Đề tài Quy trình định lượng S.Aureus bằng phương pháp đếm đĩa

BỘ CÔNG THƯƠNG TRƯỜNG ĐH CÔNG NGHIỆP THỰC PHẨM TP HỒ CHÍ MINH KHOA THỦY SẢN MÔN:MÔN: MÔN: PHÂN TÍCH VI SINH THỰC PHẨM ĐỀ TÀI: QUY TRÌNH ĐỊNH LƯỢNG S.AUREUS BẰNG PHƯƠNG PHÁP ĐẾM ĐĨA GVHD: NGUYỄN THỊ KIM OANH NHÓM THỰC HIỆN: Tổng quan vi khuẩn staphylococcus aureus: Đặc điểm: - Hiếu khí hay kị khí tùy ý - Cầu khuẩn, Gram (+), chùm nho - Có thử nghiệm coagulase, phản ứng DNA, phosphatese - Khả lên men đường manitol, trehalose, sucrose - Phản ứng đặc trưng: phản ứng đông tụ huyết tương Phân bố: - Thịt, cá, rau quả,sữa, trứng,…qua đường tiếp xúc với người thao tác trình chế biến Ngoài có lông, mụn nhọt, vết thương,… - Có khả tăng trưởng môi trường chứa đến 15% NaCl - Hầu hết vòng tan máu tạo sắc tố vàng sau – ngày nuôi cấy nhiệt độ phòng - Tạo độc tố Enterotoxin bền nhiệt staphylococcus aureus Quy trình định lượng S.aureus 2.1 Phạm vi áp dụng: - Phương pháp tham chiếu theo TCVN 4830 – 1: 2005 ( ISO 6888-1 : 1999) - *TCVN 4830-1:2005 : tiêu chuẩn quy định phương pháp định lượng Staphylococci có phản ứng dương tính với coagulase đĩa thạch có mặt sản phẩm dùng cho người thức ăn chăn nuôi, 0 cách đếm số khuẩn lạc thu môi trường đặc ( môi trường Baird-Packer) 35 C – 37 C 2.2 Nguyên tắc: - Cấy lên bề mặt môi trường chọn lọc, lượng mẫu qui định (sản phẩm dạng lỏng huyền phù) o - Ủ đĩa điều kiện hiếu khí 37 C kiểm tra 24h 48h - Tính số lượng Staphylococcus aureus ml gram mẫu từ khuẩn lạc điển hình không điển hình đĩa độ pha loãng khác khẳng định kết thử coagulase dương tính 2.3 Môi trường hóa chất: Môi trường Công dụng Dung dịch Saline Peptone Water (SPW) Dung dịch đẳng trương để pha loãng mẫu Môi trường Baird – Parker Môi trường chọn lọc để nuôi cấy S.aureus Môi trường Trypticase Soy Agar (TSA) Bảo quản phục hồi vsv trình nuôi cấy Brain heart broth (BHI) Huyết tương thỏ Dùng để khẳng định S.aureus HCl 10% Chỉnh pH môi trường NaOH 10% 2.5 Qui trình phân tích: Chương 3: Thuyết minh qui trình Bước 1: chuẩn bị mẫu thử huyền phù ban đầu Lấy 10g ( mẫu rắn) hút 10ml ( mẫu 90ml dung dịch pha loãng SPW lỏng) ( túi nhựa vô trùng ) Cho vào máy dập mẫu (mẫu rắn) lắc (mẫu lỏng) Đồng mẫu Bước 2: Pha loãng mẫu Hút 1ml dd 10 DD 10 -1 -2 9ml SPW Nếu cần, lặp lại thao tác để có dung dịch pha loãng 10 hợp -3 -4 -5 , 10 , 10 ,… đạt độ pha loãng thích Bước 3: Phân lập môi trường chọn lọc Hút 0.1ml dd mẫu BPA Bước 4: quan sát, đếm số khuẩn lạc Đánh dấu khuẩn lạc Sau 24h điển hình Sau 24h Khuẩn lạc S.aureus dương tính,đánh dấu khuẩn lạc không điển hình Bước 5+6: Phục hồi khẳng định Cấy khuẩn lạc điển hình khuẩn lạc không điển hình từ BPA sang ống nghiệm tương ứng chứa 5ml môi trường BHI o Ủ 37 ± C 24 ± 3h Hút 0,1 ml dịch nuôi cấy BHI vào ống nghiệm có kích thước 10mm × 75mm chứa 0,3 ml huyết tương thỏ ( theo hướng dẫn nhà sản xuất) Kiểm tra động tụ huyết tương sau 4, 6, 8, 24h Xác định tỷ lệ khẳng định dựa số khuẩn lạc đặc trưng không đặc trưng Báo cáo kết - Âm tính: khối đông, hỗn hợp dung dịch đồng ống không cấy Dương tính: có khối động tụ huyết tương chiếm ¾ Âm tính Dương tính Bước 7: báo cáo kết Ví dụ Nồng độ pha loãng 10 10 Số khuẩn lạc thử nghiệm Số phản ứng coagulase phản ứng coagulase (+)     47   Nt Na Ht Ha 30 5/5     2/5   5 5/5     1/5 -2 -3 Kết Cảm ơn cô bạn ý lắng nghe ... aureus Quy trình định lượng S.aureus 2.1 Phạm vi áp dụng: - Phương pháp tham chiếu theo TCVN 4830 – 1: 2005 ( ISO 6888-1 : 1999) - *TCVN 4830-1:2005 : tiêu chuẩn quy định phương pháp định lượng. .. lượng mẫu qui định (sản phẩm dạng lỏng huyền phù) o - Ủ đĩa điều kiện hiếu khí 37 C kiểm tra 24h 48h - Tính số lượng Staphylococcus aureus ml gram mẫu từ khuẩn lạc điển hình không điển hình đĩa. .. trường chọn lọc để nuôi cấy S.aureus Môi trường Trypticase Soy Agar (TSA) Bảo quản phục hồi vsv trình nuôi cấy Brain heart broth (BHI) Huyết tương thỏ Dùng để khẳng định S.aureus HCl 10% Chỉnh pH