Thao tác kỹ thuật trên saccharomyces cerevisiae ảnh hưởng đến quá trình lên men rượu

Thao tác kỹ thuật trên saccharomyces cerevisiae ảnh hưởng đến quá trình lên men rượu

ĐĐAẠÏII HHOỌÏCC QQUUOỐÁCC GGIIAA TTPP HHOỒÀCCHHÍÍ MMIINNHH TTRRƯƯƠỜØNNGG ĐĐAẠÏII HHOỌÏCC BBAÁÙCCHH KKHHOOAA TTPP HHCCMM KKHHOOAA KKYỸÕ TTHHUUAẬÄTT HHOÓÙAA HHOỌÏCC BBOỘÄ CCOÔÂNNGG NNGGHHEỆÄ SSIINNHH HHOỌÏCC ĐỒ ÁN CHUN NGÀNH THAO TÁC KỸ THUẬT TRÊN SACCHAROMYCES CEREVISIAE ẢNH HƢỞNG ĐẾN Q TRÌNH LÊN MEN RƢỢU GVHD: Th.S HOÀNG MỸ DUNG SVTH: TRẦN TRƯỜNG LUÂN MSSV: 60601418 LỚP: HC06BSH TP. HCM, 07/2010 ii LỜI CẢM ƠN Với tất cả sự chân thành, tôi xin gởi lời cảm ơn đến:  Thạc sĩ Hoàng Mỹ Dung - Bộ môn Công Nghệ Sinh Học-Khoa Kỹ Thuật Hóa Học - Trƣờng Đại Học Bách Khoa TpHCM – đã tận tình hƣớng dẫn và chia sẽ kinh nghiệm qúy báu, luôn động viên và giúp đỡ tôi trong suốt quá trình thực hiện đồ án chuyên ngành.  Các thầy cô trong bộ môn Công Nghệ Sinh Học đã truyền đạt những kiến thức bổ ích giúp tôi có những bƣớc đi rõ ràng để hoàn thành đề tài.  Các bạn sinh viên lớp HC06BSH – Trƣờng Đại Học Bách Khoa TpHCM – đã cùng chia sẽ, trao đổi kinh nghiệm và giúp đỡ tôi trong suốt quá trình làm việc. iii MỤC LỤC CHƢƠNG 1: MỞ ĐẦU . 1 1.1.Đặt vấn đề chọn đề tài. 1 1.2.Mục đích nghiên cứu. . 1 1.3.Nhiệm vụ của đề tài 2 1.4.Ý nghĩa thực tiễn. . 2 CHƢƠNG 2: TÁC ĐỘNG CỦA CÁC YẾU TỐ TRUYỀN THỐNG . 4 KHÁI QUÁT CÔNG NGHỆ SẢN XUẤT RƢỢU VÀ TÁC ĐỘNG CỦA CÁC YẾU TỐ TRUYỀN THỐNG ĐẾN QUÁ TRÌNH LÊN MEN RƢỢU 4 2.1.Khái quát chung về công nghệ sản xuất rƣợu vang. 4 2.1.1.Lịch sử sản xuất rƣợu vang 4 2.1.2.Sơ đồ quy trình công nghệ sản suất rƣợu vang trắng và vang đỏ: . 5 2.1.3. Một số công đoạn quan trọng trong quá trình sản xuất rƣợu vang. 6 2.1.4. Nguyên liệu sản xuất rƣợu vang. 8 2.2.Tổng quan nấm men. 8 2.2.1. Tăng trƣởng ,dinh dƣỡng. . 9 2.2.2. Sinh thái. . 10 2.2.3. Sinh sản: 10 2.2.4. Ứng dụng: . 10 2.3. Nấm men Saccharomyces Cerevisiae. 11 2.3.1 Đặc điểm sinh thái, thành phần cấu tạo, sinh trƣởng và phát triển ở Saccharomyces cerevisiae. . 11 2.3.2. Một số chủng Saccharomyces: . 18 2.4.Cơ sở khoa học của quá trình lên men rƣợu. . 20 2.5.Các yếu tố ảnh hƣởng đến nấm men Saccharomyces cerevisiae trong quá trình lên men rƣợu. . 24 2.5.1. Ảnh hƣởng của nhiệt độ : . 24 2.5.2. Ảnh hƣởng của pH tới quá trình lên men và tác động của các acid lên sự thay đổi pH 27 2.5.3. Ảnh hƣởng của SO2: . 31 2.5.4. Ảnh hƣởng nguồn Carbon 33 iv 2.5.5. Ảnh hƣởng của nguồn nitơ: 34 2.5.6. Ảnh hƣởng của nồng độ đƣờng ( ảnh hƣởng của áp suất thẩm thấu). 