Phân lập ursolic acid từ vỏ quả táo và tổng hợp một số dẫn xuất báo cáo tổng kết kết quả đề tài khcn cấp trường msđt t kthh 2013 34

ĐẠI HỌC QUỐC GIA TP HCM TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA FOG BÁO CÁO TỔNG KẾT KẾT QUẢ ĐỀ TÀI KHCN CẤP TRƯỜNG Tên đề tài: PHÂN LẬP URSOLIC ACID TỪ VỎ QUẢ TÁO VÀ TỔNG HỢP MỘT SỐ DẪN XUẤT Mã số đề tài: T-KTHH-2013-34 Thời gian thực hiện: 12 tháng Chủ nhiệm đề tài: TS Tống Thanh Danh Cán tham gia đề tài: Ks Trần Thị Nguyệt Viên Thành phố Hồ Chí Minh – Tháng 11/2013 Danh sách cán tham gia thực đề tài (Ghi rõ học hàm, học vị, đơn vị công tác gồm môn, Khoa/Trung tâm) Tiến sỹ Tống Thanh Danh, Bộ mơn Kỹ thuật Hóa hữu cơ, Khoa kỹ thuật hóa học, Trường Đại học Bách Khoa, ĐHQG-HCM Kỹ sư Trần Thị Nguyệt Viên, Bộ môn Kỹ thuật Hóa hữu cơ, Khoa kỹ thuật hóa học, Trường Đại học Bách Khoa, ĐHQG-HCM MỤC LỤC I TỔNG QUAN TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU THUỘC LĨNH VỰC CỦA ĐỀ TÀI 2  II MỤC TIÊU CỦA ĐỀ TÀI 7  III DỰ KIẾN SẢN PHẨM CỦA ĐỀ TÀI THEO ĐĂNG KÝ BAN ĐẦU 7  IV KINH PHÍ THỰC HIỆN ĐỀ TÀI: 7  V BÁO CÁO KẾT QUẢ CỦA ĐỀ TÀI 7  5.1 Nguyên liệu phương pháp nghiên cứu 7  5.2 Thực nghiệm 7  5.3 Kết thảo luận: 9  5.3.2 Thử hoạt tính sinh học 10  VI KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ: 11  VII TÀI LIỆU THAM KHẢO: 12  VIII PHỤ LỤC……………………………………………………………………………… 15 - Phụ lục chuyên môn: phụ lục phổ khối lượng - Phụ lục sản phẩm đào tạo - Phụ lục sản phẩm báo khoa học - Phụ lục hồ sơ quản lý khoa học I Tổng quan tình hình nghiên cứu thuộc lĩnh vực đề tài Ngày bên cạnh phát triển khoa học cơng nghệ ngày xuất nhiều bệnh hiểm nghèo, vai trò dược phẩm đề cao, ngành cơng nghiệp hóa dược góp phần đáng kể vào việc tìm sản phẩm có hoạt tính sinh học mong muốn Trong phải kể đến tầm quan trọng họ terpennoid, họ dược phẩm có tính tất yếu đời sống nay, tác dụng dược lý loại bệnh mà đem lại góp phần giải mầm bệnh mà thể mắc phải Đặc biệt Acid ursolic thuộc họ pentacyclic triterpen acid với dẫn xuất làm tăng cường khả phòng chống nhiều bệnh hữu hiệu như: khối u (ung thư), viêm nhiễm, sưng tấy, tiểu đường… bệnh liên quan tới độc tố tế bào Vì tính dược lý tích cực đó, ngày có nhiều dẫn xuất acid ursolic tổng hợp nghiên cứu hoạt tính sinh học Với cơng trình nghiên cứu đầy cơng phu, để tìm sản phẩm có vai trị q giá tính đặc trị tính hữu hiệu nên thúc đẩy thu hút khơng ngừng tìm tòi nghiên cứu sản phẩm với hoạt tính chế phản ứng thuốc với bệnh phải có hiệu đặc điểm sau: +Do tính đặc trị thuốc với bệnh khơng thể thay đổi hóa chất trị liệu khác + Nguyên nhân kháng thuốc vi sinh vật gây bệnh, nên phải nghiên cứu tìm sản phẩm thay cho sản phẩm thuốc củ yếu dần hoạt tính + Với sản phẩm cho hoạt tính sinh học tương ứng với nồng độ khác Giữ vai trò quan trọng mà dẫn xuất acid ursolic họ triterpenoid mang lại cho công nghiệp dược phẩm họ sản phẩm q giá khơng ngừng thúc đẩy nghiên cứu tìm tịi sản phẩm cải tiến với hoạt tính tốt hơn, nguyên nhân thúc đẩy đề tài triển khai với nội dung: “ phân lập ursolic acid từ vỏ táo tổng hợp số dẫn xuất” Acid Ursolic đồng phân khác triterpenoid acid, họ hợp chất với cấu trúc pentacyclic triterpen acid như: Betulinic acid, Monronic acid, olenanolic acid ursolic acid Do đặc tính cấu trúc nên tác dụng dược lý acid gần giống Tuy nhiên phong phú oleanolic acid ursolic acid nên có hai loại acid nghiên cứu ứng dụng nhiều giới [1], [3], [9], [14], [15], [17], [18], [24], [25] Các hợp chất pentacyclic triterpen acid dẫn xuất acid ngày nghiên cứu nhiều giới với vai trò chủ yếu lĩnh vực dược phẩm, thực phẩm mỹ phẩm Như vai trò ức chế loại tế bào ung thư gan, tử cung, bàng quang, tuyến tiền liệt,… số bệnh ngăn ngừa trị bệnh tiểu đường, cao huyết áp,… Trong mỹ phẩm hoạt chất ngăn ngừa ung thư da, diệt khuẩn, virut, chống lão hóa, chống rụng tóc,….