Giải mã gen kháng nguyên h, phân tích đặc điểm phân tử và xác định phả hệ nguồn gốc của canine distemper virus gây bệnh care ở chó tại hà nội

Bệnh Care hay còn được gọi là bệnh sài sốt ở chó là một bệnh truyền nhiễm cấp tính do virus Canine Distemper (Canine Distemper Virus CDV) gây ra. Đặc trưng của bệnh là sốt cấp tính, rối loạn tiêu hóa, hô hấp và rối loạn hệ thần kinh, đặc biệt bệnh có tỷ lệ chết rất cao (Nguyễn Như Pho, 2003). Bệnh Care được phát hiện lần đầu tiên ở Peru từ thế kỷ XVIII và sau đó lan ra toàn thế giới như Mỹ, Argentina, Brazil, Mexico, Nam Phi và nhiều nước châu Âu. Ở châu Á, bệnh được ghi nhận tại Nhật Bản (Lan và cs., 2006), Thái Lan (Kubo và cs.,2007), Hàn Quốc (Cha và cs.,2013) và Ấn Độ (Swati và cs.,2015). Tại Việt Nam, bệnh xảy ra tương đối phổ biến và là một trong những bệnh có tỷ lệ tử vong cao nhất ở chó. Chó mắc bệnh Care bao gồm chó chưa được tiêm vaccine và cả những chó đã được tiêm vaccine (theo ghi nhận của các phòng khám thú y). Virus gây bệnh Care có hệ gen là RNA sợi đơn âm, có kích thước khoảng 15.7kb, thuộc loài Canine morbillivirus, họ Paramixoviridae, chi Morbillivirus. Hệ gen mã hóa cho 8 protein, gồm 2 protein không cấu trúc (protein C và V) và 6 protein cấu trúc là nucleocapsid (N), matrix (M), fusion (F), hemagglutinin (H), phospho (P) và large (L) protein. Trong đó, protein H và protein F là 2 protein kháng nguyên, quyết định tính độc lực của virus. Đây là các gen có nhiều biến đổi nhất giữa các chủng và giữa các genotype nên được chọn là đối tượng chính cho nghiên cứu dịch tễ phân tử và nguồn gốc phả hệ (Ke và cs.,2015). Có ít nhất 14 genotype khác nhau của CDV đã được công bố, bao gồm: Asia1, Asia2, Asia3, Asia4, Europe, European wildlife, Arctic, Rockbornlike, America1, America2, Africa, South America1, South America2 và South America3 (Espinal và cs., 2014; Guo và cs., 2013).

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM ĐỖ ĐỨC THÀNH GIẢI MÃ GEN KHÁNG NGUYÊN H, PHÂN TÍCH ĐẶC ĐIỂM PHÂN TỬ VÀ XÁC ĐỊNH PHẢ HỆ NGUỒN GỐC CỦA CANINE DISTEMPER VIRUS GÂY BỆNH CARE Ở CHÓ TẠI HÀ NỘI Ngành: Thú y Mã số ngành: 8.64.01.01 LUẬN VĂN THẠC SĨ THÚ Y Người hướng dẫn khoa học: TS Đặng Thị Mai Lan - Đại học Nơng Lâm Thái Ngun TS Đồn Thị Thanh Hương - Viện Công nghệ sinh học Thái Nguyên - 2020 i LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan cơng trình nghiên cứu riêng tơi thực với giúp đỡ của: - Ths Đỗ Thị Roan, Ths Nguyễn Thị Khuê, Ths Phạm Thị Khánh Linh, KS Nguyễn Thị Thu Hiền anh, chị, em Phòng Miễn dịch học Viện Công nghệ Sinh học - Viện Khoa học Công nghệ Việt Nam - Chủ Phịng khám Thú y quận Hà Đơng, Nam Từ Liêm, Cầu Giấy - Hà Nội tạo điều kiện tốt để tơi hồn thành luận văn Các số liệu, kết nêu luận văn trung thực chưa công bố cơng trình khác Tơi xin cam đoan thơng tin trích dẫn luận văn rõ nguồn gốc Thái Nguyên, ngày tháng năm 2020 Tác giả Đỗ Đức Thành ii LỜI CẢM ƠN Để hoàn thành luận văn này, với nỗ lực, cố gắng thân, xin đặc biệt bày tỏ lịng biết ơn sâu sắc tới giáo: TS Đặng Thị Mai Lan TS Đoàn Thị Thanh Hương, người trực tiếp hướng dẫn truyền đạt nhiều kinh nghiệm quý báu cho trình nghiên cứu hồn thành luận văn Tơi xin chân thành cảm ơn tới Ths Đỗ Thị Roan, Ths Nguyễn Thị Khuê, Ths Phạm Thị Khánh Linh, KS Nguyễn Thị Thu Hiền anh, chị, em Phòng Miễn dịch học - Viện Công nghệ Sinh học - Viện Khoa học Công nghệ Việt Nam giúp đỡ tạo điều kiện cho trình nghiên cứu hồn thành luận văn Nhân dịp xin trân trọng cảm ơn Ban Giám hiệu nhà trường, Ban Chủ nhiệm Khoa Chăn nuôi Thú y, thầy cô, anh chị em đồng nghiệp khoa Chăn ni Thú y, Chủ Phịng khám Thú y quận Hà Đông, Nam Từ Liêm, Cầu Giấy - Hà Nội tạo điều kiện tốt để tơi hồn thành luận văn Lời sau cùng, xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành tới người bạn, người thân gia đình bố, mẹ kịp thời động viên tạo điều kiện thuận lợi để tơi hồn thành luận văn Xin trân