cầu hóa lý sản phẩm bánh dạng cán cắt BCC 54 16 2.3 Yêu cầu vi sinh sản phẩm bánh dạng cán cắt 54 17 2.4 Yêu cầu cảm quan sản phẩm bánh dạng làm lạnh BLL 55 18 2.5 Yêu cầu hóa lý sản phẩm bánh dạng làm lạnh BLL 55 19 2.6 Yêu cầu vi sinh sản phẩm bánh dạng làm lạnh BLL 56 Trang STT Bảng số Tên bảng Trang 20 3.1 Khảo sát ảnh hưởng thời gian ngâm với lượng nước ngấm độ chất khô 58 21 3.2 Khảo sát ảnh hưởng thời gian hấp với chất lượng khối bột sau hấp 59 22 3.3 Kết nghiên cứu chế độ hấp 60 23 3.4 Khảo sát thời gian nhào, giã đến chất lượng khối bột sau giã 61 24 3.5 Khảo sát ảnh hưởng thời gian nhào, giã đến chất lượng bánh dạng làm lạnh 61 25 3.6 Khảo sát ảnh hưởng thời gian nhào, giã đến chất lượng bánh dạng cán cắt 61 26 3.7 Sự thay đổi đường kính bánh cán cắt qua giai đoạn sấy, nướng 63 27 3.8 Sự thay đổi đường kính bánh làm lạnh qua giai đoạn sấy, nướng 63 28 3.9 Các thông số chuẩn bị cho mẫu nghiên cứu chế độ làm lạnh 64 29 3.10 Khảo sát ảnh hưởng nhiệt độ làm lạnh khối bột đến thời gian làm lạnh chất lượng cảm quan khối bột sau làm lạnh 64 30 3.11 Kết nghiên cứu thời gian làm lạnh nhiệt độ làm lạnh 20C 65 31 3.12 Các thông số chuẩn bị mẫu nghiên cứu bề dày bánh tươi 66 32 3.13 Ảnh hưởng bề dày lát cắt thời gian sấy sản phẩm bánh dạng làm lạnh (nhiệt độ sấy 600C) 67 33 3.14 Ảnh hưởng bề dày bột cán thời gian sấy sản phẩm bánh dạng cán cắt (nhiệt độ sấy 550C) 67 34 3.15 Ảnh hưởng nhiệt độ thời gian sấy đến tính chất cảm quan sau sấy bánh làm lạnh 69 35 3.16 Ảnh hưởng nhiệt độ thời gian sấy đến tính chất cảm quan sau sấy bánh cán cắt 70 36 3.17 Ảnh hưởng thời gian nướng đến độ nở chất lượng cảm quan bánh làm lạnh (nhiệt độ nướng 2000C) 71 STT Bảng số Tên bảng Trang 37 3.18 Ảnh hưởng thời gian nướng đến độ nở chất lượng cảm quan bánh làm lạnh (nhiệt độ nướng 2100C) 72 38 3.19 Ảnh hưởng thời gian nướng đến độ nở chất lượng cảm quan bánh làm lạnh (nhiệt độ nướng 2200C) 72 39 3.20 Ảnh hưởng thời gian nướng đến độ nở chất lượng cảm quan bánh cán cắt (nhiệt độ nướng 1900C) 74 40 3.21 Ảnh hưởng thời gian nướng đến độ nở chất lượng cảm quan bánh làm lạnh (nhiệt độ nướng 2000C) 74 41 3.22 Ảnh hưởng thời gian nướng đến độ nở chất lượng cảm quan bánh làm lạnh (nhiệt độ nướng 2100C) 75 42 3.23 Ảnh hưởng chế độ sấy sau tẩm gia vị đến chất lượng cảm quan bánh thành phẩm 77 43 3.24 Ảnh hưởng chế độ sấy sau tẩm gia vị đến độ ẩm bánh thành phẩm 77 44 3.25 Kết đánh giá cảm quan sản phẩm BLL 79 45 3.26 Kết đánh giá cảm quan sản phẩm BCC 79 46 3.27 Các tiêu hóa lý, vi sinh bánh làm lạnh cán cắt 80 DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ STT Hình số Tên hình vẽ, đồ thị 1.1 Tóm tắt tiến hoá lúa loài Oryza 15 1.2 Các sản phẩm chế biến từ gạo 25 1.3 Hình cắt dọc hạt thóc 25 1.4 Cấu trúc amyloza 28 1.5 Cấu trúc amylopectin 29 1.6 Sơ đồ công nghệ sản xuất gạo 34 