Nghiên cứu tổng hợp một số dẫn xuất của Axit Asiatic phân lập từ cây rau má [Centella Asiatica (L.) Urban] và thăm dò hoạt tính sinh học của chú

Header Page of 126 B GIO DC V O TO I HC NNG Cụng trỡnh ủc hon thnh ti I HC NNG Ngi hng dn khoa hc: TS Trn Vn Lc HUNH TH THANH TM NGHIấN CU TNG HP MT S DN XUT Phn bin 1: GS.TS o Hựng Cng CA AXIT ASIATIC PHN LP T CY RAU M [CENTELLA ASIATICA (L.) URBAN]] V THM Dề Phn bin 2: PGS.TS Lờ Th Liờn Thanh HOT TNH SINH HC CA CHNG Chuyờn ngnh: Húa hu c Mó s: 60 44 27 Lun ủó ủc bo v trc hi ủng chm Lun tt nghip Thc s Khoa hc hp ti i hc Nng vo ngy14 thỏng 11 nm 2012 TểM TT LUN VN THC S KHOA HC Nng Nm 2012 Footer Page of 126 Cú th tỡm hiu lun ti: - Trung tõm Thụng tin Hc liu, i hc Nng - Th vin trng i hc S phm, i hc Nng Header Page of 126 -1M U Tớnh cp thit ca ủ ti Cỏc hp cht thiờn nhiờn cú hot tớnh sinh hc cao ủó v ủang ủc s dng rng rói cỏc lnh vc y dc, nụng nghip v ủi sng Cú nhiu loi thuc hon ton phi da vo thiờn nhiờn ủ cha cỏc bnh thụng thng cng nh cỏc bnh him nghốo Mt nhng hng nghiờn cu quan trng hin ủc cỏc nh khoa hc nc ta v trờn th gii rt quan tõm l: T cỏc hp cht thiờn nhiờn ban ủu ngi ta bỏn tng hp, thay ủi cu trỳc hoỏ hc ca chỳng ủ tỡm cỏc hp cht mi cú hot tớnh v tớnh cht u vit hn nhng hp -2mng t cung, ung th thc qun, ung th tu xng [16] Nhng nghiờn cu v bỏn tng hp cỏc dn xut cú hot tớnh sinh hc ca axit ursolic, axit asiatic ủng trờn cỏc khoa hc gn ủõy ủó khớch l chỳng tụi tin hnh tng hp cỏc dn xut ca axit asiatic ủ th hot tớnh dc lý ca chỳng Xut phỏt t tỡnh hỡnh thc t trờn, chỳng tụi chn ủ ti: Nghiờn cu tng hp mt s dn xut ca axit asiatic phõn lp t cõy rau mỏ [Centella asiatica (L.) urban] v thm dũ hot tớnh sinh hc ca chỳng Mc tiờu nghiờn cu cht ban ủu ú l mt nhng ủng khỏ hiu qu v kinh t - Tng hp mt s dn xut ca axit asiatic ủ tỡm cỏc loi thuc mi cha bnh cho ngi, gia sỳc v cõy trng - Kho sỏt hot tớnh sinh hc ca cỏc cht tng hp ủc Trong s cỏc hp cht thiờn nhiờn, hp cht tritecpen cú khung i tng v phm v nghiờn cu ursan nh nhúm axit ursolic v cỏc dn xut ca axit ursolic cú nhiu - Tỏch, tinh ch axit asiatic t dch chit MeOH ca cõy rau mỏ hot tớnh sinh hc lý thỳ nờn ngy cng ủc quan tõm nghiờn cu v - Tng hp cỏc dn xut ca axit asiatic mt hoỏ hc v dc lý Nh hot tớnh ủc vi t bo u phi dũng -Th hot tớnh sinh hc ca cỏc dn xut sch thu ủc A-549, cng nh vi t bo bch cu lympho P-388 v L-1210, hot tớnh ủc vi t bo u KB v kh nng c ch phỏt trin u trờn da chut Trong quỏ trỡnh nghiờn cu sng lc cỏc hp cht thiờn nhiờn cú hot tớnh sinh hc t thc vt Vit Nam, chỳng tụi ủó phõn lp cht axit asiatic t cõy rau mỏ cú tờn khoa hc l Centella asiatica (L.) Urban thuc h Hoa tỏn (Apiaceae) vi hiu sut cao ( 0,37% so vi mu khụ) [2] Hp cht ny thuc khung ursan v cú hot tớnh ủc vi t bo ung th Trong bng ủc quyn sỏng ch US 2004/0097463A1 nm 2004 cỏc tỏc gi ủú s dng axit asiatic hoc asiaticosid ủ ủiu tr cỏc bnh nh: ung th biu mụ, ung th vỳ, ung th tỳi mt, ung th bng