35 2.5.7 Ảnh hƣởng của nồng độ ethanol lên quá trình lên men của Saccharomyces cerevisiae. . 36 2.5.8 Ảnh hƣởng của một số hóa chất và chất sát trùng. 38 2.5.9. Ảnh hƣởng của sục khí. 38 CHƢƠNG 3: TÁC ĐỘNG CỦA THAO TÁC KỸ THUẬT 40 TÁC ĐỘNG CỦA THAO TÁC KỸ THUẬT TRÊN GEN HSP26 VÀ YHR087W LÊN QUÁ TRÌNH LÊN MEN RƢỢU . 40 3.1. Tổng quan về HSP26 và YHR087W và giá trị thực tiễn đối với quá trình lên men rƣợu. . 40 3.1.1. Tổng quan và chức năng HSP26,ý nghĩa đối với quá trình lên men rƣợu. 40 3.1.2. Tổng quan và chức năng YHR087W,ý nghĩa đối với quá trình lên men rƣợu. 43 3.1.3. Cơ chế biểu hiện của HSP26 và phƣơng pháp nghiên cứu trên HSP26 và YHR087W. . 44 3.1.4. Phƣơng pháp nghiên cứu trên gen HSP26 và YHR087W. . 45 3.2. Kết quả của thao tác gen tác động lên mức độ biểu hiện của gen HSP26 và YHR087W 47 3.2.1.Minh chứng sự biểu hiện của HSP26 dƣới các điều kiện tác động nhiệt. . 47 3.2.2 Ảnh hƣởng của việc đƣa gen HSP26 và YHR087W thành một plasmid multicopy dƣới sự kiểm soát của promoter của chúng. 49 3.2.3 Hiệu quả của việc đƣa gen HSP26 và YHR087W vào một centromeric plasmid dƣới sự kiểm soát của promoter nó. 50 3.2.4 Ảnh hƣởng của sự thay thế promoter HSP26 hoặc YHR087W bằng promoter của gen SPI1. 52 3.2.5 Ảnh hƣởng của thay thế các promoter YHR087W bởi promoter của gen PGK1 bởi một trong những bản sao di truyền của nó 53 CHƢƠNG 4: BÀN LUẬN VÀ HƢỚNG PHÁT TRIỂN . 54 4.1.Bàn luận . 54 4.2 Hƣớng phát triển. . 55 4.2.1 Phát triển dựa trên các phƣơng pháp kiểm soát tối ƣu điều kiện lên men. 55 v 4.2.2 Phát triển dựa trên việc cải tiến hệ gen của chủng nấm men Saccharomyces cerevisiae. . 56 Tài liệu tham khảo: 57 PHỤ LỤC . 60 vi DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT VÀ THUẬT NGỮ TCA: TriCarboxylic Acid cycle (chu trình acid citric). EMP: Embden-Meyerhof Pathway (chu trình chuyển hóa Glucose thành pyruvate). Chaperone: khả năng gấp cuộn của protein trƣớc điều kiện tác động nhiệt. sHSPs: small Heat Shock Proteins : Nhóm gen chịu điều kiện shock nhiệt. Marker: gen hoặc 1 đoạn DNA với 1 điểm nhận biết trên Nhiễm sắc thể dùng để định danh các tế bào. Episomal plasmid: Chứa điểm khởi đầu sao chép, cần thiết cho quá trình phiên mã của gen nằm trong plasmid. Centromeric plasmid: Chứa centromere đóng vai trò trong quá trình nhân đôi, phân chia của gen trong plasmid. vii DANH MỤC HÌNH Hình 2.1.1: Sơ đồ quy trình sản xuất rƣợu vang trắng và vang đỏ[8]. 5 Hình 2.2.1: Một số loại nấm men: A: Lactobacillus-johnsonii, B: Candida, C: LactobacillusAcidophilus, D: Saccharomyces cerevisiae [31] . 9 Hình 2.3.1: Tế bào nấm men S. cerevisiae trong giai đoạn sinh sản bằng phƣơng pháp tạo chồi [31]. 