Ảnh hưởng của kỹ thuật di truyền học đối với quá trình lên men rượu bằng Saccharomyces cerevisiae

Khái quát chung về công nghệ sản xuất rƣợu vang

• Một số công đoạn quan trọng trong quá trình sản xuất rƣợu vang

Để rƣợu đạt đƣợc sự hài hòa và ổn định của mùi vị và chất lƣợng thì rƣợu phải đƣợc ủ nhằm làm cho khí ôxi tác động thật chậm.Rƣợu vang ủ lạnh sẽ phải ủ lâu hơn rƣợu vang ủ ấm.Rƣợu vang ủ trong bồn thép lớn sẽ phải ủ lâu hơn rƣợu vang để trong các bồn hoặc trong các thùng bằng gỗ. Các loại nguyên liệu trong sản xuất cần đạt độ chín về sinh lý nhằm thu đƣợc dịch quả có hàm lượng acid thấp,hàm lượng đường cao.Ngoài ra còn có một số chỉ tiêu về hình dáng,đặc điểm,các chỉ tiêu về an toàn chất lƣợng thực phẩm nhằm mang lại vang thương phẩm có giá trị.

Nấm men Saccharomyces Cerevisiae

Ty thể đƣợc xem là nơi sản sinh năng lƣợng cung cấp cho các hoạt động sống của tế bào, quá trình sinh tổng hợp ATP, góp mặt trong chuỗi vận chuyển điện tử bên trong màng tế bào, quá trình sinh tổng hợp phospholipid, hoặc trong quá trình β-oxy hóa. Có cấu trúc lớn thứ 2 sau không bào là nhân, đƣợcc bao bọc với lớp màng kép, và rải rác các lỗ nhân ( hiện nay đƣợc gọi là khu phức hợp của nhân, NPC), kiểm soát quá trình trao đổi các phân tử trong và ngoài nhân.Nhân có đường kính từ 0,1- 2àm, cỏc lỗ trờn về mặt cú kớch thước thay đổi được phự hợp với việc trao đổi chất, các protein có khối lƣợng thấp giữa nhân và tế bào chất. Tuy nhiên, sinh sản hữu tính không phải đơn giản nhƣ mô tả ở phần trên; theo Guilliermond (1949), nấm men có 3 loại chu kỳ sinh trưởng hay vòng đời khác nhau đƣợc mô tả ở 3 loại nấm men: Saccharomyces cerevisiae, Saccharomyces ludwigii và Schizosaccharomyces octosporus.

Rosini và al (1982), phân loại lại môi trường của các chủng nấm men của viện vi sinh học của trường Đại học Perouse, đã quan sát, trên 591 chủng S.cerevisiae bảo quản malt thạch, 23 trường hợp mất khả năng lên men galactose, điều đó có nghĩa là 23 chủng này trở nên bayanus theo sự phân loại của Lodder (1970).

Cơ sở khoa học của quá trình lên men rƣợu

Quá trình lên men rượu thực chất là một quá trình chuyển hóa đường thành rượu etylic, CO2 và các sản phẩm phụ khác.Quá trình chuyển hóa từ đường hexose đến rượu etylic và CO2 có thể biểu diễn theo phương trình tổng quát của Gay-Lussac [5]. Đến lúc này, lượng acetaldehit là cơ chất bình thường của enzyme alcohol- dehydrogenase đƣợc tạo thành đã có nhiều, nên enzyme sẽ chuyển H đến cho cơ chât của nó, rƣợu etylic và CO2 đƣợc hình thành từ đây. Trong môi trường acid, glycerin là sản phẩm phụ chỉ được tạo ra trong thời kì cảm ứng.Thực tế cho thấy rằng, sự lên men chỉ xảy ra một cách bình thường cho sản phẩm chủ yếu là rƣợu và một số sản phẩm phụ khác nhƣ glycerin, acid hữu cơ, chỉ trong điều kiện pH của môi trường từ 4-5 và môi trường yếm khí, sự lên men xảy ra mới mạnh mẽ nhƣng khi đó sự phát triển của nấm men có thể bị kìm hãm, do điều kiện yếm khí nên lƣợng Oxy không cung cấp đủ cho quá trình gia tăng sinh khối.