quang, ung th nóo, ung th c t cung, ung th nhau, ung th d dy, ung th Footer Page of 126 Phng phỏp nghiờn cu 4.1 Phng phỏp tng hp hu c Cỏc phn ng ủc thc hin bng cỏc phng phỏp tng hp hu c c bn nh phng phỏp kh, phng phỏp oxi húa, phng phỏp ankyl húa, phng phỏp axyl húa, phng phỏp th, 4.2 Phng phỏp sc ký bn mng theo dừi quỏ trỡnh phn ng Phng phỏp sc ký lp mng ủc s dng ủ giỏm sỏt tin trỡnh xy ca cỏc phn ng húa hc v phõn tớch cht lng sn phm ca phn ng 4.3 Phng phỏp phõn lp v tinh ch Cỏc hp cht sau phn ng ủc phõn lp v tinh ch bng cỏc Header Page of 126 -4- -3- phng phỏp chit, phng phỏp sc ký ct silicagel, phng phỏp kt xut mi Cu trỳc ca cỏc cht trờn ủó ủc xỏc ủnh bng vic kt hp tinh, 4.4 Phng phỏp xỏc ủnh cu trỳc húa hc cỏc hp cht hu c Cỏc cht tinh khit sau ủc phõn lp v tinh ch s ủc xỏc ủnh cỏc hng s lý húa ủc trng nh: mu sc, nhit ủ núng chy Sau ủú tin hnh ghi cỏc ph nh: - Ph hng ngoi (FT-IR) ủi vi cht rn ủc ủo di dng viờn nộn KBr, ủi vi cht lng ủc ủo dng mng mng (film) - Ph (ESI-MS) ủc ghi dung mụi CHCl3 hoc cỏc phng phỏp ph hin ủi nh ph hng ngoi (FT-IR), ph phõn gii (HR-ESI-MS), ph cng hng t ht nhõn 1H -NMR, 13CNMR,DEPT v ph NMR hai chiu (H-H-COSY, HSQC v HMBC) Kt qu cho thy tt c cỏc dn xut ủu cú hot tớnh tng ủi mnh c ch s phỏt trin ca dũng t bo ung th th nghim l BK v HepG2 Cỏc cht axit asiatic RM1, RM2Ac v Ac-RMPrAc cú hot tớnh khỏng vi sinh vt kim ủnh mnh vi nng ủ c ch 50% cỏ th CH3OH - Ph cng hng t ht nhõn (NMR) chiu v chiu s dng cht ni chun l TMS ( = ppm), dung mụi CDCl3 hoc DMSO-d6 ủc ghi tn s 500 MHz cho ph 1H-NMR v tn s 125 13 (IC50= 0,28-2,19 àg/ml) ủi vi khun S aureus v (IC50= 1,5 - 20,3 àg/ml ủi vi khun B.subtilis) B cc ca ủ ti MHz cho ph C-NMR Cu trỳc ca cỏc hp cht ủc xỏc ủnh bng Ni dung lun chia lm chng s kt hp cỏc phng phỏp ph v so sỏnh ti liu Chng 1: Tng quan 4.5 Phng phỏp sinh hc Thm dũ hot tớnh sinh hc ca cỏc cht tng hp ủc ti phũng th hot tớnh ca Vin Hoỏ hc Chng 2: Nguyờn liu hoỏ cht v phng phỏp nghiờn cu Chng 3: Thc nghim Chng 4: Kt qu nghiờn cu v tho lun D kin kho sỏt hot tớnh sinh hc ca cỏc hp cht tng hp ủc th hot tớnh khỏng khun, khỏng nm, khỏng ký sinh trựng gõy bnh, gõy ủc t bo, chng ung th, í ngha khoa hc v thc tin ca ủ ti T cỏc kt qu nghiờn cu, lun ủó thu ủc mt s kt qu CHNG TNG QUAN TI LIU 1.1 S LC V CY RAU M CA VIT NAM Rau mỏ l cõy thuc tho, mc hoang khp ni nhng ni ủt vi nhng ủúng gúp thit thc sau: m õy l loi rau thụng dng nhõn dõn ta thng dựng ch bin nhiu Trong quỏ trỡnh nghiờn cu ủ ti ủt ủc mt s kt qu sau: cỏch khỏc ủ lm mún n mỏt b; ộp nc hoc ch bin thnh tr T dch chit MeOH ca rau mỏ ủó phõn lp ủc cht sch l axit asiatic vi hm lng (0,37% so vi mu khụ) ó tng hp ủc dn xut ca axit asiatic ủú cú dn Footer Page of 126 gii khỏt cú tỏc dng nhit lng huyt, gii ủc dựng rt tt hố Theo y hc c truyn, rau mỏ cú v ủng, hi ngt, tớnh bỡnh, vo Can, T V cú tỏc dng dng õm, nhit, nhun gan, Header Page of 126 -6- -5- gii ủc, li tiu Rau mỏ thng dựng ủ lm thuc b dng, sỏt asiaticosid trựng, cha th huyt, t l, khớ h, bch ủi, mn nht, rụm sy *) Mt s hot tớnh khỏc: 1.2 TèNH HèNH NGHIấN CU TRONG NC a) Axit asiatic cú kh nng lm tng hot tớnh ca thuc khỏng sinh, vớ Nm 2011 Vin cụng nghip thc phm ủó nghiờn cu v ủng ký cht lng sn phm t cõy rau mỏ di dng sn phm chc nng l: Tinh rau mỏ: Chng nhn tiờu chun sn phm s: d nh ca thuc Ciprofloxacin v Tabramycin vi vi khun Pseudomonas aeruginosa [14] b) Hot tớnh chng x va ủng mch 7303/2011/YT-CNTC Tinh ca rau mỏ ti ủó ủc sn xut di c) Hot tớnh gim ủau v khỏng viờm ca cõy rau mỏ dng bt siờu mn Thnh phn gm ủng sacarose, glucose, v tinh d) Tỏc dng cha vt thng, vt bng rau mỏ Cú tỏc dng gii nhit, nhun gan, gii ủc li tiu, chng tỏo CHNG bún H tr lm gim mn nht, trng cỏ, cỏc vt nỏm vt nhn, lóo húa da, ngn cỏc vt thng hỡnh thnh so li Rau mỏ FOS: Chng nhn tiờu chun sn phm s : 7304/2011/YT-CNTC Thnh phn gm ủng sacarose, glucose, NGUYấN LIU V PHNG PHP NGHIấN CU 2.1 NGUYấN LIU Axit asiatic ủc phõn lp t cõy rau mỏ ủc thu hỏi ti Sn ủng chc nng FOS (Fructose Oligosacarit ) v tinh rau mỏ õy l Tõy, H Ni vo thỏng 10 nm 2011 sn phm dnh cho bnh nhõn tiu ủng, hoc ngi cú nhu cu gim 2.2 DUNG MễI V HểA CHT NGHIấN CU bộo Tỏc dng tng cm giỏc no, gim nng lng ca mi ba n, nhit li tiu nhun gan, nhun trng Cỏc dung mụi ủc s dng ủ chit tỏch v tinh ch l: Ethanol, methanol, n-hexan, etyl axetat, chloroform Nm 2008 Cụng ty c phn m phm Phng Bc ủó nghiờn Cỏc tỏc nhõn v húa cht tinh khit dựng cho cỏc quỏ trỡnh tng cu sn xut loi kem bụi da t dch chit rau mỏ cú tờn l (yoosun rau hp dn xut v phõn tớch ủc mua t hóng Sigma-aldrich, Merck mỏ) cú tỏc dng ngn nga v tr mn trng cỏ., kớch thớch lờn da non hoc Trung Quc giỳp mau lin vt thng, trỏnh ủ li so v vt thng, lm mỏt da, 2.3 CHIT TCH AXIT ASIATIC TRONG CY RAU M ngn nga v tr rụm sy, mn nga, tr cỏc vt mui ủt v cụn trựng Nguyờn liu rau mỏ ti ủc sy khụ, xay nh v chit vi cỏc cn, dng da, tỏi to t bo da cho ln da luụn ti tr Chng nhn dung mụi v cỏc phng phỏp khỏc tiờu chun sn phm s: SK: 08974/ 08/ CBMP- QLD 2.4 CC PHNG PHP CHUYN HểA HểA HC 1.3 TèNH HèNH NGHIấN CU NGOI NC: ó v ủang cú nhiu cụng trỡnh nc ngoi trung nghiờn Cỏc phn ng húa hc ủc thc hin theo cỏc phng phỏp thụng dng cỏc phũng thớ nghim tng hp hu c cu hot tớnh sinh hc ca axit asiatic v asiaticosid, cng nh cỏc dn 2.5 PHNG PHP XC NH CU TRC HểA HC CA xut ca nú CC CHT *) Hot tớnh gõy ủc t bo v khỏng ung th ca asiatic acid v Footer Page of 126 Vic xỏc ủnh cu trỳc húa hc ca cỏc cht sch ủc thc Header Page of 126 -8- -7- hin thụng qua vic kt hp cỏc phng phỏp ph hin ủi nh ph hng ngoi (FT-IR), ph (MS), sc kớ lng cao ỏp gn vi ph (LC/MS), ph cng hng t ht nhõn mt chiu v hai chiu (1D v 2D NMR) nh H, DEPT, COSY, HSQC v HMBC 1000 Digital Polarimeter Ver.1.00.19 Cỏc húa cht dựng cho phn ng ủc mua ca hóng Merck v cú ủ tinh khit loi P Dung mụi ủc ct li qua ct trc s dng 3.2 CHIT TCH, TINH CH AXIT ASIATIC Quy trỡnh: Rau mỏ khụ nghin