Nghiên cứu điều kiện kỹ thuật nuôi vi tảo nannochloropsis oculata thu sinh khối giàu lipid ở qui mô nhỏ

ĐẠI HỌC QUỐC GIA TP HỒ CHÍ MINH TRƢỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA HUỲNH NGUYỄN ANH KHOA NGHIÊN CỨU ĐIỀU KIỆN KỸ THUẬT NUÔI VI TẢO NANNOCHLOROPSIS OCULATA THU SINH KHỐI GIÀU LIPID Ở QUI MƠ NHỎ Chun ngành: Cơng Nghệ Sinh Học LUẬN VĂN THẠC SĨ TP HỒ CHÍ MINH, 8/2011 -ii- CƠNG TRÌNH ĐƯỢC HỒN THÀNH TẠI TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA ĐẠI HỌC QUỐC GIA TP HỒ CHÍ MINH Cán hướng dẫn khoa học: Phó Giáo sư, Tiến sĩ Nguyễn Đức Lượng Cán chấm nhận xét 1: Cán chấm nhận xét 2: Luận văn thạc sĩ bảo vệ Trường Đại học Bách Khoa, ĐHQG Tp HCM ngày tháng năm Thành phần Hội đồng đánh giá luận văn thạc sĩ gồm: (Ghi rõ họ, tên, học hàm, học vị Hội đồng chấm bảo vệ luận văn thạc sĩ) Xác nhận Chủ tịch Hội đồng đánh giá LV Trưởng Khoa quản lý chuyên ngành sau luận văn sửa chữa (nếu có) CHỦ TỊCH HỘI ĐỒNG TRƢỞNG KHOA KTHH -iiiĐẠI HỌC QUỐC GIA TP.HCM TRƢỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA CỘNG HÒA XÃ HỘI CHỦ NGHĨA VIỆT NAM Độc lập - Tự - Hạnh phúc NHIỆM VỤ LUẬN VĂN THẠC SĨ Họ tên học viên: Huỳnh Nguyễn Anh Khoa MSHV: 09310904 Ngày, tháng, năm sinh: 06/01/1986 Nơi sinh: Bến Tre Chuyên ngành: Công Nghệ Sinh Học Mã số : I TÊN ĐỀ TÀI: Nghiên cứu điều kiện kỹ thuật nuôi vi tảo Nannochloropsis oculata thu sinh khối giàu lipid quy mô nhỏ II NHIỆM VỤ VÀ NỘI DUNG: III NGÀY GIAO NHIỆM VỤ : IV NGÀY HOÀN THÀNH NHIỆM VỤ: V CÁN BỘ HƢỚNG DẪN : PGS TS Nguyễn Đức Lƣợng Tp HCM, ngày tháng năm 20 CÁN BỘ HƢỚNG DẪN CHỦ NHIỆM BỘ MÔN ĐÀO TẠO (Họ tên chữ ký) (Họ tên chữ ký) PGS TS Nguyễn Đức Lƣợng PGS TS Nguyễn Đức Lƣợng TRƢỞNG KHOA KTHH (Họ tên chữ ký) -iv- LỜI CẢM ƠN Để hồn thành luận văn này, tơi nhận giúp đỡ nhiều người:  Thầy tơi - Phó Giáo sư Tiến sĩ Nguyễn Đức Lượng Thầy dìu dắt tơi từ lúc cịn sinh viên đến ngày hôm Thầy gợi ý đề tài hướng dẫn tơi suốt q trình làm việc Thầy động viên tinh thần phương hướng cho tơi lúc gặp khó khăn cơng việc lẫn ngồi sống  Các tơi - Phó Giáo sư Tiến sĩ Nguyễn Thúy Hương, Tiến sĩ Lê Thị Thủy Tiên, Tiến sĩ Huỳnh Ngọc Oanh Các cô người thầy dạy suốt thời sinh viên lúc học cao học Các cô tạo điều kiện thuận lợi cho làm việc, quan tâm động viên  Chị Hoàng Mỹ Dung, Chị Võ Nguyễn Lam Uyên, Chị Trần Trúc Thanh – giảng viên cán phịng thí nghiệm Bộ Mơn Cơng nghệ sinh học – có góp ý cho tơi đề tài, tạo điều kiện thuận lợi dụng cụ, thiết bị để tơi tiến hành thí nghiệm  Các bạn sinh viên ngành Công Nghệ Sinh Học: Trần Đăng Khoa (Khóa 06), Nguyễn Anh Khoa (Khóa 06), Bùi Ngọc Đoan Chiêu (Khóa 06), Phạm Thư Trang (Khóa 07), Đồn Thị Mỹ Tiếp (Khóa 07), Từ Mỹ Tường Khánh (Khóa 07) hỗ trợ tơi việc tìm kiếm, tổng hợp tài liệu thực nghiệm  Bạn Võ Đức Thắng (Lớp Hóa Lý Khóa 05) tơi trao đổi số vấn đề đề tài  Gia đình động viên tinh thần cho yên tâm làm việc Tôi xin gởi đến người kể lời cảm ơn chân thành! -v- TÓM TẮT Vi tảo Nannochloropsis oculata (thuộc họ Eustigmatophyceae) loài vi tảo nước mặn có tốc độ sinh trưởng nhanh, hàm lượng lipid cao có thành phần lipid phù hợp với mục tiêu sản xuất biodiesel Do đó, lồi vi tảo lựa chọn đối tượng nghiên cứu đề tài Một số yếu tố môi trường điều kiện nuôi cấy ảnh hưởng đến sinh trưởng tích lũy lipid vi tảo khảo sát, bao gồm: MgSO4, NaNO3, ure, DAP, pH ban đầu, phương pháp cấy giống, chế độ chiếu sáng Kết cho thấy mơi trường có chứa 2g/l MgSO4, 0.05 g/l ure, pH ban đầu 9.2, cấy giống sau sục khí qua đêm, chiếu sáng liên tục cường độ 9000 lux cho thấy có hiệu việc thu nhận lipid thô Phương pháp sử dụng NaHCO3 để cung cấp nguồn carbon thay cho sục khí ánh sáng tự nhiên thay cho ánh sáng đèn khảo sát bước đầu cho thấy khơng có hiệu mặt tối ưu hóa q trình Thành phần acid béo lipid thơ chiết từ sinh khối vi tảo có chứa 39.4 % C18:1, 27.2% C16:0 24.8% C18:2 tổng lượng acid béo khơng có C20:5 -vi- MỤC LỤC TĨM TẮT v MỤC LỤC vi DANH MỤC BẢNG viii DANH MỤC HÌNH ix CHƢƠNG 1: MỞ ĐẦU 1.1 Tính cấp thiết đề tài 1.2 Mục tiêu nghiên cứu 1.3 