ĐẶT VẤN ĐỀ Ung thư dạ dày (UTDD) là loại ung thư thường gặp, có ảnh hưởng to lớn đến sức khỏe cộng đồng. Theo thống kê của Globocan 2018, thì UTDD là loại ung thư phổ biến thứ 5 và là nguyên nhân gây tử vong thứ 3 ở cả hai giới [1] . Hầu hết UTDD là không di truyền, tuy nhiên khoảng 10% các trường hợp UTDD có tính chất gia đình, trong đó UTDD lan tỏa di truyền chiếm 1-3% [2] Ung thư dạ dày lan tỏa di truyền là bệnh lý di truyền hiếm gặp, đặc trưng bởi mô bệnh học là những tế bào ung thư kém biệt hóa, xâm lấn lan tỏa ở lớp dưới niêm mạc nên khó phát hiện sớm. Biểu hiện lâm sàng trong UTDD lan tỏa di truyền là bệnh thường khởi phát khi tuổi còn trẻ (tuổi trung bình phát hiện là 38), tiến triển nhanh, tiên lượng xấu và tỷ lệ tử vong cao, tuy nhiên nếu phát hiện bệnh ở giai đoạn sớm thì tỷ lệ sống trên 5 năm có thể tăng lên 90% [3] . Trong cơ chế bệnh sinh của UTDD lan tỏa thì việc kiểm soát độ bám dính và tính di động của tế bào là một trong những yếu tố quan trọng trong quá trình tạo thành và tiến triển của khối u. Gen CDH1 quy định tổng hợp protein E-cadherin có vai trò quan trọng trong việc bám dính và liên kết tế bào phụ thuộc canxi, duy trì sự phân hóa và kiến trúc bình thường của biểu mô [4] . Khi xảy ra đột biến trên gen CDH1, dẫn đến suy giảm chức năng của E-cadherin làm giảm khả năng bám dính t ế bào, gây nên hình thái bất thường về cấu trúc biểu mô và mất phân cực tế bào. Nhiều nghiên cứu đã chỉ ra rằng, việc mất sự bám dính giữa các tế bào với tế bào là điều kiện tiên quyết dẫn đến sự xâm lấn và di căn của tế bào ung thư [5] . Đột biến gen CDH1 được phát hiện đầu tiên vào năm 1998 bởi Guilford, thông qua phân tích đột biến ở các thành viên mắc UTDD lan tỏa khởi phát sớm trong 3 gia đình người Maori (New Zealand) [6] . Mặc dù, đã có một vài nghiên cứu trên thế giới về một số gen có liên quan đến UTDD lan tỏa di truyền như CTNNA1, BRCA2, MAP3K6…tuy nhiên, vai trò của các đột biến gen nói trên vẫn chưa chắc chắn vì số lượng mẫu nghiên cứu không đủ để xác định mức độ phổ biến và mức độ thâm nhập của gen [7] .Tỷ lệ phát hiện đột biến của gen CDH1 chiếm 30 – 40% trong các gia đình chẩn đoán UTDD lan tỏa di truyền [6] . Vì vậy, việc xác định đột biến gen trong UTDD lan tỏa di truyền hiện được giới hạn ở gen CDH1. Đặc điểm di truyền của bệnh là theo cơ chế di truyền gen trội trên nhiễm sắc thể thường, do đó một cá thể trong gia đình có bố hoặc mẹ mang đột biến gen thì có 50% cơ hội nhận được đột biến gen từ bố hoặc mẹ. Vì vậy, việc sàng lọc và phát hiện sớm các thành viên gia đình của bệnh nhân mang đột biến gen CDH1 nhưng chưa biểu hiện bệnh là rất cần thiết. Từ đó, có biện pháp phòng bệnh và đưa ra những can thiệp điều trị sớm hiệu quả. Tại Việt Nam, nghiên cứu về đột biến gen CDH1 ở các bệnh nhân UTDD lan tỏa di truyền, cũng như xác định đột biến ở các thành viên gia đình có nguy cơ cao vẫn còn mới mẻ. Với những lý do trên đề tài “Nghiên cứu đột biến gen CDH1 (E-cadherin) trên bệnh nhân ung thư dạ dày lan tỏa di truyền” được thực hiện với 2 mục tiêu: 1. Phân tích đột biến gen CDH1 và đặc điểm lâm sàng, cận lâm sàng trên bệnh nhân ung thư dạ dày lan tỏa di truyền. 2. Xác định đột biến gen CDH1 ở các thành viên trong gia đình bệnh nhân ung thư dạ dày lan tỏa di truyền mang đột biến gen CDH1.
BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ TRƢỜNG ĐẠI HỌC Y HÀ NỘI NGUYỄN THỊ THANH HƢƠNG NGHIªN CøU §éT BIÕN GEN CDH1 (E - cadherin) TR£N BƯNH NHÂN UNG THƯ Dạ DàY LAN TỏA DI TRUYềN LUN ÁN TIẾN SĨ Y HỌC HÀ NỘI – 2020 MỤC LỤC ĐẶT VẤN ĐỀ Chƣơng 1: TỔNG QUAN 1.1 Ung thư dày lan tỏa di truyền 1.1.1 Lịch sử phát dịch tễ học 1.1.2 Các yếu tố nguy 1.1.3 Đặc điểm lâm sàng 12 1.1.4 Giải phẫu bệnh 13 1.1.5 Chẩn đoán ung thư dày lan tỏa di truyền 17 1.1.6 Chẩn đoán giai đoạn ung thư dày 18 1.1.7 Điều trị tiên lượng 20 1.2 Vai trò gen CDH1 ung thư dày lan tỏa di truyền 22 1.2.1 Cấu trúc chức gen CDH1 22 1.2.2 Cơ chế gây bệnh gen CDH1 ung thư dày lan tỏa di truyền 25 1.2.3 Đặc điểm di truyền ung thư dày lan tỏa di truyền 28 1.2.4 Tình hình nghiên cứu ung thư dày lan tỏa di truyền đột biến gen CDH1 giới Việt Nam 30 1.2.5 Quản lý bệnh ung thư dày lan tỏa di truyền đột biến gen CDH1 32 1.3 Các phương pháp phát đột biến gen CDH1 36 1.3.1 Khuếch đại gen kỹ thuật PCR 37 1.3.2 Kỹ thuật giải trình tự gen theo phương pháp Sanger 37 1.3.3 Dự đoán khả gây bệnh đột biến gen CDH1 phần mềm phân tích tin sinh học 38 Chƣơng 2: ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 40 2.1 Đối tượng nghiên cứu 40 2.2 Thời gian địa điểm nghiên cứu 41 2.3 Phương pháp nghiên cứu 41 2.3.1 Thiết kế nghiên cứu: 41 2.3.2 Cỡ mẫu nghiên cứu 41 2.3.3 Phương pháp thu thập mẫu 42 2.3.4 Các biến số nghiên cứu 43 2.3.5 Sơ đồ nghiên cứu 45 2.3.6 Phương tiện nghiên cứu 46 2.3.7 Quy trình kỹ thuật phân tích đột biến gen CDH1 48 2.3.8 Thử nghiệm Clo-Test chẩn đoán nhiễm H Pylori 51 2.3.9 Quy trình kỹ thuật nhuộm hóa mơ miễn dịch 52 2.4 Xử lý phân tích số liệu 53 2.5 Vấn đề đạo đức nghiên cứu 53 Chƣơng 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 55 3.1 Đặc điểm chung đối tượng nghiên cứu 55 3.1.1 Đặc điểm tuổi, giới, tiền sử bệnh yếu tố nguy 55 3.1.2 Đặc điểm lâm sàng 58 3.1.3 Đặc điểm tổn thương dày qua nội soi 60 3.1.4 Phân loại giai đoạn bệnh theo TNM 61 3.2 Kết phân tích gen CDH1 đối tượng nghiên cứu 61 3.2.1 Kết tách chiết DNA phản ứng PCR khuếch đại exon gen CDH1 61 3.2.2 Kết phát đột biến SNP gen CDH1 62 3.2.3 Đặc điểm lâm sàng cận lâm sàng đối tượng nghiên cứu mang đột biến SNP gen CDH1 72 3.3 Xác định đột biến gen CDH1 thành viên gia đình bệnh nhân mang đột biến gen CDH1 79 3.3.1 Phả hệ kết phát đột biến gen CDH1 thành viên gia đình 79 3.3.2 Đặc điểm phả hệ thành viên gia đình mang đột biến gen CDH1 87 Chƣơng 4: BÀN LUẬN 91 4.1 Đặc điểm chung nhóm nghiên cứu 91 4.2 Đột biến gen CDH1 bệnh nhân UTDD lan tỏa di truyền 101 4.3 Đột biến gen CDH1 thành viên gia đình bệnh nhân mang đột biến gen CDH1 120 KẾT LUẬN 134 DANH MỤC CÁC CƠNG TRÌNH NGHIÊN CỨU CĨ LIÊN QUAN ĐẾN LUẬN ÁN TÀI LIỆU THAM KHẢO PHỤ LỤC DANH MỤC BẢNG Bảng 1.1 Phân