11 Hình 2.3.2: Tế bào nấm men S. cerevisiae cố định dƣới kính hiển vi điện tử)[26]. . 11 Hình 2.3.3: Chu kỳ sinh sản của tế bào nấm men Saccharomyces cerevisiae [8]. . 15 Hình 2.3.4: Quá trình sinh trƣởng của tế bào chồi con nấm men[8]. 16 Hình 2.3.5: Sinh sản bằng cách nẩy chồi ở nấm men (Sharma,1998) 17 Hình 2.3.6: Giai đoạn sinh sản hữu tính ở nấm men Saccharomyces cerevisiae (Sharma, 1998) 18 Hình 2.4.1: Quá trình chuyển hóa glucose trong tế bào nấm men Saccharomyces cerevisiae [1]. 21 Hình 2.4.2: Quá trình chuyển hóa glucose thành ethanol [31]. 22 Hình 2.5.1: Tác động của nhiệt độ lên mật độ tế bào[28]. 24 Hình 2.5.2: Sự sinh trƣởng của nấm men S. cerevisiea S228C trong môi trƣờng YPD [19]. 27 Hình 2.5.3: Những sự thay đổi trong mức độ lên men tối đa [10]. . 28 Hình 2.5.4: Những minh chứng của cho sự thay đổi pH trong quá trình lên men[10]. 30 Hình 2.5.5: Một số acid có mặt trong nội bào trong suốt quá trình lên men của hèm nho ở 25oC [10]. 30 Hình 2.5.6: Sự thay đổi pH tại các nồng độ acid hữu cơ khác nhau [10]. 31 Hình 2.5.7: Ảnh hƣởng của SO2 lên ethanol và acetaldehyde [9]. 32 Hình 2.5.8: Ảnh hƣởng của SO2 lên acid malic và acid lactic [9]. . 33 viii Hình 2.5.9: Sự giảm glucose, ethanol, và nồng độ glycerol cũng nhƣ là sự phát triển của nấm men dƣới những điều kiện khác nhau về nồng độ glucose [12]. 37 Hình 3.1.1: Cấu trúc của HSP26 [23]. . 41 Hình 3.1.3: Mô hình cấu trúc không gian của gen HSP26 [24]. . 42 Hình 3.1.4: Vị trí, kích thƣớc của YHR087W trên Nhiễm sắc thể VIII của nấm men S.cerevisiae[30,31]. . 43 Hình 3.1.5: Cấu trúc không gian của YHR087W [30]. . 44 Hình 3.1.6: Mẫu thể hiện cơ chế của chaperone dƣới sự kiểm soát nhiệt độ của sHsp. [25]. 45 Hình 3.1.7: Cơ chế nhân số lƣợng bản sao của gen HSP26 [22]. . 46 Hình 3.1.8: Sơ đồ sự hình thành các chủng ICV16 (ICV27)-PPGK1-YHR087W. [22]. . 47 Hình.3.2.1: Hsp26 biểu hiện trong các chủng khác nhau trƣớc và sau khi sốc nhiệt [17]. 48 Hình 3.2.2: Ảnh hƣởng của việc gắn gen HSP26 và YHR087W vào plasmid YEp352 trên gen biểu hiện và kháng stress. [22]. . 49 Hình 3.2.3 : Tác động của việc gắn HSP26 và YHR087W vào centromeric plasmid pRS316 lên chung ICV27 biểu hiện gen, stress thẩm thấu và khả năng lên men [22]. 51 Hình 3.2.4: Sự thay thế thích hợp promoter của gen HSP26 và YHR087W trên chủng ICV16 và ICV27 bằng promoter SPI1 [22]. 52 Hình 3.2.5: Sự thay thế thích hợp promoter của HSP26 và YHR087W bằng PGK1 trên cả hai chủng ICV16 và ICV27 [22]. 53 ix DANH MỤC BẢNG Bảng 2.1: Thành phần các chất có trong cấu trúc của nấm men đƣợc lạnh đông khô[8]. . 