Nghiên cứu mối liên quan giữa mức độ sao chép gen GAS5 với lâm sàng, giải phẫu bệnh và kết quả sau mổ ung thư biểu mô dạ dày TT

1 ĐẶT VẤN ĐỀ Ung thư dày (UTDD) bệnh ung thư phổ biến tồn giới Năm 2018 có triệu trường hợp mắc, chiếm 5,7% tổng số loại ung thư nguyên nhân gây tử vong đứng hàng thứ ba, với gần 783.000 trường hợp Tiên lượng UTDD cải thiện đáng kể vài chục năm gần Tuy nhiên tỷ lệ sống thêm năm sau mổ chưa đến 30%, hầu hết bệnh nhân phát bệnh giai đoạn tiến triển Gần đây, nhà khoa học sâu nghiên cứu sinh bệnh học UTDD mức phân tử, nhằm phát dấu ấn sinh học mới, đặc hiệu, giúp chẩn đoán sớm, theo dõi tiên lượng bệnh Việc nhận biết liên quan RNA khơng mã hóa dài (long noncoding RNA-lncRNAs) với UTDD “dấu ấn” quan trọng sinh học phân tử đại GAS5 (Growth Arrest Specific transcrip 5) lncRNAs nhà nghiên cứu quan tâm GAS5 đóng vai trị gen ức chế khối u cách ức chế phát triển tế bào, kích thích tế bào chết theo chương trình GAS5 góp phần kiềm hãm tăng sinh xâm lấn tế bào ung thư Mức độ chép GAS5 có giá trị theo dõi, tiên lượng nhiều bệnh ung thư, có ung thư dày Tại Việt Nam, chưa có nghiên cứu tìm hiểu đặc tính sinh học GAS5 mối liên quan với đặc điểm lâm sàng, mô bệnh học thời gian sống thêm sau mổ bệnh nhân UTDD Để làm rõ vấn đề nêu trên, thực đề tài: “Nghiên cứu mối liên quan mức độ chép gen GAS5 với lâm sàng, giải phẫu bệnh kết sau mổ ung thư biểu mô dày” với hai mục tiêu: Mô tả đặc điểm lâm sàng, giải phẫu bệnh mức độ chép gen GAS5 bệnh nhân ung thư biểu mô dày Phân tích mối liên quan mức độ chép gen GAS5 với đặc điểm lâm sàng, giải phẫu bệnh thời gian sống thêm sau mổ bệnh nhân ung thư biểu mơ dày Tính cấp thiết đề tài Ung thư dày loại ung thư hay gặp đường tiêu hóa Tại Việt Nam, tỷ lệ phát UTDD sớm thấp, hiệu điều trị chưa cao Trong năm gần đây, có nhiều tiến nghiên cứu bệnh học phân tử nhằm phát gen liên quan đến điều trị tiên lượng UTDD gen Her-2/neu, p53, CDH1, … Việc tìm hiểu gen liên quan đến bệnh sinh UTDD cần thiết, nhằm chẩn đoán phát sớm điều trị có hiệu Nghiên cứu mức độ chép gen GAS5 mô u mô lành dày, tìm hiểu mối liên quan với đặc điểm lâm sàng, giải phẫu bệnh thời gian sống thêm sau mổ bệnh nhân cung cấp thơng tin hữu ích thực hành lâm sàng Nghiên cứu có tính mới, có giá trị khoa học, mang nhiều ý nghĩa thực tiễn Những đóng góp luận án Cho đến nghiên cứu phối hợp lâm sàng y sinh học phân tử Việt Nam hạn chế mặt số lượng, đặc biệt chuyên ngành ngoại khoa Đối với UTDD, mức độ chép gen GAS5 có ý nghĩa quan trọng chẩn đốn sớm, điều trị tiên lượng thời gian sống thêm sau điều trị Gen GAS5 hy vọng “dấu ấn ung thư” mới, góp phần vào việc chẩn đốn, theo dõi tiên lượng ung thư dày Bố cục luận án Luận án có 119 trang, bao gồm phần: đặt vấn đề (2 trang), tổng quan (38 trang), đối tượng phương pháp nghiên cứu (17 trang), kết (26 trang), bàn luận (34 trang), kết luận (2 trang) Luận án có 