Mối liên quan giữa mức độ sao chép gen activation induced cytidine deaminase và tỷ lệ đột biến gen P53 ở mô ung thư gan

Bài viết trình bày nghiên cứu đánh giá mức độ sao chép của AID mô ung thư gan và xác định tỷ lệ đột biến gen p53 ở mô ung thư gan; so sánh mức độ sao chép của AID và tỷ lệ đột biến gen p53 ở mô ung thư gan.

TẠP CHÍ NGHIÊN CỨU Y HỌC MỐI LIÊN QUAN GIỮA MỨC ĐỘ SAO CHÉP GEN ACTIVATION INDUCED CYTIDINE DEAMINASE VÀ TỶ LỆ ĐỘT BIẾN GEN P53 Ở MÔ UNG THƯ GAN Lê Thị Thúy1, Trần Huy Thịnh1, Ơn Quang Phóng2, Trần Vân Khánh1, Tạ Thành Văn1 Trường Đại học Y Hà Nội, 2Bệnh viện Xanh Pôn Activation Induced cytidine Deaminase (AID) tác nhân gây đột biến nội sinh q trình kiểm sốt biểu AID bị cân Các nghiên cứu gần cho thấy gen p53 liên quan đến ổn định gen tế bào kiểm soát phát sinh phát triển khối u Nghiên cứu tiến hành phân tích mối liên quan mức độ phiên mã gen AID tỷ lệ đột biến gen p53 mô ung thư gan Kết nghiên cứu cho thấy: (1) Tỷ lệ mức độ chép gen AID/ß actin mơ ung thư gan 11,09 ± 4,7; mô xơ gan 7,87 ± 1,97 mô gan viêm 2,18 ± 0,75 (2) Tỷ lệ đột biến gen p53 cao mô ung thư gan (17,8%), xơ gan 2,2% không phát đột biến gen p53 mô gan viêm (3) Tỷ lệ mức độ chép gen AID/ß actin mơ gan có đột biến gen p53 9,36 ± 3,13 mơ gan khơng có đột biến gen p53 9,39 ± 5,30 Kết cho thấy mức độ chép gen AID mô ung thư gan cao mô xơ gan cao rõ rệt so với mô gan viêm Tỷ lệ đột biến gen p53 mô gan ung thư cao so với mô gan không ung thư Tuy nhiên chưa thấy khác biệt mức độ chép gen AID mơ gan có khơng có đột biến gen p53 Từ khóa: activation Induced cytidine deaminase (AID), gen p53, ung thư gan I ĐẶT VẤN ĐỀ Quá trình phát sinh ung thư trình liên quan đến tích lũy đột biến gen chi phối tăng sinh chết theo chương trình tế bào (apoptosis) Mặc dù chứng phân tử liên quan trực tiếp đến trình phát sinh phát triển ung thư tế miễn dịch, tăng IgM2 bẩm sinh người [8] Mặt khác, tế bào thẩm quyền miễn dịch, tăng cường tổng hợp enzym AID gây nên tượng chuyển đoạn nhiễm sắc thể, tích lũy đột biến khởi đầu cho q trình ung thư hóa tế bào lành Với vai trò định trình siêu đột biến, AID xem tác nhân gây đột biến nội sinh bào gan chưa rõ ràng, nhà khoa học cho biến đổi liên tục hệ q trình kiểm sốt biểu AID bị cân Khi tác động yếu gen nguyên nhân trình phát sinh tố hoạt hoá, AID tác động trực tiếp lên gen kháng ung thư, bước làm bất hoạt ung thư gan Theo nghiên cứu dịch tể học hầu hết ung thư gan khởi phát bệnh lý viêm gan mạn tính xơ gan AID enzym xúc tác loại bỏ gốc amin cytidin (C) để tạo uracil (U) Gen AID gen then chốt quy định tính đa dạng kháng thể thơng qua hai trình: siêu đột biến (somatic hypermutation) tái tổ hợp gen kháng thể (class switch recombination) Khi gen AID bị đột biến gây hội chứng suy giảm TCNCYH 80 (3) - 2012 chức kháng ung thư gen tích lũy đột biến [7; 9; 10] Gen ức chế ung thư