12 Bảng 2.2: Các thành phần hóa học trong nấm men đông khô[8]. . 12 Bảng 2.3: Một số chủng nấm men saccharomyces cerevisiae[1]. 19 Bảng 2.4: Tác động điều kiện nhiệt độ lên các sản phẩm của quá trình lên men [28]. . 25 Bảng 2.5 : Sự tác động của yếu tố nhiệt độ lên quá trình lên men rƣợu trên chủng Saccharomyces cerevisiae. 26 Bảng 2.6: Thông số động lực học và pH kết thúc quá trình lên men với những pH ban đầu khác nhau trong môi trƣờng có sự thiếu hụt hoặc hiện diện của acid tartaric. . 29 Bảng 2.7: Ảnh hƣởng của một số acid lên sự sự sinh trƣởng của nấm men. 30 Bảng 2.8: Các thông số đánh giá trong quá trình lên men với thành phần môi trƣờng lên men chứa 20% glucose và các nguồn Nito ban đầu khác nhau[20]. . 35 Bảng 2.9: Tác động của glucose lên một số yếu tố trong quá trình lên men[12]. . 36 Bảng 3.1: Vị trí , thành phần nucleotide và acid amin cấu tạo của HSP26 [29] . 41 Bảng 3.2: Vị trí, thành phần nucleotide, acid amin cấu tạo YHR087W [30]. 43 Chƣơng 1: Mở đầu 1 CHƢƠNG 1: MỞ ĐẦU 1.1.Đặt vấn đề chọn đề tài. Các cuộc cách mạng sinh học phân tử đã mang lại những ý nghĩa mới lạ, tiến bộ với các ứng dụng vào lên men và lƣu trữ rƣợu. Những nghiên cứu trên một số chủng nấm men đã cung cấp những thông tin về môi trƣờng nuôi cấy và mật độ vi sinh vật có trong rƣợu. Đồng thời cho thấy môi trƣờng nuôi cấy phụ thuộc vào phƣơng pháp sinh học phân tử điều này trở thành những thông tin có giá trị trong công nghệ sản xuất rƣợu. Những đoạn gen có giá trị cung cấp những cơ hội hiểu biết và khai thác ứng dụng vi sinh trong sản xuất rƣợu cũng nhƣ là tìm ra chìa khóa của các nhân tố gen đây là cơ sở phát triển giá trị thƣơng phẩm hoặc hạ giá thành của rƣợu[8]. Những tiến bộ trong lĩnh vực sinh học phân tử đã thay đổi quan điểm của các nhà khoa học về việc đánh giá hệ vi sinh có trong rƣợu.Tạo nên cái nhìn mới về tính phức tạp trong các phản ứng chuyển đổi từ các loại trái cây đến rƣợu vang mang đậm mùi vị đặc trƣng [8]. Công nghệ sản xuất rƣợu đã và đang là một công nghệ chuyên nghiệp lâu đời ở nhiều nƣớc trên thế giới. Phƣơng pháp truyền thống là dựa vào kinh nghiệm và kỹ thuật thủ công. Nhƣng ngày nay, những thiết bị tự động hoá đang dần thay thế và đồng thời kiểm soát đƣợc chất lƣợng cũng nhƣ cải thiện đƣợc vấn đề vệ sinh trong quá trình sản xuất. Rƣợu đại diện cho lịch sử ,nền văn hóa của một dân tộc. Ngày này ngƣời dùng không chỉ quan tâm đến sự đa dạng của các loại rƣợu mà còn về chất lƣợng của sản phẩm.Do đó việc cải thiện những kỹ thuật lên men trong quá trình sản xuất là yếu tố quan mà nhà sản xuất hƣớng đến [1]. Việc cải thiện chất lƣợng,khả năng sinh tổng hợp lƣợng,loại bỏ chất độc hại,bổ sung tăng hàm lƣợng chất dinh dƣỡng trong rƣợu là những yêu cầu cấp thiết đối với công nghệ sản xuất rƣợu hiện nay[1]. 