Nội dung nghiên cứu CHƢƠNG 2: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1 Vi tảo ứng dụng vi tảo 2.1.1 Vi tảo sinh giới phân loại vi tảo 2.1.2 Sự sinh sản sinh dưỡng vi tảo 2.1.3 Các ứng dụng phổ biến vi tảo 2.2 Lipid vi tảo biện pháp kỹ thuật nhằm nâng cao hiệu suất nuôi vi tảo thu nhận lipid 10 2.2.1 Thành phần lipid vi tảo 10 2.1.2 Sự sinh tổng hợp lipid trung tính vi tảo 16 2.1.3 Các biện pháp kỹ thuật nhằm nâng cao hiệu suất nuôi vi tảo thu nhận lipid 21 2.2 Đặc điểm vi tảo Nannochloropsis oculata 29 2.2.1 Nguồn gốc – phân loại 29 2.2.2 Đặc điểm hình thái 30 2.2.3 Đặc điểm sinh lý 30 2.2.4 Đặc điểm sinh hóa 32 2.3 Các nghiên cứu trƣớc có liên quan đến đề tài 34 2.3.1 Nghiên cứu nước 34 2.3.2 Nghiên cứu nước 34 CHƢƠNG 3: NGUYÊN VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 37 -vii3.1 Nguyên vật liệu 37 3.1.1 Hệ thống thiết bị nuôi cấy 37 3.1.2 Môi trường nuôi cấy 38 3.1.3 Giống vi tảo Nannochloropsis oculata 40 3.1.4 Dung môi chiết xuất lipid thô 40 3.2 Phƣơng pháp nghiên cứu 40 3.2.1 Sơ đồ nghiên cứu tổng quát 40 3.2.2 Trữ giống nhân giống 40 3.2.3 Khảo sát phát triển sinh khối vi tảo theo thời gian 42 3.2.4 Đánh giá gián tiếp phát triển sinh khối theo thời gian 42 3.2.5 Khảo sát ảnh hưởng yếu tố môi trường nuôi cấy 42 3.2.6 Khảo sát ảnh hưởng yếu tố điều kiện nuôi cấy 43 3.2.7 Nuôi cấy để thu sinh khối phân tích thành phần acid béo 44 3.2.8 Khảo sát ảnh hưởng NaHCO3 nuôi cấy khơng sục khí 44 3.2.9 Ni thử nghiệm điều kiện chiếu sáng tự nhiên 44 3.2.10 Các phương pháp phân tích 45 CHƢƠNG 4: KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 49 4.1 Hình thái vi tảo Nannochloropsis oculata 49 4.2 Các vấn đề thu hoạch sinh khối 50 4.3 Sự phát triển vi tảo môi trƣờng theo thời gian 51 4.4 Ảnh hƣởng lƣợng MgSO4 52 4.5 Ảnh hƣởng nguồn Nitơ 55 4.6 Ảnh hƣởng pH ban đầu thời điểm cấy giống 59 4.7 Ảnh hƣởng chế độ chiếu sáng 63 4.8 Ảnh hƣởng NaHCO3 điều kiện khơng sục khí bƣớc đầu thử nghiệm ni ngồi ánh sáng tự nhiên 65 4.9 Thành phần acid béo lipid thô chiết đƣợc từ sinh khối vi tảo 67 CHƢƠNG 5: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 70 5.1 Kết luận 70 5.2 Kiến nghị 71 TÀI LIỆU THAM KHẢO 72 PHỤ LỤC 79 -viii- DANH MỤC BẢNG Trang Bảng Hệ thống phân loại tảo Bảng 2 So sánh vi tảo với nguồn nguyên liệu sản xuất biodiesel khác Bảng So sánh thuộc tính dầu từ vi tảo, diesel thông thường tiêu chuẩn ASTM biodiesel .9 Bảng Thành phần acid béo (% acid béo tổng) số mẫu glycosylglyceride từ loài vi tảo khác 13 Bảng Thành phần glycerolipid số loài vi tảo 16 Bảng Thành phần acid béo (% khối lượng) TAG số loài vi tảo 17 Bảng Hàm lượng suất lipid loài vi tảo khác 21 Bảng Thành phần môi trường nuôi cấy 39 Bảng Thành phần dung dịch khoáng 39 Bảng 3 Thành phần dung dịch vitamin 40 Bảng Kết nghiệm thức khảo sát ảnh hưởng MgSO4 .53 Bảng Kết nghiệm thức khảo sát ảnh hưởng NaNO3 .56 Bảng Kết nghiệm thức khảo sát ảnh hưởng ure 57 Bảng 4 Kết nghiệm thức khảo sát ảnh hưởng pH ban đầu 61 Bảng Kết nghiệm thức khảo sát ảnh hưởng NaHCO3 66 Bảng Cường độ ánh sáng tự nhiên trung bình nơi thí nghiệm 67 Bảng Thành phần acid béo mẫu lipid thô 68 -ix- DANH MỤC HÌNH Trang Hình Các glycosylglyceride vi tảo 11 Hình Các phosphoglyceride vi tảo 12 Hình 2 Cấu trúc diacylglyceryl glucuronide 12 Hình Các betaine lipid vi tảo .14 Hình Cấu trúc triacylglycerol 15 Hình Cơ chế xúc tác enzyme acetyl-CoA carboxylase .18 Hình Con đường sinh tổng hợp acid béo 19 Hình 2.8 Con đường sinh tổng hợp triglyceride 20 Hình Hình dạng tế bào số lồi thuộc Monodopsis Nannochloropsis .31 Hình 2.10 Thành phần acid béo nhóm lipid Nannochloropsis sp 33 Hình Sơ đồ nghiên cứu tổng quát .41 Hình Sơ đồ bước định lượng lipid thô 48 Hình 4.1 Đồ thị phát triển sinh khối N oculata theo thời gian 51 Hình Đồ thị phát triển sinh khối N oculata môi trường bổ sung MgSO4 .53 Hình Sự ảnh hưởng MgSO4 đến lượng sinh khối khô, lipid thô hàm lượng lipid N oculata vào ngày thứ 12 54 Hình 4 Đồ thị phát triển sinh khối N oculata môi trường có bổ sung NaNO3 .55 Hình Sự ảnh hưởng NaNO3 đến lượng sinh khối khô, lipid thô hàm lượng lipid N oculata vào ngày thứ 14 55 Hình Đồ thị phát triển sinh khối N oculata mơi trường có bổ sung Ure 56 Hình Sự ảnh hưởng ure đến lượng sinh khối khô, lipid thô hàm lượng lipid N oculata vào ngày thứ 14 57 -xHình Đồ thị phát triển sinh khối N oculata môi trường có bổ sung DAP 57 Hình Sự thay đổi pH mơi trường nuôi cấy N oculata điều kiện cấy giống lúc bắt đầu sục khí 59 Hình 10 Đồ thị phát triển sinh khối N oculata mơi trường có pH ban đầu khác 60 Hình 11 Sự ảnh hưởng pH ban đầu đến lượng sinh khối khô, lipid thô hàm lượng lipid N oculata vào ngày thứ 12 60 Hình 12 Cơ chế chuyển hóa nguồn dinh dưỡng Carbon môi trường nuôi vi tảo 61 Hình 13 Sự ảnh hưởng chế độ chiếu sáng đến lượng sinh khối khô, lipid thô hàm lượng lipid N oculata vào ngày thứ 12 64 Hình 14 Đồ thị phát triển sinh khối N oculata mơi trường có nồng độ NaNO3 khác 65 Hình 15 Sự ảnh hưởng NaNO3 chiếu sáng đèn huỳnh quang ánh sáng tự nhiên đến N oculata vào ngày thứ 12 66 -66- Hình 15 Sự ảnh hƣởng NaNO3 chiếu sáng đèn huỳnh quang ánh sáng tự nhiên đến lƣợng sinh khối khô, lipid thô hàm lƣợng lipid N oculata vào ngày thứ 12 Bảng Kết nghiệm thức khảo sát ảnh hƣởng NaHCO3 Chế độ chiếu sáng Ánh sáng đèn 9000 lux, chiếu sáng liên tục Ánh sáng tự nhiên Nồng độ NaHCO3 (g/l) 1.5 10 Sinh khối khô (g/l) Khối lượng lipid thô (mg/l) 0.177 ± 0.0098 0.2168 ± 0.0101 0.3312 ± 0.014 0.251 ± 0.0052 0.186 ± 0.0101 22 ± 2.5 21 ± 3.7 38 ± 34 ± 26 ± Tỉ lệ lipid/sinh khối khô (%) 12.5 ± 0.7 9.5 ± 2.1 11.5 ± 0.7 13.5 ± 2.1 14 ± 1.4 0.265 ± 0.0096 25 ± 1.5 9.4 ± 0.2 Trong điều kiện chiếu sáng đèn, g/l NaHCO3 cho thấy có hiệu sinh khối khô (đạt 0.3312 ± 0.014 g/l) lượng lipid thô (đạt 38 ± mg/l) Kết thu thấp sục khí với giá trị pH ban đầu 9.2 (cấy giống sau sục khí qua đêm) (đạt 0.41 g/l sinh khối khơ 77 mg/l lipid) So với việc sục khí để bổ sung liên tục nguồn carbon (CO2), NaHCO3 cung cấp vào đầu mẻ ni cấy khơng đủ cho vi tảo sử dụng mật độ tế bào tăng cao Tuy nhiên, tăng nồng độ NaHCO3 lên 8-15 g/l lại làm hạn chế phát triển vi tảo Đặc biệt nồng độ 12 15 g/l NaHCO3 có ức chế rõ rệt giá trị OD682nm sau 10 ngày nuôi cấy đạt 0.2 -67Sự ảnh hưởng xấu vừa nói tăng độ mặn mơi trường việc bổ sung NaHCO3 không kèm với việc giảm lượng muối hột (khác với trường hợp bổ sung MgSO4 mục 4.4) ảnh hưởng xấu nồng độ cao ion Na+ Độ mặn thích hợp cho phát triển N oculata 22-49 g/l (Hanhua, 2006) Trong khơng bổ sung NaHCO3 mơi trường có độ mặn 40 g/l Nồng độ 5g/l NaHCO3 lựa chọn để thử nghiệm bước đầu nuôi vi tảo ngồi ánh sáng tự nhiên điều kiện khơng sục khí Cả ba mục tiêu cần quan tâm đạt thấp so với điều kiện chiếu sáng liên tục đèn Cường độ ánh sáng tự nhiên (chiếu thẳng góc với bề mặt bình ni cấy) vị trí thí nghiệm thay đổi liên tục ngày ghi nhận lại bảng 4.6 Thời gian sáng trung bình ngày giai đoạn thí nghiệm (tháng 5-6/2011) 13 sáng/11 tối (khoảng từ 30 phút sáng đến 18 30 phút chiều) Bảng Cƣờng độ ánh sáng tự nhiên trung bình vị trí thí nghiệm ngày Cường độ sáng 5000-32000 lux 8000-12000 lux 3000-5000 lux Thời điểm đo ngày 12 16 Kết thấp thu ni N oculata ngồi ánh sáng tự nhiên thời gian chiếu sáng ngày ngắn Vào buổi trưa chiều, cường độ chiếu sáng thấp buổi sáng hướng chiếu sáng bị thay đổi ánh sáng bị chắn bớt cơng trình xây dựng Mặt dù có thời điểm ngày, cường độ chiếu sáng ánh sáng tự nhiên đạt cao so với dùng đèn (cao mức 9000 ± 800 lux) Tuy nhiên, tính tốn cho trọn ngày tổng lượng ánh sáng chiếu vào bình ni thấp dùng đèn Nhiệt độ mơi trường bình ni cấy đạt vào khoảng 35-38oC vào trưa Đây nhiệt độ không thích hợp cho N oculata (Attilio cộng sự, 2009; Hanhua cộng sự, 2006) Cả hai phương pháp nuôi cấy (bổ sung NaHCO3 thay cho sục khí bổ sung NaHCO3 kết hợp với sử dụng ánh sáng tự nhiên) nghiệm thức cho thấy khơng có hiệu việc sản xuất lipid từ sinh khối vi tảo N oculata Tuy nhiên, cần tiến hành nghiên cứu sâu để đánh giá xác hiệu kinh tế hai phương pháp chúng giúp tiết kiệm nhiều lượng cần tiêu