1.7 Sản phẩm bánh gạo Malaixia có bán thị trường Việt Nam 45 1.8 Sơ đồ phân loại bánh gạo theo Li Luh (1980) 46 2.1 Sơ đồ nội dung bước tiến hành nghiên cứu 49 10 2.2 Quy trình công nghệ sản xuất bánh gạo 51 11 3.1 Sự phụ thuộc lượng nước ngấm thời gian ngâm 58 12 3.2 Sự phụ thuộc độ chất khô thời gian ngâm 59 13 3.3 Sự phụ thuộc độ ẩm khối bột sau hấp thời gian hấp 60 14 3.4 Sự phụ thuộc thời gian nhào, giã độ nở thể tích bánh làm lạnh cán cắt sau nướng 62 15 3.5 Khối bột gạo sau vào khuôn làm lạnh để tạo hình 64 16 3.6 Bánh tươi sau cắt lát 68 17 3.7 Bánh sấy 71 18 3.8 Ảnh hưởng thời gian nướng nhiệt độ nướng đến độ nở thể tích bánh làm lạnh (so với bánh trước nướng) 73 19 3.9 Sản phẩm bánh dạng làm lạnh sau nướng 74 20 3.10 Ảnh hưởng thời gian nướng nhiệt độ nướng đến độ nở thể tích bánh cán cắt (so với bánh trước nướng) 76 21 3.11 Sản phẩm bánh dạng cán cắt sau nướng 76 22 3.12 Bánh thành phẩm có lớp ruốc bề mặt 81 23 3.13 Bánh thành phẩm có lớp dừa bề mặt 81 10 Trang V1 thể tích dung dịch NaOH 0,1N tiêu tốn mẫu (ml) V2 thể tích dung dịch NaOH 0,1N tiêu tốn mẫu trắng (ml) N nồng độ dung dịch NaOH (N) m khối lượng mẫu cân (g) 100 hệ số chuyển thành % K hệ số chuyển đổi từ nitơ toàn phần protein tương ứng Kết cuối trung bình cộng hai kết thử song song, tính xác đến 0,1% Sai lệch hai kết thử song song nhỏ 0,3% XÁC ĐỊNH HÀM LƯNG CHẤT BÉO (FAO FNP 14/7 (p.212)–1986) 3.1 Dụng cụ – Thiết bị: − Cân phân tích xác đến 0,0001g − Hệ thống chiết chất béo Soxhlet − Tủ sấy điều chỉnh nhiệt độ đến 1250C 3.2 Hóa chất: − Ete etylic loại tinh khiết phân tích 3.3 Tiến hành: Tiến hành thử nghiệm hai lần cho mẫu thử theo bước sau: − Cân khoảng 2g mẫu (đã xay mịn trộn đến đồng nhất) với độ xác 0,0001g vào tờ giấy lọc đặt chén cân − Sấy mẫu nhiệt độ 1250C từ 30 phút đến sấy 1020C giờ, để nguội − Gói mẫu cẩn thận cho vào ống giấy đặt bình chiết sấy khô đến khối lượng không đổi 1050C − Dùng ete rửa chén cân nhiều lần, dịch rửa rót qua ống giấy vào bình chiết − Rót thêm ete vào bình chiết cho đủ 140ml − Gắn bình vào hệ thống chiết chất béo Soxhlet − Sau trình chiết kết thúc, lấy ống đựng mẫu khỏi bình chiết sấy bình 1050C − Để nguội bình 30 phút bình hút ẩm cân − Tiếp tục sấy cân chênh lệch khối lượng hai lần cân liên tiếp không 0,0005g ngừng 3.4 Tính kết quả: Hàm lượng chất béo tính % theo công thức : X(%) = m1 – m0 m 100 m0 khối lượng bình chiết (g) m1 khối lượng bình chiết chất béo (g) m khối lượng mẫu (g) 88 Kết cuối trung bình cộng hai kết thử song song, tính xác đến 0,1% Chênh lệch kết hai lần thử song song không lớn 0,3% XÁC ĐỊNH HÀM LƯNG TRO KHÔNG TAN TRONG HCl 10% (FAO FNP 14/7 (p.228)–1986) 4.1 Dụng cụ – Thiết bị: − − − − Cân phân tích xác đến 0,0001g Chén nung Bếp điện Lò nung 4.2 Hóa chất: − − − − Giấy lọc định lượng không tro HCl 10% HNO3 đậm đặc AgNO3 0,1N 4.3 