Nghiên cứu ảnh hưởng của elicitor đến quá trình tích lũy dược chất trong protocorm lan thạch hộc thiết bì (dendrobium offcinale kimura et migo)

NTTU-NCKH-05 CỘNG HÒA XÃ HỘI CHỦ NGHĨA VIỆT NAM Độc lập – Tự – Hạnh phúc Đơn vị chủ trì: Trường Đại học Nguyễn Tất Thành BÁO CÁO TỔNG KẾT ĐỀ TÀI NCKH DÀNH CHO CÁN BỘ - GIẢNG VIÊN 2016 - 2017 Tên đề tài: Nghiên cứu ảnh hưởng elicitor đến q trình tích lũy dược chất protocorm lan Thạch Hộc Thiết Bì (Dendrobium officinale Kimura et Migo) Số hợp đồng: 2017.01.55/HĐ-KHCN Chủ nhiệm đề tài: Mai Thị Phương Hoa Đơn vị công tác: Đại Học Nguyễn Tất Thành Thời gian thực hiện: 04/2017 - 04/2018 TP Hồ Chí Minh, ngày 09 tháng 04 năm 2018 CỘNG HÒA XÃ HỘI CHỦ NGHĨA VIỆT NAM Độc lập – Tự – Hạnh phúc - Đơn vị chủ trì: Trường Đại học Nguyễn Tất Thành BÁO CÁO TỔNG KẾT ĐỀ TÀI NCKH DÀNH CHO CÁN BỘ - GIẢNG VIÊN 2015 - 2016 Tên đề tài: Nghiên cứu ảnh hưởng elicitor đến q trình tích lũy dược chất protocorm lan Thạch Hộc Thiết Bì (Dendrobium officinale Kimura et Migo) Số hợp đồng: 2017.01.55/HĐ-KHCN Chủ nhiệm đề tài: Mai Thị Phương Hoa Đơn vị công tác: Đại Học Nguyễn Tất Thành Thời gian thực hiện: 04/2017 - 04/2018 Các thành viên phối hợp cộng tác: STT Họ tên Mai Thị Phương Hoa Đỗ Tiến Vinh Chuyên ngành CNSH CNSH Cơ quan công tác Khoa CNSH Môi trường Khoa CNSH Môi trường Ký tên MỤC LỤC MỞ ĐẦU Đặt vấn đề Mục đích 10 Nội dung 10 Phạm vi nghiên cứu .10 Chương TỔNG QUAN 11 1.1 Thạch Hô ôc Thiết Bi 11 1.1.1 Phân bố sinh thái .11 1.1.2 Đă ôc điểm hinh thái 11 1.1.3 Thành phần hóa học 12 1.1.4 Công dụng .13 1.1.5 Các công trinh nghiên cứu .16 1.1.5.1 Các công trinh nghiên cứu Trong nước 16 1.1.5.2 Các công trinh nghiên cứu giới 16 1.2 Giới thiệu protocorm .18 1.3 Kỹ thuật nuôi cấy lát mỏng tế bào 18 Chương VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 21 2.1 Thời gian, địa điểm vật liệu nghiên cứu 21 2.2 Phương pháp nghiên cứu 21 Nội dung 1: Tạo nguyên liệu lan Thạch Hộc Thiết Bi in vitro 21 Công việc 1.1: Thu thập mẫu lan Thạch Hộc Thiết Bi 21 Công việc 1.2: Tạo nguồn vật liệu lan Thạch Hộc Thiết Bi in vitro 21 Nội dung 2: Nghiên cứu nuôi cấy lát mỏng lan Thạch Hộc Thiết Bi 21 Công việc 2.1: Khảo sát mơi trường khống ni cấy tạo protocorm 21 Công việc 2.2: Khảo sát ảnh hưởng tỷ lệ auxin đến trinh nuôi cấy tạo protocorm .22 Công việc 2.3: Khảo sát ảnh hưởng tỷ lệ auxin/cytokinin đến trinh nhân protocorm 22 Công việc 2.4: Khảo sát ảnh hưởng thành phần hữu đến trinh nhân sinh khối protocorm 22 Nội dung 3: Nghiên cứu ảnh hưởng elicitor đến tích lũy dược chất trinh nuôi cấy protocom lan Thạch Hộc Thiết Bi .23 Công việc 3.1: Khảo sát ảnh hưởng elicitor đến trinh tổng hợp dược chất protocorm lan Thạch Hộc Thiết Bi 23 Công việc 3.2: Khảo sát ảnh hưởng thời gian nuôi cấy đến trinh tổng hợp dược chất protocorm lan Thạch Hộc Thiết Bi 23 Công việc 3.3: Khảo sát ảnh hưởng thời gian bổ sung elicitor đến trinh tổng hợp dược chất protocorm Thạch Hộc Thiết Bi 23 2.4 Phương pháp thu thập xử lý số liệu .24 Chương 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 25 3.1 Nội dung 1: Tạo nguyên liệu lan Thạch Hộc Thiết Bi in vitro 25 3.1.1 Công việc 1.1: Thu thập mẫu lan Thạch Hộc Thiết Bi 25 3.1.2 Công việc 1.2: Tạo nguồn vật liệu lan Thạch Hộc Thiết Bi in vitro .26 3.2 Nội dung 2: Nghiên cứu nuôi cấy lát mỏng lan Thạch Hộc Thiết Bi 27 3.2.1 Công việc 2.1: Khảo sát mơi trường khống ni cấy tạo protocorm .27 3.2.2 Công việc 2.2: Khảo sát ảnh hưởng tỷ lệ auxin đến trinh nuôi cấy tạo protocorm 28 3.2.3 Công việc 2.3: Khảo sát ảnh hưởng tỷ lệ auxin/cytokinin đến trinh nhân protocorm 30 3.2.4 Công việc 2.4: Khảo sát ảnh hưởng thành phần hữu đến trinh nhân sinh khối protocorm 31 3.3 Nội dung 3: Nghiên cứu ảnh hưởng elicitor đến tích lũy chất thứ cấp trinh nuôi cấy protocom lan Thạch Hộc Thiết Bi 33 3.3.1 Công việc 3.1: Khảo sát ảnh hưởng elicitor đến trinh tổng hợp dược chất protocorm lan Thạch Hộc Thiết Bi 33 3.3.2 Công việc 3.2: Khảo sát ảnh hưởng thời gian nuôi cấy đến trinh tổng hợp dược chất protocorm lan Thạch Hộc Thiết Bi 35 3.3.3 Công việc 3.3: Khảo sát ảnh hưởng thời gian bổ sung elicitor đến trinh tổng hợp dược chất protocorm Thạch Hộc Thiết Bi 35 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 37 