tốn cho việc sục khí chiếu sáng 4.9 Thành phần acid béo lipid thô chiết đƣợc từ sinh khối vi tảo -68N oculata nuôi môi trường điều kiện tối ưu theo nghiệm thức tiến hành: g/l MgSO4, 0.05 g/l ure, pH 9.2, cấy giống sau sục khí qua đêm, chiếu sáng liên tục 9000 ± 800 lux Toàn sinh khối sau 12 ngày nuôi cấy (0.3948 ± 0.0235 g sinh khối khơ/l) đem trích ly để thu lipid thô định lượng thành phần acid béo Kết trình bày bảng 4.7 sắc ký đồ phụ lục Khi nuôi điều kiện trên, lượng C18:1 chiếm tỉ lệ cao khối lượng (39.4 % tổng lượng acid béo) Vẫn tồn lượng lớn C18:2 (24% tổng lượng acid béo) Các acid béo có 20 nguyên tử carbon trở lên chiếm tỉ lệ thấp Bảng Thành phần acid béo mẫu lipid thô thu đƣợc nuôi vi tảo điều kiện tối ƣu nghiên cứu Thành phần acid béo C8:0 C10:0 C12:0 C14:0 C14:1 C15:0 C16:0 C16:1 C17:0 C18:0 C18:1 C18:2 C18:3 C20:0 C20:1 C22:0 C24:0 mg/g lipid thô 0.1 0.1 0.5 3.9 0.1 0.2 113.1 4.7 1.2 12.3 164.3 103.2 10.8 0.9 0.3 0.3 0.6 Tỉ lệ khối lượng tổng khối lượng acid béo (%) 0.1 0.9 0.1 27.2 1.1 0.3 39.4 24.8 2.6 0.2 0.1 0.1 0.1 (-) nhỏ 0.1 % Thành phần acid béo chịu ảnh hưởng nhiều yếu tố Ngoài yếu tố gây ảnh hưởng chế độ chiếu sáng bàn luận mục 4.7, nhiệt độ, nồng độ nguồn nitơ hai yếu tố quan trọng Về nhiệt độ: Nghiên cứu Nannochloropsis sp Hanhua (2006) chế độ nhiệt khác (14, 22 30oC) cho thấy, hàm lượng acid palmitoleic (C16:1) acid oleic (C18:1) thay đổi không đáng kể Đây hai loại acid béo lý tưởng sản -69xuất biodiesel (Gerhard, 2008) Trong đó, có tăng gần 1.6 lần hàm lượng C16:0 giảm hàm lượng C20:5 tăng nhiệt độ từ 22oC lên 30oC Còn nghiên cứu Nannochloropsis oculata, 150C, hàm lượng C16:0 C18:3 cao (tương ứng 62% 18% tổng lượng acid béo), hàm lượng C18:1 lại thấp (1% tổng lượng acid béo) Khi nhiệt độ tăng lên 250C, hàm lượng C18:1 tăng lên nhiều (19% tổng lượng acid béo), C16:0 C18:3 lại có xu hướng giảm Về nồng độ nguồn nitơ: Cũng nghiên cứu Hanhua cộng (2006), tăng nồng độ NaNO3 theo mức 150, 600 3000 µmol/l (tương ứng 0.013, 0.05 0.255 g/l) có giảm đáng kể hàm lượng C16:0, C16:1, C18:1 tăng hàm lượng C20:5 Nannochloropsis sp Thành phần acid béo trường hợp sử dụng 150 µmol/l NaNO3 phù hợp cho việc sản suất biodiesel so với hai mức nồng độ lại Tuy nhiên, kết Attilio cộng (2009) lại có phần trái ngược Khi tăng lượng nitơ lại làm tăng hàm lượng C16:0, C18:0, C18:1 giảm hàm lượng C18:2 Tuy nhiên, trường hợp nồng độ NaNO3 mà tác giả dùng (0.075, 0.15 0.3 g/l), lượng C16:0 chiếm tỉ lệ cao (tương ứng 52, 53 62 % tổng số FAME) Trong kết bảng 4.7, hàm lượng C18:1 cao khơng có EPA (C20:5) tạo điều kiện thuận lợi cho việc sản xuất biodiesel từ lipid thu Nhưng thay cho thành phần mong muốn C16:1 thành phần C16:0 chiếm đến 27.2% tổng khối lượng acid béo Hàm lượng EPA thấp làm tránh cho biodiesel bị oxy hóa hàm lượng acid palmitic (C16:0) cao làm tăng điểm đông đặc biodiesel -70- CHƢƠNG 5: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 5.1 Kết luận Nannochloropsis oculata lồi vi tảo có tiềm cao việc ứng dụng để sản xuất lipid nhằm nhiều mục tiêu khác nhau, có mục tiêu sản xuất biodiesel Bởi lẽ lồi vi tảo có khả sinh sản nhanh nên tạo lượng lớn lipid so với loài vi tảo khác thời gian nuôi cấy Kết cơng trình thu lượng lipid thơ đạt 77 mg/l 12 ngày Tuy Nannochloropsis oculata loài vi tảo nước mặn việc ni cấy hồn tồn thực vùng khơng có biển cách sử dụng muối hột, kết hợp bổ sung khống magie để làm mơi trường ni cấy Tỉ lệ kết hợp tối ưu 38 g/l muối hột g/l MgSO4 DAP cho thấy không phù hợp với mục đích nồng độ cao dễ tạo kết tủa với môi trường nuôi cấy nồng độ thấp lại không cho hiệu cao Ure nguồn dinh dưỡng nitơ thay cho NaNO3 nâng cao qui mô sản xuất giá thành rẻ mà tạo hiệu gần tương đương Nồng độ ure 0.05 g/l tối ưu cho việc tạo lượng lipid cao Trong điều kiện thí nghiệm, phương pháp xử lý: pH ban đầu 9.2, sục khơng khí qua đêm trước cấy giống, chiếu sáng liên tục 9000 lux đèn huỳnh quang, cho thấy có hiệu so với phương pháp khác Bước đầu thử nghiệm ni cấy NaHCO3 thay cho sục khí sử dụng ánh