Khảo sát tính kháng khuẩn của cao chiết quế (Cinnamomum verum) và gừng (Zingiber officinale rose) tách chiết bằng ethanol đối với các chủng vi khuẩn Streptococcus agalactiae phân

Vi khuẩn Streptococcus agalactiae được biết đến như là tác nhân gây bệnh và gây chết nghiêm trọng trên nhiều loài cá nước ngọt và nước mặn. Trong nghiên cứu này, chúng tôi khảo sát hiệu quả kháng khuẩn đối với hai chủng vi khuẩn Streptococcus agalactiae được phân lập từ cá rô phi bị bệnh lồi mắt, xuất huyết thu tại thành phố Hồ Chí Minh bởi cao chiết quế và gừng, được tách chiết bằng phương pháp ngấm kiệt với dung môi ethanol ở 3 nồng độ riêng rẻ (96%, 72%, 48%) và liên tục (96% tiếp đến 72% và 48%).

VIỆN NGHIÊN CỨU NUÔI TRỒNG THỦY SẢN II KHẢO SÁT TÍNH KHÁNG KHUẨN CỦA CAO CHIẾT QUẾ (Cinnamomum verum) VÀ GỪNG (Zingiber officinale Rose) TÁCH CHIẾT BẰNG ETHANOL ĐỐI VỚI CÁC CHỦNG VI KHUẨN Streptococcus agalactiae PHÂN LẬP TRÊN CÁ RƠ PHI GIỐNG (Oreochromis spp.) Đồn Văn Cường 1*, Nguyễn Thị Ngọc Tĩnh 1, Mã Tú Lan1, Nguyễn Thành Nhân1 TÓM TẮT Vi khuẩn Streptococcus agalactiae biết đến tác nhân gây bệnh gây chết nghiêm trọng nhiều loài cá nước nước mặn Trong nghiên cứu này, khảo sát hiệu kháng khuẩn hai chủng vi khuẩn Streptococcus agalactiae phân lập từ cá rô phi bị bệnh lồi mắt, xuất huyết thu thành phố Hồ Chí Minh cao chiết quế gừng, tách chiết phương pháp ngấm kiệt với dung môi ethanol nồng độ riêng rẻ (96%, 72%, 48%) liên tục (96% tiếp đến 72% 48%) Kết cho thấy cao chiết quế dung mơi ethanol 96% cho đường kính vòng kháng khuẩn 29-34 mm, giá trị MIC = mg/ml, MBC = mg/ml; cao chiết gừng dung mơi ethanol 96% cho đường kính vịng kháng khuẩn 14-17 mm, giá trị MIC = mg/ml, MBC = mg/ml Cao chiết quế gừng ethanol 96% hai loại cao thảo dược tiềm có khả ứng dụng để phòng trị bệnh Streptococcus agalactiae gây cá rơ phi Từ khóa: cá rơ phi, cao chiết gừng, cao chiết quế, phương pháp ngấm kiệt, Streptococcus agalactiae I ĐẶT VẤN ĐỀ Trên cá rô phi, bệnh lồi mắt, xuất huyết thường xuất vào mùa mưa tháng giao mùa Đồng sông Cửu Long Đông Nam Bộ, với tỷ lệ chết cao (gần 100% từ phát bệnh), gây thiệt hại kinh tế nghiêm trọng cho người nuôi, bệnh xác định vi khuẩn Streptococcus agalactiae gây (Đặng Thị Hoàng Oanh ctv., 2012) Vi khuẩn Streptococcus agalactiae biết đến tác nhân gây bệnh gây chết nghiêm trọng nhiều loài cá nước nước mặn như: cá hồi vân (Oncorhynchus mykiss), cá rô phi (Oreochromis sp.), cá cam (Seriola quinquerodiata), cá phèn (Upeneus moluccensis), cá chim (Stromateoides) Tháng 7-9/2009, dịch bệnh xảy gây chết với tỷ lệ cao 86,5-100% Hà Nội, Hưng Yên, Hải Dương, Hải Phòng, Quảng Ninh, Bắc Ninh Hà Giang (Viện NCNT Thuỷ sản I, 2017) S agalactiae hai loài vi khuẩn ảnh hưởng đến việc sản xuất cá rơ phi giới, lồi cịn lại S iniae (Evans ctv., 2006) Nghiên cứu Brian cho thấy, bệnh vi khuẩn Streptococcus gây cá rô phi nước Châu Á như: Trung Quốc, Việt Nam, Indonesia, Philippines, Thái Lan S agalactiae type (Brian Sheehan ctv., 2009) Chủng vi khuẩn S agalactiae type phân lập từ mẫu cá rơ phi đỏ có dấu hiệu xuất huyết phù mắt Việt Nam (Đặng Thị Hoàng Oanh ctv., 2012) Hiện nay, giải pháp phổ biến để phòng trị bệnh nhiễm khuẩn cá sử dụng kháng sinh hay hóa chất Tuy nhiên, việc sử dụng kháng sinh, hóa chất cịn bộc lộ nhiều bất