Nghiên cứu thay đổi lysyl oxidase của tế bào nội mô mạch máu võng mạc ở môi trường nồng độ glucose cao

1 A TÓM TẮT LUẬN ÁN TIẾNG VIỆT GIỚI THIỆU LUẬN ÁN Đặt vấn đề Bệnh võng mạc đái tháo đường nguyên nhân hàng đầu gây giảm thị lực dân số độ tuổi lao động Các nghiên cứu màng đáy mao mạc dày lên dấu hiệu mô học bệnh võng mạc đái tháo đường thúc đẩy trình chết tế bào mạch máu Ngồi ra, màng đáy dày góp phần làm tổn thương hàng rào máu võng mạc dẫn đến tượng tăng tính thấm thành mạch rò rỉ mạch máu võng mạc, dấu hiệu lâm sàng bệnh võng mạc đái tháo đường Mặc dù thay đổi mô học chức kèm với bệnh lý vi mạch đái tháo đường biết đầy đủ, chế nội bào ngoại bào cụ thể liên quan đến thay đổi dẫn đến rối loạn chức bệnh võng mạc đái tháo đường chưa hiểu rõ Lysyl oxidase (LOX) enzyme ngoại bào chứng minh cần thiết cho hình thành hồn thiện chức màng đáy Nghiên cứu Song cộng hàm lượng LOX tăng võng mạc chuột đái tháo đường điều hoà LOX giúp ngăn ngừa tổn thương võng mạc đái tháo đường Ngoài ra, báo cáo gần cho thấy LOX điều hòa yếu tố gây thiếu oxy (HIFs), nhân tố quan trọng việc thúc đẩy trình tân mạch võng mạc bệnh võng mạc đái tháo đường Nghiên cứu mẫu dịch kính bệnh nhân mắc võng mạc đái tháo đường tăng sinh biểu tăng đáng kể nồng độ LOX so với người không mắc bệnh đái tháo đường Tuy nhiên, chế gây rối loạn bất thường LOX cấp độ tế bào chưa rõ ràng Vì chúng tơi tiến hành nghiên cứu " Nghiên cứu thay đổi Lysyl oxidase tế bào nội mô mạch máu võng mạc môi trường nồng độ glucose cao" với mục tiêu: Đánh giá thay đổi mức độ biểu LOX tế bào nội mô mạch máu võng mạc chuột môi trường nồng độ glucose cao Phân tích thay đổi mức độ bám dính LOX với protein chất ngoại bào tế bào nội mô mạch máu võng mạc chuột môi trường nồng độ glucose cao 2 Những đóng góp luận án: - Đây nghiên cứu phân tích đầy đủ biến đổi LOX rối loạn liên quan cấp độ tế bào tế bào nội mô mao mạch võng mạc chuột liên quan nồng độ glucose cao - Nghiên cứu enzym LOX tăng protein toàn phần, protein chất ngoại bào, lượng LOX quay trở lại tế bào giảm lượng LOX môi trường ngoại bào biến thiên theo thời gian tế bào nội mô mạch máu võng mạc chuột môi trường nồng độ glucose cao - Sự rối loạn enzym LOX gây tăng độ thẩm thấu qua màng tế bào kích hoạt tượng chết tế bào theo chương trình Các chất ức chế LOX LOXsiRNA BAPN giúp ngăn ngừa tượng - Nghiên cứu chế gây rối loạn tăng bám dính LOX với protein chất ngoại bào Mơi trường nồng độ glucose cao kích thích liên kết LOX với protein chất ngoại bào bên tế bào làm giảm lượng LOX tế bào Điều tạo nên tín hiệu ngược gây tăng sản sinh LOX dẫn đến tăng hàm lượng LOX gặp bệnh võng mạc đái tháo đường Những phát đem lại hiểu biết sâu chế sinh bệnh võng mạc đái tháo đường mở hướng nghiên cứu phát điều trị sớm bệnh lý Bố cục luận án: Luận án có 102 trang, gồm Đặt vấn đề (2 trang), chương: Chương 1: Tổng quan (27 trang), Chương 2: Đối tượng phương pháp nghiên cứu (23 trang), Chương 3: Kết nghiên cứu (27 trang), Chương 4: Bàn luận (21 trang), Kết luận (2 trang) Ngồi cịn có: phần tài liệu tham khảo, 15 phụ lục, bảng, biểu đồ hình ảnh minh họa kết thử nghiệm Chương 1: TỔNG QUAN 1.1 Đặc điểm mô học mao mạch võng mạc Thành mao mạch võng mạc mỏng, từ ngồi gồm có lớp: lớp nội mô, màng đáy tế bào quanh mạch 1.1.1 Lớp nội mô Lớp nội mô hàng tế bào đa giác dẹt lợp mặt thành mao