nh (10 kg) ủc np vo bỡnh 2.6 PHNG PHP THM Dề HOT TNH SINH HC 2.6.1 Hot tớnh khỏng vi sinh vt kim ủnh chit dung tớch 100 lớt cú khuy, sinh hn hi lu v cú h thng gia 2.6.2 Phng phỏp th ủ ủc t bo nhit Ethanol 80% (40 lớt) ủc vo, khuy ủu v gia nhit ủn 800C Sau gi, rỳt dch ethanol, ủng thi bó rau mỏ ủc chit thờm CHNG ln na vi 30 lớt ethanol 80% Dch chit ethanol ủc gp li v ct THC NGHIM loi bt ethanol trờn b quay ct chõn khụng di ỏp sut gim cho ủn cũn khong lớt dch Dch nc ủc chit ln vi n-henxan 3.1 THIT B V HểA CHT Trong quỏ trỡnh lm thc nghim, chỳng tụi ủó nghiờn cu cỏc ủiu (mi ln vi lớt) ủ loi tinh du v cht mu Dch nc ủc np vo kin thớch hp cho cỏc phn ng v theo dừi quỏ trỡnh phn ng bng sc bỡnh b thit b thy tinh 10 lớt cú khuy, sinh hn hi v h thng gia ký lp mng (SKLM) Cỏc sn phm phn ng ủc tỏch v tinh ch nhit NaOH 20% (2 lớt) ủc vo v gia nhit 800C thi bng sc ký ct thng v sc ký ct nhanh Cu trỳc hoỏ hc ca cỏc sn gian l gi, ủ ngui, chit ln vi EtOAc (mi ln lớt) ủ loi phm to thnh ủc xỏc ủnh bng cỏc phng phỏp ph nh: Ph hng Sau ủú ủc trung hũa vi HCl ủn pH = 3-4 Kt ta ủc lc qua 13 ngoi (FTIR), ph cng hng t ht nhõn ( H-, C-NMR), ph phu hỳt chõn khụng Sau ủú ủc vi nc ln (mi ln vi 500 ml) SKLM phõn tớch ủc tin hnh trờn bn nhụm sn ủn pH = 7, sy khụ thu ủc 136 gam sn phm 136 gam sn phm silicagel Merck 60 PF 254 cú ủ dy 0,2 mm vi cỏc h dung mụi thớch thụ ủc hũa 500 ml EtOH, NaOH 20% ( 0,6 lớt) ủc vo v hp, dựng thuc th l vanilin-H2SO4 cú h núng hoc hi it Phõn lp gia nhit 800C thi gian l gi, ủ ngui, chit ln vi sn phm bng phng phỏp sc ký ct vi cht hp ph silicagel EtOAc (mi ln lớt) ủ loi Dch nc ủc trung hũa vi HCl Merck o ủim chy trờn mỏy Boetus HMK (Cng hũa liờn bang c) ủn pH = 3-4 Kt ta ủc lc qua phu hỳt chõn khụng Sau ủú ủc ti Vin Húa hc vi nc ủn pH = 7, sy khụ thu ủc 112 gam cn 112 gam cn Ph hng ngoi ủc ủo di dng viờn nộn KBr hoc ủc hũa 800 ml cn tuyt ủi, cho 10 gam than hot tớnh vo v CHCl3 trờn mỏy IFS28 Ph cng hng t ht nhõn (NMR) ủc ủo ủun hi lu h Lc loi b than hot tớnh, ct loi dung mụi di ỏp trờn mỏy VARIAN GEMINI 2000-300 tn s 300 MHz cho H v 75 13 MHz cho C CDCl3 hoc CD3OD Cht chun TMS cho H, tớn hiu dung mụi ni chun cho 13 C Ph EI-MS, ESI-MS ủo trờn mỏy Finigan MAT TSQ7000 (4,5KV) quay cc []D ủo trờn mỏy Dip- Footer Page of 126 sut gim thu ủc 106 gam hn hp sn phm Tỏch bng sc ký ct silicagel Merck (c ht 0,043-0,063mm), gii bng h dung mụi CH2Cl2/MeOH vi t l MeOH tng dn: 95:5 v 90:10 Kt tinh li EtOH thu ủc axit asiatic (37g) Header Page of 126 -10- -9- hydroxy v mt nhúm axit carboxylic cú kh nng tham gia phn ng vi cỏc amin thu ủc sn phm amit ch nhúm cacboxylic C28 ta phi bo v nhúm OH bng phn ng axetyl húa ba nhúm hydroxy ca (9) vi anhydrit axetic pyridine, thu ủc sn phm (39) 4.1.1 Cht 39 (2, 3, 23-triacetoxyurs-12-en-28-oic acid) Ph hng ngoi: (hỡnh 4.1) cho ủnh hp th ủc trng ca nhúm Axit asiatic 3.3 TNG HP CC DN XUT CA AXIT ASIATIC (theo S ủ 1) CH2, CH3 2953,36; 