Hiện nay, khi kháng nguyên đích đã được mô tả hoàn toàn, ba yếu tố bao gồm viêm cầu thận, xuất huyết phổi và sự xuất hiện của kháng thể kháng chuỗi alpha-3 của collagen tuýp IV (GBM) l[r]
(1)QUY TRÌNH
N.545 QUY TRÌNH ĐỊNH LƯỢNG KHÁNG THỂ KHÁNG GBM (GBM Ab)
I NGUYÊN LÝ
Xét nghiệm dựa phản ứng miễn dịch gắn enzyme gián bước sau:
Các kháng thể có mặt mẫu dương tính gắn với kháng nguyên phủ bề mặt hai giếng phản ứng, hình thành phức hợp kháng nguyên-kháng thể Sau ủ, bước rửa loại bỏ phân tử không gắn gắn khơng đặc hiệu Tiếp đó, chất cộng hợp enzyme bổ sung gắn với phức hợp kháng nguyên - kháng thể cố định Sau ủ, bước rửa thứ hai loại bỏ chất cộng hợp không gắn Cơ chất enzyme tiếp tục thêm vào giếng, trình thủy phân tạo màu diễn thời gian ủ Cường độ màu xanh dương tạo tỉ lệ thuận với nồng độ phức hợp kháng nguyên-kháng thể đo phương pháp quang học bước sóng 650 nm hệ thống xét nghiệm miễn dịch ELISA (Enzymelinked immunosorbant assay)
II CHUẨN BỊ
1. Cán thực hiện:
01 bác sĩ 01 cán đại học 01 kỹ thuật viên chuyên ngành Hóa sinh 2 Phương tiện, hóa chất:
- Phương tiện xét nghiệm: máy xét nghiệm miễn dịch Alegria- hãng ORGENTEC/ Germany - Thuốc thử sẵn sàng sử dụng: Bộ xét nghiệm định lượng Anti – GBM Ab sau:
Thanh thử Alegria gồm giếng chứa thành phần sau:
Giếng + Giếng trống (để pha loãng mẫu)
Giếng + Phủ kháng nguyên (giếng phản ứng)
Giếng Mẫu chứng, màu vàng, chứa kháng thể
đặc hiệu, PBS, albumin huyết bò (BSA), chất tẩy, chất bảo quản natri azide 0,09% ProClin 300 0,05% Giếng Chất cộng hợp enzyme, màu đỏ nhạt,
(2)Giếng Dung dịch pha loãng mẫu, màu vàng, chứa PBS, BSA, chất tẩy, chất bảo quản natri azide 0,09% ProClin 300 0,05% Giếng Cơ chất TMB, suốt, chứa 3,3’,
5,5’- Tetramethylbenzidin
GBM có độ tinh cao phủ sẵn vi giếng
Mã hóa sản phẩm: GBM - Ngồi cịn dung dịch hệ thống như:
+ Wash (1x20mL): Dung dịch rửa, chứa TRIS, detergent, chất bảo quản natri azide 0,09% (50x)
+ System fluid (1x2,5mL): Dung dịch hệ thống chứa acid (1000x)
- Bộ xét nghiệm cần bảo quản bóng tối điều kiện 2-8°C Khơng để hóa chất tiếp xúc với nhiệt, mặt trời ánh sáng mạnh suốt trình bảo quản sử dụng Bảo quản thử Alegria (đậy kín khơ ráo) túi có khóa cung cấp Dung dịch Wash Buffer System Fluid sau pha loãng ổn định tối thiểu 30 ngày bảo quản 2-8°C
Dụng cụ khác: + Máy vortex; Pipet 20 μL; + Ống đong thể tích 1000 mL 2500 mL + Nước cất nước khử ion
3 Người bệnh: Người bệnh giải thích tư vấn trước thực XN, tốt nhịn ăn sáng lấy máu vào buổi sáng
4 Phiếu xét nghiệm: có đầy đủ thơng tin bệnh nhân bao gồm họ tên, tuổi, khoa phịng, chẩn đốn, tình trạng mẫu, tên BS định, ngày định, ngày lấy mẫu, loại thuốc sử dụng (nếu có)…
III CÁC BƯỚC TIẾN HÀNH
1. Lấy mẫu bệnh phẩm xử lý mẫu:
- Bệnh phẩm phải lấy kỹ thuật vào ống xét nghiệm tiêu chuẩn Sử dụng ống không chống đông (ống serum) sử dụng ống có chất chống đơng Li-Heparine, EDTA
(3)- Bệnh phẩm lưu 2-8°C vòng ngày -20°C vòng tháng - Bảo quản chất chuẩn, QC sau hoàn nguyên nhiệt độ -20°C, tiến hành chạy phải để nhiệt độ phòng (20- 25°C) rã đơng hồn tồn lắc trước tiến hành xét nghiệm
2 Tiến hành kỹ thuật