cập, gây nên tượng kháng kháng sinh loài vi khuẩn gây bệnh động vật thủy sản, truyền gene kháng kháng sinh cho loài vi khuẩn môi trường vi khuẩn gây bệnh người Ngồi ra, việc tích lũy kháng Viện Nghiên cứu ni trồng Thủy sản II * Email: vancuongdisaqua@gmail.com TẠP CHÍ NGHỀ CÁ SÔNG CỬU LONG - SỐ 15 - THÁNG 12/2019 VIỆN NGHIÊN CỨU NUÔI TRỒNG THỦY SẢN II sinh động vật thủy sản gây hại cho mơi trường cho người tiêu thụ Vì vậy, nhà khoa học tìm kiếm giải pháp thay (vaccine, probiotic…) việc kiểm soát bệnh nhiễm khuẩn nuôi trồng thủy sản Trong thời gian gần đây, việc sử dụng thảo dược phòng trị bệnh nhiễm khuẩn ngày trở nên phổ biến ưu điểm: dễ tìm kiếm, giá thành thấp, hoạt tính kháng khuẩn cao, có khả kích thích hệ miễn dịch tự nhiên vật chủ, thân thiện với môi trường, không gây nên tượng đề kháng thuốc đặc biệt đảm bảo an toàn vệ sinh thực phẩm người (Rattanachaikunsopon ctv., 2009) Một số nghiên cứu chứng minh hoạt tính kháng khuẩn loại thảo dược: xương cá (Stella aquatic), hoa móc tay (Impatiens biflora), anh thảo (Oenothera biennis), ngải cứu (Artemisia vulgaris) kim ngân (Lonicera japonica) giúp kháng lại bệnh vi khuẩn virus cá (Shangliang, 1990) Dịch chiết ổi (Psidium guajava) kiểm sốt bệnh xuất huyết Aeromonas hydrophila gây cá nước (Pachanawan ctv., 2008) Các nghiên cứu dược liệu cho thấy rằng, củ hành tím (Allium ascalonicum) có tác dụng kháng viêm tiêu diệt vi khuẩn lây nhiễm (bao gồm vi khuẩn E.coli Salmonella), giúp tăng cường miễn dịch xem loại thảo dược chứa chất kháng sinh tự nhiên an tồn hiệu Đối với nhóm vi khuẩn Streptococcus, có nhiều nghiên cứu tìm số loại thảo dược có tác dụng kháng Streptococcus xác định loại dung môi tạo dịch chiết đạt hiệu kháng Streptococcus mạnh Dịch ép cỏ lào (Eupatorium odoratum) đánh giá có khả kháng khuẩn vi khuẩn Streptococcus sp gây bệnh cá rô phi vằn Dịch chiết hẹ (Allium tuberosum) có khả kháng vi khuẩn Streptococcus sp cao, nước, ethanol methanol loại dung mơi cho dịch chiết có tác dụng kháng S.agalactiae cao (Trương Thị Mỹ Hạnh, 2008) Dịch chiết hương thảo (Rosmarinus officinalis) có hiệu trị bệnh nhiễm khuẩn Streptococcus sp cá rô phi (Oreochromis spp.) (Abutbul ctv., 2004) Nghiên cứu thực cá rô phi lai (O niloticus x O aureus) tuần với phần ăn có 0,5% tỏi (Allium sativum) cho thấy có tác dụng nâng cao miễn dịch tính đề kháng bệnh cá (Ndong ctv., 2007) Dịch chiết nước chùm ngây (Moringa oleifera) có tác dụng kháng vi khuẩn S agalactiae type mạnh nhất, theo sau chiết xuất dung môi Chloroform sầu đâu (Azadirachta indica) (Kamble ctv., 2014) Dịch chiết vỏ quế (Cinnamomum verum), củ tỏi (Allium sativum), hoa đinh hương (Eugenia caryphyllus), cỏ xạ hương (Thymus vulgaris) có tác dụng kháng S agalactiae (Alsaid ctv., 2010) Tác dụng kháng S agalactiae loại dịch chiết thảo dược muồng trâu (Cassia alata L), măng cụt (Garcinia mangostana), xuyên tâm liên (Andrographis paniculata), ổi (P guajava), duối nhám (S.asper), tỏi (Allium sativum) dung môi khác (nước, 95% ethanol, methanol) cá rô phi, kết cho thấy dịch chiết dung mơi nước xun tâm liên (Andrographis paniculata) có tác dụng kháng S agalactiae mạnh số loại thảo dược, với đường kính vịng vơ khuẩn đạt 27,5 mm giá trị MIC đạt 31,25 µg/ml Bên cạnh đó, dịch chiết ethanol ổi (P guajava) dịch chiết