[2], [3], [9], [15], [23], [27], [30], [32], [33], [34], [41] Với nguồn gốc pentacyclic triterpen acid chủ yếu (hình 1.1)được tách chiết nhiều loại thảo dược, thuốc trồng khắp giới Ở nước ta chủ yếu phát số tỉnh phía nam [26] Hình 1.1: cấu trúc số pentacyclic triterpen acid Acid Ursolic hay gọi urson, prunol, micromerol, malol với tên khoa học 3β-3hydroxyurs-12-en-28-oic acid Với ứng dụng rộng lĩnh vực dược phẩm, mỹ phẩm thực phẩm Đặc biệt với dẫn xuất có hiệu mạnh mẽ vai trò kháng khối u (ung thư), trị bệnh tiểu đường, tăng huyết áp, kháng viêm, kháng khuẩn,… đặc biệt chống ung thư da [11-45] Acid ursolic có nguồn gốc từ tự nhiên, có chứa nhiều thực phẩm chay, thảo dược, có nhiều loại Nó có mặt táo, lê, húng quế, nam việt quất, hoa elder , bạc hà , hương thảo, hoa oải hương, rau oregano, thyme, táo gai, mận loại trái khác với phân bố acid ursolic thảo dược mô tả bảng [34] Bảng 1.: Một số loại thảo dược có chứa ursolic acid Common Name Botanical Name Family Holy Basil (Tulsi) Bilberry Lamiaceae Vacciniace Ocimum sanctum L Vaccinum myrtillus L ae Devil's Claw Harpagophytum procumbens DC Elder Flowers (European Sambucus nigra L Variety) Peppermint leaves Mentha piperita L Periwinkle Vinca minor L Pedaliaceae Caprifoliac eae Lamiaceae Apocynace ae Lavender Lavandula augustifolia Lamiaceae Origanum vulgare L Thymus vulgaris L Crataegus laevigata (Poir) DC Prunus laurocerasus L Lamiaceae Lamiaceae Rosaceae Mill Oregano Thyme Hawthorn Cherry laurel leaves Rosaceae Acid ursolic nước ta phát nghiên cứu chủ yếu Hedyotis họ cà phê, với nhiều chi khác nhau, số nghiên cứu tiêu biểu sau: - Phạm Nguyễn Kim Tuyến, Nguyễn Kim Phi Phụng, Phạm Đình Hùng “Góp phần tìm hiểu thành phần hóa học Hoa kim cương Hedyotis Nigricans L., Họ Phần 1-Tổng Quan cà phê (Rubiaceae)” Khoa hóa- Trường Đại Học Khoa Học Tự Nhiên Thành Phố Hồ Chí Minh [24] - Phạm Nguyễn Kim Tuyến, Nguyễn Kim Phi Phụng, Phạm Đình Hùng “Tìm hiểu thành phần hóa học số thuộc chi Hedyotis mọc Việt Nam điều chế số dẫn xuất thioflavon từ flavon cô lập được” Khoa hóa- Trường Đại Học Khoa Học Tự Nhiên Thành Phố Hồ Chí Minh [25] - Phạm Đình Hùng “Nghiên cứu tách chiết, xác định cấu trúc hợp chất có hoạt tính sinh học cao từ thuốc họ cúc, cà phê, ô rô, bứa số họ khác mọc phổ biến miền nam Việt Nam” Khoa hóa- Trường Đại Học Khoa Học Tự Nhiên Thành Phố Hồ Chí Minh [26] Những nghiên cứu cho kết tách chiết hàm lượng lớn hợp chất triterpenoid acid có acid ursolic hàm lượng lớn so với triterpenoid acid khác Bên cạnh cịn cho thấy hoạt tính kháng ung thư số tế bào[34] Một số đặc tính dược lý acid ursolic tìm thấy có giá trị trị liệu tốt Cây thuốc có chứa acid ursolic sử dụng y học dân gian trước biết đến mà hiệu điều trị đem lại hữu hiệu Ngày với tiến khoa học acid ursolic cô lập chứng minh số tác dụng dược lý, chẳng hạn như: chống khối u gan, chống viêm, chống loét, kháng khuẩn, chống máu nhiễm mỡ kháng virus [11-16] Tác dụng acid oleanolic, đồng phân acid ursolic lên gan lần công bố năm 1975 cho thấy thảo dược truyền thống y học hepatitis, sử dụng cho cho nghiên cứu hoạt tính bệnh viêm gan [27] Trong số ba hợp chất cô lập từ thảo mộc này, oleanolic acid có hiệu vai trị bảo vệ chống lại CCl4 nguyên nhân gây tổn thương gan chuột, cụ thể gây phù gan, hoại tử, nhiểm mỡ Bên cạnh acid ursolic acid oleanolic đồng phân triterpenoid acid với cấu trúc pentacyclic triterpen acid nên tính chất đặc tính gần giống hoàn toàn Do acid ursolic xác định thành phần chữa trị bệnh gan nguồn chứa acid ursolic [28-34] Sambucus chinesis Lindl., Solanum incanum L.,Tripterospermum taiwanense bạch đàn lai với vai trò bảo vệ chống lại CCl4 liên quan đến bệnh gan bảo vệ chống lại D-galactosamine nguyên nhân gây tổn thương gan chuột, ngăn ngừa acetaminophen gây ứ mật Trong đó, acid ursolic chí cịn mạnh acid oleanolic làm giảm tổn thương gan gây chuột [14] Ngày với nhiều cơng trình nghiên cứu nhiều khám phá đặc tính acid ursolic, đồng thời tìm nhiều nguồn chứa acid ursolic vỏ cam quýt, bạc hà, hoa elder, oải hương, việt quốc, số họ cà phê [24-26] Ursolic acid xác định thành phần có hiệu Pyiola rotundifolia L việc ngăn ngừa carrageen gây phù nề Paw chuột, acetic acid gây đau quằn quại chuột Trong chế phẩm thuốc từ Rosmarinus officinalis L (Rosemary), acid ursolic thành phần tích cực việc ngăn