mạch Các tế bào nội mô liên kết với mối liên kết khe 1.1.2 Màng đáy Màng đáy lớp màng mỏng dày khoảng 50nm, nằm lớp tế bào nội mô tế bào quanh mạch mao mạch Màng đáy mao mạch chứa protein chất ngoại bào xếp cách có tổ chức để hình thành giá đỡ cho tế bào Màng đáy mao mạch đóng vai trị chất để gắn tế bào, tạo nên hàng rào có tính thấm chọn lọc điều hồ sống tế bào Màng đáy có cấu trúc nhiều lớp tạo nhiều thành phần thành phần collagen IV (Coll IV), fibronectin (FN), laminin heparan sulfate proteoglycans xếp theo trình tự nghiêm ngặt để đảm bảo chức tính tồn vẹn màng đáy 1.1.3 Tế bào quanh mạch Tế bào quanh mạch có nhánh bào tương dài bao quanh thành mạch màng đáy bao lấy chúng phía phía ngồi 1.1.4 Bất thường mao mạch võng mạc chuột đái tháo đường Hiện nay, chuột sử dụng phổ biến nhiều nghiên cứu phịng thí nghiệm có kích thước nhỏ, dễ thực kỹ thuật chi phí khơng cao Tuổi thọ chuột ngắn, khởi phát tăng đường huyết triệu chứng bệnh võng mạc đái tháo đường xuất sớm cho phép thực nghiên cứu thời gian ngắn Thêm vào đó, kỹ thuật bảo quản, nuôi cấy tế bào nội mô mạch máu võng mạc chuột không phức tạp tỷ lệ thành công cao Đặc biệt, nghiên cứu chế sinh bệnh chủ yếu thực chuột chúng biểu tổn thương võng mạc đái tháo đường giai đoạn sớm tương tự người Các tổn thương bao gồm tăng số lượng tế bào hình thần kinh đệm, giảm tốc độ dòng chảy động mạch tĩnh mạch, tăng tính thấm thành mạch, tăng độ dày màng đáy mao mạch, rò rỉ mạch máu võng mạc, mao mạch khơng có tế bào chết tế bào ngoại mạch 1.2 Cơ chế sinh bệnh tổn thương mao mạch võng mạc tình trạng đường huyết cao Đái tháo đường Tăng đường huyết Rối loạn chức ty thể Rối loạn kết nối tế bào-tế bào Dày màng đáy Chết tế bào theo chương trình Mạch máu khơng có tế bào Rị mạch máu võng mạc Bệnh võng mạc đái tháo đường Hình Cơ chế sinh bệnh võng mạc đái tháo đường 1.3 Lysyl oxidase Lysyl oxidase (LOX) enzym đóng vai trị thiết yếu cho ổn định mô liên kết mạch máu Các nghiên cứu trước vai trò LOX bất thường liên quan đến cân tổng hợp và/hoặc giáng hoá chất ngoại bào bao gồm tổn thương xơ hố tim (xơ hóa tim), mạch máu (xơ hoá mạch), phổi (xơ hoá phổi), da (seọ hố phì đại), thận (bệnh thận đái tháo đường) gan (xơ hoá gan) 1.3.1 Cấu trúc LOX gọi protein-lysine 6-oxidase, loại protein mã hóa gen LOX nằm nhánh dài, vị trí 23.3-31.2 nhiễm sắc thể số LOX trưởng thành tổng hợp thông qua phân tách protein tiền enzyme N-glycosylated (pro-LOX, 50 kDa), thành protein có hoạt tính (LOX 32 kDa) LOX-propeptide 18 kDa (LOXPP) Mỗi thành viên họ protein LOX đặc trưng chuỗi axit amin đầu tận C chúng bao gồm vị trí gắn đồng để hình thành yếu tố carbonyl vùng giống thụ thể cytokine 1.3.2 Vị trí LOX xác định số mô, bao gồm da, động mạch chủ, tim, phổi, gan, dày, ruột non, đại tràng, sụn, xương, thận, buồng trứng, tinh hoàn, vú, não Trong mắt, enzym LOX phát vùng bè, thể mi, thể thuỷ tinh võng mạc LOX trưởng thành sau phân tách tế bào, phần bám vào chất ngoại bào xúc tác cho q trình hình thành liên kết chéo, phần cịn lại quay trở lại bào tương tập trung nhân tế bào 1.3.3 Chức Nhiều nghiên cứu vai trò quan trọng liên kết chéo qua trung gian LOX tính tồn vẹn chức mô, đặc biệt mô mạch máu mơ liên kết LOX chứng minh đóng vai trị quan trọng việc trì tính ổn định tính tồn vẹn màng đáy liên kết chéo sợi collagen fibronectin qua trung gian