1.2.Mục đích nghiên cứu. Việc tối ƣu quá trình lên men tạo ra hàm lƣợng ethanol cao trở thành một yếu tố quan trọng trong kỹ thuật hiện đại. Đã có rất nhiều nghiên cứu về những thay đổi kỹ thuật trong quá trình lên men nhƣ pH, nhiệt độ, nồng độ đƣờng…Hiện nay với những kỹ thuật tiên tiến về sinh học phân tử các nhà nghiên cứu đã không chỉ thay đổi những yếu tố kỹ thuật truyền thống nhƣ trên mà còn tác động đến bộ gen của chủng vi sinh sử dụng lên men rƣợu thông qua những kỹ thuật di truyền. [...]... Nghiên cứu kỹ thuật gen thao tác trên gen HSP26 và YHR087W của Saccharomyces cerevisiae Cơ chế hoạt động sinh tổng hợp trong quá trình lên men Thao tác kỹ thuật nâng cao hàm lƣợng ethanol Đánh giá kết quả mang lại qua các nghiên cứu trên thế giới 1.4.Ý nghĩa thực tiễn Những tác động kỹ thuật trong quá trình lên men rƣợu đã nâng cao chất lƣợng rƣợu thành phẩm Đồng thời, giảm thiểu chi phí cho quá trình sản... tác động kỹ thuật truyền thống lên quá trình lên men, thay vào đó là tác động lên hệ gen của chủng vi sinh Những tác động kỹ thuật ảnh hƣởng tới giá trị cảm quan, chất lƣợng của rƣợu vang thành phẩm và thao tác kỹ thuật gen trên 2 gen HSP26 và YHR087W nằm trong hệ gen của Saccharomyces cerevisiae đã tăng lƣợng ethanol lên đến 10% so với thông thƣờng Điều này đã chứng minh tầm quan trọng của những thao. .. 23 Chƣơng 2: Tác động của các yếu tố truyền thống 2.5.Các yếu tố ảnh hƣởng đến nấm men Saccharomyces cerevisiae trong quá trình lên men rƣợu 2.5.1 Ảnh hƣởng của nhiệt độ : Trong công nghiệp lên men yếu tố nhiệt độ đƣợc đánh giá là nhân tố quan trọng từ khi bắt đầu đến khi kết thúc quá trình lên men Ngày nay đã có rất nhiều nghiên cứu xem xét tác động của nhiệt độ đối với quá trình lên men Nhiều nghiên... những thao tác kỹ thuật gen lên quá trình tối ƣu lƣợng ethanol sinh ra cũng nhƣ là chất lƣợng rƣợu thành phẩm 1.3.Nhiệm vụ của đề tài Tổng quan về chủng nấm men: Saccharomyces cerevisiae giống nấm men đƣợc ứng dụng rộng rãi trong công nghiệp lên men rƣợu hiện nay Làm rõ những đặc điểm sinh lý,di truyền,hệ gen các yếu tố tác động Nghiên cứu các ảnh hƣởng kỹ thuật truyền thống lên quá trình lên men rƣợu... Sự tác động của yếu tố nhiệt độ lên quá trình lên men rƣợu trên chủng Saccharomyces cerevisiae Nhiệt độ Tác động có lợi trong lên men 28-32oC Khoảng nhiệt độ tối ƣu cho quá trình lên men rƣợu[5,11] Tổn