Khi có không khí thì sự lên men sẽ yếu dần đi và nấm men thu nhận năng lƣợng của cần thiết để phát triển theo con đường hô hấp hiếu khí bằng cách oxy hóa glucose để chuyển thành CO2 và H2O.

Các yếu tố ảnh hưởng đến nấm men Saccharomyces cerevisiae trong quá trình lên men rƣợu

Việc lên men ở nhiệt độ thấp trở thành một ứng dụng quan trọng trong công nghiệp sản xuất rƣợu vang, một mặt nào đó nó có tác dụng đến quá trình sinh trưởng của tế bào, bởi vì chúng làm tăng khả năng chịu stress của nấm men trong suốt quá trình lên men. Việc lên men tại những điều kiện nhiệt độ khác nhau dẫn đến sự sinh trưởng của nấm men cũng hoàn toàn khác nhau.Việc sử dụng chửng Saccharomyces cerevisiae EC1118 ở diều kiện nhiệt độ là 15oC và 30oC đã cho thấy những thay đổi đáng kể của nấm men với các điều kiện stress về nhiệt độ. Mặc dù trong suốt quá trình đã đƣợc cung cấp 1 hàm lương amoniac là như nhau nhưng kết quả cho thất lượng sinh khối tạo ra ở 15oC ít hơn lƣợng sinh khối tạo ra ở 30oC và các chủng nấm men công nghiệp biểu hiện tốt hơn so với chủng nấm men trong phòng thí nghiệm.

Phương pháp này được áp dụng để gây men trong điều kiện sản xuất và gọi là nuôi cấy nấm men thuần khiết tự nhiên.Khi cho acid sulfuric vào đường dịch, chúng sẽ không ở dạng tự do mà liên kết hóa học với các muối và giải phóng acid hữu cơ, phosphoric tự do, chủ yếu ở dạng KH2SO4 và NaH2PO4. Việc sử dụng SO2 trong quá trình sản xuất rƣợu vang là điều kiện cần thiết cho sự ổn định về chất lƣợng vang và giảm lƣợng vi sinh có hại đến mức tối thiểu, cũng nhƣ là phòng tránh, ngăn chặn sự hình thành các loại độc tố từ các chủng nấm men thuần gây ra. Tùy theo chất lƣợng của hóa chất mà dùng nhiều hay ít, cốt sao hạn chế đƣợc phát triển của tạp khuẩn nhưng không làm ảnh hưởng xấu đến hoạt động của nấm men.Khi dùng formalin hay fluosilicat natri, nồng độ không vƣợt quá 0,02% so với dịch lên men.

Kết quả của thao tác gen tác động lên mức độ biểu hiện của gen HSP26 và YHR087W

Tất cả những dữ liệu này chứng minh rằng một trong những thao tác nâng cao sức đề kháng stress, chủ yếu ở ICV27, các chủng cho thấy thiếu hụt trong quá trình lên men rƣợu và sức đề kháng kém đối với một số các điều kiện stress đặc thù (Zuzuarregui và del Olmo, 2004a)[22]. Phân tích Northern blot và RT-PCR cho thấy chỉ những thay đổi nhỏ hoặc không có sự thay đổi trong cấp độ mRNA của những gen này trong các chủng biến đổi dưới điều kiện stress thẩm thấu gây ra bởi stress glucose 25% (Hình 3.2.3A). Đối với quá trình lên men (Hình 3.2.4C) trong chủng ICV16, thay thế các promoter của YHR087W, trong một bản sao di truyền của chúng bằng promoter của SPI1 đưa đến kết quả trong việc tiêu thụ lượng đường cao hơn trong suốt 8 ngày đầu tiên trong phương pháp lên men rượu thực hiện trong hèm Macabeo (Requena , 2007) có chứa 200g/l đường[22].