ngừa 12 otetradecanoylphorbol- 13-acetate (TPA) gây phù tai chuột [37-39] Các chế phản ứng chống viêm oleanolic acid acid ursolic xét đến khía cạnh sau [14]: (1) Sự ức chế histamine từ tế bào mast gây hợp chất 48/80 concanavalin A (2) Sự ức chế hoạt động men lipoxygenase cyclooxygenase, số yếu tố làm giảm viêm sinh acid arachidonic (loại acid béo chưa no) Ví dụ, tổng hợp PGE2 leukotriene B bị ngăn chặn acid oleanolic (3) Ức chế elastase( tính co giản), phép thử IC50, ức chế elastase acid ursolic acid oleanolic giống (4,4 vs 6.4µM) Elastase xem vai trị mơ chi phối bệnh viêm thấp khớp (4) Ức chế hoạt tính bổ sung, thông qua ức chế convertase-C3 Việc sử dụng hợp chất triterpenoid, có acid ursolic, kiến nghị cho việc điều trị ung thư da Nhật Bản [42] Mỹ phẩm chế phẩm có chứa ursolic acid axit oleanolic cấp sáng chế Nhật Bản việc chống ung thư da để sử dụng trực tiếp [43] Chế phẩm dược có chứa acid oleanolic acid ursolic cấp sáng chế cho q trình chữa bệnh bạch cầu khơng bạch huyết [31-33] Acid ursolic có vai trị ngăn chặn phát triển bệnh ung thư thời kỳ phát bệnh, ức chế phát triển tế bào hình thành bệnh [3-8] Ngồi ra, Ya-Ling Hsu et al chứng minh acid ursolic ức chế phát triển tế bào A549 người, tế bào nguyên nhân gây ung thư phổi Tác dụng hiệu chống khối u màng phổi acid ursolic thể rõ có vai trị quan trọng cho trình khỏa sát y học Dựa báo cáo nghiên cứu tác giả khoa học cho thấy với chức acid vị trí C17 chức rượu C3 acid usolic, có vai trị quan trọng q trình ester hóa, với tính linh động hai chức cho hoạt tính dược lý pentacylic triterpenes hiệu Thêm vào với nhóm hydrogen linh động dể cho điện tử C3 C28 có vai trị quan trọng hoạt tính độc tố tế bào [28-33] Ngồi acid ursolic có hoạt tính tế bào ung thư gan, dẫn xuất thể với hiệu cao hơn, với nồng độ thấp [3], [6], [12], [37] Trên tính cấu trúc quan trọng acid ursolic loạt dẫn xuất acid ursolic tổng hợp hoạt tính ức chế loại tế bào ung thư nghiên cứu, với nhiều dẫn xuất khác (hình 1.2) Hình 1.2: Một số dẫn xuất ursolic acid Yan-Qiu Meng đồng [15], [37], cho thấy dẫn xuất từ 4a-7a 9a thể hoạt tính ức chế mạnh nồng độ 10µM tế bào Hela- tế bào rây ung thư tử cung nữ Các dẫn xuất 4b-7b, 9b với OH tự cấu trúc nên thể hoạt tính kháng khối u yếu sản phẩm 4a-7a, 9b, nhiên mạnh acid ursolic Các dẫn xuất 10a-12a thể hoạt tính kháng khối u tăng cường với 10b-12b tế bào Hela-tế bào rây ung thư tử cung nữ, SKOV3-tế bào buồng trứng, BGC-823-tế bào dày Nhưng có ngoại lệ 12b với 12a, hoạt tính 12a thể tốt 12b nhóm anilino 12b (N-[3bacetoxy-urs-12-en-28-oyl]-aniline) khơng có tính chất 12a nhờ có giải phóng điện tử vòng benzen, yếu tố quan trọng ảnh hưởng tới hoạt tính - Tóm lại từ kết nghiên cứu cho thấy nhóm 3-O-acetal 28-amido có ảnh hưởng lớn đến hoạt tính, đồng nghĩa hoạt tính có khác biệt với dẫn xuất khác từ acid ursolic Hoạt tính độc tố tế bào thể tế bào khác tế bào NTUB1 (tế bào gây ung thư bàng quang người) với dẫn xuất nghiên cứu [12] (hình 1.3): Hình 1.3 Các dẫn xuất acid ursolic Các dẫn xuất đáng ý chất 16, 18-22 31-33 thể hoạt tính độc tố tế bào hiệu đặc biệt tế bào NTUB1, với hoạt tính chống phát triển tế bào Tuy nhiên tương ứng loại dẫn xuất acid ursolic tai C17 -COOH với loại dẫn xuất alkyl halide cho hoạt tính khác Dẫn xuất 34, 35 thể hoạt tính độc tố tế bào mạnh mẽ dẫn xuất khác, nguyên nhân dẫn xuất hình thành cấu trúc seco-structure Trong hợp chất hầu hết dẫn xuất cho thấy ý nghĩa hoạt động gây độc tế bào chống lại NTUB1 tế bào Các sản phẩm este hóa C17-COOH 29 với methyl halide 11 30 giảm hoạt tính gây độc tế bào chống lại NTUB1, sản phẩm este hóa 33 35 tăng cường chống lại NTUB1 Độc tố tế bào với sản phẩm ester hóa C17COOH với chuỗi alkyl halogenua tăng dần 14-19, 21 halide prenyl 20 hoạt tính mạnh 22 vai trò chống lại NTUB1 Hydroxyl hóa ethyl ester C17 11 tạo nên 21 hoạt tính chống NTUB1 yếu Acetyl hóa C3-OH tăng cường hoạt tính gây độc tế bào C3-OH sửa đổi để ester succinic chẳng hạn 28, tăng hoạt tính chống lại NTUB1 Tăng chuỗi carbon nhóm tạo nên sản phẩm ester hoạt tính yếu, tăng tính chưa no