TÀI LIỆU THAM KHẢO 38 BÁO CÁO SỬ DỤNG KINH PHÍ 39 DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT BA: benzyladenine CTV: cộng tác viên CW: coconut water (nước dừa) DNA: deoxyribonucleic acic IBA: indolebutyric acid KPT: không phân tích LV: mơi trường Litvay 1985 MS: mơi trường Murashige-Skoog 1962 Môi trường thạch: môi trường có bổ sung agar g/l NAA: α-Naphthalene acetic acid NT: nghiệm thức TN: thí nghiệm DANH SÁCH BẢNG BẢNG TRANG Bảng 1.1: Các thuốc sử dụng Dendrobium làm dược liệu (Chinese Traditional Patent Medicine số 29 - 2007) .15 Bảng 3.1: Kết vô trùng mẫu lan Thạch Hộc Thiết Bi 27 Bảng 3.2: Kết khảo sát ảnh hưởng thành phần khoáng đến khả tạo protocorm lan Thạch Hô ôc Thiết Bi in vitro .28 Bảng 3.3: Kết khảo sát ảnh hưởng nồng đô ô auxin lên trinh tạo protocorm lan Thạch Hô ôc Thiết Bi in vitro 29 Bảng 3.4: Kết khảo sát ảnh hưởng BA NAA lên trinh nhân sinh khối protocorm lan Thạch Hô ôc Thiết Bi in vitro 31 Bảng 3.5 : Kết khảo sát ảnh hưởng thành phần hữu đến trinh nhân sinh khối protocorm lan Thạch Hô ôc Thiết Bi in vitro 32 Bảng 3.6: Kết khảo sát ảnh hưởng elicitor đến trinh tổng hợp dược chất protocorm lan Thạch Hộc Thiết Bi 34 Bảng 3.7: Kết khảo sát ảnh hưởng thời gian nuôi cấy đến trinh tổng hợp dược chất protocorm lan Thạch Hộc Thiết Bi 35 Bảng 3.8: Kết khảo sát ảnh hưởng thời gian bổ sung elicitor đến trinh tổng hợp dược chất protocorm lan Thạch Hộc Thiết Bi 36 DANH SÁCH HÌNH HÌNH TRANG Hình 1.1: Lan Thạch Hơ ơc Thiết Bi 11 Hình 1.2: Cấu trúc số alkaloit phân lập từ giống lan Dendrobium .13 Hình 3.1: Lan Thạch Hộc Thiết Bi trồng Cao Bằng 26 Hình 3.2: Lan Thạch Hộc Thiết Bi sau vô trùng mẫu tuần 27 Hình 3.3: Lan Thạch Hộc Thiết Bi ni cấy môi trường C 28 Hình 3.4: Protocorm lan Thạch Hơ ơc Thiết Bi mơi trường có bổ sung auxin 29 Hình 3.5: protocorm Lan Thạch Hô ôc Thiết Bi in vitro mơi trường thí nghiệm bổ sung BA 0,1 mg: A sau cấy 10 ngày; B sau cấy 30 ngày .31 Hình 3.6: protocorm Lan Thạch Hô ôc Thiết Bi môi trường bổ sung nước dừa 10% .33 TÓM TẮT KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU Sản phẩm thực đạt Sán phẩm đăng ký thuyết minh - 01 quy trinh nuôi cấy prorocorm lan Thạch - 01 quy trinh nuôi cấy prorocorm lan Thạch Hộc Thiết Bi Hộc Thiết Bi - Đào tạo 01 sinh viên ngành công nghệ sinh - Đào tạo 01 sinh viên ngành công nghệ sinh học học - 01 báo đăng tạp chí đại học Nguyễn - 01 báo đăng tạp chí/ kỷ yếu khoa Tất Thành Thời gian đăng ký : từ ngày học nước đến ngày Thời gian nộp báo cáo: ngày MỞ ĐẦU Đặt vấn đề Trong cổ thư đông y Trung Quốc cách 1.000 năm xác định Trung Quốc có loại tiên dược xếp theo thứ tự sau: Thạch Hộc, Tuyết liên, Nhân sâm, Thủ ô, Phục linh, Tùng dung, Linh chi, Ngọc trai, Đông trùng hạ thảo, đó Thạch Hộc xếp đầu bảng vi giá trị độc đáo công bảo vệ sức khỏe, trở thành sản phẩm bổ dưỡng giúp lợi phổi sinh tân từ lâu đời Cây Thạch Hộc Thiết Bi (Dendrobium officinale Kimura et Migo) thành phần gồm có alkaloid dendrobin, nobilonin; G-hydroxydendrobin; polysaccharides (23%) (Huang ctv, 1994), alkaloid (0,02% - 0,04%) (Zhu ctv, 2010), axit amin (133 mg/g khô) (Huang ctv, 1994) nguyên tố vi lượng Fe 292 mg/g, Zn 12 mg/g, Mn 53 μg/g, Cu 3,6 μg/g (Weng, 2003) Thạch Hộc Thiết Bi có khả chống ung thư, kéo dài tuổi thọ, chống lão hóa, tăng sức đề kháng thể, làm dãn mạch máu kháng đông máu, gây mê giảm sốt, có tác dụng tăng lượng glucose máu, với liều cao làm yếu hoạt động tim, làm giảm huyết áp - khó thở sử dụng rộng rãi lâm sàng thuốc thị trường đón nhận (Ji, 1999; The Pharmacopoeia Commission of PRC, 2010; Liu ctv, 2011) Ngoài ra, Thạch Hộc sử dụng làm thực phẩm chức an toàn, bổ dưỡng giá trị kinh tế cao thị trường nước quốc tế quốc gia Đông Nam Á, Trung Quốc, Hàn Quốc, Nhật Bản, châu Âu châu Mỹ Với khả mang lại nguồn ngoại tệ lớn nước ta việc nghiên cứu loài lan hạn chế, có Trung Quốc phát triển loài lan Dendrobium officinale Kimura et Migo phân bố phân tán không liên tục hoạt động đốn gỗ, khai thác rừng mức tàn phá môi trường sống khiến cho giống lan cịn gần tự nhiên, trở thành loài bị đe dọa tuyệt chủng tự nhiên cần bảo tồn nhân giống nguồn gen quý (Gu, 2007) Tại Chiết Giang sản lượng công nghiệp D officinale lên đến tỷ nhân dân tệ năm 2011 dự kiến tăng tới