47 bảng, 25 hình, 12 biểu đồ 165 tài liệu tham khảo (118 tiếng Anh, 47 tiếng Việt) CHƯƠNG TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 CẬP NHẬT GIẢI PHẪU BỆNH UNG THƯ DẠ DÀY 1.1.1 Vị trí u Hiện nay, nghiên cứu có khuynh hướng chia UTDD thành hai loại ung thư tâm vị ung thư không thuộc tâm vị Phân loại ung thư vùng nối dày- thực quản (EGJ) Hiệp hội ung thư Hoa Kỳ (AJCC) có thay đổi phiên lần thứ năm 2017 so với phiên lần thứ năm 2010 Theo phiên lần thứ 7, khối u nằm vòng cm từ đường nối xâm lấn lên thực quản phân loại theo TMN ung thư thực quản Khối u nằm phạm vi cm chưa xâm lấn lên thực quản phân loại điều trị UTDD 3 Ở phiên lần thứ năm 2017, có thay đổi: khối u khoảng 2cm từ đường nối thực quản- dày, lan vào thực quản phân loại ung thư thực quản Khối u có vị trí nằm khoảng cách >2cm từ đoạn nối dày- thực quản phân loại UTDD cho dù khối u có lan lên vùng nối 1.1.2 Đại thể ung thư dày Hiện nay, phân loại hiệp hội UTDD Nhật Bản năm 2011 áp dụng rộng rãi Hình ảnh đại thể chia thành typ, typ dạng sớm, type lại dạng đại thể UTDD tiến triển 1.1.3 Vi thể ung thư dày Phân loại Lauren, bao gồm: thể ruột, thể lan tỏa, thể hỗn hợp Thể ruột thể lan tỏa có khác biệt dịch tễ, bệnh nguyên tiên lượng Thể ruột có tiên lượng tốt thể lan tỏa Phân loại WHO 2010, phân loại 2010 cập nhật từ phân loại 2000, bao gồm phân loại Lauren Bảng phân loại mã hóa, thuận tiện cho việc trao đổi thông tin sở với 1.1.4 Độ biệt hóa UTBM tuyến: - Phân loại WHO: - Biệt hóa cao: cấu trúc tuyến rõ ràng, giống với biểu mô ruột dị sản - Biệt hóa kém: tuyến hình dáng khơng rõ, khơng đều, thâm nhiễm - Biệt hóa vừa: hình ảnh trung gian biệt hóa tốt biệt hóa - Phân loại hiệp hội Bác sĩ Giải phẫu bệnh Hoa Kỳ: - Độ 1: Biệt hóa rõ, > 95% cấu trúc u hình thành tuyến - Độ 2: Biệt hóa vừa, 50 - 95% cấu trúc u hình thành tuyến - Độ 3: Biệt hóa kém, 5- 50% cấu trúc u hình thành tuyến - Độ 4: Khơng biệt hóa 1.1.5 Phân loại giai đoạn ung thư dày Phân giai đoạn UTDD theo TNM lần thứ năm 2010 sau: Giai đoạn 0: Tis N0M0 Giai đoạn IA: T1 N0M0 Giai đoạn IB: T2 N0M0 Giai đoạn IIA: T3 N0M0 Giai đoạn IIB: T4a N0M0 Giai đoạn IIIA: T4a N1M0, T3N2M0, T2N3M0 Giai đoạn IIIB: T4bN0N1M0, T4a N2M0, T3 N3M0 Giai đoạn IIIC: T4a N3M0, T4bN2N3M0 Giai đoạn IV: T bất kỳ, N bất kỳ, M1 Tại phiên lần thứ năm 2017, phân loại có số thay đổi: - T1N3bM0 T2N3bM0 từ giai đoạn IIB IIIA thành IIIB - T3N3bM0 từ giai đoạn IIIB thành giai đoạn IIIC - T4bN0M0 T4aN2M0 từ IIIB thành IIIA - T4aN3aM0 T4bN2M0 từ IIIC thành IIIB 1.2 CHẨN ĐOÁN UNG THƯ DẠ DÀY 1.2.1 Lâm sàng Đau bụng thượng vị sụt cân hai triệu chứng thường gặp Xuất huyết tiêu hóa triệu chứng thường gặp với cầu phân đen nôn máu Triệu chứng thực thể thường xuất muộn: u vùng thượng vị, hạch thượng đòn trái, hạch nách trái, u buồng trứng 1.2.2 Chẩn đoán cận lâm sàng 1.2.2.1 Nội soi, siêu âm, chụp cắt lớp vi tính Nội soi dày