Nếu ch dựa vào đặc điểm lâm sàng và kết quả huyết học, điện di huyết sắc tố ta cũng có thể chẩn đoán được bệnh a Thalassemia tuy nhiên, nếu như vậy sẽ không thể sàng ỉọc được những người[r]
(1)TÀ I LIỆU THAM KHẢO
1 Chadha, R., Gupta, s., and Pathak, N Artesunateloaded chitosan/lecithin nanoparticles: Preparation, characterization, and in vivo studies Drug Development and Industrial Pharmacy, 38,15381546 (2012)
2 Efferth, T Willmar Schwabe Award 2006: antiplasmodial and antitumor activity of artemisininfrom bench to bedside Planta medica, 73,299309 (2007)
3 Gabriels, M., and PlaizierVercammen, J Physical and chemical evaluation of liposomes, containing artesunate Journal of pharmaceutical and biomedical analysis, 31, 655667 (2003)
4 Kumari, A., Yadav, s K., and Yadav, s c Biodegradable polymeric nanoparticles based drug delivery systems Colloids and Surfaces B: Biointerfaces, 75,118 (2010)
5 Pradhan, R, Poudel, B K., Ramasamy, T., Choi, H.G., Yong, c s., and Kim, J o DocetaxelLoaded Poiylactic AcidCoGlycolic Acid Nanoparticles: Formulation, Physicochemical Characterization and Cytotoxicity Studies Journal of Nanoscience and Nanotechnology, 13, 59485956 (2013)
6 Woerdenbag, H J, Moskal, T A., Pras, N., Malingré, T M, EiFeraiy? F s., Kampinga, H H., and Konings, A
w Cytotoxicity of artemisininrelated endoperoxides to Ehrlich ascites tumor cells Journal of natural products, 56, 849856 (1993)
7 Xiao, X.C, and Hong, Z.G Firstborn microcrystallization method to prepare nanocapsules containing artesunate Internationa journal of nanomedicine, 5,483 (2010)
8 Xu, Q., Li, Z.X., Peng, H.Q., Sun, Z.W, Cheng, R.L., Ye, Z.M., and Li, W.“X Artesunate inhibits growth and induces apoptosis in human osteosarcoma HOS cell line in vitro and in vivo Journal of Zhejiang University SCIENCE B, 12,247255 (2011)
PHÁT HIỆN ĐỘT BIỂN GEN GÂY BỆNH
a THALASSEMIA BẰNG KỸ THUẬT MULTIPLEX-PCR ThS B ài Thị M inh Phượng* Hướng dẫn: GS.TS Tạ Thành Vãn** TÓM T T
a Thalassmia bệnh di truyền gen lặn nằm NST 16, bệnh nhân mắc bệnh nạy gánh nặng cho thân, gia đinh, xã hội Hiện nay, tỷ lệ mắc bệnh tương đối cao chi phí cho điều trị bệnh ỉớn Xuất phái từ vấn đề đó, chúng tơi nghiên cứu đề tài nhằm phát gen gây đột biến bệnh để có biện pháp tư vấn di truyền trước hôn nhân nhằm giảm tỷ lệ mắc bệnh
Đối tuợng phương pháp nghiên cửu: Nghiên cứu 33 bệnh nhân chẩn 'đoán bị a Thalassmia Mục tiêu: Phát gen đột biến gây bệnh a Thalassmia
Kết quả: Đột biến SEA chiếm tỷ lệ cao 54,7% Điều cho thấy Việt Nam đột biến SEA chiếm chu yếu Đột biến a 4.2 chiếm tỷ lệ cao thứ Đột biến a 3.7 chiếm tỷ ỉệ 16,7% Không t m thấy đột biến THAI, đột biến FIL
Kết luận: Đây kỹ thuật hữu ích cho việc phát sớm gen gây đột biến có hướng tư vấn di truyền trước nhân * Từ khóa: Đột biến gen; a Thalassmia
D t ction o f dis as -causing g n m utatons in a thalass m ia b y m ultipl x p r t chniqu Summary