tự nhiên thay cho chiếu đèn cho thấy khơng có hiệu việc làm tăng lượng lipid thô từ Nannochloropsis oculata Kết hợp g/l NaHCO3 chiếu sáng tự nhiên thu 25 ± 1.5 mg/l lipid thô -716 Thành phần acid béo lipid thu nuôi vi tảo điều kiện tối ưu nêu có chứa 39.4 % C18:1, 27.2% C 16:0 24.8% C18:2 tổng khối lượng acid béo 5.2 Kiến nghị Cần tiến hành nghiên cứu thêm ảnh hưởng chế độ chiếu sáng sử dụng đèn công suất lớn để tạo cường độ chiếu sáng cao ổn định, nghiên cứu ảnh hưởng chất (màu sắc) ánh sáng đến sinh trưởng tích lũy lipid vi tảo Nannochloropsis oculata Tối ưu hóa q trình quy hoạch thực nghiệm thử nghiệm quy mô bioreactor để kiểm sốt thơng số nhiệt độ, pH, tốc độ sục khí…hoặc tiến hành ni liên tục Nghiên cứu tái sử dụng lại môi trường nuôi cấy sau thu hoạch sinh khối vi tảo để tiết kiệm lượng nước dùng để pha mơi trường Tìm kiếm phương pháp ni cấy thay nhằm giảm thiểu tiêu tốn lượng cho khâu ni cấy, góp phần hạ giá thành biodiesel từ vi tảo -72- TÀI LIỆU THAM KHẢO Tài liệu nƣớc: Trần Cơng Bình, Dương Thị Hồng Oanh, Quách Thế Vinh, Trần Thị Kiều Trang, Trương Trọng Nghĩa (2006) Nuôi luân trùng (Brachionus plicatilis) thâm canh hệ thống tuần hoàn kết hợp với bể nước xanh Tạp chí Nghiên cứu Khoa học 2006, trang 102-112 Nguyễn Thị Thùy Dương, Nguyễn Đức Lượng (2009) Breaking the Spirulina platensis cells by enzymes Kỷ yếu Hội nghị Khoa Học Công Nghệ lần thứ 11, Trường Đại học Bách Khoa –Đại học Quốc Gia Tp HCM, trang 50-52 Huỳnh Thị Ngọc Như (2010) Bước đầu khảo sát ảnh hưởng chất điều hòa sinh trưởng thực vật đến tăng trưởng vi tảo Thalassiosira sp Luận văn thạc sĩ chuyên ngành Sinh Học Thực Nghiệm – Trường Đại học Khoa Học Tự Nhiên – Đại học Quốc Gia Thành phố Hồ Chí Minh Nguyễn Tiến Thắng, Nguyễn Đình Hun (1998) Giáo trình sinh hóa đại Nhà xuất Giáo Dục, Tp Hồ Chí Minh 488 trang Vũ Bội Tuyển (1979) Kỹ thuật sản xuất muối khoáng từ nước biển Nhà xuất Khoa Học & Kỹ Thuật Tài liệu nƣớc ngoài: Alessandra R., Adele M., Silvia A., Nicola T., Paolo M (2004) Fatty acid composition of different microalgae strains (Nannochloropsis sp., Nannochloropsis oculata (Droop) Hibberd, Nannochloris atomus Butcher and Isochrysis sp.) according to the culture phase and the carbon dioxide concentration Journal of The World Aquaculture Society, 35:401-411 Anita N.G., Cheng J.Y (1982) The keto-carotenoids of two marine coccoid members of the Eustigmatophyceae British Phycological Journal, 17:39-50 -738 Anne-Catherine V., Jean-Claude M (1993) Fatty acid from 28 marine microalgae Phytochemistry, 34: 1521-1533 Antia N.J., Bisalputra T., Cheng J.Y, Kalley J.P (1975) Pigment and cytological evidence for reclassification of Nannochloris oculata and Monallantis salina in the Eustigmatophyceae Journal of Phycology, 11: 339-343 10 Arief W., Chao-Chang C., Yi-Hsu J (2009) Study of increasing lipid production from freshwater microalgae Chlorella vulgaris Journal of the Taiwan Institute of Chemical Engineers, 40:13–20 11 Aslan S., Kapdan I K (2006) Batch kinetics of nitrogen and phosphorus removal from synthetic waste water by algae Ecological Engineering, 28: 64–70 12 Attilio C., Alessandro A C., Erika Y O., Patrizia P., Marco D B (2009) Effect of temperature and nitrogen concentration on the growth and lipid content of Nannochloropsis oculata and Chlorella vulgaris for biodiesel production Chemical Engineering and Processing: Process Intensification, 48:1146-1151 13 Bozbas K (2008) Biodiesel as an alternative motorfuel: production and policies in the European Union Renewable and Sustainable Energy Reviews,12: 542–52 14 Brown M.R (1991) The amino acid and sugar composition of 16 species of microalgae used in mariculture Journal of Experimental Marine Biology and Ecology, 145:79-99 15 Carvalho J C M., Fernando R F., Kleber A A., Sato S., Attilio C (2004) Cultivation of Arthrospira (Spirulina) platensis (cyanophyceae) by fed-batch addition of ammonium chloride at exponentially increasing feeding rates Journal of Phycology, 40: 589-597 16 