p53 gen tiêu biểu cho áp chế khối u gen cần thiết cho trình ngăn chặn phát triển tế bào bất thường nhằm trì ổn định gen sau tổn thương di truyền tế bào Nghiên cứu gần cho thấy biểu bất thường AID tế bào gan tạo TẠP CHÍ NGHIÊN CỨU Y HỌC đột biến DNA, dẫn đến tích lũy đột biến đốn mơ bệnh học bệnh viện Đại học Y làm biến đổi gen p53 góp phần vào q trình phát sinh khối u [7, 9] Dược thành phố Hồ Chí Minh Để chứng minh vai trò AID q trình phát sinh phát triển ung thư tế bào gan người, nghiên cứu thực với mục tiêu: (1) Đánh giá mức độ chép AID mô ung thư gan, (2) Xác định tỷ lệ đột biến gen p53 mô ung thư gan, (3) So sánh mức độ chép AID tỷ lệ đột biến gen p53 mô ung thư gan II ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP Đối tượng - Mẫu nghiên cứu: mẫu mô gan viêm, 10 mẫu mô xơ gan 30 mẫu mô ung thư gan - Mẫu chứng: mẫu mơ lành lấy vị trí cách khối u, tổ chức xơ viêm 5cm với số lượng tương đương với mẫu nghiên cứu Toàn mẫu nghiên cứu chẩn Tên Phương pháp 2.1 Xác định mức độ chép gen AID mô gan - Real time- PCR khuếch đại gen mã hóa AID ß actin mơ gan: RNA tổng số tách chiết, mức độ chép gen AID mô gan định lượng đối chiếu với gen nội chuẩn ß actin Real time - PCR xác định chu kỳ ngưỡng gen AID chu kỳ ngưỡng gen ß actin Sử dụng phương pháp 2-ΔΔCt Livak để định lượng tương đối mức độ chép gen mơ bệnh (mơ vị trí khối u) mơ lành (mơ cách vị trí khối u 5cm) [4] Tỷ lệ chép gen AID mô ung thư dày so với mô lành cách vị trí khối u R = 2-ΔΔCt Kỹ thuật Real time - PCR định lượng với cặp mồi đầu dò đặc hiệu sau: Trình tự AID forward primer 5'-AAA TGT CCG CTG GGC TAA GG-3' AID reverse primer 5'-GGA GGA AGA GCA ATT CCA CGT-3' AID TaqMan Probe 5'-TCG GCG TGA GAC CTA CCT GTG CTA C-3' β-actin forward primer 5’-GATGGCCACGGCTGCTT-3’ β-actin reverse primer 5’-ACCCTCATTGCCAATGGT-3’ β-actin TaqMan Probe 5’-CTACGAGCTGCCTGACGGCCAGG-3’ Thành phần phản ứng PCR: x Ex-Taq buffer: 2µl; 2,5 mM dNTP: 2µl; Ex Taq polymerase: 0,2µl; 10 pmol Primer: 1µl; 10 pmol Taqman probe: 1µl; cDNA 150 ng/ml: 2µl; nước cất: 11,8µl.Chu trình nhiệt phản ứng PCR: 940C - phút 94 C - 50 giây 58 C - 50 giây 72 C - 50 giây 25 chu kỳ 15 C - phút Thí nghiệm tiến hành lần cho mẫu TCNCYH 80 (3) - 2012 TẠP CHÍ NGHIÊN CỨU Y HỌC Quy trình thực hệ thống 2.3 Xử lý số liệu: Xử lý số liệu theo phần mềm SPSS 16.0 Realtime PCR hãng Eppendorf 2.2 Xác định đột biến gen p53 III KẾT QUẢ - Tách chiết DNA xác định đột biến: exon gen p53 khuếch đại Đặc điểm bệnh nhân phản ứng PCR với cặp mồi đặc hiệu có trình tự sau: - Tuổi: tuổi trung bình nhóm nghiên cứu 54,3 ± 13,0 Tuổi 23, tuổi cao P53-F: 5’- CTTGCCACAGGTCTCCCCAA - 3’; P53-R: 5’- AGGGGTCAGCGGCAAGCAGA - 3’ 80 Tuổi trung bình nhóm viêm gan 50,4 ± 8,3, nhóm xơ gan 58,7 ± 12,2 Sản phẩm PCR exon cắt enzym HaeIII Những trường hợp phát có nhóm ung thư gan 58,7 ± 12,2 Tuổi nhóm khơng có khác