loại mô bệnh học ung thư biểu mô dày Tổ chức Y tế Thế giới năm 2010 so sánh với phân loại Lauren 15 Bảng 1.2 Phân loại TNM ung thư dày theo AJCC 8th 2017 19 Bảng 1.3 Phân loại giai đoạn bệnh UTDD theo TNM 20 Bảng 1.4 Ý nghĩa phương pháp đánh giá đột biến gen CDH1 37 Bảng 2.1 Thành phần phản ứng PCR 49 Bảng 2.2 Chu kỳ nhiệt phản ứng PCR 49 Bảng 2.3 Thành phần phản ứng PCR cho giải trình tự 50 Bảng 2.4 Chu trình nhiệt phản ứng PCR cho giải trình tự 50 Bảng 2.5 Quy trình xử lý tiêu hóa mơ miễn dịch 52 Bảng 3.1 Phân loại đối tượng nghiên cứu theo tiêu chuẩn IGCLC 2015 55 Bảng 3.2 Phân bố tuổi giới bệnh nhân tham gia nghiên cứu 56 Bảng 3.3 Mối liên quan tuổi phát bệnh với giới tính 56 Bảng 3.4 Tiền sử cá nhân, gia đình số yếu tố nguy 57 Bảng 3.5 Lý vào viện đối tượng nghiên cứu 58 Bảng 3.6 Thời gian xuất triệu chứng đến vào viện 59 Bảng 3.7 Đặc điểm tổn thương dày qua nội soi 60 Bảng 3.8 Phân loại giai đoạn bệnh theo TNM 61 Bảng 3.9 Các SNP tìm thấy nghiên cứu 63 Bảng 3.10 Đột biến SNP gen CDH1 tìm bệnh nhân UTDD lan tỏa di truyền 64 Bảng 3.11 Dự đoán khả gây bệnh đột biến sai nghĩa 70 Bảng 3.12 Đặc điểm lâm sàng bệnh nhân mang đột biến gen CDH1 73 Bảng 3.13 Đặc điểm nội soi mô bệnh học bệnh nhân mang đột biến 74 Bảng 3.14 Phân bố SNP bệnh nhân tham gia nghiên cứu 77 Bảng 3.15 Đặc điểm lâm sàng số yếu tố nguy 77 Bảng 3.16 Đặc điểm phả hệ mang đột biến gen nghiên cứu 87 Bảng 3.17 Tỷ lệ mang đột biến gen CDH1 phả hệ gia đình 88 Bảng 3.18 Đặc điểm nội soi mô bệnh học thành viên gia đình mang đột biến gen CDH1 89 DANH MỤC HÌNH Hình 1.1 (A) Ung thư biểu mơ tế bào nhẫn chỗ: tuyến với màng ngun vẹn lót tế bào hình nhẫn (B) Sự xâm nhập tế bào hình nhẫn bên biểu mô (đầu mũi tên) (C) Ung thư biểu mô tế bào nhẫn xâm lấn giai đoạn T1a 16 Hình 1.2 Hình ảnh gen CDH1 nằm nhánh dài NST 16, gồm 16 exon mã hóa cho vùng protein tương ứng 23 Hình 1.3 Vị trí E-cadherin vai trị kết dính tế bào 24 Hình 1.4 Các đường sinh ung thư liên quan đến E-cadherin 25 Hình 1.5 Phức hợp cadherin-catenin protein APC 26 Hình 1.6 Con đường Rho-GTPase 27 Hình 1.7 Sơ đồ phả hệ 29 Hình 1.8 Vị trí phân loại dạng đột biến gen CDH1 UTDD lan tỏa di truyền công bố 30 Hình 3.1 Kết PCR exon (A) exon 13 (B) gen CDH1, (-): chứng âm, (+): chứng dương, M: ladder thang chuẩn 100 bp 62 Hình 3.2 Kết giải trình tự đoạn gen mang đột biến 65 Hình 3.3 Kết giải trình tự đoạn gen mang đột biến 66 Hình 3.4 Kết giải trình tự đoạn gen mang đột biến 67 Hình 3.5 Kết giải trình tự đoạn gen mang đột biến 68 Hình 3.6 Phân bố đột biến SNP gen CDH1 69 Hình 3.7 Hình ảnh minh họa sử dụng cơng cụ Polyphen dự đốn khả gây bệnh đột biến sai nghĩa 71 Hình 3.8 Hình ảnh minh họa sử dụng công cụ Mutation Taster xác định khả gây bệnh đột biến 72 Hình 3.9 Ảnh vi thể UTDD thể lan tỏa bệnh nhân B4 75 Hình 3.10 Ảnh vi thể UTDD thể lan tỏa bệnh nhân B732 75 Hình 3.11 Ảnh vi thể UTDD thể lan tỏa bệnh nhân B532 76 Hình 3.12 Ảnh vi thể UTDD thể lan tỏa bệnh nhân B151 76 Hình 3.13 Phả hệ kết phân tích gen CDH1 gia đình bệnh nhân B4 79 Hình 3.14 