chuổi hoạt tính thể ngược lại tức tăng dần hoạt tính 26 Các q trình oxy hóa C3-OH (1 12) tạo nhóm keto (29 30) hoạt tính tăng, dẫn xuất lactone tạo từ 29 3,4-seco 31 lactone 33 thu từ 31 có hoạt tính yếu 3,4-seco-24 thu từ 23, cho thấy khả hoạt động ngăn phát triển tế bào sản phẩm ester dimethyl C17 C3 cho thấy hoạt tính ức chế có hiệu lực vào tăng trưởng tế bào mạnh mẽ, thu từ phân cắt vòng A hiển thị mạnh mẽ So sánh tác dụng gây độc tế bào dẫn xuất acid ursolic NTUB1 tế bào PC3 A549 nghiên cứu so sánh hai loại tế bào hoạt tính khơng đạt kết tốt II Mục tiêu đề tài: -Thu nhận thô ursolic acid từ vỏ táo bi đỏ với phương pháp tách chiết dung môi hữu -Tổng hợp dẫn xuất từ ursolic acid phản ứng ester hóa C-3 C-28 ursolic acid, thử hoạt tính dịng ung thư Hela, MCF-7.Nâng cao chất lượng luận văn cao học lực cán nghiên cứu III Dự kiến sản phẩm đề tài theo đăng ký ban đầu - Báo cáo phương pháp thực số liệu kết phân tích - Đăng báo tạp chí chuyên ngành - Đào tạo luận văn thạc sỹ IV Kinh phí thực đề tài: Tổng kinh phí : 30 triệu đồng Trong đó: Nguồn trường: 30 triệu đồng Thuyết minh sử dụng nguồn kinh phí (từ nguồn trường): Khốn chi theo quy định: triệu đồng Khơng khốn chi theo quy định: 23 triệu đồng V Báo cáo kết đề tài 5.1 Nguyên liệu phương pháp nghiên cứu TPHCM Các hóa chất dùng phản ứng mua từ hãng Aldrich-Sigma Sử dụng sắc ký mỏng (TLC) để theo dõi phản ứng, tinh chế sản phẩm sử dụng sắc ký cột Sử dụng phương pháp đo phổ cộng hưởng từ hạt nhân (1HNMR, Bruker 500 MHz) khối phổ (HRMS, micrOTOF-Q) để xác định cấu trúc sản phẩm Mẫu đo phòng phân tích thí nghiệm trường Đại Học Tự Nhiên – ĐHQG 5.2 Thực nghiệm Ursolic acid (3-hydroxy-urs-12-en-28-oic acid, 1) : Táo bi mua rửa sạch, gọt lấy vỏ, để sấy nhiệt độ 80oC tủ sấy 24 Vỏ táo sau sấy khô trở nên sẫm màu, cứng lại Cho toàn vỏ táo sấy vào máy xay cho nhuyễn để sử dụng làm nguyên liệu Cân 120 g nguyên liệu vỏ táo cho vào bình cầu lít Thêm 400 ml 2-propanol ngâm vòng 24 nhiệt độ phòng Sau đó, dùng bình lọc hút để lọc dịch ngâm Phần bã rắn ngâm tiếp với thể tích tương tự 2-propanol làm tương tự thêm lần Gộp tồn dung dịch sau trích ly đem cạn áp suất thấp thu cao khô, đem chạy sắc ký cột thường, sử dụng dung môi giải ly hexan : etyl axetat 9:1 thu sản phẩm UA (1.02g; 0.85%) 1H-NMR (CDCl3; 500MHz) δ: 0.77 (3H, s, -CH3), 0.81 (3H, d, J=6.5 Hz, -CH3), 0.88 (3H, d, J=6, -CH3), 0.93 (3H, s, -CH3), 0.96 (3H, s, -CH3), 0.98 (3H, s, -CH3), 1.09 (3H, s, -CH3), 2.19 (1H, d, J=11 Hz, H-18), 5.26 (1H, t, J=3.5Hz, H -12) HRMS (ESI-MS, m/z) [M-H]+ tính cho C30H47O3: 455.3525, tìm thấy 455.3491 3β-acetoxy-urs-12-en-28-oic acid (2): hòa tan 100 mg (0,2 mmol) UA 10 ml THF, 0,5 ml pyridin, mg DMAP 40 µl anhydride acetic (0,4 mmol) Sau 24 h (TLC), hỗn hợp sau phản ứng chiết với 20 ml nước 20 ml etyl axetat x lần, lớp hữu tách ra, làm khan Na2SO4, lọc đem cô cạn, chạy cột sử dụng hệ dung môi etyl axetat : hexan (2:8) thu (2) (hiệu suất 90% 1H-NMR (500 MHz, CDCl3), δ: 5,2 ( t, 1H, J= 3.5 Hz, H-12), 4,5 (dd, 1H, J= 9,8, 6,2 Hz, H-3, 2,19 (d, 1H, J= 12.5 Hz, H-18), 2,04 (s, 3H, CH3COO), 1,07 (s, 3H, CH3-27), 0,96 (s, 3H, CH3-26), 0,95 (d, 3H, J= 6,3 Hz, CH3-29), 0,89 (m, 2H, HB -11, HB-1), 0,87 (s, 3H, CH3- 23), 0,85 (d, 3H, J= 6,0 Hz, CH3-30), 0,85 (s, 3H, CH3-24), 0,76 (s, 3H CH3-25) HRMS (ESI-MS, m/z), (M+Na)+, C32H50O4Na, lý thuyết: 521,3607, tìm thấy 521,3604 3β-acetoxy-urs-11-oxo-12-en-28-oic acid (3): hòa tan 50 mg (0,10 mmol) (2), 0,75 ml anhydride axetic, 14,25 ml axít axetic 20 mg CrO3 (0,2 mmol) Sau 24 h (TLC), hỗn hợp sau phản ứng chiết với 20 ml nước 20 ml etyl axetat x lần, lớp hữu tách ra, làm khan Na2SO4, lọc đem cô cạn, chạy cột sử dụng hệ dung môi etyl axetat : hexan (2:8) thu (3) (hiệu suất 80%) 1H-NMR (500MHz, CDCl3), δ 5,6 (s, 1H, H-12), 4,5 ( dd, 1H, J= 11,65, 4,75 Hz, H-3), 1,29 (s, 3H, CH3-27), 1,15 (s, 3H, CH3-26), 0,97 (d, 3H, J= 6,4 Hz, CH3-29), 0,89 (s, 3H, CH3-23), 0,88 (d, 3H, J= 6,7 Hz, CH3-30), 0,86 (s, 3H, CH3-24), 0,85 (s, 3H, CH3-25), 0,79 (d, 1H, J= 10,95 Hz, H-5) HRMS (ESI-MS, m/z), (M-H)+, C32H47O5, lý