- Máy xét nghiệm, hóa chất chuẩn trước thực phân tích Việc chuẩn xét nghiệm định lượng Anti- GBM hiệu chuẩn thay đổi lơ hóa chất Kiểm tra chất lượng nằm giới hạn cho phép Thông thường chạy nội kiểm (QC) mức ngày: mức bình thường khơng bình thường Đối chiếu với luật kiểm tra chất lượng đạt tiến hành phân tích mẫu
- Thanh thử Alegria Test Strips với công nghệ SMC sử dụng với thiết bị chẩn đoán Alegria Để có thơng tin chi tiết quy trình vận hành thiết bị, tham khảo tài liệu hướng dẫn sử dụng thiết bị
(1) Bóc miếng dán phủ giếng trống từ đến thử Alegria Test Strips Khơng bóc phần dán phủ có in mã vạch, phủ giếng từ đến
(2) Hút 10 μL mẫu khơng pha lỗng vào đáy giếng (3) Đặt thử vào khay SysTray
(4) Đặt khay SysTray vào vị trí thiết bị Alegria bắt đầu chạy Tất bước sau thực tự động Xét nghiệm chạy hoàn tất thiết bị bắt đầu in kết
- Định kỳ: Chuẩn lại chạy mức QC sau thay lô thuốc thử sau bảo dưỡng, sửa chữa máy cố, thay trang thiết bị phân tích quan trọng Ghi lại kết vào bảng theo dõi kết chuẩn máy xét nghiệm
- Đưa bệnh phẩm vào phân tích theo protocol máy Khi có kết phân tích đối chiếu với phiếu xét nghiệm, trả, lưu kết vào hệ thống mạng, in phiếu kết xét nghiệm trả kết cho người bệnh thời gian quy định
IV NHẬN ĐỊNH KẾT QUẢ
1 Giá trị tham chiếu: Bình thường: Anti-GBM Ab < 20 U/mL 2 Ý nghĩa lâm sàng
Xét nghiệm ELISA Anti-GBM dùng để định lượng tự kháng thể lớp IgG kháng màng cầu thận (GBM) huyết huyết tương người
(4)xem rối loạn tự miễn bao gồm viêm cầu thận, xuất huyết phổi hình thành kháng thể kháng màng cầu thận
Tỷ lệ mắc hội chứng Goodpasture khoảng 0,5 đến trường hợp triệu dân năm Phần lớn bệnh nhân mắc hội chứng thập kỷ thập kỷ Hội chứng Goodpasture trường hợp khẩn cấp y khoa với tỷ lệ tử vong 75% đến 90% suy thận suy hô hấp không điều trị kịp thời
Theo mô học, hội chứng đặc trưng lắng đọng liên tục immunoglobulin dọc theo màng cầu thận (GBM), chứng minh phương pháp miễn dịch huỳnh quang trực tiếp mẫu sinh thiết thận Hiện nay, việc xác định tự kháng thể (lưu hành tuần hoàn) kháng đầu C chuỗi alpha-3 collagen tuýp IV coi tiêu chuẩn chẩn đốn Màng hình thành hàng rào giải phẫu vị trí biểu mơ gặp mô liên kết Collagen tuýp IV (chỉ thấy GBM) tạo thành đệm, phân tử bổ sung (ví dụ Laminin, Entactin) tích hợp Ba sáu chuỗi alpha (polypeptide có 1.650 amino acid) tạo thành cấu trúc xoắn ba đặc trưng cho tiểu đơn vị collagen tuýp IV Tất đầu tận C chuỗi alpha tạo thành vùng hình cầu, hịa tan tách khỏi cấu trúc xoắn ba cách xử lý với collagenase vi khuẩn
Phản ứng tự kháng thể anti-GBM (đặc hiệu với hội chứng Goodpasture) kháng vùng NC1 (29 kDa) chuỗi alpha-3 collagen tuýp IV (GBM) Hiện nay, kháng nguyên đích mơ tả hồn tồn, ba yếu tố bao gồm viêm cầu thận, xuất huyết phổi xuất kháng thể kháng chuỗi alpha-3 collagen tuýp IV (GBM) yếu tố cần thiết để chẩn đoán hội chứng Goodpasture Hệ thống xét nghiệm ELISA sử dụng kháng nguyên tinh khiết tương ứng thể độ nhạy 98% độ đặc hiệu 99%
V NHỮNG SAI SĨT VÀ XỬ TRÍ
Sử dụng bệnh phẩm máu toàn phần thu thập kỹ thuật phê duyệt, tránh gây vỡ hồng cầu
Mẫu huyết dùng cho xét nghiệm phải không bị vỡ hồng cầu Tránh sử dụng mẫu vỡ hồng cầu mẫu nhiễm mỡ, nhiên, mẫu không gây nhiễu xét nghiệm Tránh lặp lại bước làm đông rã đông mẫu huyết huyết tương làm giảm hoạt tính kháng thể