Tiến hành: Tiến hành thử nghiệm hai lần cho mẫu thử theo bước sau: − Cân khoảng 2g mẫu (đã xay mịn trộn đến đồng nhất) với độ xác 0,0001g vào chén nung biết trước khối lượng − Đặt chén lên bếp điện đốt mẫu than hóa hoàn toàn − Cho chén nung vào lò nung nhiệt độ 550 – 6000C, nung đến tro trắng (khoảng giờ) − Lấy chén ra, để nguội 45 phút bình hút ẩm cân − Lặp lại trình nung cân chênh lệch khối lượng hai lần cân liên tiếp không 0,0005g Tro thu tro cacbonat − Cho 25ml HCl 10% vào chén nung có tro cacbonat − Đun nồi cách thủy sôi 10 – 15 phút Khuấy để hòa tan tro cacbonat HCl 10% − Lọc dung dịch chén nung giấy lọc không tro − Rửa kỹ kết tủa nước sôi đến nước lọc hết Cl – (lấy – giọt nước lọc thử với giọt HNO3 đậm đặc giọt AgNO3 0,1N mà không thấy kết tủa) − Cho giấy lọc tro không tan HCl 10% vào chén nung biết trước khối lượng − Sấy khô chén nung có giấy lọc tro không tan HCl 10% 1000C – 1050C − Cho chén nung có giấy lọc tro không tan vào lò nung 5500C – 6000C 89 − Làm nguội bình hút ẩm khoảng 45 phút cân − Tiếp tục nung đến khối lượng tro không đổi (chênh lệch khối lượng hai lần cân liên tiếp không 0,0005g) Thời gian nung lần 30 phút 4.4 Tính kết quả: Hàm lượng tro không tan HCl 10% tính % theo công thức : X(%) = m1 – m0 100 m m khối lượng mẫu (g) m1 khối lượng chén nung tro không tan HCl 10% (g) m0 khối lượng chén nung (g) Kết cuối trung bình cộng hai kết thử song song, tính xác đến 0,01% Chênh lệch kết hai lần thử song song không lớn 0,02% XÁC ĐỊNH HÀM LƯNG TINH BỘT : KNLTTP p.246 5.1 Dụng cụ thiết bị: _ Cân phân tích xác đến 0,001g _ Bình định mức 100 ml _ Bình tam giác dung tích 100 ml _ Phễu lọc giấy lọc _ Buret 25 ml _ Ống đong 50 ml _ Pipét ml _ Bếp điện, kẹp, lưới amiăng 5.2 Hoá chất: _ Dung dịch kali feryxianua K3(FeCN)6 1,2% _ Dung dòch KOH 2,5N _ Dung dòch chì axetat Pb(CH3COO)2 10% _ Dung dịch Na2SO4 bão hoà _ Dung dịch HCl đậm đặc _ Dung dịch NaOH 10% _ Dung dịch thử Iod 90 _ Dung dịch glucoza tinh khiết 0,5% _ Dung dịch M.O 0,1% _ Dung dịch M.B 0,5% 5.3 Cách tiến hành: _ Cân 2g mẫu thí nghiệm nghiền nhỏ, cho vào bình tam giác 100 ml _ Thêm 50 ml nước cất, lắc _ Thêm – 10 ml dung dịch HCl đậm đặc _ Đậy kín bình nút cao su có lắp ống sinh hàn hồi lưu, đun cách thuỷ ÷ _ Làm nguội, trung hoà hỗn hợp dung dịch NaOH 10% _ Chuyển vào bình định mức 100 ml, cho thêm vào ml chì axetat 10%, lắc cho thêm ml Na2SO4 bão hoà _ Thêm nước cất tới vạch định mức, lắc lọc, thu dịch đường từ thuỷ phân _ Dùng pipét lấy 20 ml dung dịch kaliferixyanua 1,2% cho vào bình tam giác 250 ml chịu nhiệt _ Thêm vào ml dung dịch KOH 2,5N ÷ giọt xanh metylen 0,5% (nếu dung dịch đường có nồng độ < 0,25% lấy 10 ml kaliferixyanua 2,5 ml KOH) _ Lắc nhẹ, đặt lên bếp điện, đun cho sau 1÷2 phút sôi _ Tiếp dùng dung dịch đường loãng (đã xử lý) để chuẩn đến màu xanh metylen _ Màu phản