trọng cảm ơn tất giúp đỡ quý báu Thái Nguyên, ngày tháng năm 2020 Đỗ Đức Thành iii MỤC LỤC LỜI CAM ĐOAN i LỜI CẢM ƠN ii MỤC LỤC iii DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT vi DANH MỤC CÁC BẢNG BIỂU vii DANH MỤC CÁC HÌNH viii MỞ ĐẦU 1 Tính cấp thiết đề tài Mục tiêu nghiên cứu Ý nghĩa đề tài 3.1 Ý nghĩa khoa học 3.2 Ý nghĩa thực tiễn Chương TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Cơ sở khoa học vấn đề nghiên cứu 1.1.1 Nguyên nhân gây bệnh 1.1.2 Con đường xâm nhập cách lây lan 1.1.3 Cơ chế gây bệnh 1.1.4 Triệu chứng lâm sàng bệnh tích 1.1.5 Chẩn đốn phịng, trị bệnh 1.2 Cơ sở pháp lý vấn đề nghiên cứu 14 1.2.1 Đặc điểm sinh học virus Canine Distemper (CDV) 14 1.2.2 Tầm quan trọng việc giải mã hệ gen virus Care 17 1.3 Tổng quan tình hình nghiên cứu giới 20 1.4 Tổng quan tình hình nghiên cứu Việt Nam 22 CHƯƠNG ĐỐI TƯỢNG, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 24 iv 2.1 Đối tượng phạm vi nghiên cứu 24 2.1.1 Đối tượng nghiên cứu 24 2.1.2 Phạm vi nghiên cứu 24 2.1.3 Địa điểm thời gian nghiên cứu 24 2.2 Nội dung nghiên cứu 24 2.2.1 Tình hình chó mắc bệnh Care số quận địa bàn Hà Nội 24 2.2.2 Thu nhận mẫu bệnh phẩm nhiễm CDV 24 2.2.3 Thu nhận gen kháng nguyên H kỹ thuật PCR 24 2.2.4 Giải trình tự nucleotide amino acid gen H 24 2.2.5 So sánh tỷ lệ đồng nucleotide amino acid chủng CDV Việt Nam với chủng giới 24 2.2.6 Xác định phả hệ nguồn gốc chủng CDV Việt Nam 24 2.3 Vật liệu phương pháp nghiên cứu 25 2.3.1 Vật liệu nghiên cứu 25 2.3.2 Phương pháp nghiên cứu 26 CHƯƠNG KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 34 3.1 Kết tình hình chó mắc bệnh Care số Quận địa bàn Hà Nội 34 3.1.1 Tình hình chó mắc bệnh Care số Quận Hà Nội 34 3.1.2 Tỷ lệ chó mắc bệnh Care theo giống 35 3.1.3 Tỷ lệ mắc bệnh Care theo lứa tuổi 37 3.1.4 Tỷ lệ chó mắc bệnh Care theo mùa 39 3.1.5 Tỷ lệ chó mắc bệnh Care theo nhóm tiêm phòng chưa tiêm phòng vaccine 40 3.1.6 Những triệu chứng lâm sàng chó mắc bệnh Care 42 3.2 Kết số mẫu xét nghiệm thu nhận gen H chó mắc bệnh Care 43 3.3 Kết phản ứng PCR giải trình tự nucleotide, amino acid gen H 45 v 3.4 Kết phân tích gen H so sánh với chủng giới 49 3.5 Kết phân tích phả hệ nguồn gốc chủng CDV Việt Nam 55 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 58 Kết luận 58 Đề nghị 59 TÀI LIỆU THAM KHẢO 60 vi DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT CDV: Canine Distemper Virus bp: base pair (cặp base) DNA: Deoxyribonucleic acid RNA: Ribonucleic acid CPE Cyto pathogenic Effect ELISA Enzyme-Linked Immuno Sorbent Assay IHC Immunohistochemistry IF Immuno Fluorescent test RT-PCR Reverse Transcription Polymesase Chain Reaction RT Reverse Transcriptase msf multiple sequence file dNTPs: deoxynucleotide triphosphate MEGA Molecular Evolutionary Genetics Analysis Epp: Eppendorf NCBI: Ngân hàng gen PCR: Polymerase Chain Reaction vii DANH MỤC CÁC BẢNG BIỂU Bảng 2.1 Bộ mồi thu nhận gen H 25 Bảng 2.2: Các bước tách chiết RNA tổng số 27 Bảng 2.3: Thành phần phản ứng chuyển đổi cDNA từ RNA tổng số 28 Bảng 2.4: Thành phần phản ứng PCR 28 Bảng 2.5: Các bước tinh sản phẩm PCR 31 Bảng 3.1 Tỷ lệ chó mắc bệnh Care Quận Hà Nội 34 Bảng 3.2 Tỷ lệ chó mắc bệnh Care theo giống 36 Bảng 3.3 Tỷ lệ chó mắc bệnh Care theo lứa tuổi 37 Bảng 3.4 Tỷ lệ chó mắc bệnh Care theo mùa 39 Bảng 3.5 Tỷ lệ chó mắc bệnh theo nhóm tiêm chưa tiêm phòng vaccine 40 Bảng 3.6 Triệu chứng lâm sàng chủ yếu chó mắc bệnh Care 42 Bảng 3.7 Các mẫu virus CDV sử dụng nghiên cứu 44 Bảng 3.8 Nồng độ RNA tổng số đo máy Nanodrop 45 Bảng 3.9 Danh sách chủng CDV Việt Nam giới sử dụng nghiên cứu 49 Bảng 3.10 Tỷ lệ đống nucleotide amino acid chủng CDV nghiên cứu chủng giới 53 viii DANH MỤC CÁC HÌNH Hình 1.1 Mơ hình cấu trúc virus Canine Distemper (CDV) .15 Hình 1.2 Hình thái virus Canine Distemper 16 Hình 2.1: Sơ đồ nghiên cứu 26 Hình 2.2: Chu trình nhiệt phản ứng PCR 29 Hình 3.1 