Chan Y., So-Young J., Jae-Yon L., Chi-Yong A., Hee-Mock O (2010) Selection of microalgae for lipid production under high levels carbon dioxide Bioresource Technology, 101:S71-S74 17 Cheng-Wu Z, Zmora O, Kopel R, Richmond A, (2001) An industrialsize flat plate glass reactor for mass production of Nannochloropsis sp (Eustigmatophyceae) Aquaculture , 195:35–49 18 Chih-Hung H., Wen-Teng W (2009) Cultivation of microalgae for oil production with a cultivation strategy of urea limitation Bioresource Technology,100:3921–3926 -7419 Chiu S.Y., Kao C.Y., Tsai M.T., Ong S.C., Chen C.H., Lin C.S (2009) Lipid accumulation and CO2 utilization of Nannochloropsis oculata in response to CO2 aeration Bioresource Technology, 100:833-838 20 Danesi E D G., Rangel-Yagui C O., Carvalho J C M and Sato S (2002) An investigation of effect of replacing nitrate by urea in the growth and production of chlorophyll by Spirulina platensis Biomass and Bioenergy, 23:261-269 21 Flynn K J , Davidson K and Leftley J W (1993) Carbon-nitrogen relations during batch growth of Nannochloropsis oculata (Eustigmatophyceae) under alternating light and dark Journal of Applied Phycology,5:465-475 22 Gerhard K (2008) “Designer” Biodiesel: Optimizing Fatty Ester Composition To Improve Fuel Properties Energy and Fuels, 22:13581364 23 Golueke C.G., Oswald W.J (1965) Harvesting and processing sewage grown planktonic algae Journal Water Pollution Control Federation, 37:471– 98 24 Grima E.M., Belarbi E.H., Fernández F.G.A., Medina A.R., Chisti Y (2003) Recovery of microalgal biomass and metabolites: process options and economics Biotechnology Advances, 20:491-515 25 Guan H H., Feng C., Dong W., XueWu Z., Gu C (2009a) Biodiesel production by microalgal biotechnology Applied Energy, 87:38-46 26 Guan H H., Gu C and Feng C (2009b) Rapid screening method for lipid production in alga based on Nile red fluorescence Biomass and Bioenergy, 33:1386-1392 27 Guillard R R L., Ryther J.H (1962) Studies of marine planktonic diatoms, I Cyclotella nana (Hustedt) and Detonula confervacea (Cleve) Canadian Journal of Microbiology, 8: 229-239 28 Guillard R.R.L (1975) Culture of phytoplankton for feeding marine invertebrates, in: W.L Smith, M.H Chanley (Eds.), Culture of Marine Invertebrate Animals, Plenum Press, New York, 1975, pp 26–60 29 Hanhua H., Kunshan G (2006) Response of growth and fatty acid compositions of Nannochloropsis sp to invironmental factors under elevated CO2 concentration Biotechnology Letter, 28: 987 – 992 -7530 Hibberd D.J (1980) Notes on the taxonomy and nomenclature of the algal classes Eustigmatophyceae and Tribophyceae (synonym Xanthophyceae) Botanical Journal of the Linnean Society, 82: 93-119 31 Jae-Yon L., Chan Y., So-Young J., Chi-Yong Ahn, Hee-Mock Oh (2009) Comparison of several methods for effective lipid extraction from microalgae Bioresource Technology, 101:S75-S77 32 Karen P F., Marvin W F (2007) Observations on the Diversity and Ecology of Freshwater Nannochloropsis (Eustigmatophyceae), with Descriptions of New Taxa Protist, 158: 325-336 33 Karlson B., Potter D., Kuylenstierna M., Anderson RA (1996) Ultrastucture pigment composition and 18s rRNA gene sequence for Nannochloropsis granulata sp nov (Monodopsidaceae, Eustigmastophyceae), a marine ultraplankton isolated from the Skagerrak, North East Atlantic Ocean Phycologia, 35:253-262 34 Liliana R., Graziella C Z (2008) Microalgae for Oil: Strain Selection, Induction of Lipid Synthesis and Outdoor Mass Cultivation in a LowCost Photobioreactor Biotechnology and bioengineering, 102:100-112 35 Luisa G (2011) Microalgae as a Feedstock for Biofuels SpringerBriefs in Microbiology, 1-69 36 Michael T A., Michael T B., Martin J K., (2009) Lipids in Aquatic Ecosystems, Springer Science Business Media 37 Miri K., Moshe C., Ami B.A., Aharon G (2010) Bio-diesel production directly from the microalgae biomass of Nannochloropsis by microwave and ultrasound radiation Bioresource Technology 102:4265–4269 