Hình ảnh giải trình tự gen CDH1 vị trí mang đột biến thành viên gia đình B4 80 Hình 3.15 Phả hệ kết phân tích gen CDH1 gia đình bệnh nhân B732 81 Hình 3.16 Hình ảnh giải trình tự gen CDH1của thành viên gia đình B732 mang đột biến 82 Hình 3.17 Phả hệ kết phân tích gen CDH1 gia đình bệnh nhân B15183 Hình 3.18 Hình ảnh giải trình tự gen CDH1 thành viên gia đình B151 mang đột biến 84 Hình 3.19 Phả hệ kết phân tích gen CDH1 gia đình bệnh nhân B532 85 Hình 3.20 Hình ảnh giải trình tự gen CDH1của thành viên gia đình B532 mang đột biến 86 Hình 4.1 Bản đồ phân bố đột biến gen CDH1 104 ĐẶT VẤN ĐỀ Ung thư dày (UTDD) loại ung thư thường gặp, có ảnh hưởng to lớn đến sức khỏe cộng đồng Theo thống kê Globocan 2018, UTDD loại ung thư phổ biến thứ nguyên nhân gây tử vong thứ hai giới [1] Hầu hết UTDD không di truyền, nhiên khoảng 10% trường hợp UTDD có tính chất gia đình, UTDD lan tỏa di truyền chiếm 1-3% [2] Ung thư dày lan tỏa di truyền bệnh lý di truyền gặp, đặc trưng mô bệnh học tế bào ung thư biệt hóa, xâm lấn lan tỏa lớp niêm mạc nên khó phát sớm Biểu lâm sàng UTDD lan tỏa di truyền bệnh thường khởi phát tuổi trẻ (tuổi trung bình phát 38), tiến triển nhanh, tiên lượng xấu tỷ lệ tử vong cao, nhiên phát bệnh giai đoạn sớm tỷ lệ sống năm tăng lên 90% [3] Trong chế bệnh sinh UTDD lan tỏa việc kiểm sốt độ bám dính tính di động tế bào yếu tố quan trọng trình tạo thành tiến triển khối u Gen CDH1 quy định tổng hợp protein E-cadherin có vai trị quan trọng việc bám dính liên kết tế bào phụ thuộc canxi, trì phân hóa kiến trúc bình thường biểu mô [4] Khi xảy đột biến gen CDH1, dẫn đến suy giảm chức E-cadherin làm giảm khả bám dính tế bào, gây nên hình thái bất thường cấu trúc biểu mô phân cực tế bào Nhiều nghiên cứu rằng, việc bám dính tế bào với tế bào điều kiện tiên dẫn đến xâm lấn di tế bào ung thư [5] Đột biến gen CDH1 phát vào năm 1998 Guilford, thông qua phân tích đột biến thành viên mắc UTDD lan tỏa khởi phát sớm gia đình người Maori (New Zealand) [6] Mặc dù, có vài nghiên cứu giới số gen có liên quan đến UTDD lan tỏa di truyền CTNNA1, BRCA2, MAP3K6…tuy nhiên, vai trò đột biến gen nói chưa chắn số lượng mẫu nghiên cứu không đủ để xác định mức độ phổ biến mức độ thâm nhập gen [7] Tỷ lệ phát đột biến gen CDH1 chiếm 30 – 40% gia đình chẩn đốn UTDD lan tỏa di truyền [6] Vì vậy, việc xác định đột biến gen UTDD lan tỏa di truyền giới hạn gen CDH1 Đặc điểm di truyền bệnh theo chế di truyền gen trội nhiễm sắc thể thường, cá thể gia đình có bố mẹ mang đột biến gen có 50% hội nhận đột biến gen từ bố mẹ Vì vậy, việc sàng lọc phát sớm thành viên gia đình bệnh nhân mang đột biến gen CDH1 chưa biểu bệnh cần thiết Từ đó, có biện pháp phòng bệnh đưa can thiệp điều trị sớm hiệu Tại Việt Nam, nghiên cứu đột biến gen CDH1 bệnh nhân UTDD lan tỏa di truyền, xác định đột biến thành viên gia đình có nguy cao mẻ Với lý đề tài “Nghiên cứu đột biến gen CDH1 (E-cadherin) bệnh nhân ung thư dày lan tỏa di truyền” thực với mục tiêu: Phân tích đột biến gen CDH1 đặc điểm lâm sàng, cận lâm sàng