biệt (p > 0,05) đột biến kỹ thuật cắt enzym giới hạn - Giới tính: nam chiếm 71,1% nữ chiếm kiểm tra kết kỹ thuật giải trình tự gen hệ thống máy ABI Hoa Kỳ 28,9% Mức độ chép gen AID mô gan Bảng Sao chép gen AID mô gan viêm, xơ gan ung thư gan n 2-ΔΔCt Gan viêm 2,18 ± 0,75 Xơ gan 10 7,87 ± 1,97 Ung thư gan 30 11,09 ± 4,73 Mẫu mô p1-3: gan viêm – ung thư gan p2-3: xơ gan – ung thư gan p1-3 < 0,05 p2-3 < 0,05 p1-2 < 0,05 p1-2: gan viêm – xơ gan - Tỷ lệ chép gen AID/ß actin mơ ung thư gan so với mô lành (cách khối u 5cm) 11,09 ± 4,73, mô gan viêm so với mô lành (cách khối viêm 5cm) 2,18 ± 0,75 mô xơ gan so với mô lành (cách khối xơ 5cm) 7,87 ± 1,97 - Tỷ lệ chép gen AID/ß actin mơ ung thư gan, mơ xơ gan cao rõ so với mô gan viêm (p < 0,05) Tỷ lệ đột biến gen p53 mô gan Bảng Tỷ lệ gen p53 đột biến mô gan Gan viêm (n = 5) Xơ gan (n = 10) Ung thư gan (n = 30) Đột biến Không đột biến 22 Tổng cộng 10 30 Gen p53 TCNCYH 80 (3) - 2012 p > 0,05 TẠP CHÍ NGHIÊN CỨU Y HỌC Bảng Tỷ lệ đột biến gen p53 mô ung thư gan không ung thư gan Không ung thư (n1 = 15) Ung thư gan (n2 = 30) Đột biến Không đột biến 14 22 Tổng cộng 15 30 Gen p53 p < 0,05 - Không phát đột biến gen p53 mô gan viêm; trường hợp đột biến gen p53 nhóm mơ xơ gan, nhiều trường hợp đột biến gen p53 nhóm mơ ung thư gan (p > 0,05) - Khi so sánh nhóm ung thư gan khơng ung thư (bao gồm gan viêm xơ gan) cho thấy tỷ lệ đột biến gen p53 mô ung thư cao so với mô không ung thư Sự khác biệt có ý nghĩa thống kê với p < 0,05 Mức độ chép AID mơ gan có đột biến gen p53 so với mơ gan khơng có đột biến gen p53 Bảng Mức độ chép gen AID mơ gan có khơng có đột biến gen p53 n 2-ΔΔCt Đột biến 9,36 ± 3,13 Không đột biến 36 9,39 ± 5,30 Gen p53 p > 0,05 Tỷ lệ chép gen AID/ß actin mơ gan có đột biến gen p53 9,36 ± 3,13, mơ gan khơng có đột biến gen p53 9,39 ± 5,3 Sự khác biệt ý nghĩa thống kê với p > 0,05 IV BÀN LUẬN Ung thư gan nguyên phát loại ung thư thường gặp Việt Nam quốc gia có tỉ lệ người mắc bệnh ung thư gan đứng hàng thứ giới [1] Đặc biệt, tỷ lệ nam mắc bệnh nhiều nữ Theo “ghi nhận ung thư quần thể” thành phố Hồ Chí Minh 2006, trở thành quốc gia có tỉ lệ người mắc bệnh ung thư gan hàng đầu giới [1] Nghiên cứu cho thấy tỷ lệ mắc ung thư gan nam giới 71,1% nữ giới 28,9%, tỷ lệ mắc bệnh nam gấp khoảng 2.5 lần nữ với p > 0,05 Sự khác biệt khơng có ý nghĩa thống kê số lượng bệnh nhân nghiên cứu nên chưa thể kết luận ung thư gan đứng hàng thứ nam giới với tần suất 24,2/100.000 dân đứng hàng mối liên quan giới tính ung thư gan Kết phù hợp với nghiên cứu thứ nữ giới với tần suất 6,2/100.000 Chen C.J cộng phát tỷ lệ mắc ung thư gan nam gấp 2,4 lần nữ [2] dân Tại Bệnh viện Ung Bướu Tp.HCM, năm tiếp nhận khoảng 500 ca ung thư gan Trong năm gần đây, năm, Việt Nam có đến 10.000 ca mắc bệnh mới, Tuổi trung bình nhóm nghiên cứu 54,3 ± 13,0, tuổi thấp 23 cao 