a Thalassmia recessive genetic disease is located on chromosome 16, patients suffering from such a disease are a burden to themselves, their families, and society The morbidity is now relatively high and the expense for this tteatment is quite much Originating from that problem, we conducted this study aimed to detect diseasecausing gene mutations to propose genetic counseling measures before marriage, therefore, the incidence of disease can be reduced
(2)Subjects and methods: 33 patients diagnosed with a Thalassmia Objective: To detect the diseasecausing gene mutation a Thalassmia
Results: Mutation SEA accounts for highest percentage (54.7%) This shows that in Vietnam mutations SEA dominated Mutations a 4.2 comes the second, a 3.7 occupies 16.7% No mutation THAI and FEL was found
Conclusion: This is a useful technique in early detection ofgene mutations towards genetic counseling before marriage * Key words: Gene mutation; a thalassmia
▼ 7nnIT f It n>ir* í IIA T VANtJO j
a Thalassemia bệnh di truyền lặn nhiễm sắc thể (NST) thường đo đột biến gen aglobin nằm cánh ngắn NST số 16 (16pl3.3) quy định, gây giảm khả tổng hợp chuỗi aglobin Đây ỉà bệnh huyết sắc tố phổ biến toàn giới nguyên nhân hàng đầu (chiếm tới 6090% nguyên nhân) gây phù thai nước Đông Nam Á Tại Việt Nam, tỷ lệ người mang gen bệnh phân bố nước khác tùy địa phương, nhóm dân tộc Trong đó, tỷ lệ người mang gen đột biến đoạn lớn dạng SEA (Đông Nam Á) cao (tỷ lệ 90 95%), Bắc Thái Lan 14%, Nam Trung Quốc 5,0 8.8%, Hồng Kông Ịà 4,5%, Trung tâm Thái Lah ỉà 3,7% dạng Bắc Đài Loan 3,5%
Hầu hết trẻ bị bệnh có biểu hiện: thiếu máu nhược sắc, đa xanh, lách to, mệt mỏi chậm chạp, xương ph đại dễ gãy, hay mắc bệnh nhiễm trùng, suy tim khó thở, bất thường gan, mật Trẻ mắc bệnh thường chết sớm v suy tim nhiễm trùng nặng
Sự phát triển kỹ thuật sinh học phân tử cho phép phát đột biến hiểu biết rõ sinh lý bệnh a Thalassemia phục vụ tư vấn di truyền trước sinh
Xuất phát từ thực tế đó, chúng tơi tiến hành nghiên cứu đề tài nhằm: Xác định đột biển g n a globin bệnh nhân a Thalass mia
Nhận xét đặc điểm lâm sàng cận lâm sàng bệnh nhân a Thalass mia
II ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHI N c ứ u
2.1 Đối tượng nghiền cứu
Chọn 33 bệnh nhân chẩn đốn a Thalassemia 2.2 Thịi gian địa điểm nghiên cứu
" Thòi gian nghiên cứu: Từ tháng 12 2012 đến 2013
Địa điểm nghiên cứu: Trung tâm Nghiên cứu Gen Protein Trường Đại học Y Hà Nội 2.3 Phutmg pháp nghiên cứu
Sử dụng kỹ thuật m ultiplex PCR vào tr nh phát đột biến gen phổ biến gây bệnh a Thalassem ia Việt Nam (SEA, THAI, FIL, 0,3.7, a4.2)
- Phương pháp phân tích bệnh chứng 2.4 Kỹ thuật nghiên cứu
2.4.1 Tách chietADN
ADN tách chiết từ tế bào bạch cầu máu ngoại vi phương pháp phenol/chlorofor 2.4.2 Thiết kể mồl cho multiplex PCR
(3)THAIF FILF SEAF 4.2F a2/3,7Fa2R 4.2R 3.7R FÍLR THAiR SEAR
IZHVR I T | a r j
j Ì gE» L a 42 frj
.SEA
—FIL
THAI
3*J*VR
H nh Sơ đồ tổ hợp gen a globin vị trí mồi xác định đột biến [70]
Cặp mồi để xác định đột biến phải dài đoạn gen bị đột biến nằm vị trí đoạn gen đột bién: Đột biến a3.7 gen<Xjvà a2th cặp mồi Ct3.7 phải nằm vị trí gen cti vàct2
2.4.3 C huẩn hóa quy tr n h m ultiplex PC R Bảng Thành phần phản ứng PCR