ứng chuyển từ xanh sang phớt hồng vàng da cam kết thúc Khi để nguội màu phản ứng chuyển sang tím hồng bị oxy hóa 5.4 Tính kết : Hàm lượng tinh bột tính % theo công thức sau: X= a.VDM 100 × 0,9 (%) V m Trong đó: a: số gam glucoza tương ứng với 20 ml feryxyanua kali (a = 0,023) V: số ml dịch đường tiêu tốn chuẩn độ VDM: dung tích bình định mức m: số g mẫu 91 XÁC ĐỊNH TỔNG SỐ VI SINH VẬT HIẾU KHÍ (TCVN 5165 – 1990) 6.1 Dụng cụ − − − − − − − Pipet 1ml Bình tam giác 150ml Đóa petri Ống nghiệm Nồi hấp Tủ sấy Môi trường cho nhóm + Cân 22,5 g môi trường bột PCA (Plate Count Agar) hòa 1000ml nước cất + Đun nóng từ từ cho môi trường tan hoàn toàn + Phân phối vào chai chứa môi trường miệng nhỏ + Hấp tiệt trùng môi trường nồi hấp, áp suất 15 ± 1atm (121 ± 10C) 15 phút + Giữ môi trường bể điều nhiệt 45 ± 10C trước dùng 6.2 Pha loãng mẫu − Cân 10g mẫu xay mịn cho vào bình tam giác 150ml có sẵn 90ml nước cất tiệt trùng Lắc đều, để lắng cặn Hút phần dịch để cấy mẫu, ta dung dịch mẫu có nồng độ 10-1 − Tiếp tục pha loãng nồng độ khác từ dung dịch mẫu có nồng độ 10-1 6.3 Tiến hành − Chuẩn bị thử, pha loãng mẫu nồng độ 10-1 10-2 − Dùng pipet vô trùng chuyển ml dịch mẫu thử vào đóa petri vô trùng, để dịch mẫu chảy tự do, mẫu chảy hết, chạm đầu pipet vào chỗ khô đóa − Rót vào đóa khoảng 10 -15 ml môi trường PCA 450C − Dùng tay lắc xoay tròn đóa xuôi ngược chiều kim đồng hồ cho môi trường cấy dịch mẫu thử hòa với Để đóa đông tụ tự nhiên mặt bàn thử (khoảng - 10 phút) Bên cạnh, rót khoảng 10 ml môi trường PCA vào đóa petri có nước pha loãng mẫu đóa petri vô trùng dịch mẫu − Khi môi trường đông đặc, lật ngược đóa cho vào tủ ấm 32 ± 10C ủ 24 – 48 − 6.4 Kết − Có thể đếm khuẩn lạc mắt thường hay qua máy đếm khuẩn lạc đếm sau thời gian ủ chấm dứt 92 − Trong trường hợp đếm ngay, giữ đóa 40C không 24 không xem việc làm thường xuyên − Sự phân bố khuẩn lạc phải hợp lý, tức số lần pha loãng cao, số khuẩn lạc Lấy số khuẩn lạc nằm phạm vi 30 - 300 nhân với số lần pha loãng để báo cáo kết + Nếu hai độ pha loãng có số khuẩn lạc nằm phạm vi 30 -300 sau nhân với độ pha loãng, tỷ lệ chúng không lớn lấy số pha loãng thấp báo cáo kết + Nếu số khuẩn lạc độ pha loãng 30, lấy số khuẩn lạc độ pha loãng thấp nhân với số lần pha loãng báo cáo kết + Nếu số khuẩn lạc độ pha loãng 300 lấy số xấp xỉ 300 nhân với số lần pha loãng báo cáo kết + Nếu phân bố khuẩn lạc độ pha loãng không hợp lý kiểm tra lại + Nếu khuẩn lạc mọc loang ½ diện tích đóa tính khuẩn lạc XÁC ĐỊNH COLIFORMS (TCVN 4883 – 1993) 7.1 Môi trường nuôi cấy Môi trường bột pha sẵn : Desoxycholate lactose agar (DLA) Đây môi trường đặc hiệu phát coliform nước, sữa sản phẩm sữa, công thức (g/lit): + Pepton 10,0 + Lactose 10,0 + Sodium chloride 5,0 + Sodium citrate 2,0 + Sodium desoxycholate 0,5 + Neutral red 0,033 + pH môi trường sau hấp tiệt trùng/ 