38 Natalia V Z and Nina A A (1995) Fatty acid composition of 15 species of marine microalgae Phytochemistry, 39:351- 356 39 Naumann E (1921) Notizen sur Systematik der Süsswasseralgen Arkiv for Botanik, 16:1-19 40 Ning Z and Amos R (1999) Effect of light-path length in outdoor flat plate reactors on output rate of cell mass and of EPA in Nannochloropsis sp Journal of Biotechnology, 70:351-356 41 Pauline S., Claire J., Elie D., Arsène I (2006) Optimization of Nannochloropsis culata growth using the response surface method Journal of Chemical Technology and Biotechnology, 81: 1049–1056 -7642 Qiang L., Wei D and Dehua L (2008) Perspectives of microbial oils for biodiesel production Applied Microbiology and Biotechnology, 80:749756 43 Qin J G (2010) Lipid-Containing Secondary Metabolites from Algae, School of Biological Sciences, Flinders University, Adelaide, SA, Australia 44 Ranjan A., Patil C., Moholkar V.S (2010) Mechanistic Assessment of Microalgal Lipid Extraction Industrial & engineering chemistry research, 49:2979-2985 45 Reimund G and Christian W., (2009) Lipids in Algae, Lichens and Mosses, Lipids in Photosynthesis: Essential and Regulatory Functions, 117–135, 46 Reinhardt G., Rettenmaier N., Koppen S (2008) How sustainable are biofuels for transportation? Bioenergy: challenges and opportunities International conference and exhibition on bioenergy 47 Renaud S M., Luong-Van Thinh, George L., David L P (2001) Effect of temperature on growth, chemical composition and fatty acid composition of tropical Australian microalgae grown in batch cultures Aquaculture , 211:195–214 48 Renaud S M., Parry D L , Luong-Van Thinh, Kuo C , Padovan A and Sammy N (1991) Effect of light intensity on the proximate biochemical and fatty acid composition of Isochrysis sp and Nannochloropsis oculata for use in tropical aquaculture Biomedical and Life Sciences Journal of Applied Phycology, 3:143-53 49 Renaud S.M., Thinh L.V., Lambrinidis G., Parry D.L (2002) Effect of temperature on growth, chemical composition and fatty acid composition of tropical Australian microalgae grown in batch cultures Aquaculture, 211: 195–214 50 Renaud S.M., Zhou H.C., Parry D.L., Thinh L.V., Woo K.C (1995) Effect of temperature on the growth, total lipid content and fatty acid composition of recently isolated tropical microalgae Isochrysis sp., Nitzschia closterium, Nitzschia paleacea, and commercial species Isochrysis sp., (cloneT.ISO) Journal of Applied Phycology, 7: 595–602 51 Robert A A., Robyn W B., Daniel P., and Julianne P S (1998) Phylogeny of the Eustigmatophyceae Based upon 18S rDNA, with Emphasis on Nannochloropsis Protist,149:61-74 -7752 Salim S., Bosma R., Vermue M.H., Wijffels R.H., (2010) Harvesting of microalgae by bio-flocculation Journal of Applied Phycology, DOI 10.1007/s10811-010-9591-x 53 Sato N., Tsuzuki M., Kawaguchi A (2003) Glycerolipid synthesis in Chlorella kessleri 11h II Effect of CO2 concentration during growth Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Molecular and Cell Biology of Lipids, 1633:35–42 54 Schenk P.M., Thomas H.S.R., Stephens E., Marx U., Mussgnug J.H., Posten C., Kruse O., Hankamer B (2008) Second generation biofuels: high-efficiency microalgae for biodiesel production Bioenergy Resource,1:20–43 55 Silverberg B.A., Stokes PM., Ferstenberg LB., (1976) Intranuclear Complexes in a Cooper-Tolerant Green Alga J Cell Biol., 69:210-214 56 Soletto D., Binaghi L., Lodi A., Carvalho J.C.M and Converti A (2004) Batch and fed-batch cultivations of Spirulina platensis using ammonium sulphate and urea as nitrogen sources Aquaculture, 243:4217-224 57 Sorensen B H., Nyholm N., and Baun A (1996) Algal Toxicity Tests with Volatile and Hazardous Compounds in Air-Tight Test Flasks with CO2 Enriched Headspace Chemosphere, 32 : 1513-1526 58 Sukenik A., Bilanovic D and Shelef G (1988) Flocculation of Microalgae in Brackish and Sea Waters Biomass 15:187-199 59 Sukenik A., Carmeli Y (1989) Regulation of fatty