Thành phần Thể tích (M) Nồng độ
Nước cất lần
Master Mix Qiagen Mutiplex Taq 2X
DNA 25 ng/3 |il
DMSO
LIS1 xuôi 0,5 1,5 pmolẠđ
LIS1 ngược 0,5 1,5 pmol/ịil
cc2/a3.7 xuôi pmol/Ịil
a3.7 ngược 0,5 1,5 pmol/ịil
a2 ngược 0,5 1,5 pmolẠil
Mồi Ct4.2 xuôi 0,5 1,5 pmol/ịil
(10 pmolẠil) a4.2 ngược 0,5 1,5 pmol/Ịil
SEA xuôi 0,5 1,5 pmol/fxl
SEA ngược 0,5 1,5 pmol/ịil
Thai xuôi 0,5 1,5 pmol/ịil
Thai ngược 0,5 l,5pmolẠil
Fil xuôi 0,5 1,5 pmol/^il
Fil ngược 0,5 1,5 pmol/ịil
Ỉ8 Phản ứng multiplex PCR chạy với chu tr nh nhiệt sau: 95°C: 15 phút
95°C: 40 giây 65°C: 90 giây 72°C: phút 30 giấy 72°C: phút 15°C: 00
(4)na KẾT QƯẢ
3.1 Kễt bệnh nhân
1 MK : 9 10
H nh H nh ảnh điện di bệnh nhân
M lkb, () chứng âm người b nh thường, sản phẩm bệnh nhân từ aOl đến aio
■a i đ n sh ợ p tử 0.1dị hợp tử :H bH
iC hua phát hiện
Biểu đồ Tỷ lệ thể bệnh a Thalassemia
■SEA oe4.2
II 3.7
l i i W
(5)rv BÀNLUẶN
Các kết multiplex PCR
Mau nghiên cứu thể HbH thể Thalassemia v tất bệnh nhân t nh trạng thiếu máu nặng, thiếu màu vừa số xét nghiệm giảm, kết điện di huyết sắc tố HbAị < 97%, HbA2< 3.%, có HbH thể HbH phát gen đột biến tương ứng với đặc điểm cùa bệnh
Đột biến SEA chiếm tỷ lệ cao (54,7%) tương ứng nghiên cứu Lý Thị Thanh Hà vàcs 58,8% Tuy nhiên, két khác biệt với nghiên cứu Malaysia (0,5%) Trung Quốc (1,36%) Điều cho thấy Việt Nam đột biến SEA chiếm chủ yếu
Đột biến a 4.2 chiếm tỷ lệ cao thứ 2: 28,6%, có khác biệt so với nghiên cứu Lý Thị Thanh Hà (5,9%), Malaysia (0,25%), Trung Quốc (1,36%)
Đột biến a 3.7 chiếm tỳ lệ Ỉ6,7% tương đối cao hon so với nghiên cứu Lý Thị Thanh Hà 0%, Malaysia (8%), Trang Quốc (2,7%)
Chưa t m thấy đột bién THAI, FIL bệnh nhân nghiên cứu Kết tương đương với kết Lý Thị Thanh Hà Điều chứng tỏ đột biến Thai đột biến FĨL chưa phát thấy Việt Nam Hai loại đột biến thường có tộc người Thái Lan Philipphin
Ngoài loại đột biến nghiên cứu Lý Thị Thanh Hà phát thêm loại đột biến điểm HbQs HbCs Tuy nhiên, nghiên cứu chưa t m loại đột biến V thời gian nghiên cứu có hạn nên chúng tơi tiếp tục nghiên cứu để t m thêm loại đột biến khác
Từ kết thu được, rút số kết luận sau
ứ ng dụng ỉhành công quy tr nh phát gen đột biến gây bệnh a Thalassemia số bệnh nhân mắc bệnh a Thalassemia: SEA (54,7%), a4.2 (28,6%), a3.7 (16,7%)
Tim số yếu tố liên quan với bệnh a Thalassemia
Ở bệnh nhân a Thalassemia có biến đổi máu tủy xương bệnh Thalassemia nói chung: thiếu máu nhược sắc, hồng cầu nhỏ, kích thước khơng đều, thay đổi h nh dáng hồng cầu
về biến đổi thành phần Hb bệnh nhân a Thalassemia nói chung bệnh nhân thể HbH nói riêng mang tính chất đặc hiệu Tất bệnh nhân có điện di huyết sắc tố có tỷ lệ HbH ỉàm PCR cho kết xác bệnh nhân HbH
Nếu ch dựa vào đặc điểm lâm sàng kết huyết học, điện di huyết sắc tố ta chẩn đốn bệnh a Thalassemia nhiên, sàng ỉọc người lành mang gen bệnh để có tư vấn di truyền giúp cho hệ sau không sinh đứa bị bệnh, c ần có nghiên cửu sâu để phát thêm đột biến khác pháthiệnnhững người lành mang gen bệnh cộng đồng
VI KIẾN NGHỊ