250C : 7,1 ± 0,2 Cách pha môi trường : - Cân 42,5 g bột môi trường DLA hòa 1000 ml nước cất - Đun nóng từ từ cho môi trường tan hoàn toàn giữ sôi phút - Phân phối vào chai thủy tinh miệng nhỏ hấp vô trùng Đậy nút miệng chai - Giữ môi trường bể điều nhiệt 45 ± 10C trước dùng Chú ý : Môi trường DLA pha dùng ngày không để sang ngày sau Môi trường kiểm chứng : Brilliant Green Lactose Bile (BGLB) 2% Công thức (g/l) + Pepton + Lactose 10 g 20 g 93 + Oxgall 20 g + Brilliant green 0,0013 g + Nước cất vừa đủ 1000 ml + pH : 7,2 ± 0,2 Hòa tan thành phần môi trường với phân phối vào ống nghiệm có chứa ống Durham, hấp 121 ± 10C 15 phút để nguội xuống nhiệt độ phòng 7.2 Tiến hành thử - Chuẩn bị thử, pha loãng mẫu - Dùng pipet vô trùng chuyển 10 ml dịch mẫu thử pha loãng 1/10 hay ml mẫu sữa dạng lỏng (sữa tươi ) - Rót vào đóa petri vô trùng, để dịch / mẫu sữa chảy tự do, khoảng 10 - 15 ml môi trường DLA (vào đóa mẫu) - Dùng tay lắc xoay tròn đóa xuôi ngược chiều kim đồng hồ cho môi trường cấy hòa với Để đóa đông tự nhiên mặt bàn thử (khoảng - 10 phút) - Đổ đóa đối chứng cho chai môi trường cấy - Sau môi trường đông hoàn toàn, rót thêm 3- ml môi trường DLA tráng kín bề mặt đóa để tránh khuẩn lạc mọc mặt mọc loang - Môi trường đông đặc, lật ngược đóa cho vào tủ ấm 32 ± 10C, ủ 24 ± - Trong trường hợp khuẩn lạc đóa mọc chi chít, vi trùng coliform mọc lạc kiểu, thông thường nhỏ 0,5 mm Ngoài men vi sinh vài loại vi trùng khác mọc núm mang đặc tính tiêu biểu coliform, phải thực tiếp thí nghiệm kiểm chứng môi trường BGLB sau: tách khuẩn lạc nghi ngờ cấy vào ống nghiệm có ống Durham chứa môi trường BGLB Các ống cấy lắc ủ nhiệt độ 32 ± 10C 48 ± - Ngoài lấy mẫu kiểm tra lại (nếu có) với nhiều hệ số pha loãng khác 7.3 Kết - Đếm số núm khuẩn lạc coliform môi trường DLA có đường kính 0,5 mm hay lớn hơn, màu đỏ sậm, xung quanh màu hồng - Kết kiểm chứng : Nếu có sinh khí thay đổi màu môi trường khuẩn lạc nghi ngờ coliform XÁC ĐỊNH E COLI (TCVN 5155 – 1990) 8.1 Môi trường thuốc thử Môi trường tăng sinh : Brillient green bile lactose 2% (BGBL) 94 Cân 40 g môi trường bột BGBL 2% (10g peptone; 10g lactose; 20g oxgall; 0,0133g Brilliant) hòa 1000 ml nước cất Phân phối vào ống nghiệm có sẵn ống Durham, ống khoảng - 10 ml Hấp tiệt trùng 15 ± atm (121± 10C) 15 phút Để nguội bảo quản - 100C pH môi trường sau hấp tiệt trùng/ 250C : 7,2 ± 0,2 Môi trường phân lập : Desoxycholate lactose Agar (DLA) Xem mục 7.1 : xác định Coliform Môi trường nước pepton Hòa tan 10 g trypton 1000 ml nước cất Phân phối vào ống nghiệm, ống khoảng - ml Hấp tiệt trùng 15 ± atm (121 ± 10C) 15 phút Để nguội bảo quản - 100C Môi trường Methyl red - Voges Proskauer (MR-VP) Hòa tan 17 g bột môi trường MR-VP (7g polypeptone; g dextrose; 5g K2HPO4) 1000 ml nước cất Phân phối vào ống nghiệm 16 x 125mm, ống khoảng ml Hấp tiệt