thuyết: 511,3424, tìm thấy: 511,3411 Benzyl-3β-acetoxy-urs-11-oxo-12-en-28-oate (4): hịa tan 20 mg (0,04 mmol) (3) ml axeton, thêm 27 mg K2CO3 (0,2 mmol), 10 µl benzylbromide (0,08 mmol) Sau 24 h (TLC), hỗn hợp sau phản ứng chiết với 20 ml nước 20 ml etyl axetat lần, lớp hữu tách làm khan Na2SO4, lọc, cô cạn, chạy cột hệ dung môi etyl axetat : hexan (2:8), thu sản phẩm (4) (hiệu suất 90%) 1H-NMR (500 MHz, CDCl3), δ:7,32-7,38 (m, 5H, C6H5-), 5,6 (s, 1H, H-12), 5,07 (s, 2H, -CH2-Ph), 4,5 (dd, 1H, J= 11,75, 4,7 Hz, H-3), 2,8 (dt, 1H, J= 13,65, 3,5 Hz, HA-1), 2.47 ( d, 1H, J= 11,25 Hz, H-18), 2,3 (s, 1H, H-9), 2,1 (d,1H, J= 4,65 Hz, HA-15), 2,07 (s, 3H, CH3-COO), 1,3 (s, 3H, CH3-27), 1,27 (m, 2H, CH2-2), 1,1 (s, 3H, CH3-26), 0,99 (d, 3H, J= 6,35 Hz, CH3-29), 0,884-0.896 (m, 9H, CH3-30, CH3-23, CH3-24), 0,78 (s, 3H, CH3-25) HRMS (ESI-MS, m/z), (M+H)+, C39H55O5, lý thuyết: 603,3405, tìm thấy: 603,4047 3β-hydroxyurs-11-oxo-12-en-28-oic acid (5):Hịa tan 20 mg (0,04 mmol) (3) ml CH2Cl2, thêm 27 mg K2CO3 (0,2 mmol), thêm tiếp ml CH3OH, vừa khuấy vừa đun sôi hỗn hợp hệ thống hồn lưu Sau 24 h (TLC), axít hóa hỗn hợp sau phản ứng dung dịch HCl 0.1M (đến pH 3-4), sau chiết 20 ml nước 20 ml etyl axetat lần, lớp hữu tách ra, làm khan Na2SO4, lọc đem cô cạn Cao thô đem chạy cột sử dụng hệ dung môi etyl axetat : hexan (2:8) thu (5) (hiệu suất 90%) 1H-NMR (500 MHz, CDCl3), δ: 5,37 (s, 1H, H-12), 4.2 (d, 1H, J= 5,1 Hz, HO-), 3,0 (m, 1H, H-3), 2,27 (d, 1H, J= 11,8 Hz, H-18), 1,01 (s, 3H, CH3-23), 0.92 (d, 3H, J= 6,25 Hz, CH3-29), 0,89 (s, 3H, CH3-26), 0,87 (s, 3H, CH3-24), 0,79 (d, 3H, J= 6,4 Hz, CH3-30), 0,67 (s, 3H, CH3-25) HRMS (ESI-MS, m/z), (M+Na)+, C30H46O4Na lý thuyết: 493,3294, tìm thấy 493,3244 Allyl 3β-hydroxyurs-11-oxo-12-en-28-oate (6): hòa tan 20 mg (0.04 mmol) (5) 50 ml axeton khuấy thêm 27 mg K2CO3 (0,2 mmol), 75 µl allyl bromide (0,08 mmol), hỗn hợp khuấy nhiệt độ phòng Sau 24 h (TLC), hỗn hợp sau phản ứng chiết với 20 ml nước 20 ml etyl axetat lần, lớp hữu tách ra, làm khan Na2SO4, lọc đem cô cạn Cao thô đem chạy cột sử dụng hệ dung môi etyl axetat : hexan (2:8) thu (6) (hiệu suất 90%) 1H-NMR (500 MHz, CDCl3), δ: 5,9 (m, 1H, CH2=CH-CH2-), 5,6 (s, 1H, H-12), 5.3(m, 1H, CH2=CH-CH2), 5,25 (m, 1H, CH2=CH-CH2-), 4,57 (dd, 1H, J= 12,5, 5,2 Hz, CH2=CH-CH2-), 4,5 (dd, 1H, J= 13,1, 5,5 Hz, CH2=CH-CH2-), 4,24 (m, 1H, HO-), 3,25, (dd, 1H, J= 11, 5,1 Hz, H-3), 2,47 (d, 1H, J= 11,2 Hz, H-18), 1,33 (s, 3H, CH3-27), 1,15 (s, 3H, CH3-23), 1,02 (s, 3H, CH3-26), 1,0 ( d, 3H, J= 6,5 Hz, CH3-30), 0,95(s, 3H, CH3-24), 0,90 (d, 3H, J= 6,5 Hz, CH3-29), 0,82 (s, 3H, CH3-25) HRMS (ESI-MS, m/z), (M+Na)+, C33H50O4Na, lý thuyết: 533,3607, tìm thấy: 533,3610 5.3 Kết thảo luận: 5.3.1 Tổng hợp hóa học Các phản ứng tổng hợp trình bày hình 1.4 UA acetyl hóa tạo nên dẫn xuất 3-O-acetylursolic nhằm mục đích bảo vệ nhóm OH vị trí C-3 Hợp chất sau hóa với oxít chrom CrO3 (VI) mơi trường axít thu ketone α,β-khơng no với nhóm carbonyl vị trí C-11 [6] Ester hóa nhóm axít carboxylic C-28 với benzyl bromide cho hợp chất Để loại bỏ nhóm bảo vệ, hợp chất deacetyl hóa metanol sử dụng K2CO3 thu hợp chất 5, tiếp tục ester hóa cho sản phẩm Các phổ NMR MS thu phù hợp Hình 1.4: Các phản ứng tổng hợp Trên phổ 1H-NMR hợp chất 2, sau acetyl hóa, xuất mũi đơn proton 2,04 ppm tín hiệu proton H-3 dịch chuyển từ 3,0 ppm phổ UA lên 4,5 ppm chứng tỏ vị trí –OH C-3 bị ester hóa Sau oxy hóa, phổ có xuất tín hiệu proton H-12 mũi đơn δ 5,6 ppm Ngồi ra, dù khơng quan sát tính hiệu proton nhóm –COOH, việc ester hóa để tạo sản phẩm cho tính hiệu đặc trưng nhóm benzyl (tính hiệu proton CH2Ph 5,07 ppm) allyl CH2CH=CH2 (4,55,3ppm) 5.3.2 Thử hoạt tính sinh học Hoạt tính kháng ung thư hợp chất 1-6 thử in vitro dòng tế bào HeLa, MCF-7, NCI-H460, HepG2, thực phương pháp Sulfohrodamine B (SRB) Kết thử nghiệm hoạt tính gây độc tế bào sau 48 cảm ứng nồng độ 100 µg/ml với việc sử dụng camptothecine làm mẫu đối chứng (bảng 2) Bảng 2: Kết sàng lọc thơ nồng độ 100 µg/ml Hep G2 -16.57 ± 3.82 -9.51 ± 6.56 -14.03 ± 7.34 -13.45 ± 8.82 Phần trăm gây độc tế bào (%) TB ± ĐLC (*) NCI-H460 MCF-7 0.60 ± 4.60 5.15 ± 1.46 -5.66 ± 1.91 1.46 ± 2.66 -12.60 ± 4.69 -9.32 ± 8.61 -3.20 ± 1.34 -3.73 ± 0.69 Hela -1.10 ± 3.69 -1.02 ± 2.97 5.54 ± 1.95 4.67 ± 1.46 51.97 ± 0.97 81.50 ± 1.71 47.81 ± 3.26 59.38 ± 1.75 Kết xác định IC50 mẫu UA 32.49 ± 0.83 16.75 ± 0.41 14.36 ± 0.16 26.86 ± 0.47 19.59 ± 1.24 19.90 ± 1.20 (*) TB, ĐLC: trung bình, độ lệch chuẩn 34.95 ± 0.26 24.88 ± 1.66 Mẫu CPT (0.01 µg/ml) Kết đo hoạt tính gây độc dẫn xuất – cho thấy dẫn xuất tạo thành có hoạt tính thấp so với UA (1) ngoại trừ 3, nguyên nhân chất khơng hịa tan tốt mơi trường DMSO ngoại trừ Điều cho thấy quan trọng hai proton tự nhóm –OH C-3 nhóm COOH vị trí C-28 có tác động quan trọng đến hoạt tính UA Các biến đổi nhóm chức gây suy giảm đáng kể hoạt tính chúng 10 VI Kết luận kiến nghị: Các phản ứng ester hóa oxy hóa nhóm chức có sẵn UA cho thấy khả tổng hợp nhiều dẫn xuất khác nhằm tìm kiếm hợp chất với hoạt tính sinh học Kết thử nghiệm hoạt tính gây độc dẫn xuất bốn dòng tế bào ung thư Hela, MCF-7, NCI-H460 HEPG2 cho thấy nhóm carboxylic acid –COOH C-28 axít ursolic giữ vai trị quan trọng Việc ester hóa làm suy giảm hoạt tính gây độc tế bào dẫn xuất từ axít ursolic Việc nghiên cứu thêm dẫn xuất khác cần thiết để hiểu thêm tác động Một phần kết nghiên cứu đăng tạp chí Tạp chí khoa học công nghệ , số 51(5B) năm 2013 từ trang 228 đến trang 232 Đã đào tạo học viên cao học thực luận văn thạc sỹ: Trần Ngọc Vĩ, MSHV 09050129 Tp.HCM, ngày tháng năm Chủ nhiệm đề tài (Ký ghi rõ họ tên) TS Tống Thanh Danh Tp.HCM, ngày tháng năm TL HIỆU TRƯỞNG TRƯỞNG PHỊNG KHCN&DA PGS TS Nguyễn Hồng Dũng 11 VII Tài Liệu Tham Khảo [1] Alexandre T Cardoso Taketa, Tatjana Schmittmann-Schlagera, Dominique Guillaumeb, Grace Gosmannc, Eloir Paulo Schenkel Triterpenoid glycosides and a triterpene from Ilex brevicuspis, Phytochemistry Vl53 , p.901-904, 2000 [2] Ashutosh K Pathak, Manisha Bhutani, Asha S Nair, Kwang Seok Ahn Ursolic Acid Inhibits STAT3 Activation Pathway Leading to Suppression of Proliferation and Chemosensitization of Human Multiple Myeloma Cells, Mol Cancer Res , 5; 943, 2007 [3] Chao-Mei Ma, Shao-Qing Cai, Jing-Rong Cui a, Rui-QingWang, Peng-Fei Tu, Masao Hattori, Mohsen Daneshtalab The cytotoxic activity of ursolic acid derivatives European Journal of Medicinal Chemistry vl40, p582–589, 2005 [4] Carlo Farina a, Mario Pinza, Giorgio Pifferi Synthesis and anti-ulcer activity of new derivatives of glycyrrhetic, oleanolic and ursolic acids 11 Farrnaco vl53, p22-32, 1998 [5] Catherine Mullié a, Alexia Jonet , Alexandra Dassonville-Klimpt, Grace Gosmann, Pascal Sonnet Inhibitory effect of ursolic acid derivatives on hydrogen peroxideand glutathionemediated degradation of hemin: A possible additional mechanism of action for antimalarial activity Experimental Parasitology, Vl125 , p202–207, 2010 [6] Dan Huanga, Yan Ding, Yan Li, Wenming Zhang, Weishuo Fang, Xiaoguang Chen Antitumor activity of a 3-oxo derivative of oleanolic acid Cancer Letters Vl233, p289–296, 2006 [7] Dravidum Maitraie, Chi-Feng Hung, Huang-Yao Tu, Ya-Ting Liou, Bai-Luh Wei,ShyhChyun Yang, Jih-Pyang Wang, Chun-Nan Lin Synthesis, anti-inflammatory, and antioxidant activities of 18b-glycyrrhetinic acid derivatives as chemical mediators and xanthine oxidase inhibitors Bioorganic & Medicinal Chemistry vl17, p.2785–2792, 2009 [8] Gayathri Chadalapaka, Indira Jutooru, Alan McAlees,Tom Stefanacb and Stephen Safea Structure-dependent inhibition of bladder and pancreatic cancer cell growth by 2-substituted glycyrrhetinic and ursolic acid derivatives Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters vl18, p.2633–2639, 2008 [9] G Papanov, P Bozov and P, Malakov Triterpenoids from lavandula splca g papanov Phytochemsiry, Vl31, p1424-1426, 1992 [10] Heather J Finlay,Tadashi Honda, Gordon W Gribble, David Danielpour, Nicole E Benoit, Nanjoo Suh, Charlotte Williams, Michael B Sporn Novel a-ring cleaved analogs of oleanolic and ursolic acids which affect growth regulation