LOX giúp màng đáy hoàn thiện chức Ngoài ra, LOX làm tăng biểu tiết yếu tố tăng trưởng nội mô mạch máu (VEGF) liên quan đến hình thành tân mạch 1.4 Tình hình nghiên cứu Việt Nam giới Hiện Việt Nam có nhiều nghiên cứu bệnh võng mạc đái tháo đường, chủ yếu liên quan đến dịch tễ bệnh, biểu lâm sàng hiệu điều trị Rất nghiên cứu chế sinh bệnh bệnh võng mạc đái tháo đường chưa có nghiên cứu thay đổi LOX Trên giới có số nghiên cứu liên quan đến biến đổi ảnh hưởng LOX bệnh đái tháo đường bệnh lý khác Theo nghiên cứu Erler cộng sự, tăng biểu LOX số bệnh ung thư xâm lấn có liên quan đến tăng tính thấm chất ngoại bào bệnh lý so với chất ngoại bào bình thường Nghiên cứu Le Pape cộng đánh giá collagen màng đáy cầu thận liên kết chéo qua trung gian LOX bệnh đái tháo đường báo cáo tỷ lệ dihydroxylysinonorleucine so với hydroxylysinonorleucine tăng lên, chứng tỏ có thay đổi liên kết chéo bệnh đái tháo đường Nghiên cứu sinh hiển vi điện tử Ortoland cho thấy có biến đổi cấu trúc sợi collagen bệnh đái tháo đường Những khác biệt bao gồm tăng mật độ bó sợi fibrin, giảm đường kính bó sợi fibrin hình thái sợi bất thường với biểu sợi xoắn, cong, chồng chéo, rối loạn tổ chức, gợi ý đến tăng liên kết chéo mức sợi fibrin Nghiên cứu khác đường kính bó sợi fibrin thể đường kính sợi phụ thuộc vào giai đoạn xếp sợi fibrin, hoạt động điều hoà LOX Các nghiên cứu thành phần thiết yếu cho tính tồn vẹn màng đáy bao gồm ổn định, xếp sợi fibrin phân cực, phụ thuộc phần lớn vào liên kết chéo thích hợp điều hồ LOX Bất thường hình thái màng đáy mao mạch võng mạc bệnh nhân đái tháo đường phản ánh thay đổi cấu trúc liên kết chéo tăng mức Sự thay đổi biểu hiện tượng màng đáy võng mạc dày lên, đặc điểm bật bệnh võng mạc đái tháo đường Theo nghiên cứu Rodriguez Lucero, tượng dư thừa liên kết chéo phụ thuộc LOX gây tích lũy chất ngoại bào Mặc dù mâu thuẫn nghiên cứu Paszek chứng minh gia tăng độ cứng chất ngoại bào gây tăng cường vận chuyển qua chất ngoại bào cách thay đổi phức hợp tín hiệu thụ thể bề mặt tế bào Gần đây, nghiên cứu hàm lượng LOX tăng võng mạc chuột mắc đái tháo đường điều hoà LOX giúp giảm tổn thương liên quan bệnh võng mạc đái tháo đường Tuy vậy, thông tin liên quan đến mức độ biểu hiện, phân bố điều hoà LOX mạch máu võng mạc cịn chưa rõ ràng A: Chuột bình thường B: Chuột đái tháo đường Hình chụp qua sinh hiển vi điện tử Khung tỉ lệ = 100nm Hình Hiện tượng dày màng đáy mao mạch võng mạc chuột đái tháo đường 1.5 Những vấn đề tồn lý thực đề tài Do tính đa dạng chức sinh học, bất thường mức độ biểu LOX có vai trị chế sinh bệnh nhiều bất thường liên quan cân tổng hợp giáng hoá chất ngoại bào Tuy nhóm bệnh tổn thương vi mạch, so với bệnh lý khác, hiểu biết LOX bệnh võng mạc đái tháo đường hạn chế Nhiều câu hỏi đặt cho nghiên cứu tương lai như: (1) Tình trạng đường huyết cao gây rối loạn biểu enzym LOX nào? (2) Cơ chế tín hiệu tế bào điều hoà biểu LOX tế bào mao mạch võng mạc? (3) Những yếu tố ảnh hưởng tới biểu enzym LOX? (4) Điều hồ mức độ biểu LOX có giúp ngăn ngừa tổn thương mao mạch võng mạc đái tháo đường hay không? Trả lời câu hỏi giúp hiểu rõ chế sinh bệnh võng mạc đái tháo đường, từ mở hướng dự phòng điều trị bệnh võng mạc đái tháo đường liên quan đến rối loạn mức độ biểu enzym CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Đối tượng nghiên cứu - Nhóm