80 Tuổi trung bình nhóm viêm gan 50,4 TCNCYH 80 (3) - 2012 TẠP CHÍ NGHIÊN CỨU Y HỌC ± 8,3, nhóm xơ gan 58,7 ± 12,2 nhóm Kết nghiên cứu cho thấy: mức độ ung thư gan 58,7 ± 12,2 Tuổi nhóm khơng có khác biệt (p > 0,05), kết chép gen AID mô ung thư gan so với mô lành (cách khối u 5cm) 11,09 ± 4,73 nghiên cứu phù hợp với nghiên cứu khác (tuổi thường gặp ung thư gan từ 40 ÷ mơ gan viêm so với mơ lành (cách khối viêm 5cm) 2,18 ± 0,75 (p < 0,05) Trong 60) [2] Gen p53 gen có kích thước lớn mức độ chép gen AID mô xơ gan so với mô lành (cách khối xơ 5cm) 7,87 ± 1,97 nghiên cứu giới cho thấy đột biến (p > 0,05) Tadayuki Kou cộng nghiên hay gặp gen p53 exon 7, vị trí 249 [8] Do vậy, nghiên cứu khảo sát đột cứu in vitro sử dụng dòng tế bào gan người ni cấy cho thấy gia tăng biểu biến gen p53 exon 7, đặc biệt đột biến điểm vị trí 249 (AGG → AGT,), đột biến AID mức độ mRNA tế bào gan viêm mạn 38,7 ± 10,0 tế bào ung thư gan 78,1 ± gây biến đổi acid amin serin thành arginin (249ser) Kết nghiên cứu cho thấy: không 21,0 [10] Nghiên cứu cho thấy khơng có có đột biến gen p53 phát nhóm khác biệt mức độ chép gen AID/ß mơ viêm gan; nhóm mơ xơ gan phát trường hợp đột biến (2,2%) actin mơ gan có đột biến gen p53 9,36 ± 3,13, mơ gan khơng có đột biến gen p53 nhóm mơ ung thư gan phát trường hợp đột biến gen p53 (17,8%) Khi so 9,39 ± 5,3 Kết khác với kết thu từ nghiên cứu in vitro sử dụng dòng sánh nhóm mơ ung thư gan nhóm mơ khơng ung thư gan (mơ viêm gan mô tế bào nuôi cấy tác giả khác Điều lý giải không đồng xơ gan) cho thấy tỷ lệ đột biến gen p53 mô nghiên cứu mức độ phong phú mô gan ung thư cao so với mô gan không ung thư, khác biệt có ý nghĩa thống kê dòng tế bào tỷ lệ khác số lượng tế bào ung thư/các tế bào lành (p < 0,05) Theo Kirk cộng sự, tần suất xuất đột biến gen p53 26,7% tương Thêm vào đó, khác biệt nàycũng nghiên cứu khảo sát đột biến gen p53 đương với kết thu nghiên cứu 26,0%) Như vậy, từ kết nghiên điểm hospot (điểm 249 exon 7) Thành công can thiệp điều trị ung thư cứu thấy đột biến gen p53 đóng gan nguyên phát phụ thuộc nhiều vào thời vai trò quan trọng chế bệnh sinh ung thư gan [3] gian phát bệnh sớm hay muộn Tại Việt Nam, kỹ thuật sinh học phân tử Hiện việc chẩn đoán sớm ung thư gan thách thức ngành y tế áp dụng ngày nhiều vào chẩn đoán theo dõi điều trị bệnh lý gây Chẩn đoán ung thư gan hầu hết thực bệnh nhân giai đoạn vi sinh vật, tổn thương di truyền đặc biệt bệnh lý HBV, HCV, HIV Tuy nhiên, muộn làm hạn chế khả điều trị Do vậy, lĩnh vực ung thư, chưa có nghiên cứu việc tìm dấu ấn phân tử nhằm chẩn đoán sớm chẩn đoán xác định áp dụng kỹ thuật sinh học phân tử để chẩn đoán sớm tiên lượng bệnh hướng nhà khoa học quan tâm Trong AID coi công bố Bởi vậy, nghiên cứu bước đầu cung cấp chứng khoa học giá trị dấu ấn nhiều triển vọng nhằm góp phần làm sáng tỏ chế bệnh sinh TCNCYH 80 (3) - 