2875,03 cm-1 v nhúm carbonyl 1746,26 (C=O) Ph 1H-NMR (Hỡnh 4.2, 4.3 v 4.4) cho thy cú nhúm metyl ủú cú nhúm metyl gn vi cacbon bc vi cỏc tớn hiu singlet ti H = 0,694 (3H, s, CH3); 0,806 (3H, s, CH3); 1,004 (3H, s, CH3); 1,033 (3H, s, CH3) v xut hin nhúm acetyl vi cỏc tớn hiu singlet ti H = 1,915 (3H, s, OCOCH3); 1,958 (3H, s, OCOCH3); 2,020 (3H, s, OCOCH3) Ph 13C-NMR v cỏc ph DEPT-90, DEPT-135 ca cht LMAc2 (Hỡnh 4-22, Hỡnh 4-23 v 4-24) cú mt ca 36 cacbon ủú cú nhúm CH3 cacbon bc (CH3); nhúm cacbon bc (CH2); nhúm cacbon bc (CH) v 10 nhúm cacbon bc Ph 13C-NMR cú tớn hiu ca nhúm axetyl = 170,4 (3 x OCOCH3) T cỏc s liu ph hng ngoi, ph khi, 1H -NMR v 13C-NMR S ủ 1: S ủ tng hp mt s dn xut ca axit asiatic ca cht (39) hon ton phự hp vi d liu ph ti liu [ ] (xem bng 4.1) Bng 4.1: S liu ph 1H- v 13C-NMR ca cỏc hp cht 39 CHNG KT QU V THO LUN STT 4.1 TNG HP CC DN XUT AMIT CA AXIT ASIATIC C 43,7 43,7 69,9 5,07 - 5,10 (m, 1H-2) 69,9 5,12 - 5,17 (m, 1H-2) 74,8 5,03 (d, J = 10,5 Hz, 1H-3) 74,8 5,07 (d, J = 10,3 Hz, 1H-3) V TR 28-COOH Sau chit tỏch v tinh ch ủc axit asiatic cú ủ tinh khit > 98%, chỳng tụi tin hnh tng hp cỏc dn xut ca axit asiatic Hp cht axit asiatic (9) cú trung tõm phn ng gm ba nhúm Footer Page of 126 Cht 39 (LMAc-2) C H Ti liu [23] C H Header Page of 126 -11- -12- 41,8 41,9 47,4 17,8 32,4 47,5 17,9 32,4 39,4 47,5 39,5 47,6 10 37,7 37,8 11 23,3 23,3 12 125,2 13 138,0 138,0 14 41,9 41,9 15 27,9 27,9 16 23,9 24,0 17 47,9 47,9 18 52,4 52,5 19 38,9 39,0 20 38,7 38,8 21 30,5 30,5 22 36,6 36,6 23 65,2 24 13,9 13,9 25 16,8 16,9 26 18,9 17,0 27 23,3 23,4 28 183,6 182,9 29 17,0 17,0 30 21,1 21,2 COCH3 170,8 170,9 5,17 (br, 1H-12) 5,28 (d, J = 11,6 Hz, 1H-23) 3,79 (d, J = 11,5 Hz, 1H-23) Footer Page of 126 125,3 65,3 OCH3 170,5 170,4 21,0 20,8 20,7 1,92 (3H, s, OCH3) 1,95 (3H, s, OCH3) 2,02 (3H, s, OCH3 ) 170,5 170,4 21,1 20,9 20,8 1,98 (3H, s, OCH3) 1,97 (3H, s, OCH3) 2,08 (3H, s, OCH3 ) 5,25 (br, 1H-12) Hỡnh 4.2: Ph cng hng t ht nhõn 1H-NMR ca cht 39 5,58 (d, J = 11,8 Hz, 1H-23) 3,83 (d, J = 11,8 Hz, 1H-23) Hỡnh 4.6: Ph cng hng t ht nhõn 13C- DEPT ca cht 39 Header Page of 126 -13- -14- Nhận xét khả phản ứng chất Chất axit hữu có tính axit yếu chúng khó tham gia phản ứng trực tiếp với axit amin để tạo hợp chất amit Chúng phản ứng dễ dàng với axit amin hoạt hoá nhóm axit cách cho 39 tác dụng với oxalylchlorid Cht (39) ủc hot húa di dng clorua axit nh phn ng vi oxalylchlorit diclometan nhit ủ phũng Ct loi oxalylchlorit d, sau ủú cho thờm amoniac hoc 3-amino-1-propanol v khuy nhit ủ phũng 24 gi Ta thu ủc sn phm (40) hoc (41) 4.1.2 Cht 40 (2, 3, 23-triacetoxyurs-12-en-28-amit) Hỡnh 4.9: Ph cng hng t ht nhõn 1H-NMR ca cht 40 Ph hng ngoi cho ủnh hp th ủc trng ca nhúm amit 3480,24 (CONH2), CH2, CH3 2931,99; 2882,15 cm-1 v nhúm carbonyl 1745,18 cm-1 (C= O) Ph cng hng t ht nhõn 1H-NMR ngoi cỏc tớn hiu ủc trng ca cht 39, xut hin hai tớn hiu = 5,48 v 5,83 ppm ca nhúm