ống mềm phương tiện quan trọng chẩn đốn tầm sốt UTDD có độ nhạy độ đặc hiệu cao Nội soi kết hợp sinh thiết tiêu chuẩn vàng chẩn đoán UTDD Siêu âm giúp phát tổn thương di căn, xâm lấn quan lân cận Dấu hiệu UTDD siêu âm dày thành khu trú, cấu trúc lớp niêm mạc dày Siêu âm nội soi giúp xác định mức độ xâm lấn tổn thương mức độ di hạch, đặc biệt tổn thương giai đoạn sớm - CT giúp xác định di hạch di xa Độ xác đánh giá mức độ xâm lấn u từ 77- 89%, đánh giá di hạch từ 80- 89% 1.2.2.2 Chỉ điểm khối u (tumor marker) CEA, CA 19-9 CA 72-4 điểm khối u thường sử dụng chẩn đoán ung thư dày Tỷ lệ dương tính CEA, CA19-9, CA724 21,1%, 27,8% 30% 1.3 ĐIỀU TRỊ PHẪU THUẬT UNG THƯ DẠ DÀY Nguyên tắc điều trị phẫu thuật ung thư dày Phẫu thuật UTDD bao gồm: phẫu thuật triệt không triệt Phẫu thuật cho triệt đạt tiêu chuẩn: cắt bỏ phần hay tồn dày, khơng tế bào ung thư diện cắt đại thể vi thể, lấy bỏ toàn hệ thống bạch huyết di căn, lấy bỏ hết tổ chức bị xâm lấn di Năm 1987, UICC đưa định nghĩa R để đánh giá tính triệt phẫu thuật: R0: khơng cịn tế bào ung thư vi thể R1: tế bào ung thư vi thể R2: tổ chức ung thư đại thể Phẫu thuật không triệt bao gồm: phẫu thuật tạm thời phẫu thuật giảm thiểu tế bào ung thư Mức độ nạo hạch điều trị ung thư dày Trong hướng dẫn nhất, hiệp hội UTDD Nhật Bản thay đổi chặng hạch nạo hạch thành: D1, D1+, D2, D2+ để đơn giản tùy thuộc vào phương pháp phẫu thuật cắt bán phần toàn dày, thương tổn nguyên phát vị trí 1.4 SỐNG THÊM SAU MỔ VÀ CÁC YẾU TỐ LIÊN QUAN Nhiều nghiên cứu cho yếu tố tiên lượng UTDD bao gồm: kích thước u, mức độ xâm lấn u, di hạch, giai đoạn bệnh biến chứng sau mổ Trên giới có nhiều nghiên cứu yếu tố liên quan đến thời gian sống thêm sau mổ UTDD: Isobe cho thấy tỷ lệ sống năm giai đoạn I II 91,9% 85,5% 33,4% 15,8% giai đoạn III IV Siewert nghiên cứu 1654 bệnh nhân UTDD điều trị phẫu thuật, cho biết yếu tố tiên lượng độc lập quan trọng tỷ lệ hạch di căn, yếu tố: cịn sót lại tế bào ung thư bờ cắt, số lượng hạch di căn, kích thước u, biến chứng, di xa 1.5 CƠ CHẾ PHÂN TỬ VÀ VAI TRÒ CỦA GAS5 1.5.1 Sơ lược RNA khơng mã hóa dài (lnc RNAs) Các nghiên cứu gần 90% gen sinh vật nhân thật mã, lượng nhỏ (khoảng 2-3%) gen mã hóa protein, phần lớn cịn lại RNA khơng mã hóa, gồm nhóm chính: RNA khơng mã hóa dài (long non coding RNA- lncRNAs) RNA khơng mã hóa ngắn (small non coding RNA) LncRNAs RNA không mã hóa, dài 200 nucleotide LncRNA đóng vai trị quan trọng tiến trình sinh học tế bào điều hòa biểu gen, phát triển tế bào phát sinh u Các lncRNA có vai trị ức chế khối u kích thích làm khối u tăng sinh H19 lncRNA Brannan báo cáo năm 1990, nhiều lncRNA phân lập có vai trị ung thư dày như: ANRIL, GHET1, HOTAIR, LET, GAPLINEC… GAS5 GAS5 giữ vai trò ức chế tăng sinh tế bào, kích thích tế bào chết theo chương trình Nhiều nghiên cứu cho thấy GAS5 số lncRNA khác “dấu ấn ung thư” có độ nhạy, độ đặc hiệu