Biểu đồ tỷ lệ chó mắc bệnh Care Quận Hà Nội .34 Hình 3.2 Biểu đồ tỷ lệ chó mắc bệnh Care theo giống 36 Hình 3.3 Biểu đồ tỷ lệ chó mắc bệnh Care theo lứa tuổi 38 Hình 3.4 Biểu đồ tỷ lệ chó mắc bệnh Care theo mùa .39 Hình 3.5 Biểu đồ tỷ lệ chó mắc bệnh theo nhóm tiêm chưa tiêm phòng vaccine 41 Hình 3.6 Sản phẩm điện di RNA chủng CDV thu thập 43 Hình 3.7 Kết điện di sản phẩm PCR nhân gen H mẫu CDV nghiên cứu 45 Hình 3.8 Trình tự nucleotide amico acid (suy diễn) gen H chủng CDVHN7 47 Hình 3.9 Trình tự nucleotide amino acid (suy diễn) gen H chủng CDVHN6 48 Hình 3.10 Sai khác nucleotide cuối gen H dẫn đến khác biệt chủng virus vaccine so với chủng virus nghiên cứu .54 Hình 3.11 Cây phả hệ thể mối quan hệ nguồn gốc chủng CDV nghiên cứu chủng giới 56 MỞ ĐẦU Tính cấp thiết đề tài Bệnh Care hay cịn gọi bệnh sài sốt chó bệnh truyền nhiễm cấp tính virus Canine Distemper (Canine Distemper Virus - CDV) gây Đặc trưng bệnh sốt cấp tính, rối loạn tiêu hóa, hơ hấp rối loạn hệ thần kinh, đặc biệt bệnh có tỷ lệ chết cao (Nguyễn Như Pho, 2003) Bệnh Care phát lần Peru từ kỷ XVIII sau lan tồn giới Mỹ, Argentina, Brazil, Mexico, Nam Phi nhiều nước châu Âu Ở châu Á, bệnh ghi nhận Nhật Bản (Lan cs., 2006), Thái Lan (Kubo cs.,2007), Hàn Quốc (Cha cs.,2013) Ấn Độ (Swati cs.,2015) Tại Việt Nam, bệnh xảy tương đối phổ biến bệnh có tỷ lệ tử vong cao chó Chó mắc bệnh Care bao gồm chó chưa tiêm vaccine chó tiêm vaccine (theo ghi nhận phòng khám thú y) Virus gây bệnh Care có hệ gen RNA sợi đơn âm, có kích thước khoảng 15.7kb, thuộc lồi Canine morbillivirus, họ Paramixoviridae, chi Morbillivirus Hệ gen mã hóa cho protein, gồm protein không cấu trúc (protein C V) protein cấu trúc nucleocapsid (N), matrix (M), fusion (F), hemagglutinin (H), phospho (P) large (L) protein Trong đó, protein H protein F protein kháng nguyên, định tính độc lực virus Đây gen có nhiều biến đổi chủng genotype nên chọn đối tượng cho nghiên cứu dịch tễ phân tử nguồn gốc phả hệ (Ke cs.,2015) Có 14 genotype khác CDV công bố, bao gồm: Asia-1, Asia-2, Asia-3, Asia-4, Europe, European wildlife, Arctic, Rockbornlike, America-1, America-2, Africa, South America-1, South America-2 South America-3 (Espinal cs., 2014; Guo cs., 2013) 54 Toàn gen H chủng virus nghiên cứu gồm 1824 nucleotide Độ dài giống với đa số độ dài gen H chủng CDV nhiều genotype có chủng vắc xin SnyderHill (JN896987) (thuộc genotype America - 1) lại dài độ dài gen H chủng virus vắc xin Onderstepoort (AF378705) nucleotide tương ứng với amino acid Chín nucleotide nằm cuối gen H Bộ kết thúc chủng nghiên cứu TGA chủng vắc xin lại TAA khiến chủng virus vắc xin Onderstepoort khác hẳn với chủng virus khác vị trí kết thúc 1815 (của gen H) Chủng virus nghiên cứu CDVHN6 có sai khác (T1815C) so với chủng khác vị trí (Hình 3.4) Sự sai khác dẫn đến sai khác amino acid (L605S) Đây khác biệt rõ rệt gen H chủng virus thực địa so với chủng virus vắc xin 1815 Hình 3.10 Sai khác nucleotide cuối gen H dẫn đến khác biệt chủng virus vaccine so với chủng virus nghiên cứu 55 Kết so sánh trình tự nucleotide gen H so với chủng CDV thuộc genotype khác nhận thấy: chủng virus CDV thuộc genotype Asia - có khác biệt hồn tồn với genotype khác vị trí 30 vị trí gen H dẫn đến vị trí sai khác amino acid (A179G, T267N, V359A) vị trí 1590 (tương ứng với vị trí amino acid 530) có khác biệt hồn tồn genotype 3.5 Kết phân tích phả hệ nguồn gốc chủng CDV Việt Nam Hai chủng CDV nghiên cứu phân tích xác định phả hệ nguồn gốc 49 chủng CDV thu thập Việt Nam giới dựa trình tự tồn gen H (Hình 3.11) Trình tự gen H chủng virus CDNHN6 CDVHN7 đưa vào phần mềm tin - sinh chuyên dụng GENEDOC 2.7 MEGA để xác định tỷ lệ tương đồng nucleotide/amino acid xây dựng phả hệ nguồn gốc Phần mềm MEGA sử dụng nghiên cứu phiên cập nhật, sử dụng phương pháp kết nối liền kề (Neighbors joining method) với hệ số tin cậy Bootstrap 1000 Các chủng đưa