NH2 Ph 13C-NMR ủúng gúp quan trng cho vic xỏc ủnh cu trỳc ca cht 40 Ta thy ph 13C-NMR v ph DEPT ca cht 40 cú tớn hiu ca 36 nguyờn t carbon ủú cú nguyờn t carbon bc 2, 10 carbon bc 4, nguyờn t carbon bc v carbon bc (xem hỡnh 4.9) Ph C-NMR cng cho cỏc tớn hiu: (ppm) = 181,0 13 (CONH2) S gỏn ph hon ton phự hp vi cu trỳc amit ủó ủc ủ ngh cho cht 40 (xem bng 4.2) Footer Page of 126 Hỡnh 4.10: Ph cng hng t ht nhõn 13C-DEPT ca cht 40 Header Page of 126 -15- -16- 4.1.3 Chất 41 (2, 3, 23-triacetoxyurs-12-en-28-3-propyl-1-olamit) 41 Cht 39 ủc hot hoỏ di dng chlorua axit nh oxalylchlorit diclometan nhit ủ phũng, ct loi diclometan v oxalylchlorit d Sau ủú cho 3-aminopropan -1- ol vi t l mol 1:2 CH2Cl2 / N(C2H5)3, khuy 24 gi nhit ủ phũng ta thu ủc cỏc sn phm 41 Ph hng ngoi cho ủnh hp th ủc trng ca nhúm hydroxy Hỡnh 4.12: Ph cng hng t ht nhõn 1H-NMR ca cht 41 3383,62 (OH) v nhúm carbonyl 1746,19 cm-1 (C= O) Ph cng hng t ht nhõn 1H-NMR xut hin tớn hiu triplet = 6,18 ppm (J = 6,0Hz) ca nhúm NH amit v xut hin tớn hiu = 3,15-3,57 (m, 4H) tng ng vi proton C-1 v C-3 ca mch nhỏnh Ph 13 C-NMR v ph DEPT ca cht 41 cho tớn hiu ca 39 nguyờn t carbon, ủú cú 12 nguyờn t carbon bc 2, 10 carbon bc 4, nguyờn t carbon bc v carbon bc (xem hỡnh 4.13 v 4.14) c bit trờn ph 13C-NMR xut hin thờm tớn hiu ca nhúm CH2: /ppm = 39,0 (C-1); 32,2 (C-2); 59,3 (C-3) Kt hp ph hng ngoi, ph 13C-NMR v ph DEPT chỳng tụi kt lun nhúm carboxylic axit C-28 tham gia phn ng vi 3aminopropan -1- ol ủ to thnh cht 41, phự hp vi cu trỳc trờn Footer Page of 126 Hỡnh 4.14: Ph cng hng t ht nhõn 13C- DEP ca cht 41 Header Page 10 of 126 -174.1.4.Cht 42 (2, 3, 23-triacetoxyurs-12-en-28-nitrile) -18- CN AcO AcO AcO 42 Khi cho cht 40 tỏc dng vi acetyl clorua dung mụi CH2Cl2 vi xỳc tỏc l DMAP ủó xy hin tng mt H2O ca nhúm amit to thnh CN (cht 42) Ph 1H-NMR ngoi cỏc tớn hiu ủc trng ca cht 42, khụng xut hin hai tớn hiu ca nhúm NH2 Ph 13C-NMR cng cho cỏc tớn hiu ca C-28 chuyn dch v trng cao (ppm) = 122,9 (CN) Ph (ESI-MS) cho pic ion gi phõn t ti m/z = 614.4 [M+1]+, kt hp vi ph 1H-NMR v ph 13C- NMR suy cht 42 phự hp vi cụng Hỡnh 4.20: Ph cng hng t ht nhõn 13C-DEPT ca cht 42 4.1.5 Cht 43 (2, 3, 23-trihydroxyurs-12-en-28-amide) thc phõn t l (C36H56NO7) [M+1]+ Nh vy cụng thc phõn t ca cht 42 s l C36H55NO7 T cỏc s liu ESI-MS, ph hng ngoi, ph 1H-,13C-NMR, chỳng tụi xỏc ủnh ủc cu trỳc ca cht 42 Thy phõn cht 40 bng KOH (4N) MeOH thu ủc hp cht ancol vi hiu 72% Ph 1H-NMR vựng trng cao ch cũn tớn hiu ca nhúm metyl H = 0,72-1,02, khụng cũn xut hin nhúm acetyl Ph 13 C- NMR v cỏc ph DEPT 90, DEPT 135 cú mt ca 30 cacbon ủú cú nhúm CH3; nhúm (CH2); nhúm (CH) v nhúm bc trng thp ch xut hin mt tớn hiu c=183,5 ca nhúm 28-amit, nh vy cỏc nhúm axetyl ủó b thy phõn thnh cỏc nhúm hydroxyl Kt hp Hỡnh 4.16: Ph cng hng t ht nhõn H-NMR ca cht 42 Footer Page 10 of 126 Header Page 11 of 126 -20- -19- ph ESI-MS, ph hng ngoi, ph H-, C-NMR, chỳng tụi xỏc