Do giới hạn khuôn khổ luận văn, thời gian kinh phí cịn hạn chế, chúng tơi thấy cần phải nghiên cứu sâu thêm số khía cạnh như:
Tiếp tục đánh giá khả phát gen đột bién gầy bệnh a Thalassemia người lành mang gen bệnh cộng đồng để tư vấn di truyền trước hôn nhân giải pháp quan trọng nhấ£ việc phịng bệnh từ đó, làm giảm tỷ lệ mắc bệnh a Thalassemia
(6)TÀI LIỆU THAM KHẢO
ỉ Hoàng văn Ngọc Nghiên cứa thực trạng bệnh thalassemia số yếu tố liên quan trẻ em dân tộc Tày Dao huyện Định Hóa tỉnh Thái Nguyên, Luận văn Thạc sỹ Y học 2007
2 Nguyễn Công Khanh Một số đặc điểm lâm sàng huyết học bệnh p Thalassemia người Việt Nam Luận án Phó Tiến sỹ khoa học Y dược, Đại học Y Hà Nội 1985
3 Lý Thị Thanh Hà, Ngô Diễm Ngọc, Nguyễn Thị Phư ng Mai, Nguyễn Tân Sinh, Dư ng Bá Trực, Bùi Văn Viện, Nguyễn Thanh Liêm, ứng dụng kỹ thuật sinh học phân tử chẩn đoán trước sau sinh bệnh alpha Thalassemia Bệnh viên Nhi TW.Tạp chí Nhi khoa, tập 3, số 3,4 tháng 10/2010, tr.337342
4 Chui DH, Way JS Hydrops fetal is caused by aỉphathalassemia: an emerging health care problem Blood.1998, 91, pp.22132222
5 Di ss roth A t al Hemoglobin synthesis in somatic cell hybrid: independent segregation of the human alpha and beta globin gene Science 191,1976, p.1262
6 Potrakul s t al Incidence of a Thalassemia in Bangkok J.Med Assoc, Thailan 1970,53, pp.250
8 Told D.Lai MCS, Braga C.A, ISoo N.H Alpha thalassemia in Chinese cord blood studies Br J.Haematoi 1969, 16, pp.551556
9 Embury S.H t a t Organization of the a globin gen in the chines a thalassemia syndromes J.Clin.Inv sX 1979,63
NGHIÊN c ứ u ỨNG D NG KỸ THUẬT NESTED RT-PCR TRONG CHÂN ĐOÁN NHIỄM RUBELLA TRƯỚC SINH
BS Đặng Tiến Trường*; s v Lê Hòa Yên* s v Nguyễn V ìấ Hiếu* BS Nguyễn Thị Hà* Ht âng dẫn; PGS TS Nguyễn Duy Bắc* T Ó M T Ẳ T
Sốtphátban RubellađovirutRubellagâynên, bệnh thường nhẹ, biến chứng
Tại Việt Nam, chưa có chương tr nh tiêm chủng quốc gia phòng nhiễm Rubella; nhiều thai phụ nhiễm Rubella phài đ nh thai nghén mà không rõ thai nhi có nhiễm Rubella khơng? Việt Nam chưa có phương pháp chẩn đoán trước sinh CRĨ đạt tiêu chí xác, sớm, rè, địi hỏi phương tiện đơn giản V vậy, tiến hành đề tài với mục tiêu:
Hồn thiện quy trìnhphát nhiễm virutRub llabằng kỹ thuậtnestedRT-PCR
- Áp dạng kỹ thuật n st d RT-PCR chẩn đoán nhiễm virut Rub lla trước sình nh m đối tượng cổ nguy c cao
Đổi tượng phương pháp nghiên cún:
60 mẫu bệnh phẩm nhiễm virut Rubella 60 mẫu tác nhân khác gây triệu chứng phát ban 41 thai phụ chẩn đoán nhiễm virut Rubella kỹ thuật huyết học
Phương pháp nghiên cứu: Tách chiết ARN ADN
Tối ưu hóa phản ứng Nested RTPCR: tối ưu hóa thành phần chu tr nh nhiệt phản ứng Sau nhân ADN đích, điện sản phầm ADN agarose gel 2% phân tích kểt
Đánh giá độ xác kỹ thuật: xác định độ nhạy độ đặc hiệu kỹ thuật, chẩn đoán 60 mẫu ARN virutRubella 60 mẫu không nhiễm phải virut Rubella, tính độ nhạyvà độ đặc hiệu
+ Xác định ngưỡng phát kỹ thuật: tiến hành chẩn đoán ưên mẫu ARN pha loăng + Giải tr nh tự sản phẩn phản ứng nested RTPCR để xác định sản phẩm gen virutRubella Áp dụng kỹ thuật nested RTPCR chẩn đoán trước sinh