vào xây dựng nguồn gốc phả hệ chủng thuộc nhiều genotype khác có thời gian phân lập vị trí phân bố khác Kết phân tích phả hệ nguồn gốc chủng CDV dựa liệu trình tự nucleotide gen H Chủng CDVHN6 gần gũi với chủng CDVHN5 thu Hà Nội, Việt Nam năm 2018 (đã giải mã toàn hệ gen) Sự gần gũi vị trí thời điểm thu mẫu tương đối giống (cùng Hà Nội năm 2018) Chủng CDVHN7 lại gần gũi với chủng CDV/dog/HCM/33/140816 thu thành phố Hồ Chí Minh năm 2014 Cả hai chủng nghiên cứu thuộc genotype Asia - Kết thể hình 3.11 56 Asia4-CDV2-TH-2014(MH496773) 65 95 Asia4-CDV1-TH-2014(MH496772) 93 Asia4-CDV8-TH-2014(MH496777) 97 Asia4-CDV-CP8-TH-2017(MT149210) Asia4-CDV3-TH-2014(MH496774) 93 ASIA-4 100 71 28 41 63 64 Asia4-NJ(12)5(CN-2012)-KJ489381 Asia4-NJ(11)2-(CN-2011)-KJ437594 100 Asia4-NJ(12)4-(CN-2012)-KJ437596 Europe-wildlife-R252-US(KF640687) Europe-Uy251-UY-2012(KM280689) Europe-5804-DE(AY386315) 100 100 Europe-5804P-DE(AY386316) America2-01-2689-US-2001(AY649446) America2-A75-17-US(AF164967) America2-164071-US-2004(EU716337) 99 96 America2-171391-513-US-2004(KJ123771) Asia1-CDV4-TH-2014(MH496775) Asia1-CDV6-TH-2014(MH496779) 74 Asia1-CDV-SY-CN-2012(KJ466106) 94 EUROPE AMERICA-2 100 CDVHN7 100 52 82 94 44 Asia1-HCM-33(VN-2014)-LC159587 Asia1-PS-CN-2010(JN896331) Asia1-Canine-NTU(TW-2005)(MK431532) Asia1-CDV-RD-JL-CN-2014(KJ848781) ASIA-1 CDVHN6 99 99 Aisa-1-CDVHN5-(VN-2018) Asia2-007Lm-JP(AB474397) Asia2-50Con-JP(AB476402) Asia2-007Lm-B-JP(AB490680) 100 Asia2-011C-H-JP(AB490674) Asia2-011C-JP(AB476401) 95 Asia2-M25CR-JP(AB475097) Asia2-009L-H-JP(AB490672) 51 Asia2-55L-JP(AB475099) South-Africa-WT01SA-ZA-2016(KY971528) Arctic-25130-IT-2015(KX943324) Arctic-Wa-CDV2013-IT-2013(KC966928) 100 Arctic-Wb-CDV2013-IT-2013(KC966929) 99 Arctic-CDV2784-2013-IT-2013(KF914669) Arctic-BA376-13-ITA-IT-2013(KM115535) 39 63 Arctic-BA201-13-IT-2013(KM115534) 51 Arctic-BA440-13-ITA-IT-2013(KM115536) 96 America1-BJ16C0-CN-2016(MF926601) 100 America1-BJ16C7-CN-2016(MF926602) America1-Onderstepoort(AF378705) America1-SnyderHill-US(JN896987) America1-98-2646-US-1998(AY542312) 99 97 America1-98-2645-US-1998(AY445077) 62 America1-98-2654-US-1998(AY466011) 100 70 100 ASIA-2 AFRICA ARCTIC AMERICA-1 0.01 Hình 3.11 Cây phả hệ thể mối quan hệ nguồn gốc chủng CDV nghiên cứu chủng giới Chú thích: Chủng CDVHN6 CDVHN7 chủng nghiên cứu đánh dấu hình trám ( ) phả hệ nguồn gốc 57 Cây phả hệ cho thấy chủng CDVHN6 CDVHN7 thu nhận Hà Nội năm 2019 thuộc genotye Asia-1 với chủng châu Á bao gồm Trung Quốc, Thái Lan, Đài Loan chủng CDVHN5 Việt Nam phân lập năm 2018 Hà Nội, CDV/dog/HCM/33/140816 Việt Nam phân lập năm 2014 thành phố Hồ Chí Minh; chủng CDVHN6 có quan hệ gần gũi với CDVHN5 Việt Nam, chủng CDVHN7 gần gũi với chủng CDV/dog/HCM/33/140816 Việt Nam (số GenBank: LC159587) Kết nghiên cứu hoàn toàn thống với kết nghiên cứu năm 2018 xác định genotype chủng virus CDV thu nhận Hà Nội dựa liệu gen H (Đoàn Thị Thanh Hương cs., 2018) Các chủng CDV phân lập Thái Lan Trung Quốc năm 2014 tập trung thành genotype Asia-4 có quan hệ gần gũi với nhóm genotype Asia-1 Các tác giả dự đốn genotype Asia-4 Thái Lan gần có nguồn gốc từ chủng thuộc nhóm Asia-1 tiến hóa thành (Piewbang cs., 2019) Các genotype lại nằm nhánh riêng biệt, có độ tập trung cao theo nhóm genotype Nhóm genotype Asia-2 gồm chủng Nhật Bản Nhóm genotype America-1 gồm chủng Mỹ, Anh Trung Quốc Nhóm genotype America-2 tập hợp chủng Mỹ Nhóm genotype Europe gồm tập hợp chủng Mỹ, Anh, Gabon, Brazin, Uruguay Đức Các chủng CDV Ý thuộc genotype Arctic Genotype Africa gồm chủng WT01SA-ZA phân lập Nam Phi năm 2016 Một số nghiên cứu Việt Nam cho thấy: chủng CDV từ năm 2013 - 2018 chưa có biến đổi lớn, thuộc genotype Asia-1 Điều thuận lợi cho cơng tác phịng bệnh vắc xin Việt Nam Tuy nhiên, đáng ý nhiều loại vắc xin sử dụng nhập từ Mỹ nước châu Âu, có khác biệt lớn trật tự hệ gen, không gần gũi phả