ủnh ppm = 21,0; 20,9; 20,8 v 20,7 ủc trng cho nhúm COCH3 Kt ủc cu trỳc ca ca cht 43 hp ph hng ngoi, ph 1H-, 13 13 C-NMR v ph DEPT chỳng tụi kt lun nhúm hydroxy mch nhỏnh ca cht 41 ủó ủc acetyl húa thnh cht 44 Hỡnh 4.26: Ph cng hng t ht nhõn 1H-NMR ca cht 44 Hỡnh 4.24: Ph cng hng t ht nhõn 13C-DEPT ca cht 43 4.1.6 Cht 44 (2, 3, 23-triacetoxyurs-12-en-28-3-propyl-1acetoxy-amit ) Khi cho cht 41 tỏc dng vi acetyl clorua vi xỳc tỏc kim DMAP dung mụi CH2Cl2 khan ta thu ủc cht 44 vi hiu sut 82% Ph 1H-NMR xut hin nhúm tớn hiu singlet = 1,96; 2,02; 2,05 v 2,06 ca nhúm OCH3 Trờn ph 13C-NMR v ph DEPT ca cht 44 cú tớn hiu ca 41 nguyờn t carbon ủú cú 12 nguyờn t carbon bc 2, 10 nguyờn t carbon bc 1, nguyờn t carbon bc v 11 nguyờn t carbon bc (xem hỡnh 4.27, 4.28 v bng 4.2) c bit trờn ph 13C-NMR xut hin thờm tớn hiu ppm = 171,1; 170,7; 170,4; 170,3 ủc trng cho nhúm OCOCH3 v tớn hiu Footer Page 11 of 126 Bng 4.2: S liu ph 13C-NMR ca axit asiatic v cỏc cht 39-44 TT Cht Cht 39 C 10 11 12 13 14 15 16 17 C 48,0 69,7 78,2 44,1 48,2 19,1 33,6 40,7 48,5 38,9 24,5 126,6 139,8 43,4 29,1 25,3 48,7 C 43,7 69,9 74,8 41,8 47,4 17,8 32,4 39,4 47,5 37,7 23,3 125,2 138,0 41,9 27,9 23,9 47,9 Cht 40 C 43,8 69,9 74,8 41,9 47,5 17,9 32,3 39,4 47,6 37,7 23,4 125,2 139,8 42,5 27,8 23,4 47,9 Cht 41 Cht 42 Cht 43 Cht 44 C 43,7 69,9 74,8 41,9 47,5 21,1 32,4 39,7 47,5 37,7 23,3 125,2 139,7 42,4 27,7 24,7 47,8 C 43,9 69,9 74,8 41,9 47,6 17,9 32,8 39,7 47,6 37,8 23,4 126,9 136,9 42,3 28,5 25,4 39,8 C 48,0 69,7 78,2 43,5 48,9 19,1 33,5 40,8 48,2 38,7 24,4 126,9 140,1 44,1 28,9 25,3 49,3 C 43,8 69,9 74,8 41,9 47,5 17,8 32,4 39,7 47,5 37,7 23,4 125,1 139,8 42,4 27,7 24,7 47,7 Header Page 12 of 126 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 54,3 40,4 40,4 31,6 38,1 66,3 13,9 17,6 17,7 24,1 181,5 17,8 21,5 COCH3 OCH3 -21- -22- 52,4 38,9 38,7 30,5 36,6 65,2 13,9 16,8 18,9 23,9 183,6 17,0 21,1 170,8 170,5 170,4 54,2 37,8 38,7 30,8 37,1 65,2 13,9 17,0 17,0 23,1 181,0 17,1 20,7 170,8 170,5 170,4 53,7 39,6 39,0 30,8 36,0 65,2 13,9 16,8 17,1 23,1 179,4 17,0 21,1 170,7 170,4 170,3 55,3 38,6 38,7 28,5 36,4 65,3 13,9 16,9 17,2 22,9 122,9 17,4 20,8 170,4 170,4 170,4 21,0 20,8 20,7 21,1, 21,0, 20,8 21,0 20,8 20,7 39,0 32,2 59,3 21,0 20,8 20,8 54,5 40,8 40,3 31,9 33,5 66,3 13,9 17,6 17,7 24,1 183,5 17,9 21,6 53,8 39,6 39,1 30,8 36,2 65,2 13,9 16,9 17,1 23,1 177,9 17,0 21,1 171,1 170,7 170,4 170,3 21,0 20,9 20,8 20,7 37,3 28,6 62,0 Cỏc cht tng hp t axit asiatic S Ký hiu TT Cu trỳc STT Ký hiu Cu trỳc 40 43 41 Cht mi 4.2 KT QU TH HOT TNH SINH HC 4.2.1 Th hot tớnh gõy ủc t bo Bng 4.3: Kt qu th hot tớnh gõy ủc t bo STT Tờn cht Ký hiu mu 42 Cht mi IC50 (àg/ml) KB HepG2 Lu RM1 30,22 32,0 40 RMAc-amit 0,41 0,50 5,70 41 Ac-Propanol 1,25 5,46 55,41 42 RM-28Ac 1,71 1,34 8,54 44 Ac-RMPrAc 0,50 0,50 26,66 Cht tham kho (Ellipticine) 39 44 Cht mi 0,62 - 1,25 Kt qu Bng 4.3 cho thy hu ht cỏc cht ủu cú hot tớnh