bệnh nhân ung thư dày lan tỏa di truyền Xác định đột biến gen CDH1 thành viên gia đình bệnh nhân ung thư dày lan tỏa di truyền mang đột biến gen CDH1 PHỤ LỤC TRÌNH TỰ MỒI CỦA GEN CDH1 Kích thƣớc Kích thƣớc sản Tm Trình tự (5’ – 3’) o Exon phẩm PCR ( C) E1 171 287 58 F: CAGGTGAACCCTCAGCCAATC R: AATGCGTCCCTCGCAAGT E2 114 242 59 F:CACTCTTTACATGGTGGTGATG R:CAGAGAACTCCTATCTTGGGCA E3 223 358 57 F: GTCTTCCCACAAGTTCGCTC R: AGCGCACTAAAACAACAGCG E4I4E5 143 – 155 645 61 F: GACGCTGTCTGGCTAGGTTG R: GCAACAGGTCAAGAGGTGTC E6 144 476 55 F: AGAGTTTTTCAGGCCCGCATCT R:TTACACAACCTTTGGGCTTGGA E7 175 307 62 F: GCAGTATTGACCCAGTCCCAA R: CTTTGTCCACGGGATTGAGC I7E8 128 736 61 F: CCATCGCTTACACCATCCTC R: CAACTTCACAATCTTGCACC E9 182 302 57 F: AATCCTTTAGCCCCCTGAGA R: AGGGGACAAGGGTATGAACA E10 244 502 57 F: CCCTAGAATAGCCCCAGCTTT R:GCTGCAAGTCAGTTGAAAAATC E11 145 287 53 F: AGCGCTTAAGCCGTTTTCA R: AGGGAGGGGCAAGGAACT E12 224 687 53 F: GGAAACAACAGGCAGGCAATA R: CAATGGAAGGGGTGACATCTA E13 227 664 55 F: TACCGAACCCAGCGACATC R: GGCTGGCATAACTTGGGAGT E14 130 523 57 F: CCGACTTCAGGGATGTGAGTG R: GCTCAGGCAAGCTGAAAACAT E15 143 662 55 F: TCACACAACAAAGCCCCAGAT R: GCTCAGGCAAGCTGAAAACAT E16-1 840 57 F: TGGTTGGTGCTTGCATCTCTC R: GTAGCTGACTTCTCCCCTTCTT Exon NGUYÊN TẮC TRONG THIẾT KẾ MỒI Chiều dài mồi: mồi tối ưu cho phản ứng khuếch đại PCR cho phản ứng giải trình tự từ 18-24bp, đủ để gắn đặc hiệu gắn vào với khuôn nhiệt độ gắn mồi Nhiệt độ nóng chảy mồi (Tm): tối ưu khoảng 52-58oC, Tm > 65oC thường dễ xảy sản phẩm phụ thứ cấp Tm nên tính tốn cẩn trọng, Tm hai mồi chênh 5oC phản ứng khuếch đại khó xảy Nhiệt độ gắn mồi (Ta) định tính đặc hiệu quan trọng phản ứng khuếch đại PCR Ta cao dẫn đến việc gắn không hiệu mồi DNA gốc dẫn tới hiệu suất sản phẩm PCR thấp Ta thấp dẫn tới việc gắn không đặc hiệu gây việc bắt cặp nhầm với sản phẩm phụ khác Tỉ lệ G, C mồi: hàm lượng base G, C tổng số base mồi nên khoảng 40-60% Kẹp GC: diện base G, C base cuối đầu 3’ mồi vô quan trọng định khả liên kết liên kết G C thường mạnh Tuy nhiên để tránh việc gắn không đặc hiệu, lượng base G,C không nên lớn base cuối đầu 3’ Cấu trúc bậc 2: Sự diện cấu trúc thứ cấp mồi tạo tương tác phân tử mồi nội phân tử mồi dẫn đến khơng có suất sản phẩm Chúng ảnh hưởng xấu đến trình ủ mẫu mồi q trình khuếch đại, làm giảm đáng kể “số lượng thực” sẵn có mồi cho phản ứng Cấu trúc kẹp tóc (Hairpins): cấu trúc thứ phát tạo tương tác liên kết base mồi Nên hạn chế cấu trúc kẹp tóc Điều kiện tối ưu ΔG kẹp tóc vị trí 3’ nên lớn -2 kcal/mol, ΔG kẹp tóc bên (ngoại trừ base đầu 3’) nên lớn -3 kcal/mol Liên kết tự thân mồi (Self-dimer): cấu trúc hình thành liên kết mồi đơn loại (ví dụ mồi xuôi tự liên kết với ống stock ban đầu) Khi mồi hình thành liên kết self-dimer giảm hiệu bắt cặp với DNA đích, chúng làm giảm suất sản phẩm Điều kiện tối ưu ΔG liên kết tự thân vị trí 3’ nên lớn -5 kcal/mol, ΔG liên kết tự thân bên mồi (trừ base đầu 3’) nên lớn -6 kcal/mol Liên kết chéo mồi (Cross-dimer): liên kết hình thành mồi xuôi mồi ngược Điều kiện tối ưu ΔG liên kết mồi vị