acid composition by irradiance level in the Eutigmatophyte Nannochloropsis sp Journal of Phycology,25: 686-692 60 Tatsuzawa, H , Takizawa , E , Wada , M , and Yamamoto Y (1996) Fatty acid and lipid composition of the acidophilic green alga Chlamydomonas sp J Phycol, 32 : 598 – 601 61 Teresa M.M., António A.M., Nidia S., (2009) Caetano, Microalgae for biodiesel production and other application: A review Renewable and Sustainable Energy Reviews, 14:217-232 62 Thi Thai Yen Doan, Balasubramanian S., Jeffrey P O (2011) Screening of marine microalgae for biodiesel feedstock Biomass and bioenergy, 35 2534-2544 63 Udum E.S., Tuncer M., Seker E., (2009) Transesterification of Nannochloropsis oculata microalga’s lipid to biodiesel on Al2O3 -78supported CaO and MgO catalysts Bioresource Technology, 100:28282831 64 Valtere E., Laura B., Paolo G., Anna M F., V P., (2007) Effect and Detection Algal Toxins: Nature, Occurrence, NATO Science for Peace and Security Series: Chemistry and Biology, 978-1-4020-8480 -5 P.O Box 17, 3300 AA Dordrecht, The Netherlands 65 Volkman J K , Jeffrey S W , Nichols P D., Rogers G I and C D.Garland (1989) Fatty acid and lipid composition of 10 species of microalgae used in mariculture Journal of Experimental Marine Biology and Ecology, 128: 219-240 66 Volkman J.K., Brown M.R., Dunston G.A., Jeffre S.W (1993) The biochemical composition of marine microalgae from the class Eustigmatophyceae Journal ò phycology., 29:69-78 67 Whittle S., Casselton P., (1975) The chloroplast pigments of the algal class Eustigmatophyceae and Xanthophyceae I Eustigmatophyceae British Phycology Journal, 10:179-191 68 Yuesong L., Shuang L., Dongmei T., Ruili S., Wenyan Y., Yong F., Renwei Q., Changwei H (2011) One-step production of biodiesel from Nannochloropsis sp on solid base Mg–Zr catalyst Applied Energy 88:3313–3317 69 Yusuf C (2007) Biodiesel from microalgae Biotechnology Advances 25 : 294–306 70 Zittelli G C., Lavista F., Bastianini A., Rodolfi L., Vincenzini M., Tredici M.R (1999) Production of eicosapentaenoic acid by Nannochloropsis sp cultures in outdoor tubular photobioreactors Journal of Biotechnology, 70: 299–312 Tài liệu internet: 71 http://www.baobinhdinh.com.vn/suckhoe-doisong/2011/4/107907/ -79- PHỤ LỤC Bảng kết khảo sát ảnh hưởng chế độ chiếu sáng đến lượng sinh khối khô, khối lượng lipid thô hàm lượng lipid N oculata ngày nuôi thứ 12 Kết Sinh khối khô Cường độ chiếu sáng 6000 lux 9000 lux Chu kỳ chiếu sáng (số sáng/số tối 12/12 16/8 20/4 24/0 0.1532 0.1774 0.2699 0.3656 0.2505 0.2697 0.2974 0.4064 Khối lượng lipid thô thu (mg/l) 6000 lux 9000 lux 14.00621 22.11109 33.4385 33.5734 44.6223 58.556 58.8813 76.5665 Hàm lượng lipid % 6000 lux 9000 lux 9.14428 8.86464 15.5818 12.5591 16.7409 19.7011 16.1060 19.0019 -80- Môi trường F/2 NaNO3 (75.0 g/l H2O cất) 1.0 ml NaH2PO4·H2O (5.0 g/l H2O cất) 1.0 ml Na2SiO3·9H2O (30.0 g/l H2O cất) (*) 1.0 ml Dung dịch khoáng F2 1.0 ml Dung dịch vitamin F2 0.5 ml Nước biển Đến 1.0 l (*) Na2SiO3 dùng cho môi trường nuôi cấy tảo cát (Diatom) Dung dịch khoáng F2 FeCl3·6H2O Na2EDTA·2H2O CuSO4·5H2O (9.8 g/l H2O cất) Na2MoO4·2H2O (6.3 g/l H2O cất) ZnSO4·7H2O (22.0 g/l H2O cất) CoCl2·6H2O (10.0 g/l H2O cât) MnCl2·4H2O (180.0 g/l H2O cất) Nước cất 3.15 g 4.36 g 1.0 ml 1.0 ml 1.0 ml 1.0 ml 1.0 ml Đến 1l Dung dịch vitamin F2 Vitamin B12 (1.0 g/l H2O cất) Biotin (0.1 g/l H2O cất) Thiamine HCl Nước cất ml 10 ml 200 mg Đến l ... 2.1 Vi tảo ứng dụng vi tảo 2.1.1 Vi tảo sinh giới phân loại vi tảo 2.1.2 Sự sinh sản sinh dưỡng vi tảo 2.1.3 Các ứng dụng phổ biến vi tảo 2.2 Lipid vi tảo. .. xuất sinh khối vi tảo 2.3.2 Nghiên cứu nước ngồi Có nhiều nghiên cứu nước ngồi có liên quan đến vi? ??c ni vi tảo thu nhận lipid Các nghiên cứu tập trung vào mục tiêu chính:  Tuyển chọn giống vi tảo. .. 2011  Nghiên cứu ảnh hưởng yếu tố môi trường điều kiện nuôi cấy đến sinh trưởng, hàm lượng lipid thành phần lipid vi tảo kết hợp với thiết kế thử nghiệm nuôi vi tảo photobioreactor quy mô lớn