trùng 15 ± atm (121 ± 10C) 15 phuùt Để nguội bảo quản - 100C Môi trường Simmons Citrate Goàm: 1g Ammonium hydrogen phosphate; 1g Dipotassium hydrogen phosphate; 5g NaCl, 2g Sodium citrate; 0,2g Magnesium sulfate; 0,03g Bromothymol blue; 12,5g Agar Hòa tan hỗn hợp 1000 ml nước cất, đun nóng cho tan hoàn toàn, phân phối vào ống nghiệm 16 x 125 mm, ống khoảng ml Hấp tiệt trùng 15 ± atm (121 ± 10C) 15 phút Môi trường nguội 45 -500C, làm môi trường thạch nghiêng Bảo quản -100C Thuốc thử Kovacs, indole Gồm: 5g p-dimethylaminobenzaldehyde; 75 ml amyl alcohol; 25 ml acid HCl đậm đặc Hòa tan p-dimethylaminobenzaldehyde amyl alcohol cho từ từ acid HCl vào hòa Bảo quản 40C - 100C chai thủy tinh màu tối, nắp vặn có ống nhỏ giọt Thuốc thử Methyl red (M.R) Gồm 0,19 g Methyl red; 300 ml cồn 95% Hòa tan thêm nước cất vừa đủ 500 ml Bảo quản chai thủy tinh nắp vặn có ống nhỏ giọt Dung dịch ∝ - naphthol 5% cồn 95% Bảo quản chai thủy tinh có nắp vặn ống nhỏ giọt Dung dịch KOH 40% 95 Bảo quản chai thủy tinh có nắp vặn ống nhỏ giọt 8.2 Tiến hành thử - Dùng pipet vô trùng chuyển ml dịch mẫu thử vào ống nghiệm chứa môi trường BGBL 2% (mỗi nồng độ thử ống) - Cho vào tủ 35 ± 10C ủ 24 ± + Dương tính (+) : màu môi trường thay đổi có sinh ống Durham + Âm tính (-) : màu môi trường không thay đổi không sinh ống Durham - Dùng khuyên cấy khử trùng lấy dịch mẫu ống có phản ứng dương tính cấy ria qua môi trường DLA Cho vào tủ ấm 35 ± 10C 24 ± - Thử phản ứng sinh hóa với khuẩn lạc mọc môi trường DLA (khuẩn lạc hình tròn dẹt khô, đường kính 0,5 mm, màu đỏ) + Thử Indol Dùng khuyên cấy khử trùng chuyển vi khuẩn cần xác định sang môi trường nước pepton Cho vào tủ ấm 35 ± 10C, ủ 24 ± → nhỏ giọt thuốc thử Kovacs vào ống * Dương tính (+) : xuất màu đỏ mặt môi trường * Âm tính (-) : giữ nguyên màu môi trường + Thử MR-VP Dùng khuyên cấy khử trùng chuyển vi khuẩn cần xác định sang môi trường MR-VP Cho vào tủ ấm 35 ± 10C, ủ 48 ± Nhỏ giọt thuốc thử MR vào ống * Dương tính (+): Dịch cấy có màu đỏ * Âm tính (-): Dịch cấy có màu vàng màu cam Nhỏ khoảng giọt dung dịch ∝- naphthol 5% giọt dung dịch KOH 40% Lắc nhẹ ống khoảng 30-60 giây để yên * Dương tính (+): xuất màu hồng đỏ * Âm tính (-): môi trường giữ nguyên màu thuốc thử + Thử Citrate Dùng khuyên cấy khử trùng chuyển vi khuẩn cần xác định từ môi trường DLA sang môi trường thạch nghiêng citrate simmons Cho vào tủ ấm 35 ± 10C, ủ 24 ± * Dương tính (+): môi trường chuyển sang màu xanh dương * Âm tính (-): môi trường giữ nguyên màu xanh lục 8.3 Kết Từ phản ứng IMViC + + − − hay − + − −, suy số lượng E.coli 1g mẫu theo phương pháp MPN (Most Probable Number) 96 Bảng số MPN Áp dụng dùng ống nghiệm : ống với 0,1g; 0,01g 0,001g(hay ml) Số ống có phản ứng (+) Chỉ số Giới hạn độ tin cậy 95% ống ống ống 0,001g MPN/100g Thấp Cao 0,1g (ml) 0,01g (ml) (ml) (ml) ⎯ ⎯ 0