Cải thiện tập tính lên men , ảnh hưởng của việc thay thế promoter của gen YHR087W bởi một trong những bản sao di truyền của nó cho promoter của gen PGK1.Theo các điều kiện stress thử nghiệm (Hình 3.2.5A), sự biểu hiện của gen này tăng từ 10 đến 40 lần trong trường hợp của chủng ICV16 và 3-7 lần cho ICV27, mặc dù chỉ có khả năng chống stress ethanol gia tăng trong cả hai chủng (với sự khác biệt ý nghĩa thống kê trong ICV16) với thao tác này (Hình 3.2.5B)[22].

Bàn luận

Các kết quả này có thể đƣợc giải thích bởi thời điểm phản ứng đƣợc quyết định của cảm ứng trong các điều kiện stress; như dưới điều kiện sốc nhiệt hoặc nồng độ glucose cao cảm ứng xảy ra rất nhanh chóng và cấp độ sự biểu hiện ở cấp độ mRNA khoảng 2-6 lần giữa 30 phút và 2h sau khi tác động những điều kiện bất lợi (Gasch et al., 2000; Kaeberlein et al, 2002.), đây là thời gian đƣợc xem xét trong các thí nghiệm. Cuối cùng, trong các thao tác khác (ví dụ, trong biểu hiện của HSP26 ở espisomal plasmid trong chủng ICV16 hoặc trong centromeric plasmid trong chủng ICV27), các cấp độ mRNA tăng nhƣng khả năng tồn tại trong điều kiện stress đặc biệt là không đƣợc cải thiện, cho thấy rằng các thao tác của một gen cụ thể là không đủ để có đƣợc một hiệu ứng tích cực trong tính năng này. Điều thú vị, khi các promoter PGK1 đƣợc xem xét, sự biểu hiện của YHR087W tăng lên, nhƣng điều này đã không mang lại bất cứ cải tiến trong khả năng lên men, có lẽ vì sự thiếu kiểm soát thời gian chính xác trong biểu hiện trong suốt quá trình lên men.

Theo đó, việc sử dụng điều hòa của một promoter mạnh với các biểu hiện thấp hơn ở những giai đoạn thuận lợi của quá trình, nhƣ PGK1, không thích hợp để thay đổi các cấp độ mRNA của gen stress với mục đích cải thiện khả năng lên men.

Hướng phát triển

Do đó phương pháp kiểm soát tối ưu các điều kiện lên men trở nên hữu hiệu vì có nhiều ƣu điểm nhƣ : không sử dụng máy móc trang thiết bị đắt tiền,dễ dàng thực hiện, việc tiến hành các thí nghiệm để tối ƣu điều kiện lên men nhanh. Phương pháp này có nhiều ưu điểm vượt trội: Tạo được chủng nấm men saccharomyces cerevisiae có khả năng lên men tạo ethanol ở nồng độ cao, cải thiện khả năng lên men, chịu được các điều kiện cực đoan của môi trường( áp thẩm thấu, các acid hữu cơ, nhiệt độ…). Hiện nay trên thế giới việc cải tiến hệ gen ngày càng đƣợc phát triển vì nó mang lại lợi ích lâu dài cho công nghệ sản xuất rƣợu vang, tế bào nấm men có khả năng chịu đƣợc các điều kiện bất lợi mà vẫn tạo ra những sản phẩm rƣợu vang chất lượng.

Vì vậy ở Việt Nam việc cải tiến hệ gen của nấm men là một bước tiến quan trọng và cấp thiết để tạo ra những giống nấm men đạt đƣợc yêu cầu trong sản xuất rượu vang, bên cạnh đó phát triển được ngành công nghệ sinh học nước nhà đặc biệt là lĩnh vực sinh học phân tử.