tỷ nhân dân tệ năm 2015 Sản lượng đưa thị trường khiêm tốn, giá kg thạch Hộc thành phẩm thị trường quốc tế vào khoảng 1000 USD Nhu cầu lớn loài Dendrobium khác có đặc điểm hinh thái tương tự D devonianum, D aphyllum D gratiosissimum có giá thấp (dưới 1/4 giá trị D officinale) D officinale lại có tương đồng hinh thái lớn với lồi lân cận Phương pháp quan sát hinh thái thơng thường khó phân biệt được, làm cho sản phẩm giả xuất ngày nhiều thị trường chênh lệch lớn giá chúng Vi vậy, việc phân biệt loài lan mặt di truyền để có nguồn giống đảm bảo chất lượng làm nguyên liệu sản xuất dược liệu có ý nghĩa quan trọng Hiện nay, nguồn cung cấp giống lan Thạch Hộc từ tự nhiên Lượng giống ni mơ sản xuất theo phương pháp truyền thống đáp ứng nhu cầu Do đó, để giải vấn đề nhu cầu giống ngày tăng cần có nghiên cứu sâu công nghệ nhân giống loại lan Trong đó, phương pháp nuôi phôi với hệ số nhân giống cao, đảm bảo bệnh, chất lượng đồng xem phương pháp khả thi cần thiết phải nghiên cứu (Trần Văn Minh, 2013) Bên cạnh việc chủ động nguồn giống có chất lượng cao đáp ứng nhu cầu nước xuất thi khâu ni trồng lồi lan Việt Nam nói chung khu vực phía Nam nói riêng vấn đề cần quan tâm nghiên cứu Với mục tiêu xây dựng quy trinh hoàn chỉnh nuôi cấy tạo sinh khối tế bào có chứa hàm lượng dược chất cao Chúng thực đề tài: “Nghiên cứu ảnh hưởng elicitor đến trinh tích lũy dược chất protocorm lan Thạch Hộc Thiết Bi (Dendrobium officinale Kimura et Migo)” Mục tiêu đề tài - Xây dựng quy trinh nhân sinh khối lan Thạch Hộc Thiết Bi thông qua nuôi cấy protocorm - Đào tạo công nghệ nuôi cấy tế bào thực vật cho sinh viên khoa NNCNC CNSH Nội dung - Tạo nguyên liệu lan Thạch Hộc Thiết Bi in vitro - Nghiên cứu nuôi cấy lát mỏng lan Thạch Hộc Thiết Bi - Nghiên cứu ảnh hưởng elicitor đến tích lũy dược chất trinh nuôi cấy protocom lan Thạch Hộc Thiết Bi Phạm vi nghiên cứu Đề tài thực quy mơ phịng thí nghiệm 10 kéo dài nhiều năm Chúng tiến hành thu mẫu loại làm vật liệu cho thí nghiệm Hình 3.1: Lan Thạch Hộc Thiết Bi trồng Cao Bằng 3.1.2 Công việc 1.2: Tạo nguồn vật liệu lan Thạch Hộc Thiết Bì in vitro Lan Thạch Hộc Thiết Bi thu thập tự nhiên thường bị bám bẩn đất, loại nấm mốc, khuẩn Việc rửa nước xà có thể làm đất bụi bám bên ngồi khơng thể loại trừ hết tất loại vi sinh vật Dó đó, để đảm bảo thành công trinh nuôi cấy mẫu Lan Thạch Hộc Thiết Bi phải vô trùng tuyệt đối trước tiến hành thí nghiệm Hiện nay, có nhiều chất dùng để khử trùng mẫu sử dụng nuôi cấy in vitro như: javel, canxi hypochlorid, natri hypochlorid, HgCL đó javel chất sử dụng phổ biến vi rẻ tiền, dễ tim độc hại người sử dụng Nồng độ javel thường sử dụng để khử trùng mẫu từ 50 - 100% thời gian 10 - 30 phút Tùy thuộc vào đặc điểm mẫu thí nghiệm mà chọn nồng độ thời gian khử trùng khác Nồng độ javel cao làm chết mẫu, nồng độ thấp thi mẫu không dễ nhiễm nấm, khuẩn Do đó, việc lựa chọn nồng độ javel thích hợp để khử trùng mẫu quan trọng cần thiết Kết thể bảng 3.1 cho thấy: tỷ lệ vô trùng tăng tỷ lệ thuận với nồng độ javel Cụ thể, tăng nồng độ javel từ 50 - 100% thi tỷ lệ vô trùng tăng từ 13,35% lên 26 85,45% Thời gian khử trùng kéo dài thi mẫu sạch, nhiên tỷ lệ mẫu sống giảm dần theo thời gian Kết thúc thí nghiệm xác định nồng độ javel 75% thời gian 20 phút thích hợp để khử trùng mẫu lan Thạch Hộc Thiết Bi Bảng 3.1: Kết vô trùng mẫu lan Thạch Hộc Thiết Bi NT Javel (%) 1.1 1.2 1.3 1.4 1.5 1.6 50 50 75 75 100 100 Thời gian Tỷ lệ mẫu vô (phút) trùng (%) 10 20 10 20 10 20 0,00e 13,35d 27,67c 79,53ab 82,28ab 85,45a Tỷ lệ mẫu sống (%) 0,00d 0,00d 65,33ab 67,85a 45,68b 25,17c Hình 3.2: Lan Thạch Hộc Thiết Bi sau vô trùng mẫu tuần 3.2 Nội dung 2: Nghiên cứu nuôi cấy lát mỏng lan Thạch Hộc Thiết Bì 3.2.1 Cơng việc 2.1: Khảo sát mơi trường khống ni cấy tạo protocorm Có nhiều loại mơi trường khống khác sử dụng cho nuôi cấy mô tế bào thực vật Chúng có hàm lượng khoáng đa lượng, vi lượng vitamin khác đó có ảnh hưởng khác tới sinh trưởng phát triển mẫu nuôi cấy điều kiện in vitro Môi trường khoáng sử dụng phổ biến MS (Murashige Skoog, 1962) hầu hết loài có khả sinh trưởng phát triển tốt môi trường Môi trường C (Knudson C, 1946) VW (Vacin Went 1949) môi trường tối ưu hóa cho ni cấy in vitro lồi hoa lan Do vậy, thí