in nrp.152 prostate cells Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters, Vl7, pp1769-1772, 1997 [11] Ho Jin You, Chul Yung Choi, Ji Young Kim, Sung Jun Park, Kyung-Soo Hahm, Hye Gwang Jeong Ursolic acid enhances nitric oxide and tumor necrosis factor-K production via nuclear factor-UB activation in the resting macrophages FEBS Letters vl509, p156-160, 2001 [12] Huang-Yao Tu, A-Mei Huang , Bai-Luh Wei, Kim-Hong Gan, Tzyh-Chyuan Hour, ShyhChyun Yang, Yeong-Shiau Pu, Chun-Nan Lin Ursolic acid derivatives induce cell cycle arrest and apoptosis in NTUB1 cells associated with reactive oxygen species Bioorganic & Medicinal Chemistry vl17, p.7265–7274, 2009 [13] Kyoung-Ah Kim, Ji-Suk Lee, Hi-Joon Park, Jin-Woo Kim, Chang-Ju Kim, In-Sop Shim, Nam-Jae Kim, Seung-Moo Han, Sabina Lim Inhibition of cytochrome P450 activities by oleanolic acid and ursolic acid in human liver microsomes Life Sciences vl74, p2769–2779, 2009 [14] Jie Liu Pharmacology of oleanolic acid and ursolic acid, Journal of Ethnopharmacology vl49, p 57-68, 1995 12 [15] Jie Liu Oleanolic acid and ursolic acid Journal of Ethnopharmacology vl100, p92–94, 2005 [16] Mayte Pozo, Virginia Castilla, Cristina Gutierrez, Rosario de Nicol´as, Jes´us Egido, Jes´us Gonz´alez-Cabrero Ursolic acid inhibits neointima formation in the rat carotid artery injury model Atherosclerosis vl184, p53–62, 2006 [17] K Takada, T Nakaneb, K Masuda, H Ishii Ursolic acid and oleanolic acid, members of pentacyclic triterpenoid acids, suppress TNF - induced E-selectin expression by cultured umbilical vein endothelial cells Phytomedicine v.l17, p1114–1119, 2010 [18] Marko Tarvainen&, Jukka-Pekka Suomela, Heikki Kallio, Baoru Yang Triterpene Acids in Plantago major: Identification, Quantification and Comparison of Different Extraction Methods Department of Biochemistry and Food Chemistry, University of Turku, 2009 [19] Nguyễn Kim Phi Phụng Phổ NMR-Sử dụng phân tích hữu Nhà xuất Đại Học Quốc Gia TP Hồ Chí Minh, 2005 [20] Nguyễn Kim Phi Phụng Các phương pháp cô lập hợp chất hữu Nhà xuất Đại Học Quốc Gia TP Hồ Chí Minh, 2007 [21] Peng Wang, Chunxia Li, Jing Zang, Ni Song, Xiuli Zhang and Yingxia Li Synthesis of two bidesmosidic ursolic acid saponins bearing a 2,3-branched trisaccharide residue Carbohydrate Research ,vl340, p2086–2096, 2005 [22] Peng Wang a, Jun Wang, TianTian Guo, Yingxia Li Synthesis and cytotoxic activity of the N-acetylglucosamine-bearing triterpenoid saponins Carbohydrate Research vl345, p607–620, 2010 [23] Phan Van Kiem, Chau Van Minh, Hoang Thanh Huong, Nguyen Hoai Nam, Jung Joon Lee1, and Young Ho Kim Pentacyclic Triterpenoids from Mallotus apelta Arch Pharm Res Vl27, p1109-111, 2004 [24] Phạm Nguyễn Kim Tuyến, Nguyễn Kim Phi Phụng, Phạm Đình Hùng “Góp phần tìm hiểu thành phần hóa học Hoa kim cương Hedyotis Nigricans L., Họ cà phê (Rubiaceae)”, Tạp chí Hố học 43(6), 778-782, 2005 [25] Phạm Nguyễn Kim Tuyến, Nguyễn Kim Phi Phụng, Phạm Đình Hùng Tìm hiểu thành phần hóa học số thuộc chi Hedyotis mọc Việt Nam điều chế số dẫn xuất thioflavon từ flavon cô lập Kỷ yếu Hội nghị khoa học kỹ thuật lần VI, ĐHKHTNĐHQG HCM, III-P-18, 2008 [26] Phạm Đình Hùng Nghiên cứu tách chiết, xác định cấu trúc hợp chất có hoạt tính sinh học cao từ thuốc họ cúc, cà phê, ô rô, bứa số họ khác mọc phổ biến miền nam Việt Nam, Hội nghị tổng kết NCCB KHTN khu vực phía Nam năm 2005, 40-43, 2005 [27] Ren D, Zuo R, Gonzalez Barrios AF, Bedzyk LA, Eldridge GR Differential Gene Expression for Investigation of Escherichia coli Biofilm Inhibition by Plant Extract Ursolic Acid Appl Environ Microbiol Vl71, p4022-4034, 2005 [28] Oxana B Kazakova,1 Gul'nara V Giniyatullina, Emil Yu Yamansarov, Genrikh A Tolstikov Betulin and ursolic acid synthetic derivatives as inhibitors of Papilloma virus Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters.,v.20(14):4088-90, 2010 [29] Salimuzzaman Siddiqui, Bina Shaheen Siddiqui, Akhtar Naeed and Sabira Begum Pentacyclic triterpenoids from the leaves of plumeria obtusa Phytochemistry Vl 31, p4279-4283, 