nghiên cứu: Các tế bào nội mơ mạch máu võng mạc chuột nuôi cấy môi trường nồng độ glucose cao - Nhóm đối chứng: Các tế bào nội mô mạch máu võng mạc chuột nuôi cấy môi trường nồng độ glucose bình thường 2.2 Địa điểm nghiên cứu Trường Y Đại học Boston, bang Massachusetts, Hoa Kỳ 2.3 Phương pháp nghiên cứu 2.3.1 Thiết kế nghiên cứu: Nghiên cứu thử nghiệm 2.3.2 Mẫu Dựa công thức tính cỡ mẫu theo phương pháp "Resource equation" áp dụng cho nghiên cứu thử nghiệm: n= E/(k+1) Trong n: số thử nghiệm E: sai lệch đối tượng (= 10 đến 20) k: số đĩa tế bào thử nghiệm (2-4) Từ tính giá trị n = 2-7 Do nghiên cứu này, loại thử nghiệm định lượng lặp lại lần tính giá trị trung bình, thử nghiệm định tính chọn ngẫu nhiên vi trường Tổng cộng 104 thử nghiệm bao gồm 102 thử nghiệm định lượng thử nghiệm định tính 2.3.3 Phương tiện nghiên cứu 2.3.4 Cách thức tiến hành 2.3.4.1 Chuẩn bị môi trường nuôi cấy tế bào: Môi trường nồng độ glucose cao (HG, 30mM glucose) mơi trường bình thường (N, 5mM glucose) 2.3.4.2 Mục tiêu 1: Thay đổi mức độ biểu LOX  Các bước xác định hàm lượng LOX protein toàn phần, chất ngoại bào tế bào  Các bước xác định hàm lượng LOX môi trường nuôi cấy tế bào  Các bước xác định hoạt động LOX  Các bước xác định mật độ LOX  Các bước xác định tác động chất ức chế LOX tới mức độ biểu LOX  Các bước xác định độ thẩm thấu tế bào  Các bước xác định tượng chết tế bào theo chương trình 2.3.4.3 Mục tiêu 2: Thay đổi mức độ bám dính LOX  Các bước xác định lượng LOX liên kết với Coll IV FN  Các bước xác định mật độ LOX liên kết với Coll IV and FN 2.3.5 Các số nghiên cứu 2.3.5.1 Mục tiêu 1: Đánh giá thay đổi mức độ biểu LOX tế bào nội mô mạch máu võng mạc môi trường nồng độ glucose cao a Thay đổi hàm lượng LOX  Hàm lượng LOX protein toàn phần  Hàm lượng LOX protein chất ngoại bào  Hàm lượng LOX protein tế bào  Hàm lượng LOX môi trường tế bào - Hàm lượng LOX môi trường tế bào sau ngày nuôi cấy - Hàm lượng LOX môi trường tế bào sau ngày nuôi cấy - Hàm lượng LOX môi trường tế bào sau ngày nuôi cấy - Hàm lượng LOX môi trường tế bào sau ngày nuôi cấy b Thay đổi hoạt động LOX  Họạt động LOX c Thay đổi mật độ LOX  Mật độ LOX protein toàn phần  Mật độ LOX protein chất ngoại bào d Tác động chất ức chế LOX tới mức độ biểu LOX  Hàm lượng LOX  Hoạt động LOX e Tác động thay đổi mức độ biểu LOX tới hoạt động tế bào 10  Tính thấm màng tế bào  Tỷ lệ pAKT/AKT  Số tế bào chết theo chương trình/1000 tế bào 2.3.5.2 Mục tiêu 2: Đánh giá thay đổi mức độ bám dính LOX với protein chất ngoại bào tế bào nội mô mạch máu võng mạc môi trường nồng độ glucose cao a Thay đổi bám dính LOX với protein chất ngoại bào  Trong protein toàn phần - Hàm lượng LOX liên kết với Coll IV - Hàm lượng LOX liên kết với FN  Trong protein chất ngoại bào - Hàm lượng LOX liên kết với Coll IV - Hàm lượng LOX liên kết với FN b Thay đổi mật độ liên kết LOX với protein chất ngoại bào  Trong protein toàn phần - Mật độ LOX liên kết với Coll IV - Mật độ LOX liên kết với FN  Trong protein chất ngoại bào - Mật độ LOX liên kết với Coll IV - Mật độ LOX liên kết với FN 2.4 Phương pháp thu thập số liệu xử lý số liệu Số liệu thu thập mẫu phiếu xử lý phần mềm thống kê SPSS 18.0 Các biến liên tục trình bày dạng trung bình Giá trị nhóm đối chứng quy đổi thành 100% giá trị nhóm nghiên cứu tính theo phần trăm nhóm đối chứng So