2012 TẠP CHÍ NGHIÊN CỨU Y HỌC ung thư gan nguyên phát, mở triển hepatocellular carcinoma Oncogene; 24 (38): vọng nghiên cứu chẩn đốn điều trị trúng đích bệnh lý nan giải 5858 - 5867 V KẾT LUẬN Livak KJ, Schmittgen TD (2001) Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the Mức đô chép gen AID mô ung thư (-Delta Delta C(T)) method Method ; 25: 402-8 gan, mô xơ gan cao rõ so với mô gan viêm (p < 0,05) mức độ chép gen AID Muramatsu, M., V.S Sankaranand, S mô ung thư gan cao mô xơ gan Tỷ lệ đột biến gen p53 mô gan ung thư Anant et al (1999) Specific expression of activation-induced cytidine deaminase (AID), a novel member of the RNA-editing deaminase cao so với mô gan không ung thư family in germinal center B cells The Journal (p < 0,05) Chưa phát thấy khác biệt of biological chemistry 274: 18470-18476 mức độ chép gen AID mơ gan có đột biến gen p53 mơ gan khơng có đột biến gen p53 (p > 0,05) Kết nghiên cứu gợi ý vai trò tăng biểu AID làm tăng nhạy cảm tế bào đột biến gen, dẫn đến phát triển q trình ung thư hóa tế bào gan tảng bệnh lý tế bào gan mạn tính TÀI LIỆU THAM KHẢO Muto, T., I.M Okazaki, S Yamada, Y Tanaka, et al (2006) Negative regulation of activation-induced cytidine deaminase in B cells Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 103: 2752 - 2757 Okazaki, I.M., A Kotani, and T Honjo (2007) Role of AID in tumorigenesis Advances in immunology 94: 245 - 273 Revy, P., T Muto, Levy, F Phạm Hoàng Anh, Nguyễn Bá Đức, Nguyễn Mạnh Quốc (2001) Một số đặc điểm dịch tễ học bệnh ung thư dày Việt nam Geissmann, et al (2000) Activation-induced cytidine deaminase (AID) deficiency causes Tài liệu Hội thảo lần – Trung tâm hợp tác nghiên cứu Tổ chức y tế giới ung thư IgM syndrome (HIGM2) Cell: 102, 565-575 dày, Bộ Y tế - Tổ chức Y tế Thế giới, – lan, et al (2003) AID mutant analyses indicate requirement for class-switch-specific cofac- Chen C.J., Yu M.W., Liaw Y.F (1997) Epidemiological characteristics and risk factors of hepatocellular carcinoma Biological Sciences, 294 – 308 Kirk GD, Lesi OA, Mendy M, et al (2005) 249(ser) TP53 mutation in plasma DNA, hepatitis B viral infection, and risk of the autosomal recessive form of the Hyper9 Ta, Van Thanh., H Nagaoka, N Cata- tors Nature immunology 4: 843 - 848 10 Tadayuki Kou 1, Hiroyuki Marusawa, Kazuo Kinoshita, et al (2006) Expression of activation-induced cytidine deaminase in human hepatocytes during hepatocarcinogenesis Cancer: 120, 469 - 476 TCNCYH 80 (3) - 2012 TẠP CHÍ NGHIÊN CỨU Y HỌC Summary RELATIONSHIP BETWEEN LEVEL OF ACTIVATION INDUCED CYTIDINE DEAMINASE TRANSCRIPTION AND P53 MUTATION IN LIVER CARCINOMA TISSUES Activation Induced cytidine Deaminase (AID) has been shown as an endogenous mutator when its expression was not controlled AID acts directly on the tumor suppressor genes by accumulating mutations