hệ nguồn gốc với chủng thuộc genotype Asia-1 Do đó, nên thận trọng sử dụng chủng vắc xin nhập tiêm phịng cho chó Việt Nam 58 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ Kết luận Tại Quận (Hà Đông, Nam Từ Liêm, Cầu Giấy - Hà Nội), chó mắc bệnh Care có đầy đủ triệu chứng lâm sàng đặc trưng bệnh: sốt, bỏ ăn ăn ít, nơn mửa, ỉa chảy, phân có lẫn máu, vùng da mỏng có nốt chấm đỏ (nốt sài), chảy dịch mắt dịch mũi có triệu chứng thần kinh…., tỷ lệ chó mắc bệnh 19,05% với 74,53% số chết bệnh Trong đó, giống chó lai có tỷ lệ mắc bệnh cao chiếm 40,90%; giống chó nội có tỷ lệ mắc bệnh 29,13% giống chó ngoại 11,20% Chó từ - tháng tuổi chó có tỷ lệ mắc bệnh cao chiếm 23,28%; giai đoạn đến 12 tháng tỷ lệ từ 11,11 - 11,92% Chó thường mắc bệnh với tỷ lệ cao vào mùa xuân (32,91%); mùa thu thấp (2,00%) Nếu tiêm phòng đầy đủ tỷ lệ mắc 8,91%; chưa tiêm phòng có tỷ lệ mắc bệnh chiếm 28,84% Đã xác định lựa chọn mẫu CDVHN6, CDVHN7 để tách chiết RNA thu RNA tổng số với nồng độ mẫu CDVHN6 165 ng/µl, CDVHN7 202 ng/µl Sản phẩm PCR thu có kích thước dự đoán, chất lượng sản phẩm tốt Sản phẩm tiếp tục tinh thu đoạn DNA có kích thước 2021 nucleotide, chứa hồn tồn gen H có kích thước 1824bp Đã xác định chủng virus phân lập có hệ số tương đồng cao so với chủng công bố Ngân hàng gen với tỷ lệ đồng 97,30% nucleotide tỷ lệ tương đồng 97,20% amino acid Đã phân tích phả hệ chủng CDVHN6 CDVHN7 thu nhận Hà Nội năm 2019 cho thấy chủng thuộc genotye Asia-1 với chủng châu Á bao gồm Trung Quốc, Thái Lan, Đài Loan 59 Đề nghị - Cần tiếp tục có nghiên cứu sâu rộng gen kháng nguyên virus Care chó - Áp dụng kết nghiên cứu sở để nhằm phát triển sản xuất vaccine tái tổ hợp - Người ni chó cần trọng đến việc phòng, chống bệnh Care cách hiệu nhằm giảm thiệt hại chăn nuôi - Cần thận trọng sử dụng chủng vắc xin nhập từ Mỹ nước châu Âu tiêm phòng cho chó Việt Nam khác biệt lớn trật tự hệ gen, không gần gũi phả hệ nguồn gốc với chủng thuộc genotype Asia-1 60 TÀI LIỆU THAM KHẢO I Tài liệu tiếng Việt Hồ Đình Chúc (1993), Bệnh Care đàn chó Việt Nam kinh nghiệm điều trị, Cơng trình nghiên cứu, Hội Thú y Việt Nam Tơ Du, Xn Giao (2006), Kỹ thuật ni chó mèo phòng trịnh bệnh thường gặp, Nxb Lao động Xã hội, Hà Nội Nguyễn Văn Dũng, Vũ Kim Chiến, Phan Xuân Thảo (2018), “Phân lập xác định đặc tính di truyền virus gây bệnh Care chó ni thành phố Hồ Chí Minh”, Tạp chí Khoa học Kỹ thuật Thú y, 15(4): 19 - 26 Nguyễn Bá Hiên, Trần Thị Lan Hương (2009), Giáo trình miễn dịch học thú y, Nxb Nơng Nghiệp, 79 - 84 Nguyễn Bá Hiên, Trần Thị Lan Hương (2010), Giáo trình miễn dịch học ứng dụng, Nxb Nông Nghiệp, 153 -156 Nguyễn Thị Huyền, Nguyễn Vũ Sơn, Phạm Ngọc Thạch, Nguyễn Hữu Nam (2018), “Một số đặc điểm bệnh lý chủ yếu chó gây nhiễm thực nghiệm chủng virus CDV-HV”, Tạp chí Khoa học Kỹ thuật Thú y, 15(4): 27 - 35 Nguyễn Thị Huyền, Nguyễn Vũ Sơn, Phạm Ngọc Thạch, Nguyễn Hữu Nam (2019), “Một số đực điểm dịch tễ bệnh Care chó Hà Nội”, Tạp chí Khoa học Nông nghiệp Việt Nam, 17(4): 279 - 287 Đoàn Thị Thanh Hương, Nguyễn Thị Khuê, Đỗ Thị Roan, Nguyễn Ngọc Trâm, Lê Thị Kim Xuyến, Nguyễn Thị Bích Nga, Lê Thanh Hòa (2018), “Đặc điểm phân tử phả hệ nguồn gốc virus gây bệnh Care (Cannine Distemper Virus) phân lập năm 2017 Hà Nội” Hội nghị khoa học Cơng nghệ sinh học tồn quốc 2018, Nxb Khoa học Tự nhiên & Công nghệ: 1705 - 1711 61 Nguyễn Thị Lan, Bounheuhang Sihoungvanh, Nguyễn Thị Yến, Nguyễn Hữu Nam (2015), “Một số đặc điểm bệnh lý chó gây bệnh thực nghiệm chủng virus Care (CDV-768)”, Tạp chí Khoa học Phát triển 13(1): 56 - 64 10.Nguyễn Thị Lan, Trần Trung Kiên (2010), “Nghiên cứu bệnh Care chó vùng Hà Nội phương pháp giải phẫu bệnh lý mơ hóa miễn dịch”, Tạp chí Khoa học Kỹ thuật Thú y, 7(2): 14 - 18 11.Nguyễn Thị Lan, Khao Keonam (2012), “Đặc điểm bệnh lý chó Phú Quốc mắc bệnh Care ứng dụng kỹ thuật miễn dịch huỳnh quang để chẩn đốn bệnh”, Tạp chí Khoa học