sánh trung bình thuật toán kiểm định t-student So sánh tỷ lệ thuật tốn điểm định chi2 So sánh nhóm tính theo thuật tốn ANOVA Bonferroni post-hoc Sự khác biệt coi có ý nghĩa thống kê p < 0.05 2.5 Đạo đức nghiên cứu Nghiên cứu thông qua Hội đồng đạo đức Trường Đại học Y Hà Nội 32 2.2 Research location Boston University School of Medicine, Massachusetts, USA 2.3 Study methods 2.3.1 Study design: Experimental research 2.3.2 Study sample size "Resource equation" method for experimental research: n= E/(k+1) n: number of experiments E: difference among objects (= 10 to 20) k: number of cell dishes in an experiment (2-4)  n = 2-7 In this study, each experiment was repeated six times There were 104 experiments in total 2.3.3 Equipments 2.3.4 Protocols 2.3.4.1 Preparation of media: High glucose media (HG, 30mM glucose) and normal media (N, 5mM glucose) 2.3.4.2 Purpose 1: The changes of LOX expression  Evaluation of LOX expression in total protein, extracellular matrix protein and LOX intracellular protocol  Evaluation of LOX expression in the media protocol  Evaluation of LOX activity protocol  Evaluation of LOX distribution protocol  Evaluation of effects of LOX inhibitors on LOX expression protocol  Evaluation of cell permeability protocol  Evaluation of apoptosis protocol 2.3.4.3 Purpose 2: The changes of LOX binding with extracellular matrix proteins  Evaluation LOX bound to Coll IV and FN protocol 33  Evaluation of LOX binding with Coll IV and FN distribution protocol 2.3.5 Evaluation standards 2.3.5.1 Purpose 1: The changes of LOX expression in rat retinal endothelial cells under high glucose condition a The changes of LOX expression  LOX expression in total protein  LOX expression in extracellular matrix protein  LOX internalization expression  LOX expression in the media - LOX expression in day media - LOX expression in days media - LOX expression in days media - LOX expression in days media b The changes of LOX activity  LOX activity c The changes of LOX distribution  LOX distribution in total protein  LOX distribution in extracellular matrix protein d Effects of LOX inhibitors on LOX expression  LOX expression  LOX activity e Effects of LOX changes on cell activity  Cell permeability  pAKT/AKT ratio  Number of cell death/1000 cells 2.3.5.2 Purpose 2: The changes of LOX binding with extracellular matrix protein in rat retinal endothelial cells under high glucose conditon a The changes of LOX bound to extracellular matrix protein expression 34  In total protein - LOX bound to Coll IV expression - LOX bound to FN expression  In extracellular matrix protein - LOX bound to Coll IV expression - LOX bound to FN expression b The changes of LOX bound to extracellular matrix protein distribution  In total protein - LOX bound to Coll IV distribution - LOX bound to FN distribution  In extracellular matrix protein - LOX bound to Coll IV distribution - LOX bound to FN distribution 2.4 Statistical Analyses Data is processed with statistical software SPSS 18.0 Continuous variables are presented as averages All data are expressed as mean ± SD Values from the normal group were considered as 100%, and values from the HG group are expressed as percentages of the normal group Comparisons between groups were performed using the Student’s t-test A level of P