c ch s phỏt trin ca dũng t bo ung th th nghim l KB (ung th biu mụ), HepG2 (ung th gan) v Lu (ung th phi) c bit cỏc cht 40 v 42 cú hot tớnh rt mnh vi ( IC50= 0,41, 0,5 v 0,50, 0,50 àg/ml tng ng) Nh vy s cú mt ca nhúm axetat phõn t lm tng hot tớnh ủc t bo ung th so vi cỏc nhúm OH t Footer Page 12 of 126 Header Page 13 of 126 -24- -23- 4.2.2 Th hot tớnh khỏng vi sinh vt kim ủnh Bng 4.4: Kt qu th hot tớnh khỏng vi sinh vt kim ủnh 13 ht nhõn H-NMR, C-NMR v ph NMR hai chiu - ó th hot tớnh ca axit asiatic cng nh cỏc dn xut tng hp ủc gõy ủc t bỏo ung th trờn dũng t bo BK (t bo ung th biu mụ), Hep-G2 (t bo ung th gan) v Lu (t bo ung th phi) v hot tớnh khỏng vi sinh vt kim ủnh Kt qu cho thy tt c cỏc cht ủu cú hot tớnh mnh c ch hai dũng t bo ung th th nghim BK v Hep-G2 c bit cỏc dn xut 40, 41, 42 v 44 cú hot tớnh rt mnh c ch s phỏt trin ca dũng t bo ung th BK (IC50= 0,41 1,74 àg/ml) v Hep-G2 (IC50= 0,5 5,46 àg/ml) Cht axit asiatic v cht 44 cú hot tớnh khỏng vi khun gram (+) l Lactobacillus Fementan mc ủ khỏ mnh vi nng ủ c ch 50% cỏ th (IC50= 2,197 v 1,5 àg/ml Bng 4.4 cho thy cỏc cht axit asiatic cú hot tớnh khỏng vi khun gram (+) l S.aureus, B.subtilis v Lactobacillus Fermentum tng ng) KIN NGH mc ủ khỏ mnh vi nng ủ c ch 50% cỏ th (IC50= 54,37, 17,18 Tip tc nghiờn cu tng hp cỏc dn xut mi ca axit asiatic v v 2,197 àg/ml tng ng) c bit cht 44 cú hot tớnh khỏng vi thm dũ hot tớnh sinh hc (ủc t bo, chc nng bo v gan) ca khun gram (+) ủi vi khun Lactobacillus rt mnh (IC50= 1,5 àg/ml chỳng ), cỏc cht 40, 41 v 42 khụng cú hot tớnh khỏng vi khun KT LUN V KIN NGH KT LUN CễNG TRèNH C CễNG B Trn Vn Lc, Trn Vn Sung, o c Thin, Nguyn Minh Th, - ó chit tỏch ủc hp cht axit asiatic t cõy rau mỏ (Centella Phm c Thng, Hunh Th Thanh Tõm v Ung Th Nh Truyn asitica (Lim)) Urban, thu hỏi Sn Tõy H Ni vi hm lng 0,37% (2011) Tng hp mt s dn xut ca axit Asiatic phõn lp t cõy rau (tớnh theo trng lng khụ) vi ủ tinh khit 98% mỏ [Centella asiatica (L.) Urban.] ca Vit Nam, Hi ngh khoa hc - ó tng hp ủc dn xut ca axit asiatic ủú cú dn xut mi l: 41 (Ac-propanol), 42 (RM28Ac) v 44 (Ac-RMPrAc) - Cỏc sn phm thu ủc ủó ủc xỏc ủnh cu trỳc húa hc bng vic kt hp cỏc phng phng phỏp ph hin ủi nh: Ph hng ngoi (FTIR); ph phõn gii cao (HR-ESI-MS); ph cng hng t Footer Page 13 of 126 vin Húa hc Tuyn cỏc bỏo cỏo ton vn, Tr 39-44  ... ca axit asiatic phõn lp t cõy rau mỏ [Centella asiatica (L.) urban] v thm dũ hot tớnh sinh hc ca chỳng Mc tiờu nghiờn cu cht ban ủu ú l mt nhng ủng khỏ hiu qu v kinh t - Tng hp mt s dn xut ca axit. .. khả phản ứng chất Chất axit hữu có tính axit yếu chúng khó tham gia phản ứng trực tiếp với axit amin để tạo hợp chất amit Chúng phản ứng dễ dàng với axit amin hoạt hoá nhóm axit cách cho 39 tác... sng lc cỏc hp cht thiờn nhiờn cú hot tớnh sinh hc t thc vt Vit Nam, chỳng tụi ủó phõn lp cht axit asiatic t cõy rau mỏ cú tờn khoa hc l Centella asiatica (L.) Urban thuc h Hoa tỏn (Apiaceae) vi