trí 3’ nên lớn -5 kcal/mol, ΔG liên kết mồi bên mồi (trừ base đầu 3’) nên lớn -6 kcal/mol Lặp cặp: nên tránh đoạn di-nucleotid lặp lặp lại nhiều lần mồi gây bắt cặp nhầm VD: ATATATATAT Số lượng cặp dinucleotid chấp nhận mồi nên cặp Lặp nucleotid: hạn chế nucleotid lặp lại liền kề nhiều lần dễ dẫn tới bắt cặp nhầm VD: AGCGGGGGATGGGG số nucleotid lặp mồi Số lượng nu đơn lặp liên tục tối đa cho phép nên khơng q Trình tự gen CDH1 lấy trực tiếp từ trình tự FASTA kho liệu NCBI thông qua phiên giới hạn phần mềm CLC Main Workbench 8.1.2 hãng QIAGEN [120] Trên phần mềm hiển thị rõ vùng exon, vùng mã hóa protein (coding DNA sequence), intron… Nhóm nghiên cứu tiến hành thiết kế cặp mồi bao trùm exon phần intron liền kề để đảm bảo yêu cầu chiều dài đoạn DNA đích: (1) Có thể kiểm tra đột biến ghép nối splicing cận kề có (2) Đảm bảo giải trình tự phương pháp Sanger hạn chế vùng tín hiệu nhiễu ban đầu ảnh hưởng tới đoạn exon rìa intron mong muốn (3) Thực GTT hệ thống 3730 giải đoạn 1000bp, đoạn đích mong muốn chiều dài 1000bp PHỤ LỤC DANH SÁCH CÁC THÀNH VIÊN THAM GIA NGHIÊN CỨU CỦA GIA ĐÌNH BỆNH NHÂN B4 STT 10 11 Ký hiệu III-1 III-2 III-3 III-4 III-5 III-6 III-7 IV-1 IV-6 IV-7 IV-11 Họ tên Phạm Thanh T Phạm Hồng P Phạm Thị K Phạm Văn Đ Phạm Văn X Phạm Văn T Hồ Thị H Phạm Văn Q Phạm Thị H Phạm Thị H Phạm Ngọc T Tuổi 64 62 55 65 61 59 57 37 31 34 17 Quan hệ với bệnh nhân Bác họ Bác họ Bác họ Bác ruột Bác ruột Bố đẻ Mẹ đẻ Anh họ Chị họ Chị ruột Em ruột DANH SÁCH CÁC THÀNH VIÊN THAM GIA NGHIÊN CỨU CỦA GIA ĐÌNH BỆNH NHÂN B151 STT 10 Ký hiệu II-1 III-1 III-2 III-4 III-6 III-7 IV-2 IV-3 IV-4 IV-5 Họ tên Ngô Thị X Nguyễn Bá T Nguyễn Bá S Nguyễn Thị Đ Nguyễn Viết T Nguyễn Thị H Nguyễn Bá C Nguyễn Thị Q Nguyễn Bá Q Mai Xuân A Tuổi 68 46 44 33 44 33 17 23 16 15 Quan hệ với bệnh nhân Mẹ đẻ Anh trai Anh trai Em gái Em họ Em họ Cháu trai Cháu gái Cháu trai Con trai DANH SÁCH CÁC THÀNH VIÊN THAM GIA NGHIÊN CỨU CỦA GIA ĐÌNH BỆNH NHÂN B532 STT 10 11 Ký hiệu II-2 II-6 III-1 III-2 III-4 III-8 IV-5 IV-6 IV-7 IV-8 IV-9 Họ tên Trần Văn Đ Trần Thị T Trần Thị L Trần Thị L Trần Thị H Bùi Văn H Nguyễn Văn B Nguyễn Văn D Nguyễn Thị H Nguyễn Văn T Nguyễn Thị Minh T Tuổi 71 54 48 43 37 27 16 15 13 15 12 Quan hệ với bệnh nhân Bố đẻ Cô ruột Chị gái Chị gái Chị gái Em họ Cháu trai Cháu trai Cháu gái Cháu trai Cháu gái DANH SÁCH CÁC THÀNH VIÊN THAM GIA NGHIÊN CỨU CỦA GIA ĐÌNH BỆNH NHÂN B732 STT Ký hiệu Họ tên Lê Thị C Phạm Thị Lê T Nguyễn Khánh L Nguyễn Hoàng Gia B Tuổi 74 37 13 10 Quan hệ với bệnh nhân Mẹ đẻ Chị gái Cháu gái Cháu trai PHỤ LỤC Hình ảnh số SNP gen CDH1 đƣợc tìm thấy nghiên cứu Hình ảnh giải trình tự SNP rs 61747632 – c.1020G>A (p.T340T) nằm Exon Hình ảnh giải trình tự SNP rs1801552 – c.2076T>C (p.A692A) nằm Exon 13, kiểu gen đồng hợp CC Hình ảnh giải trình tự SNP rs33964119 - c.2253C>T (p.N751N) nằm exon 14 Hình ảnh giải trình tự SNP rs552874184 – c.2165-15C>A nằm intron 13 Hình ảnh giải trình tự SNP rs3743674 – c.48+6C>T nằm intron Hình ảnh giải trình tự gen SNP rs35667437 - c.1711+47G>A nằm intron 11 Hình ảnh giải trình tự SNP rs1801026 – c.2649+54C>T nằm intron 16 (a) c.2164+17A (b) c.2164+17dupA Hình ảnh giải trình tự SNP rs34939176 – c.2164+17dupA nằm intron 13 Hình (a) hình ảnh giải trình tự bình thường Hình (b) hình ảnh giải trình tự SNP c.2164+17dupA (a) c.1008+131G (b) c.1008+131delGinsATC Mồi E7F (c) c.1008+131delGinsATC Mồi E7R Hình ảnh giải trình tự SNP c.1008+131delGinsATC nằm intron 7, SNP phát nghiên cứu Hình (a) hình ảnh GTT bình thường Hình (b) hình ảnh GTT SNP c.1008+131delGinsATC mồi xi (F) Hình (c) hình ảnh GTT SNP c.1008+131delGinsATC mồi ngược (R) (a) c.1712-54T (b) c.1712-54dupT 10 Hình ảnh giải trình tự SNP c.1712-54dupT nằm intron 11, SNP phát nghiên cứu Hình (a) hình ảnh GTT bình thường Hình (b) hình ảnh GTT SNP c.1712-54dupT 11 Hình ảnh giải trình tự SNP rs730881656 - c.2103C>T (V701V) mồi ngược (R) Phụ lục BỘ CÂU HỎI AUDIT-C STT Nội dung câu hỏi 1Tần suất uống rượu Nội dung câu trả lời -Chưa -≤ lần/tháng thời gian gần -2 – lần/tháng -2 – lần/tuần -≥ lần/tuần 2Số chén rượu uống -Không uống -1 – chén* ngày -3 – chén -5 – chén -7 – chén -≥ 10 chén 3Bao nhiêu lâu uống từ chén -Không -Vài tháng lần trở lên lần uống -Hàng tháng -Hàng tuần -Hàng ngày Điểm 0 4 *: chén rượu câu hỏi tương đương với đơn vị rượu tiêu chuẩn PHỤ LỤC Hình ảnh điện di exon gen CDH1 Hình ảnh điện di Exon (287bp) Hình ảnh điện di Exon (242bp) Hình ảnh điện di Exon (358bp) Hình ảnh điện di E4E5 (645bp) Hình ảnh điện di Exon (476bp) Hình ảnh điện di Exon (307bp) Hình ảnh điện di Exon (736bp) Hình ảnh điện di Exon (302bp) Hình ảnh điện di Exon 10 (502bp) Hình ảnh điện di Exon 11 (287bp) Hình ảnh điện di Exon 12 (687bp) Hình ảnh điện di Exon 13 (664bp) Hình ảnh điện di Exon 14 (523bp) Hình ảnh điện di Exon 15 (662bp) Hình ảnh điện di Exon 16 (840bp) PHỤ LỤC Bảng tổng hợp đột biến SNP gen CDH1 tìm thấy nghiên cứu Mã BN B04 B151 B532 B732 B144 B158 B169 B729 B738 B284 B725 Exon/ Intron Đột biến/SNP n Thể đột biến Chú thích Ý nghĩa Đồng hợp SNP Lành tính Dị hợp Mới Gây bệnh I1 c.48+6 C>T (rs3743674) E5 c.639 G>A (p.W213*) E13 c.2076 T>C (rs1801552) Dị hợp SNP Lành tính I1 c.48+6 C>T (rs3743674) Đồng hợp SNP Lành tính E13 c.1990A>C (p K664Q) Dị hợp Mới Chƣa rõ E13 c.2076 T>C (rs1801552) Dị hợp SNP Lành tính I1 c.48+6 C>T (rs3743674) Đồng hợp SNP Lành tính I7 c.1008+131 delGinsATC - - Chưa rõ E9 c.1298 A>G (D433G) Dị hợp Mới Chƣa rõ I11 c.1711+47G>A (rs35667437) Dị hợp SNP Lành tính E13 c.2076 T>C (rs1801552) Dị hợp SNP Lành tính I1 c.48+6 C>T (rs3743674) Đồng hợp SNP Lành tính I7 c.1008+131 delGinsATC - Mới Chưa rõ I12 c.1937-13T>C Dị hợp DV Gây bệnh E13 c.2076 T>C (rs1801552) Dị hợp SNP Lành tính I1 c.48+6 C>T (rs3743674) Đồng hợp SNP Lành tính I11 c.1711+47G>A (rs35667437) Dị hợp SNP Lành tính E13 c.2076 T>C (rs1801552) Dị hợp SNP Lành tính I1 c.48+6 C>T (rs3743674) Đồng hợp SNP Lành tính I7 c.1008+131 delGinsATC - Mới Chưa rõ E13 c.2076 T>C (rs1801552) Dị hợp SNP Lành tính E16 *54 C>T (rs1801026) Dị hợp SNP Lành tính I1 c.48+6 C>T (rs3743674) Dị hợp SNP Lành tính E13 c.2076 T>C (rs1801552) Đồng hợp SNP Lành tính E14 c.2253 C>T (rs33964119) Dị hợp SNP Lành tính E16 *54 C>T (rs1801026) Đồng hợp SNP Lành tính E8 c.1020 G>A (rs61747632) Dị hợp SNP Lành tính E13 c.2076 T>C (rs1801552) Đồng hợp SNP Lành tính I13 c.2164+17dupA (rs34939176) SNP Lành tính 1 1 1 B39 B295 B718 B730 B733 B734 B737 B285,B308 B717,B720 B726,B731 B277,B341 B519,B163 B735 B367,B486 B719,B728 B445 B668 B723 E14 c.2253 C>T (rs33964119) Dị hợp SNP Lành tính I1 c.48+6 C>T (rs3743674) Đồng hợp SNP Lành tính I7 c.1008+131 delGinsATC - Mới Chưa rõ E13 c.2076 T>C (rs1801552) Dị hợp SNP Lành tính I1 c.48+6 C>T (rs3743674) Dị hợp SNP Lành tính E13 c.2076 T>C (rs1801552) Đồng hợp SNP Lành tính E16 *54 C>T (rs1801026) Dị hợp SNP Lành tính E13 c.2076 T>C (rs1801552) Đồng hợp SNP Lành tính E14 c.2253 C>T (rs33964119) Dị hợp SNP Lành tính E16 *54 C>T (rs1801026) Dị hợp SNP Lành tính I1 c.48+6 C>T (rs3743674) Dị hợp SNP Lành tính I11 c.1712-54dupT - Mới Chưa rõ E13 c.2076 T>C (rs1801552) Đồng hợp SNP Lành tính I1 c.48+6 C>T (rs3743674) Đồng hợp SNP Lành tính I11 c.1711+47G>A (rs35667437) Dị hợp SNP Lành tính E13 c.2076 T>C (rs1801552) Đồng hợp SNP Lành tính I1 c.48+6 C>T (rs3743674) Đồng hợp SNP Lành tính E13 c.2076 T>C (rs1801552) Đồng hợp SNP Lành tính I13 c.2165-15C>A(rs552874184) Dị hợp SNP Lành tính I1 c.48+6 C>T (rs3743674) Đồng hợp SNP Lành tính E13 c.2076 T>C (rs1801552) Đồng hợp SNP Lành tính E16 *54 C>T (rs1801026) Đồng hợp SNP Lành tính Đồng hợp SNP Lành tính Đồng hợp SNP Lành tính Đồng hợp SNP Lành tính Dị hợp SNP Lành tính Dị hợp SNP Lành tính Dị hợp SNP Lành tính Đồng hợp SNP Lành tính Dị hợp SNP Lành tính Dị hợp SNP Lành tính Dị hợp SNP Lành tính Dị hợp SNP Lành tính I1 c.48+6 C>T (rs3743674) E13 c.2076 T>C (rs1801552) I1 c.48+6 C>T (rs3743674) E13 c.2076 T>C (rs1801552) I1 c.48+6 C>T (rs3743674) E13 c.2076 T>C (rs1801552) I1 c.48+6 C>T (rs3743674) E14 c.2253 C>T (rs33964119) E13 c.2076 T>C (rs1801552) I11 c.1711+47G>A (rs35667437) I1 c.48+6 C>T (rs3743674) 1 1 1 1 - Mới Chưa rõ Đồng hợp SNP Lành tính c.2076 T>C (rs1801552) Đồng hợp SNP Lành tính I1 c.48+6 C>T (rs3743674) Dị hợp SNP Lành tính B22 E13 c.2076 T>C (rs1801552) Dị hợp SNP Lành tính B722 I1 c.48+6 C>T (rs3743674) Đồng hợp SNP Lành tính Dị hợp SNP Lành tính I7 c.1008+131 delGinsATC I1 c.48+6 C>T (rs3743674) B38 B724 E13 B279 B193,B462 B551,B736 E13 Tổng c.2103 C>T (rs730881656 45 ... bệnh nhân ung thư dày lan tỏa di truyền Xác định đột biến gen CDH1 thành viên gia đình bệnh nhân ung thư dày lan tỏa di truyền mang đột biến gen CDH1 3 Chƣơng TỔNG QUAN 1.1 Ung thƣ dày lan tỏa. .. chức gen CDH1 22 1.2.2 Cơ chế gây bệnh gen CDH1 ung thư dày lan tỏa di truyền 25 1.2.3 Đặc điểm di truyền ung thư dày lan tỏa di truyền 28 1.2.4 Tình hình nghiên cứu ung thư dày lan tỏa di. .. ung thư dày thể lan tỏa cần nghiên cứu thêm 1.1.2.2 Biến đổi gen di truyền ung thư dày lan tỏa di truyền Đột biến gen Ung thư dày có tính chất gia đình chiếm khoảng 10%, – 3% UTDD lan tỏa di