1992 [30] Simone C.B Gnoatto, Alexandra Dassonville-Klimpt, Sophie Da Nascimento, Philippe Gale´ra, Karim Boumediene, Grace Gosmann, Pascal Sonnet, Safa Moslemi Evaluation of 13 ursolic acid isolated from Ilex paraguariensis and derivatives on aromatase inhibition European Journal of Medicinal Chemistry v.143, p1865-1877, 2008 [31] Simone C.B.Gnoatto, Sophie Susplugas, Luciana Dalla Vechia Pharmacomodulation on the 3-acetylursolic acid skeleton: Design, synthesis, and biological evaluation of novel N-{3-[4(3-aminopropyl)piperazinyl]propyl} -3-O-acetylursolamide derivatives as antimalarial agents Bioorganic & Medicinal Chemistry V.116, p771–782, 2008 [32] Stéphane Fontanay, Marion Grare, Joséphine Mayer, Chantal Finance, Raphaël Emmanuel Duval Ursolic, oleanolic and betulinic acids: Antibacterial spectra and selectivity indexe Journal of Ethnopharmacology v.120, p272–276, 2008 [33] T J Raphael and G Kuttan Effect of naturally occurring triterpenoids glycyrrhizic acid, ursolic acid, oleanolic acid and nomilin on the immune system Phytomedicine v.110, p483–489, 2003 [34] Thiard Franck, Tất Tố Trinh, Nguyễn Thụy Vy, Nguyễn Hoài Nghĩa, Nguyễn Diệu Liên Hoa, Nguyễn Kim Phi Phụng, Nguyễn Ngọc Hạnh, Hồ Huỳnh Thùy Dương Khảo sát hoạt tính ức chế tăng trưởng thuốc Việt Nam dòng tế bào ung thư cổ tử cung HeLa.,Tạp chí phát triển KH&CN, tập 11, số 1, 2008 [35] Trần Thị Việt Hoa, Phan Thanh Sơn Nam Hóa Hữu Cơ Nhà xuất Đại Học Quốc Gia TP Hồ Chí Minh, 2007 [36] Wei Zhang, Di Hong, Yueyang Zhou, Yinan Zhang, Qiang Shen, Jing-ya Li, Li-hong Hu, Jia Li Ursolic acid and its derivative inhibit protein tyrosine phosphatase 1B, enhancing insulin receptor phosphorylation and stimulating glucose uptake Biochimica et Biophysica Acta v.117, p1505–1512, 2006 [37] Yan-Qiu Meng , Dan Liu, Ling-Li Cai, Hong Chen, Bo Cao, Yi-Zheng Wang The synthesis of ursolic acid derivatives with cytotoxic activit and the investigation of their preliminary mechanism of action Bioorganic & Medicinal Chemistry v.117,p848–854, 2009 [38] Yanqiu Meng , Yanling Song, Zhaokai Yan and Yan Xia Synthesis and in vitro Cytotoxicity of Novel Ursolic Acid Derivatives Molecules v.115, 4p033-4040, 2010 [39] Ying Wei, Chao-Mei Ma, Masao Hattori Synthesis of dammarane-type triterpene derivatives and their ability to inhibit HIV and HCV proteases Bioorganic & Medicinal Chemistry v.117, p3003–3010, 2009 [40] Young-Jae You, Yong Kim, Nguyen-Hai Nam and Byung-Zun Ahn Synthesis and Cytotoxic Activity of A-ring Modified Betulinic Acid Derivatives Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters v.113, p3137–3140, 2003 [41] Zhi-hong Wang, Cheng-chin Hsu, Chien-ning Huang, Mei-chin Yin Anti-glycative effects of oleanolic acid and ursolic acid in kidney of diabetic mice European Journal of Pharmacology v.628, p255–260, 2010 [42] Muto Y, et al., Present status of research on cancer chemoprevention in Japan,Jpn J Clin Oncol 20(3):219-24, 1990 [43] Ishida, M., Okubo, T., Koshimizu, K., Daito, H., Tokuda, H., Kin, T., Yamamoto, T., Yamazaki, N Topical preparations containing ursolic acid and/or oleanolic acid for prevention of skin cancer Chemical Pharmaceutical Bulletin v.113, 12173, 1990 14 VIII PHỤ LỤC   ‐ Phụ lục chuyên môn: phụ lục phổ khối lượng ‐ Phụ lục sản phẩm đào tạo ‐ Phụ lục sản phẩm báo khoa học ‐ Phụ lục hồ sơ quản lý khoa học 15 ... ngừng thúc đẩy nghiên cứu t? ?m t? ??i sản phẩm cải tiến với ho? ?t tính t? ? ?t hơn, nguyên nhân thúc đẩy đề t? ?i triển khai với nội dung: “ phân lập ursolic acid t? ?? vỏ t? ?o t? ??ng hợp số dẫn xu? ?t? ?? Acid Ursolic. .. sánh t? ?c dụng gây độc t? ?? bào dẫn xu? ?t acid ursolic NTUB1 t? ?? bào PC3 A549 nghiên cứu so sánh hai loại t? ?? bào ho? ?t tính khơng đ? ?t k? ?t t? ? ?t II Mục tiêu đề t? ?i: -Thu nhận thô ursolic acid t? ?? vỏ t? ?o. .. bi? ?t tế bào NTUB1, với ho? ?t tính chống ph? ?t triển t? ?? bào Tuy nhiên t? ?ơng ứng loại dẫn xu? ?t acid ursolic tai C17 -COOH với loại dẫn xu? ?t alkyl halide cho ho? ?t tính khác Dẫn xu? ?t 34, 35 thể ho? ?t tính