nghiệm đánh giá tác động mơi trường khống khác MS, C VW tới khả sinh trưởng phát triển protocorm lan Thạch Hô ôc Thiết Bi in vitro quan trọng sở để tối ưu hóa thành phần khác bổ sung vào môi trường nuôi cấy Bảng 3.2: Kết khảo sát ảnh hưởng thành phần khoáng đến khả tạo protocorm lan Thạch Hô ôc Thiết Bi in vitro 27 Nghiê ôm thức Môi trường Tỷ lê ô tạo protocorm (%) 2.1 MS 27,73b 2.2 C 50,44a 2.3 VW 12,26c Hình 3.3: Lan Thạch Hộc Thiết Bi ni cấy mơi trường C Kết thí nghiệm bảng 3.2 cho thấy khác biệt có ý nghĩa mặt thống kê, sau tuần nuôi cấy, tất nghiệm thức phát sinh protocorm trội môi trường C với tỷ lệ tạo protocorm đến 50,44%, protocorm phát sinh thành cụm từ mẫu cắt ban đầu, phần gốc cụm trắng xanh dần đến ngọn, phát triển mạnh mẽ Ở hai mơi trường cịn lại MS VW, có phát sinh protocorm mật độ thấp, cụm nhỏ, thưa thớt mẫu cắt ban đầu hóa nâu với tỷ lệ tạo protocorm lần lượt (27,73%; 12,26%) Từ kết xác định mơi trường C mơi trường thích hợp tạo protocorm lan Thạch Hô ôc Thiết Bi in vitro sử dụng thí nghiệm 3.2.2 Công việc 2.2: Khảo sát ảnh hưởng tỷ lệ auxin đến q trình ni cấy tạo protocorm Kết thí nghiệm xác định mơi trường C (Knudson C, 1946) mơi trường thích hợp đẻ tạo protocorm cho lan Thạch Hộc Thiết Bi Tuy nhiên để nâng cao tỷ lệ tạo protocorm cần phải tiến hành khảo sát ảnh hưởng chất điều hòa sinh trưởng thực vật Auxin nhóm chất sử dụng hiệu ni cấy lát mỏng Vi vậy, thí nghiệm nàychúng tiến hành khảo sát ảnh hưởng 2,4-D, NAA nồng độ (0,5 - mg/l) đến trinh tạo protocorm lan Thạch Hộc Thiết Bi in vitro Bảng 3.3: Kết khảo sát ảnh hưởng nồng đô ô auxin lên trinh tạo protocorm lan Thạch Hô ôc Thiết Bi in vitro 28 Nghiê ôm thức 2,4-D (mg/l) NAA (mg/l) Tỷ lê ô tạo protocorm (%) 3.1 3.2 3.3 3.4 3.5 3.6 3.7 3.8 3.9 0,5 - 0,5 2,65e 1,42e 1,42e 0,83e 82,89a 69,59b 52,86c 3.10 - 50,02c 3.11 3.12 - 46,84cd 36,93d A B C D Hình 3.4: Protocorm lan Thạch Hô ôc Thiết Bi môi trường có bổ sung auxin A & B: Trên môi trường bổ 2,4-D C & D: Trên môi trường bổ sung NAA Sau tuần nuôi cấy, kết thể bảng 3.3 cho thấy có đối lập hai môi trường có bổ sung 2,4-D NAA Ở nghiệm thức có bổ sung 2,4-D với nồng độ biến thiên 0,5 - mg/l, tỷ lệ tạo protocorm giảm từ 2,65% đến 0,00%, phát sinh protocorm thấp hồn tồn khơng tạo protocorm, mẫu ban đầu hóa nâu có tượng trương nước Khác hoàn toàn với nghiệm thức bổ sung NAA, với tỷ lệ tạo protocorm cao 82,89% nồng độ NAA (0,5 mg/l), phát sinh thành khối cụm nhỏ, màu trắng xanh Ở nồng độ NAA biến thiên từ - mg/l tỷ lệ tạo protocorm giảm dần từ 69,59% xuống 36,93%, nồng độ NAA cao làm ức chế khả phát sinh protocorm, kim hãm phát triển khối protocorm Nồng độ NAA tăng dần, tượng hóa nâu phần gốc mẫu nuôi cấy nhiều 29 mẫu phát triển chậm dần Do đó, có thể kết luận nồng độ NAA 0,5 mg/l thích hợp cho trinh nuôi cấy tạo protocorm lan Thạch Hô ôc Thiết Bi in vitro 3.2.3 Công việc 2.3: Khảo sát ảnh hưởng tỷ lệ auxin/cytokinin đến trình nhân protocorm Protocorm lan Thạch Hơ ơc Thiết Bi thu thí nghiệm tiếp tục sử dụng làm nguồn nguyên cho thí nghiệm nhân nhanh protocorm Protocorm sau hinh thành có thể nhân sinh khối tiếp tục mồi trường tương tự môi trường tạo nó Tuy nhiên, giai đoạn sinh trưởng khác mơ tế bào thực vật địi hỏi thành phần dinh dưỡng khác Việc thay đổi thành phần mơi trường ni cấy cịn tùy thuộc vào mục đích q trinh ni cấy Mục tiêu thí nghiệm nhân nhanh sinh khối protocorm hạn chế hinh thành chồi từ mẫu nuôi cấy Trong nuôi cấy in vitro để điểu khiển trinh sinh trưởng phát triển mẫu nuôi cấy nhóm chất auxin cytokinin sử dụng phổ biến Trong đó, Sự kết hợp sử dụng BA NAA cho thấy kết tốt nuôi cấy tế bào loại hoa lan hồ điệp, giả hạt, ngọc điểm Để đạt mục tiêu thí nghiệm chúng tơi nhận thấy cần phải tiến hành khảo sát lại thành phần chất điều tiết sinh trưởng thực vật Nhằm tim môi trường tối ưu để tri tăng sinh khối protocorm phục vụ cho thí nghiệm sau NAA hai chất điều hịa sinh trưởng thích hợp cho trinh tạo protocorm lan Thạch Hô ôc Thiết Bi tiếp tục sử dụng nồng độ 0,5 mg/l kết hợp với BA chất điều hòa sinh trưởng thuộc nhóm cytokinin có tác dụng làm tăng phân chia tế bào, kim hãm trinh già hóa quan nguyên vẹn Tỷ lê ô auxin/cytokinin quan trọng phát sinh hinh thái (morphogenesis) ô thống