Phát triển, 10(6): 913 - 918 12.Diệp Thị Diễm My, Trần Ngọc Bích, Trần Thị Thảo, Nguyễn Khánh Thuận, Huỳnh Kim Diệu (2020), “Bệnh Care chó thành phố Sa Đéc, tỉnh Đồng Tháp”, Tạp chí Khoa học Kỹ thuật Thú y, 17(4): 25 - 30 13 Nguyễn Hữu Nam (2010), Nghiên cứu lưu hành virus Care gây bệnh chó vùng phụ cận Hà Nội phương pháp miễn dịch chọn chủng để chế vaccine phịng bệnh Báo cáo tóm tắt tổng kết đề tài, - 14 Trần Văn Nên, Nguyễn Thị Lan, Nguyễn Thị Hoa, Nguyễn Hữu Nam (2016), “Đánh giá khả bảo hộ vacxin vô hoạt Care từ chủng CDV-VNUA-768 chó thí nghiệm”, Tạp chí Khoa học Phát triển, 14 (1): 21 - 27 15 Trần Văn Nên, Nguyễn Thị Lan, Nguyễn Văn Thanh, Lương Quốc Hưng (2017), “Nghiên cứu số đặc điểm sinh học phân tử virus Care phân lập số tỉnh phía Bắc Việt Nam”, Tạp chí Khoa học Nơng nghiệp Việt Nam, 15(1): 44 - 57 16.Nguyễn Như Pho (2003), Bệnh Parvovirus Care chó, Nxb Nơng nghiệp, Hà Nội 17.Phan Thị Hồng Phúc, Nguyễn Thị Ngân, La Văn Cơng, Đặng Thị Mai Lan, Nguyễn Thị Bích Đào, Nguyễn Đình Thắng (2019), “Nghiên cứu 62 số đặc điểm dịch tễ chó mắc bệnh Care Bệnh xá Thú y, trường Đại học Nông Lâm Thái Nguyên”, Tạp chí Khoa học Kỹ thuật Thú y, 16(4): 43 - 50 18.Phan Thị Hồng Phúc, Phạm Thị Trang, Phạm Thị Phương Lan (2020), “Một số đặc điểm bệnh lý chó mắc bệnh Care khám điều trị Bệnh xá thú y, trường Đại học Nông Lâm Thái Nguyên”, Tạp chí Khoa học Kỹ thuật Thú y, 17(4): 31 - 36 19.Nguyễn Vĩnh Phước (1978), Giáo trình bệnh truyền nhiễm gia súc, Nxb Nông nghiệp 20.Lê Thị Tài (2006), Một số bệnh virus, Nxb Nông Nghiệp 21.Trần Thị Thảo, Trần Ngọc Bích, Nguyễn Phúc Khánh (2019), “Bệnh Care chó thành phố Trà Vinh”, Tạp chí Khoa học Kỹ thuật Thú y, 16(8): 22 - 27 II Tài liệu tiếng nước 22 Alessia Peserico, Maurilia Marcacci, Daniela Malatesta, Marco Di Domenico, Annamaria Pratelli, Iolanda Mangone, Nicola D’Alterio, Federica Pizzurro, Francesco Cirone, Guendalina Zaccaria, Cesare Cammà, Alessio Lorusso (2019), “Diagnosis and characterization of canine distemper virus through sequencing by MinION nanopore technology”, Scientific reports, 9:1714 23.An D.J., Yoon S.H., Park J.Y., No I.S., Park B.K (2008), “Phyogenetic characterization of canine distemper virus isolates from naturally infected dogs and marten in Korea”, Veterinary Microbiology, 132: 389 - 395 24.Angelika K Loots, Emily Mitchell, Desiré L Dalton, Antoinette Kotzé, Estelle H Venter (2017), “Advances in canine distemper virus pathogenesis research: a wildlife perspective”, Journal of General Virology, 98: 311 - 321 25 Appel M.J.G., Gillespie J.H (1972), "Canine Distemper Virus", Volume 63 11 of the series Virology Monogiaphs/Die V11US foischung 111 Einzeldarstellungen Vienna: Springer Vienna, - 96 26 Assessment M.E (2005), Ecosystems and human well-being, World Resources Institute Springer New York, 159 27.Bevan Sawatsky, Veronika von Messling (2010), “Canine Distemper Viruses Expressing a Hemagglutinin without N-Glycans Lose Virulence but Retain Immunosuppression”, Jouranl of virology, 2753 – 2761 28.Blancou J (2004), “Dog distemper: imported into Europe from South America?” Hist Med Vet, 29(2): 35 - 41 29.Carter S.D., May C., Bell S.C (1992), “Canine distemper virus and rheuma toid arthritis in dogs”, Veterinary Microbiology, 123 - 145 30.Carvalho O.V., Botelho C.V., Ferreira C.G., Ferreira H.C., Santos M.R., Diaz M.A., Oliveira T.T., Soares-Martins J.A., Almeida M.R., Silva Júnior A.S (2013), “In vitro inhibition of canine distemper virus by flavonoids and phenolic acids: Implications of structural differences for antiviral design”, Research in Veterinary Science, 95(2): 717 - 724 31 Cha S.Y Seo H.S., Kang M., Jang H.K (2013), “Serologic survey for antibodies to canine parvovirus and influenza virus in wild raccoon dogs (Nyctereutes procyonoides) in South Korea”, Journal of Wildlife Diseases, 49: 200 - 202 32 Cheng Y., Wang