gradually resulted in inactivation and loss of their function p53 is a frequent target for genetic alteration in various human malignancies The aim of this study was to examine the involvement of AID in the development of human HCC The results indicated that: (1) AID/ß actin transcriptional ratio in the liver cancer tissues and in the liver cirrhosis tissue were 11.09 ± 4.73 and 7.87 ± 1.97, while and AID/ß actin ratio in the chronic hepatitis tissue was 2.18 ± 0.75, respectively (2) Subsequently, mutation frequency in p53 gene from liver cancer tissue, liver cirrhosis tissue were 17.8%, and 2.2% and no detected in the chronic hepatitis tissues (3) AID trancriptional ratio with p53 gene mutation in the liver tissue is 9.36 ± 3.13, AID trancriptional ratio with no p53 gene mutation in the liver tissue is 9.39 ± 5.3 ( p < 0.05) Taken together, our results indicated that AID upregulation in the enhancement of genetic susceptibility to mutagenesis, leading to the development of HCC in the setting of chronic liver Howerver, no significant difference was found in AID transcripts in mutated and non-mutated p53 gene Key words: Activation Induced cytidine Deaminase (AID), p53, liver cancer PHÂN TÍCH NHIỄM SẮC THỂ Ở BA GIA ĐÌNH SINH CON DOWN LIÊN TIẾP VỚI KIỂU GEN NGƯỜI MẸ THỂ KHẢM Nguyễn Văn Rực Trường Đại học Y Hà Nội Hội chứng Down (trisomi 21) hay gặp hội chứng có liên quan đến rối loạn nhiễm sắc thể chiếm tỷ lệ 1/600-1/800 trẻ sơ sinh sống Mục tiêu nghiên cứu nhằm phân tích nhiễm sắc thể (NST) trẻ Down nhiễm sắc thể bố mẹ tư vấn nguy sinh sản cặp bố mẹ Kết nghiên cứu cho thấy người bố có karyotyp bình thường (46, XY), người mẹ thể khảm: 47,XX,+21 [3%]/46,XX[97%], người mẹ thể khảm: 47,XX,+21[4%]/46,XX[96%] Các Down có karyotyp: 47,XY,+21 Từ kết thấy, cặp bố mẹ cần tư vấn nguy sinh sản Từ khóa: hội chứng Down, thể khảm I ĐẶT VẤN ĐỀ Ngày với phương pháp nuôi cấy mô kỹ thuật nhuộm tiêu bản, đặc biệt kỹ thuật nhuộm băng G ngày phát triển cải tiến không ngừng cho phép nhà di TCNCYH 80 (3) - 2012 truyền học phát rối loạn nhiễm sắc thể (NST) số lượng cấu trúc Hội chứng Down (trisomi 21) hay gặp hội chứng có liên quan đến rối loạn NST chiếm tỷ lệ 1/600-1/800 trẻ sơ sinh sống [4, 6] Một nguyên nhân gây ... Bảng Tỷ lệ đột biến gen p53 mô ung thư gan không ung thư gan Không ung thư (n1 = 15) Ung thư gan (n2 = 30) Đột biến Không đột biến 14 22 Tổng cộng 15 30 Gen p53 p < 0,05 - Không phát đột biến gen. .. (p < 0,05) Tỷ lệ đột biến gen p53 mô gan Bảng Tỷ lệ gen p53 đột biến mô gan Gan viêm (n = 5) Xơ gan (n = 10) Ung thư gan (n = 30) Đột biến Không đột biến 22 Tổng cộng 10 30 Gen p53 TCNCYH 80... triển ung thư tế bào gan người, nghiên cứu thực với mục tiêu: (1) Đánh giá mức độ chép AID mô ung thư gan, (2) Xác định tỷ lệ đột biến gen p53 mô ung thư gan, (3) So sánh mức độ chép AID tỷ lệ đột