thất do tạo men khá cao Ở 29,5oC là 7,37%[2] 32-35oC Thời gian lên men nhanh, hàm lƣợng sản phẩm phụ cao tăng giá trị tạo hƣơng vị cho sản phẩm[5] Lƣợng tế bào chết tăng, mất cân bằng Hoạt tính nấm men. .. đổi chất của nấm men Quá trình chuyển hóa nguồn nguyên liệu thành sản phẩm chính trong lên men rƣợu là ethanol và CO2, ngoài ra trong quá trình lên men còn tạo ra nhiều sản phẩm hữu cơ khác có khả năng ảnh hƣởng tới chất lƣợng của rƣợu vang Do đó hiểu rõ những cơ sở khoa học trong quá trình lên men sẽ giúp cho việc điều khiển quá trình lên men xảy ra theo chiều hƣớng có lợi 20 Chƣơng 2: Tác động của các... Hình 2.4.1: Quá trình chuyển hóa glucose trong tế bào nấm men Saccharomyces cerevisiae [6] Quá trình lên men rƣợu thực chất là một quá trình chuyển hóa đƣờng thành rƣợu etylic, CO2 và các sản phẩm phụ khác .Quá trình chuyển hóa từ đƣờng hexose đến rƣợu etylic và CO2 có thể biểu diễn theo phƣơng trình tổng quát của Gay-Lussac [5] 21 Chƣơng 2: Tác động của các yếu tố truyền thống Hình 2.4.2: Quá trình chuyển... thay đổi sự trao đổi chất của nấm men Việc lên men ở nhiệt độ thấp trở thành một ứng dụng quan trọng trong công nghiệp sản xuất rƣợu vang, một mặt nào đó nó có tác dụng đến quá trình sinh trƣởng của tế bào, bởi vì chúng làm tăng khả năng chịu stress của nấm men trong suốt quá trình lên men Bảng 2.4: Tác động của điều kiện nhiệt độ lên các sản phẩm của quá trình lên men [28] Nồng độ(g/l) 15oC 20oC 25oC... rỉ Có khả năng lên men rƣợu rất tốt, đồng thời có đặc tính lên men bánh mì cao Chủng M (thu đƣợc vào 1905) do Ghenebec Bền và ổn định, thích nghi đƣợc những điều kiện không bình thƣờng trong thực tế sản xuất Lên men trong môi trƣờng chứa các hỗn hợp đƣờng khác nhau Sinh sản nhanh và hiệu suất lên men tƣơng đối tốt 2.4.Cơ sở khoa học của quá trình lên men rƣợu Quá trình lên men là quá trình phức tạp... nhà sản xuất Ngoài những thay đổi về tác động kỹ thuật truyền thống thƣờng dùng có thể dùng những thao tác trên kỹ thuật di truyền để tạo ra những giống nấm men có khả năng tạo ra lƣợng ethanol lớn hơn so với chủng thông thƣờng Thông qua những tác động lên chủng nấm men Saccharomyces cerevisiae nhằm giúp tạo nên một cơ sở dữ liệu về những điều kiện tác động kỹ thuật, về hệ gen và khả năng thích ứng . TÁC ĐỘNG CỦA THAO TÁC KỸ THUẬT ........................................ 40 TÁC ĐỘNG CỦA THAO TÁC KỸ THUẬT TRÊN GEN HSP26 VÀ YHR087W LÊN QUÁ TRÌNH LÊN MEN. xu hƣớng tác động kỹ thuật truyền thống lên quá trình lên men, thay vào đó là tác động lên hệ gen của chủng vi sinh. Những tác động kỹ thuật ảnh hƣởng