J., Zhang M., Zhao J., Shao X., Ma Z., Zhao H., Lin P., Wu H (2015), Isolation and sequence analysis of a canine distemper virus from a raccoon dog in Jilin Province, China Virus Gene 33.Chutchai Piewbang, Araya Radtanakatikanon, Jiratchaya Puenpa, Yong Poovorawan , Somporn Techangamsuwan (2019), “Genetic and evolutionary analysis of a new Asia-4 lineage and naturally recombinant canine distemper virus strains from Thailand”, Sci Rep, 9: 3198 64 34.David T Smith, Donald S Martin (1979), Zinser’s Text book of Bacteriology, 808 - 810 35 Diallo A (1990), “Morbillivirus gruop: genome organisation and proteins”, Veterinary Microbiology, 23: 155 - 163 36.Demeter Z., Plade E.A., Hormyak A., Rusvai M (2010), “Controversial results of the genetic analysis of a canine distemper vaccine strain”, Vet Microbiol, 142: 420 - 426 37.Dung N.V., Suzuki J., Minami S., Yonemitsu K., Nagata N., Kuwata R., Shimoda H., Vu C.K., Truong T.Q., Maeda K (2016), “Isolation and phylogenetic analysis of canine distemper virus among domestic dogs in Vietnam”, J Vet Med Sci, 79(1):123 - 127 38.Duque Valencia J., Sarute N., Olarte Castillo X A., Ruíz Sáenz J (2019), “Evolution and Interspecies Transmission of Canine Distemper Virus-An Outlook of the Diverse Evolutionary Landscapes of a Multi-Host Virus” Viruses, 11(7): 582 39 Gámiz C., Martella V., Ulloa R., Fajardo R., Hernandér I Q., Martínez S (2011), “Indentification of a new genotype of canine distemper virus circulating in America”, Vet Res Commun, 35: 381 - 390 40.Greene C.E., Appel M.J (1987), Canine distemper In Clinical microbiology and infectious diseases of the dog and cat, 386 - 405 Edited by Greene C E Philadelphia: W B Saunders 41.Hashimoto M., Une Y., Mochizuki M (2001), “Hemagglutinin genotype profiles of canine distemper virus from domestic dogs in Japan” Arch Virol, 146: 149 - 155 42.Hirama K., Goto Y., Uema M., Endo Y., Miura R., Kai C (2004) “Phylogenetic analysis of the hemagglutinin (H) gene of canine distemper viruses isolated from wild masked palm civets (Paguma larvata)” J Vet Med Sci, 66(12): 1575 - 1578 65 43.Ke G.M., Ho C.H., Chiang M.J., Shanno D., Chung C.S., Lin M.Y., Shi Y.Y., Yang M.H., Tyan Y.C., Liao P.C., Chu P.Y (2015), “Phylodynamic analysis of the canine distemper virus hemagglutinin gene”, BMC Vet Res, 11: 164 44.Kennedy S., Smyth J.A., Cush P.F., Duignan P., Platten M., McCullough S.J., Allan G.M (1989), Histopathologic and immune histochemmical studies of distemper in seal, Veterinary Pathology, 97 - 103 45.Kubo T., Kagawa Y., Taniyama H., Hasegawa A (2007), “Distribution of inclusion bodies in tissues from 100 dogs infected with canine distemper virus”, J Vet Med Sci, 69(5): 527 - 529 46.Krumm S A., Yan D., Hovingh E S., Evers T.J., Enkirch T., Reddy G P., Sun A., Saindane M T., Arrendale R F., Painter G., Liotta D C., Natchus M G., Messling V V., Plemper R K (2014), “An Orally Available, Small-Molecule Polymerase Inhibitor Shows Efficacy Against a Lethal Morbillivirus Infection in a Large Animal Model”, Science Translational Medicine ,Vol 6, Issue 232: 232 - 252 47.Lamb R.A.; Kolakofsky D (2001), “Paramyxoviridae: the viruses and theirreplication” In: Fields, D.M; Knipe, D.M; Howley, P.M (ed) Fields virology 4th ed Phialdephia: Lippincott-William&Wilkins, 1305 - 1443 48.Lan N.T., Yamaguchi R., Furuya Y., Inomata A., Ngamkala S., Noganobu K., Kai K., Mochizuki M., Kobayashi Y., Uchida K & Tetayama S (2005), “Pathogenesis and phylogenetic analyses of canine distemper virus strain 007Lm, a new isolate in dogs”, Vet Microbiol 110 (3 - 4): 197 - 207 49.Lan N.T., Yamaguchi R., Inomata A., Furuya Y., Uchida K., Sugano S & Tetayama S (2006), “Comparative analyses of canine distemper viral isolates from clinical cases of canine distemper in vaccinated dogs”, Vet Microbiol 115(1 - 3): 32 - 42 66 50 Nguyen Thi Lan, Ryoji Yamaguchi, Tran