nuôi cấy Đối với phát sinh phôi (embryogenesis), để tạo callus rễ cần có tỷ lê ô auxin/cytokinin cao, trường hợp ngược lại dẫn đến sinh sản chồi chồi nách Sau tuần nuôi cấy, kết thể bảng 3.4 cho thấy có khác biệt có ý nghĩa mặt thống kê nghiệm thức Nồng độ BA 0,1 0,5 mg/l cho kết tăng sinh khối protocorm tốt nồng độ lại, cao nồng độ 0,5 mg/l đạt 19,03 g Khi tăng nồng độ BA lên - - mg/l lượng sinh khối thu giảm đáng kể tương ứng 14,33 - 9,65 - 7,57 g Điều có thể lý giải nồng độ BA tăng cao làm thay đổi tỷ lệ auxin/cytokinin, làm thay đổi tỷ lệ tối ưu cho mẫu phát triển Taiz Zeiger (2002) cho nồng độ auxin tối ưu hoạt hóa số enzyme, dẫn đến tăng hàm lượng DNA, RNA protein giúp cho phân chia tế bào Nồng độ auxin ngoại sinh thấp nồng độ tối ưu làm giảm IAA nội sinh cần thiết cho hoạt hóa enzyme liên quan đến phiên mã RNA Như vậy, Nồng độ BA 0,1 0,5 mg/l thích hợp để tăng sinh protocorm lan Thạch Hô ôc Thiết Bi Tuy nhiên, lượng sinh khối thu hai nồng độ không có 30 khác biệt đáng kể mặt thống kê Do đó, để giảm chi phí sản xuất hạn chế sử dụng chất điều tiết sinh trưởng thực vật chọn nồng độ BA 0,1 mg/l để kết hợp với NAA 0,5 mg/l làm tác nhân điều khiển trinh tăng sinh khối thí nghiệm sau Bảng 3.4: Kết khảo sát ảnh hưởng BA NAA lên trình nhân sinh khới protocorm lan Thạch Hơ ơc Thiết Bì in vitro NT BA (mg/l) NAA (mg/l) Sinh khối tươi (g) 4.1 4.2 4.3 4.4 4.5 0,1 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 18,45ab 19,03a 14,33b 9,65c 7,57d Hình 3.5: Protocorm Lan Thạch Hô ôc Thiết Bi in vitro mơi trường thí nghiệm bổ sung BA 0,1 mg: A sau cấy 10 ngày; B sau cấy 30 ngày 3.2.4 Công việc 2.4: Khảo sát ảnh hưởng thành phần hữu đến trình nhân sinh khối protocorm Trong nuôi cấy mô tế bào thực vật ngồi chất điều hịa sinh trưởng, thành phần vô cơ, nguồn nitrogen, nguồn carbon, hàm lượng agar, pH môi trường phát triển tế bào thực vật chịu tác động chất hữu bổ sung dịch chiết (Trần Văn Minh, 2006) Vi vậy, để nâng cao hiệu tăng sinh khối lan protocorm lan Thạch Hô ôc Thiết Bi tiến hành nghiên cứu ảnh hưởng nguồn hữu bổ sung Các thành phần hữu thường sử dụng nuôi cấy nước dừa, dịch chiết lúa mạch, chuối, khoai tây, nước cam, nước cà chua, casein, lactalbumin Các nghiên cứu trước nước dừa khoai tây có tác dụng tốt cho trinh nuôi cấy lan thạch hộc Thiết Bi Trong nước dừa có chứa zeatin số cytokinin khác có tác dụng thúc đẩy hoạt động phân chia tế bào; nước dừa có chứa số acid amine hạn chế khác (Letham, 1974) Tổ chức y tế giới (WHO) cho biết nước dừa có nhiều protein, carbohydrate, calcium, hợp chất sắt, đường, số vitamin thiamin, riboflavin, niacin, acid ascorbic Các chất có thể 31 đóng vai trò quan trọng việc thúc đẩy hoạt động tăng trưởng phân chia tế bào Khoai tây loại củ giàu acid amin lysine, methionine, threonin, tryptophan, vitamin c, vitamin B6, khoáng đặc biệt giàu sắt thích hợp cho sinh trưởng mơ ni cấy Do đó, thí nghiệm chúng tơi tiếp tục sử dụng hai nguồn hữu Bảng 3.5 : Kết khảo sát ảnh hưởng thành phần hữu đến q trình nhân sinh khới protocorm lan Thạch Hơ ơc Thiết Bì in vitro Nghiê ôm thức Nước dừa (%) Khoai tây (g/l) Sinh khối tươi (g) ĐC - - 16,45d 5.1 - 18,42cd 5.2 10 - 25,83ab 5.3 15 - 26,53ab 5.4 20 - 27,03a 5.5 - 25 16,10d 5.6 - 50 18,47cd 5.7 - 75 22,63b 5.8 - 100 19,23c Kết thí nghiệm cho thấy việc bổ sung nước dừa khoai tây cho kết tăng sinh tốt so với mẫu đối chứng Các nghiệm thức từ 5.5 - 5.8 với thành phần bổ sung khoai tây, lượng sinh khối thu đạt cao nghiệm thức 5.7 với nồng độ khoai tây 75 g/l (sinh khối tươi đạt 22,63 g) Kết thấp rõ rệt so với nghiệm thức sử dụng nước dừa Cụ thể, hệ số tăng sinh tăng tỷ lệ thuận với nồng độ nước dừa từ - 20% đạt kết tốt 27,03 g Tuy nhiên, kết phân tích thống kê cho thấy khác biệt nghiệm thức sử dụng nước dừa 10 - 15 - 20% không đáng kể Vi vậy, chọn nồng độ nước dừa 10% thích hợp để bổ sung vào mơi trường ni cấy 32 Hình 3.6: Protocorm Lan Thạch Hơ ơc Thiết Bi môi trường bổ sung nước dừa 10% 3.3 Nội dung 3: Nghiên cứu ảnh hưởng elicitor đến tích lũy chất thứ cấp q trình ni cấy protocom lan Thạch Hộc Thiết Bì 3.3.1 Cơng việc 3.1: Khảo sát ảnh hưởng elicitor đến trình tổng hợp dược chất protocorm lan Thạch Hộc Thiết Bì Trong năm gần xu hướng sử dụng chất có hoạt