cao CA19.9, CEA CA 72.4 chẩn đoán tiên lượng ung thư dày 1.5.2 Cấu trúc chức sinh học GAS5 GAS5 phân lập lần vào năm1988 GAS5 gen khơng mã hóa protein nằm nhiễm sắc thể 1q25, dài 630 nucleotid, thuộc họ 5’-Terminal Oligopyrimidine (5’ TOP) Nhiều nghiên cứu cho thấy GAS5 có vai trị sinh học quan trọng, bao gồm kích hoạt gen, ức chế gen tăng sinh tế bào Ngoài GAS5 có vai trị kiềm hãm di căn, xâm lấn tế bào ung thư thông qua nhiều chế phân tử liên kết với chuỗi DNA, tạo phức hợp RNADNA, kích hoạt ngăn chặn chép gen, liên kết protein để tạo thành phức hợp biến đổi nhiễm sắc thể 1.6 Kỹ thuật Realtime PCR đánh giá mức độ chép GAS5 Phản ứng realtime PCR thể biểu đồ khuếch đại gồm giai đoạn: - Giai đoạn ủ: Tín hiệu huỳnh quang tích lũy chưa đạt ngưỡng nhận biết thiết bị Khi đó, nồng độ mức đường thẳng (đường nền) - Giai đoạn lũy thừa: Tín hiệu huỳnh quang tăng vọt lên vượt qua đường ngưỡng tăng nhanh Thời điểm tăng lên vượt ngưỡng gọi chu kỳ ngưỡng (Ct) Chu kỳ ngưỡng thông số để đánh giá mức độ chép GAS5 - Giai đoạn bình nguyên: Đồ thị theo đường ngang mà nồng độ bão hịa, khơng tăng lên enzym Taq polymerase khơng cịn hoạt động lượng dNTP hết CHƯƠNG ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU 2.1.2 Tiêu chuẩn chọn bệnh nhân vào nhóm nghiên cứu Các bệnh nhân đáp ứng tiêu chuẩn sau: - Được điều trị phẫu thuật cắt bán phần cắt tồn dày - Được chẩn đốn mơ bệnh học ung thư biểu mô dày - Được xét nghiệm phân tích mức độ chép gen GAS5 mô u mô lành dày kỹ thuật Realtime PCR - Bệnh nhân đồng ý tham gia nghiên cứu 2.1.3 Tiêu chuẩn loại trừ khỏi nghiên cứu UTDD di từ quan khác đến, có ung thư khác phối hợp 2.2 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.2.1 Thiết kế nghiên cứu: Nghiên cứu mô tả tiến cứu 2.2.2 Cỡ mẫu nghiên cứu Ước lượng cỡ mẫu theo cơng thức tính cỡ mẫu dựa tỷ lệ nghiên cứu trước đó: 𝑝(1 − 𝑝) 𝑑2 Sun M (2014) cho biết tỷ lệ sống thêm toàn sau mổ năm bệnh nhân UTDD có mức chép GAS5 thấp 30,9% Áp dụng cơng thức, tính cỡ mẫu: n ≥ 82 Thực tế có 96 bệnh nhân đủ tiêu chuẩn chọn bệnh đưa vào nghiên cứu 2.2.3 Các tiêu nghiên cứu ➢ Đặc điểm chung bệnh nhân - Tuổi, giới, thời gian mắc bệnh - Chỉ số khối thể BMI ➢ Đặc điểm lâm sàng, cận lâm sàng - Các triệu chứng năng, thực thể vào viện - Bệnh lý nội khoa kèm - Xét nghiệm huyết học, sinh hóa - Chỉ điểm khối u: CEA, CA 19-9, CA 72.4 - Nội soi dày, cắt lớp vi tính ➢ Đặc điểm giải phẫu bệnh - Vị trí u: 1/3 trên, 1/3 giữa, 1/3 - Kích thước u: chia thành nhóm cm, 11,6% thương tổn ≥ 10 cm Guo P (2013) nghiên cứu 2.379 bệnh nhân UTDD phẫu thuật, tác giả kết luận: kích thước u liên quan với tuổi, vị trí u, mức độ xâm lấn u di hạch - Đặc điểm vi thể: thể ống nhỏ chiếm tỷ lệ cao 65,6%, thể tế bào nhẫn 26%, thể khác gặp - Mức độ xâm lấn u T3 gặp nhiều với 39 trường hợp (40,5%), T4a 34 trường hợp (35,5%), có trường hợp (7,3%) tổn thương khu trú lớp niêm mạc Hầu hết bệnh nhân đến viện giai đoạn muộn, chiếm đến 76% - Nghiên cứu có 62/96 bệnh nhân di hạch chiếm 64,6%, 19,8% N1, 26,0% N2, 11,5% N3a 7,3% N3b Đặc biệt có bệnh nhân nam 49 tuổi di 25 tổng số 25 hạch nạo được, bệnh nhân tử vong sau phẫu thuật tháng Vũ Hải (2009) cho biết tỷ lệ di hạch 72,5% Nguyễn Xuân Kiên (2005) nhận thấy có mối liên quan mức độ xâm lấn u di hạch Với u xâm lấn mạc có 80,4% di hạch; u xâm lấn tạng tỷ lệ di 97,1% Mức độ di hạch liên quan với kích thước u (p=0,001) - Nghiên cứu chúng tơi có 5/96 bệnh nhân (5,2%) có di xa, 15 bệnh nhân di gan, bệnh nhân di phúc mạc bệnh nhân di tụy, bệnh nhân tử vong - Hầu hết bệnh nhân giai đoạn tiến triển, gần giai đoạn III IV Theo Trịnh Hồng Sơn, tỷ lệ bệnh nhân giai đoạn III IV 85,95% Nghiên cứu bệnh nhân chết vòng năm sau mổ tác giả ghi nhận tỷ lệ giai đoạn bệnh I, II, III, IV là: 0%, 10,2%, 75,5%, 14,32% Huang B (2011), nghiên cứu 323 bệnh nhân UTDD giai đoạn Ia Ib, tiên lượng sống thêm sau mổ bệnh nhân giai đoạn sớm khả quan Tỷ lệ sống thêm sau mổ năm 10 năm 97% 91,3% 4.4 KẾT QUẢ SAU MỔ 4.4.1 Đặc điểm phẫu thuật Hầu hết bệnh nhân nghiên cứu mổ mở (94,8%) Thời gian mổ trung bình 204,5 ± 34,5 phút Phẫu thuật cắt bán phần dày chiếm 78,1%, cắt toàn dày 21,9% Nạo hạch D2 thực cho 70 bệnh nhân (72,9%) Tỷ lệ số hạch di căn/ số hạch nạo ≥ 20% 47 bệnh nhân, chiếm 49% trường hợp Nguyễn Quang Bộ (2017) phẫu thuật cắt bán phần dày, nạo hạch D2 cho 53 bệnh nhân Trong mổ nội soi trường hợp (9,4%) mổ mở 48 trường hợp (90,6%) Tổng số hạch vét 440, tổng số hạch dương tính 259, chiếm tỷ lệ 58,8%, cao so với nghiên cứu 4.4.2 Kết sau mổ, tử vong, tai biến biến chứng Thời gian trung tiện sau mổ 3,1± 0,8 ngày Thời gian nằm viện sau mổ 8,46 ± 1,9 ngày (6- 14 ngày) Khơng có tử vong mổ vòng 30 ngày sau mổ Một trường hợp tai biến chảy máu mổ, bệnh nhân phẫu thuật cắt dày ngả nội soi, chảy máu thực nạo vét hạch, bệnh chuyển mổ mở, cắt bán phần dày, hậu phẫu bệnh ổn định, xuất viện sau ngày Các biến chứng sớm sau mổ ghi nhận bao gồm: nhiễm trùng vết mổ, viêm tụy cấp, áp xe tồn lưu, viêm phổi Những bệnh nhân điều trị nội khoa ổn định, can thiệp thêm Một trường hợp tắc ruột sớm ngày thứ sau mổ, phẫu thuật cấp cứu phát dính quai đến lên đại tràng ngang gây tắc ruột, bệnh nhân nối quai 16 đến với quai kiểu Brown, bệnh ổn định, tiếp tục hóa trị xuất viện Xiao H (2018) nghiên cứu tổng số 2.023 bệnh nhân UTDD phẫu thuật triệt từ tháng 11/2010 đến tháng 7/2017 Trong số có 60 bệnh nhân (3%) nhập viện trở lại vòng 30 ngày sau xuất viện, có bệnh nhân (8,3%) vào lại tình trạng cấp cứu bệnh nhân (6,7%) chết ngừng tim đột ngột, xuất huyết tiêu hóa, nhiễm trùng huyết suy đa tạng 4.5 MỨC ĐỘ SAO CHÉP GAS5 VÀ CÁC MỐI LIÊN QUAN 4.5.1 Mức độ chép GAS5 Mức chép trung bình GAS5 mơ u 0,38 ± 0,13 mô lành 2,19 ± 0,77 Như vậy, mức chép GAS5 mô u thấp rõ rệt, 1/6 so với mức chép mô lành (p