Trung Kien Takuya Hirai, Yuichi Hidaka and Nguyen Huu Nam (2008), “First Isolation and Chaiactenzation of Canine Distemper Virus in Vietnam with the Immunohistochemical Examination of the Dog”, J Vet Med Sci, 155-162 51.Lednicky J.A., Dubach J., Kinsel M.J (2004) “Genetically distant American Canine distemper virus lineages have recently caused epizootics with somewhat different characteristics in raccoons living around a large suburban zoo in the USA” Virol J 1, 52.Li W., Cai C., Xue M., Xu G., Wang X., Zhang A., Han L (2018), “Phylogenetic analysis of canine distemper viruses isolated from vaccinated dog in Wuhan”, J Vet Med Sci, 80(11): 1688 - 1690 53.Ling Guo, Shao-lin Yang, Cheng-dong Wang, Rong Hou, Shi-jie Chen, Xiao-nong Yang, Jie Liu, Hai-bo Pan, Zhong-xiang Hao, Man-li Zhang, San-jie Cao, Qi-gui Yan (2013), “Phylogenetic analysis of the haemagglutinin gene of canine distemper virus strains detected from giant panda and raccoon dogs in China”, Virology Journal, 10:109 54 Maclachlan N.J., Dubovi E.J (2011), Paramyxoviridae Fenner’s veterinary virology ed California, San Diego: Academic Press, 299 - 325 55.Maria A Espinal, Francisco J Díaz, Julian Ruiz-Saenz (2014), “Phylogenetic evidence of a new canine distemper virus lineage among domestic dogs in Colombia, South America”, Veterinary Microbiology, 172: 168 - 176 56.Messling V.V., Zimmer G., Herrler G., Haas L., Cattaneo R (2001), “The Hemagglutinin of Canine Distemper Virus Determines Tropism and Cytopathogenicity”, J Virol 75(14): 6418 - 6427 57.Nicholas K.B., Nicholas H.B (1999), GeneDoc: a tool for editing and annotating multiple sequence aligntment Distributed by authors 67 58.Piewbang C., Radtanakatikanon A., Puenpa J., Poovorawan Y., Techangamsuwan S (2019), “ Genetic and evolutionary analysis of a new Asia-4 lineage and naturally recombinant canine distemper virus strains from Thailand, Scientific Reports, 9: 3198 59.Pope J.P., Miller D.L., Riley M.C., Anis E., Wilkes R.P (2016), “Characterization of a novel Canine distemper virus causing disease in wildlife”, J Vet Diagn Invest, 28 (5): 506 - 513 60.Renata da Fontoura Budaszewski, Veronika von Messling (2016), “Morbillivirus Experimental Animal Models: Measles Virus Pathogenesis Insights from Canine Distemper Virus”, Viruses, 8: 274 61 Sawatsky B., Messling V V (2010), “Canine distemper viruses expressing a hemagglutinin without N-glycans lose virulence but retain immunosuppression”, J Virol, 84(6): 2753 - 2761 62.Sidhu M.S., Husar W., Cook S.D., Dowling P.C., Udem S.A (1993), “Canine distemper terminal and intergenic non-protein coding nucleotide sequences: completion of the entire CDV genome sequence”, Virology, 66 - 72 63.Swati, Deka D., Uppal S.K., Verma R (2015), “Isolation and phylogenetic characterization of Canine distemper”, Virus Dis, 26(3): 133 - 140 64.Trejo-Avila L M., Morales-Martínez M E., Ricque-Marie D., Cruz- Suarez L E., Zapata-Benavides P., Morán-Santibanez K., RodríguezPadilla C (2014), “In vitro anti-canine distemper virus activity of fucoidan extracted from the brown alga Cladosiphon okamuranus”, Virus Disease, 25: 474 - 480 III Tài liệu Internet 65 http://www.marvistavet.com/canine-distemper 66 www.veteriankey.com 67 http://www.ncbi.nlm.nih.gov ... mắc bệnh Care chó số quận địa bàn Hà Nội - Nghiên cứu xác định gen kháng nguyên H, phân tích đặc điểm phân tử, xác định phả hệ nguồn gốc virus CDV, xác định genotype chủng virus gây bệnh Care chó. .. tiến hành nghiên cứu đề tài: ? ?Giải mã gen kháng nguyên H, phân tích đặc điểm phân tử xác định phả hệ nguồn gốc Canine Distemper virus gây bệnh Care chó Hà Nội? ?? Mục tiêu nghiên cứu - Xác định. .. bàn Hà Nội 3 Ý nghĩa đề tài 3.1 Ý nghĩa khoa học - Cung cấp tư liệu khoa học gen kháng nguyên H, đặc điểm phân tử phả hệ nguồn gốc virus CDV gây bệnh Care chó - Cung cấp thêm thơng tin thành