tính sinh học chiết xuất từ thực vật ngày tăng cao Rất nhiều loài thực vật đầu tư nghiên cứu nhân giống, trồng trọt, chiết xuất đặc biệt nghiên cứu nâng cao hàm lượng dược chất mẫu nuôi cấy Tuy nhiên, trinh chuyển hóa tổng hợp chất thứ cấp thực vật chưa hiểu rõ Các chất chuyển hóa thứ cấp hinh thành loạt điều kiện, điều kiện đó trở nên quan trọng nghiên cứu điều tiết trinh sản xuất Các chất kích thích sản xuất hợp chất thứ cấp có thể kể acid jasmonic, ethylene, acid salicylic, methyl jasmonate, YE, chitosan, Casein hydroxylase Trong đó, YE Casein hydroxylase hai yếu tố sử dụng nhiều nghiên cứu cho kết tốt nghiên cứu nuôi cấy tế bào hao, đinh lăng, thông đỏ, tràm trà Casein hydroxylase cung cấp calcium, phosphate, nguyên tố vi lượng, vitamin quan trọng hỗn hợp 18 amino acid Casein cải thiện tốc độ tăng trưởng nghiên cứu Cardamine pratensis môi trường thiếu phosphate Casein khắc phục thiếu hụt bổ sung glutamine (Bister - Miel ctv, 1985) Dịch chiết nấm men YE (Yeast extract): chế phẩm dùng nuôi cấy vi sinh vật, nuôi cấy mơ tế bào với nồng độ thích hợp Có tác dụng kích thích sinh trưởng phát triển mô tế bào Trước đây, YE sử dụng nguồn cung cấp chất dinh dưỡng tăng trưởng môi trường nuôi cấy mô (Vasil Hildebrandt, 1966) Hiện nay, YE sử dụng để bổ sung amino acid vào môi trường Để đạt hiệu cao nuôi cấy tế bào thực vật thu nhận hợp chất thứ cấp yêu cầu phải kết hợp nhiều yếu tố là: chất cần thiết bổ sung vào trinh tổng hợp chất thứ cấp để trinh diễn liên tục thu nhận hợp chất có suất cao Chọn loài thực vật có hàm lượng chiết suất chất thứ cấp cao, chọn lọc dòng tế bào có suất cao liên tục, xác định điều kiện môi trường điều kiện ni cấy thích hợp thu nhận chất thứ cấp cao Bảng 3.6: Kết khảo sát ảnh hưởng elicitor đến trình tổng hợp dược chất protocorm lan Thạch Hộc Thiết Bì Nghiệm thức Yeast extract (mg/l) Casein (mg/l) Sinh khối tươi (g) 33 Hàm lượng polysaccharides (mg/g) 6.1 0 24,89a 52,2 d 6.2 50 12,45 KPT 6.3 100 12,72d KPT e 6.4 150 8,58 KPT 6.5 200 7,81e KPT ab 6.6 50 23,75 60,5 6.7 100 22,33ab 63,2 6.8 150 16,47b KPT 6.9 200 15,64bc KPT Kết thể bảng 3.6 cho thấy tất nồng độ thí nghiệm sử dụng casein khả tăng sinh protocorm lan Thạch Hộc Thiết Bi thấp, mẫu bắt đầu chuyển vàng sau 15 ngày nuôi cấy hóa đen khoảng 25 đến 30 ngày sau cấy với lượng sinh khối thu lần lượt 12,45 - 12,72 - 8,58 - 7,81 tương ứng với nồng độ casein tăng dần từ 50 100 - 150 - 200 mg/l Các nghiệm thức từ 6.6 - 6.9 với bổ sung yeast extract mẫu nuôi cấy sinh trưởng binh thường sau 30 ngày nuôi cấy mẫu xanh tốt nhiên lượng sinh khối thu thấp so với mẫu đối chứng Điều cho thấy việc bổ sung yeast extract, casein hydrolysate không có tác động làm tăng khả tăng sinh mẫu nuôi cấy, việc bổ sung nồng độ cao làm giảm khả tăng sinh mẫu Do đó, tiến hành phân tích hàm lượng polysaccharides số mẫu nuôi cấy có khả tăng sinh tốt Kết phân tích cho thấy nghiệm thức 6.6 6.7 hàm lượng polysaccharides thu mẫu nuôi cấy lần lượt 60,5 mg/g 63,2 mg/g cao so với mẫu đối chứng đạt 52,2 mg/g Như vậy, hàm lượng polysaccharides có su hướng tăng cao tỷ lệ thuận với nồng độ chất kích kháng bổ sung vào mẫu nuôi cấy Kết hợp hai yếu tố khả tăng sinh hàm lượng dược chất nhận thấy việc bổ sung yeast extract nồng độ 100 mg/l thích hợp cho việc nuôi cấy tăng sinh protocorm lan thạch hộc thiết bi Việc bổ sung chất kích kháng nồng độ cao làm giảm khả tăng sinh mẫu nuôi cấy Điều có thể lý giải bổ sung yeast extract nồng độ cao giúp tạo tiền chất lại gây cản trở phát triển tế bào, nồng độ thích hợp nó kích hoạt việc sản xuất, chuyển hóa chất thứ cấp (Sanchez-Sampedro ctv, 2005) Nghiên cứu thực tương tự nghiên cứu Guo Ohta (1994) Ảnh hường YE tăng cường tích lũy - methoxy mellein tế bào cà rốt (Zhao ctv, 2004), xử lí YE ni cấy tế bào Cupressus lusitanica tăng cường tích lũy polyphosphoinositol Bổ sung YE vào môi trường nuôi cấy Dioscorea deltoidea giúp làm tăng hiệu suất tổng hợp chất thứ cấp diosgenin Kết môi trường nuôi cấy bổ sung chiết xuất từ nấm men không cung cấp chất dinh dưỡng mà tăng cường khả tích lũy hợp chất thứ cấp 3.3.2 Cơng việc 3.2: Khảo sát ảnh hưởng thời gian nuôi cấy đến trình tổng hợp dược chất protocorm lan Thạch Hộc Thiết Bì 34 Bên cạnh nghiên cứu nồng độ chất cảm ứng phi sinh học sinh học thích hợp có thể nâng cao hàm lượng chất chuyển hóa thứ cấp nhằm gia tăng hiệu sản xuất chất thứ cấp thức vật Việc xác định thời điểm thu mẫu yếu quan trọng giúp xác định thời điểm thích hợp để thu mẫu ni cấy có hàm lượng dược chất tốt Trong thí nghiệm tiến hành thu mẫu ba khoảng thời gian 30 - 60 - 90 ngày sau cấy truyền tiến hành phân tích hàm lượng dược chất có mẫu ni cấy Kết tích cho thấy hàm lượng polysaccharides mẫu protocorm lan Thạch Hộc Thiết Bi tăng dần theo thời gian nuôi cấy đạt cao sau 90 ngày nuôi cấy Như thời điểm 90 ngày sau cấy thích hợp để thu sinh khối vi sau thời điểm mẫu ni cấy bắt đầu rơi vào pha suy thối chết Bảng 3.7: Kết khảo sát ảnh hưởng thời gian nuôi cấy đến trinh tổng hợp dược chất protocorm lan Thạch Hộc Thiết Bi NT Thời điểm thu mẫu (ngày sau cấy) polysaccharides (mg/g) 7.1 30 52,2 7.2 60 55,7 7.3 90 60,3 3.3.3 Công việc 3.3: Khảo sát ảnh hưởng thời gian bổ sung elicitor đến trình tổng hợp dược chất protocorm Thạch Hộc Thiết Bì Mơi trường ni cấy xem yếu tố quan trọng có tác động trực tiếp tới hiệu trinh nuôi cấy, nghiên cứu gần cho thấy bổ sung chất vào môi trường nuôi cấy có tác động tích cực đến hiệu suất thu nhận chất thứ cấp Bên cạnh đó việc bổ sung chất thúc đẩy phản ứng sinh tổng hợp chất thứ cấp mà thân tế bào thực vật không có Tuy nhiên, việc bổ sung elicitor thường làm giảm khả sinh trưởng mẫu nuôi cấy làm chết mẫu Để giải khắc phục vấn đề trên, nhiều công trinh nghiên cứu thực Cụ thể nghiên cứu bổ sung yeast extract vào mơi trường ni cấy lồi Dioscorea deltoidea giúp làm tăng hiệu suất tổng hợp chất thứ cấp diosgenin hay tác động chitosan việc kích hoạt gen liên quan đến trinh sinh tổng hợp artemisinin tế bào hao, chất valencene tổng hợp nothatone, chất codeinone tổng hợp codeine (Trần Văn Minh, 2006) tiến hành khảo sát thời điểm bổ sung elicitor Vi vậy, thí nghiệm thực để xác định thời điểm thích hợp cho việc bổ sung chất bổ trợ vào môi trường nuôi cấy Kết thúc trinh nghiên cứu nhận thấy việc bổ sung elicitor giai đoạn sau giúp mẫu nuôi cấy phát triển tốt so với việc bổ sung từ ban đầu Tuy nhiên, việc bổ sung chất vào giai đoạn sau làm tăng nguy nhiễm mẫu Về hàm lượng dược chất việc bổ sung elicitor thời gian ngắn không làm tăng khả tổng hợp polysaccharides mẫu cấy Thời gian bổ sung dài hàm lượng dược chất cải thiện Cụ thể, thời điểm bổ sung 10 35 15 ngày trước thu mẫu không có tác dụng làm tăng hàm lượng dược chất, thời điểm 20 ngày trước thu mẫu cho thấy hàm lượng polysaccharides tăng lên đáng kể từ 53,5 lên 60,4 mg/g Kết hợp hai yếu tố thời gian thu mẫu thời gian bổ sung chất kích kháng kết luận mẫu protocorm lan Thạch Hộc Thiết Bi có khả tăng sinh tốt 60 ngày sau cấy có thể sống thời gian 90 ngày Do đó, nên chọn thời điểm 60 ngày sau cấy để bổ sung chất kích kháng sau đó 30 ngày thi tiến hành thu mẫu, giúp thu lượng sinh khối cao hàm lượng dược chất tất Bảng 3.8: Kết khảo sát ảnh hưởng thời gian bổ sung elicitor đến trinh tổng hợp dược chất protocorm lan Thạch Hộc Thiết Bi NT 8.1 8.2 8.3 Thời gian bổ sung elicitor (ngày) 10 15 20 36 Sinh khối tươi Hàm lượng (g) polysaccharides 25,05a 22,27b 21,16b (mg/g) 53,5 55,8 60,4 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ Kết luận Nồng độ javel 75% thời gian 20 phút thích hợp để khử trùng mẫu lan Thạch Hộc Thiết Bi Môi trường C có bổ sung NAA 0,5 mg/l, đường sucrose 30 g/l mơi trường thích hợp tạo protocorm lan Thạch Hô ôc Thiết Bi in vitro Môi trường nhân sinh khối protocorm lan Thạch Hô ôc Thiết Bi in vitro môi trường C có bổ sung NAA 0,5 mg/l, BA 0,1 mg/l, đường sucrose 30 g/l nước dừa 10% Yeast extract nồng độ 100 mg/l có tác dụng làm tăng hàm lượng polysaccharides mẫu nuôi cấy Thời điểm 90 ngày sau cấy thích hợp để thu sinh khối protocorm thời điểm bổ sung Yeast extract tốt 30 ngày trước thu mẫu Kiến nghị - Nghiên cứu chọn dịng tế bào lan Thạch Hơ ơc Thiết Bi có hàm lượng dược chất cao nhất, tăng số lần lặp lại thí nghiệm bổ sung tiền chất 37 TÀI LIỆU THAM KHẢO Babu K.N., Sajina A., Minoo D., John C.Z., Mini P.M., Tushar K.V., Rema J., Ravindran P.N (2003) Micropropagation of camphor tree (Cinnamomum camphora) Plant Cell Tiss Org Cult, 74: 179-183 Ding G, Li X, Ding X, Qian L, 2009 Genetic diversity across natural populations of Dendrobium officinale, the endangered medicinal herb endemic to China, revealed by ISSR and RAPD markers Genetika, 45(3):375-82 Gu S., Ding X Y., Wang Y., Zhou Q., Ding G., Li X X and Qian, 2007 Isolation and characterization of microsatellite markers in Dendrobium officinale, an endangered herb endemic to China Molecular Ecology Notes 7: 1166-1168 Guo X, Li Y, Li C, Luo H, Wang L, Qian J, Luo X, Xiang L, Song J, Sun C, Xu H, Yao H, Chen S, 2013 Analysis of the Dendrobium officinale transcriptome reveals putative alkaloid biosynthetic genes and genetic markers Elsevier B.V Int Immunopharmacol;11(12):2025-32 Li X, Ding X, Chu B, Zhou Q, Ding G, Gu S, 2008 Genetic diversity analysis and conservation of the endangered Chinese endemic herb Dendrobium officinale Kimura et Migo (Orchidaceae) based on AFLP Epub.133(2):159-66 Nai-dong Chena, Han Chena, Jun Lic, Mang-mang Sanga, Shen Dinga, Hao Yua, 2015 Discrimination and similarity evaluation of tissue cultured and wild Dendrobium species using Fourier transform infrared spectroscopy Volume 1086, 255–265 Trần Văn Minh, 2013 Công nghệ sinh học thực vật Giáo trinh cao học - nghiên cứu sinh Trường Đại học Nơng Lâm TP Hồ Chí Minh, 751 trang Xiao Ming Tana, Chun Lan Wang, Xiao Mei Chena, Ya Qin Zhoub, Yun Qiang Wangc, An Xiong Luoa, Zhi Hua Liua, Shun Xing Guoa, 2014 Scientia Horticulturae Volume 165, 62–68 Xin qian, Caixia Wang, Tong Ouyang Min Tian, 2014 In vitro flowering and fruiting in culture of Dendrobium officinale Pak J Bot., 46(5): 1877-1882 Yan L, Wang X, Liu H, Tian Y, Lian J, Yang R, Hao S, Wang X, Yang S, Li Q, Qi S, Kui L, Okpekum M, Ma X, Zhang J, Ding Z, Zhang G, Wang W, Dong Y, Sheng J, 2014 The Genome of Dendrobium officinale Chủ nhiệm đề tài ThS Mai Thị Phương Hoa 38 BÁO CÁO SỬ DỤNG KINH PHÍ o o o Tổng kinh phí duyệt: 25 triệu đồng Kinh phí cấp: 12,5 triệu đồng Sử dụng kinh phí : liệt kê theo bảng Các khoản chi Kinh phí chi Trả cơng lao động (khoa học, phổ thông) Nội dung 1: Tạo nguyên liệu lan Thạch Hộc Thiết Bì có giá trị dược (triệu đồng) 25 liệu cao in vitro Công việc 1.1: Thu thập xác định giá trị dược liệu lan Thạch Hộc Thiết Bi Công việc 1.2: Tạo nguồn vật liệu lan Thạch Hộc Thiết Bi in vitro Nội dung 2: Nghiên cứu nuôi cấy lát mỏng lan Thạch Hộc Thiết Bì Cơng việc 2.1: Khảo sát mơi trường khống ni cấy tạo protocorm Cơng việc 2.2: Khảo sát ảnh hưởng tỷ lệ auxin/cytokinin đến trinh nuôi 12 3 cấy tạo protocorm Công việc 2.3: Khảo sát ảnh hưởng tỷ lệ auxin/cytokinin đến trinh nhân sinh khối protocorm Công việc 2.4: Khảo sát ảnh hưởng thành phần hữu đến trinh nhân sinh khối protocorm Nội dung 3: Nghiên cứu ảnh hưởng elicitor đến tích lũy chất thứ cấp q trình ni cấy protocom lan Thạch Hộc Thiết Bì Công việc 3.1: Khảo sát ảnh hưởng elicitor đến trinh tổng hợp dược chất protocorm lan Thạch Hộc Thiết Bi Công việc 3.2: Khảo sát ảnh hưởng thời gian nuôi cấy đến trinh tổng hợp dược chất protocorm lan Thạch Hộc Thiết Bi Công việc 3.3: Khảo sát ảnh hưởng thời gian bổ sung elicitor đến trinh tổng hợp dược chất protocorm Thạch Hộc Thiết Bi 39 QUY TRÌNH NI CẤY PROTOCORM LAN THẠCH HỘC THIẾT BÌ IN VITRO Thạch Hộc Thiết Bi Vô trùng javel 75% thời gian 20 phút Cắt mỏng cấy vào môi trường C + NAA 0,5 mg/l sau 20 - 25 ngày tạo protocorm Protocorm Tách nhỏ kích thước 0,5 x 0,5 cm Nhân protocorm môi trường C có bổ sung BA 0,1 (mg/L), NAA 0,5 mg/l, nước dừa 10%, đường sucrose 30 (g/l) agar (g/l) Nuôi cấy điều kiện nhiệt độ 26°C ± 2°C, cường độ ánh sáng 2000 - 3000 lux, thời gian chiếu sáng 10 giờ/ngày Thu sinh khối sau 90 ngày 40 ... elicitor đến tích lũy dược chất q trình ni cấy protocom lan Thạch Hộc Thiết Bì Cơng việc 3.1: Khảo sát ảnh hưởng elicitor đến trình tổng hợp dược chất protocorm lan Thạch Hộc Thiết Bì - Mục tiêu:... có chứa hàm lượng dược chất cao Chúng thực đề tài: ? ?Nghiên cứu ảnh hưởng elicitor đến trinh tích lũy dược chất protocorm lan Thạch Hộc Thiết Bi (Dendrobium officinale Kimura et Migo)? ?? Mục tiêu... vitro - Nghiên cứu nuôi cấy lát mỏng lan Thạch Hộc Thiết Bi - Nghiên cứu ảnh hưởng elicitor đến tích lũy dược chất trinh nuôi cấy protocom lan Thạch Hộc Thiết Bi Phạm vi nghiên cứu Đề tài thực