nước duối nhám (S asper) có tác dụng kháng S agalactiae mạnh Kết thí nghiệm in vivo cho thấy cá rơ phi ăn thức ăn có bổ sung bột xuyên tâm liên tách chiết dung môi nước, giúp làm giảm tỉ lệ chết cá gây nhiễm với S agalactiae (Rattanachaikunsopon ctv., 2009) Trước nhóm khảo sát mười loại dược liệu phương pháp ngâm dung môi nước, ethanol 96% methanol 96%, quế gừng ngâm ethanol methanol có tác dụng kháng Streptococcus agalactiae cao Trong nghiên cứu này, chúng tơi tiếp tục khảo sát tính kháng khuẩn loại cao chiết thảo dược (gừng quế) tách chiết phương pháp ngấm kiệt dung môi ethanol với nồng độ khác nhằm tìm nồng độ TẠP CHÍ NGHỀ CÁ SƠNG CỬU LONG - SỐ 15 - THÁNG 12/2019 VIỆN NGHIÊN CỨU NUÔI TRỒNG THỦY SẢN II tối ưu cho tách chiết hai chủng vi khuẩn Streptococcus agalactiae CC-2.1 Q9-8.1 thu từ cá rơ phi có biểu xuất huyết, lồi mắt thành phố Hồ Chí Minh chế, thái lát mỏng sấy lạnh 40oC (Tủ sấy lạnh, sản xuất Việt Nam) đạt độ ẩm < 12%, xay mảnh nhỏ máy xay khô (Xinganbangle-880Y) làm ẩm loại II VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU dung môi ngấm kiệt, sau cho vào bình ngấm kiệt ngâm 24 giờ, sau 24 sử dụng 30 lít ethanol (Cơng ty CP dược phẩm OPC) cho ngấm kiệt 1kg thảo dược khô, tốc độ rút dịch chiết ml/phút Hai phương pháp thu dịch chiết khác thực 2.1 Phương pháp thu mẫu, phân lập định danh vi khuẩn Thu mẫu gan, thận, lách cá rô phi giống bị bệnh lồi mắt, xuất huyết nuôi ao Trung tâm Giống thủy sản trồng xã Tân An Hội, huyện Củ Chi bè nuôi phường Long Trường, quận 9, Tp Hồ Chí Minh Thu cá cịn sống, có triệu chứng bệnh tích: lồi mắt, xuất huyết (hậu mơn, thân, đầu, nắp mang,…), mổ cá ghi nhận dấu hiệu bệnh lý bên thể cá Dùng que cấy để lấy mẫu bệnh phẩm nội tạng gan, thận, lách Mẫu bệnh phẩm cấy đĩa môi trường BrainHeart Infusion Agar (110493, Merck) để phân lập vi khuẩn Blood Agar (110886, Merck) để xác định dạng tan huyết, tan huyết dạng β tan huyết hoàn toàn xung quanh khuẩn lạc, tan huyết dạng α tan huyết phần có màu xanh nâu xung quanh khuẩn lạc (Buxton, 2005) Đĩa cấy ủ nhiệt độ 35°C tủ ấm (Memmert-UFB 400) 24-48 Hình dạng, kích thước khuẩn lạc phân lập từ mẫu bệnh xác định phương pháp nhuộm Gram (11885, Merck) Sử dụng test kit API 32 Strep (BioMerieux, Pháp) để test sinh hóa xác định kết phần mềm APIweb (bio Mérieux SA, France) Bên cạnh đó, vi khuẩn gửi đến Công ty TNHH Thương mại & Dịch vụ Nam Khoa, quận 7, Tp Hồ Chí Minh định danh phương pháp giải trình tự gen 16S rRNA so sánh với trình tự ngân hàng gen NCBI + Mỗi loại thảo dược ngấm kiệt với ethanol 96%, dịch chiết thu để riêng ra, bã thảo dược tiếp tục ngấm kiệt với ethanol 72% ethanol 48% Cô quay dịch chiết phân đoạn tổng phân đoạn, thu loại cao chiết khác loại thảo dược + Mỗi loại thảo dược ngấm kiệt riêng rẽ với ethanol 96%, ethanol 72%, ethanol 48% ("Assessment report on Hypericum perforatum L., herba," 2018) Cô quay dịch chiết thu từ nồng độ ethanol tổng phân đoạn, thu loại cao chiết khác loại thảo dược Các cao chiết cô máy cô quay (Haake Phoenix II - C25P - Thermo) nhiệt độ 60oC dịch chiết tương ứng 99% dung môi loại bỏ Các cao chiết dạng 2.2 Phương pháp chiết xuất dược liệu Sử dụng phương pháp ngấm kiệt với dung môi ethanol để chiết xuất dược liệu (Nguyễn Thượng Dong ctv., 2008) Hai loại thảo dược: Vỏ quế (mua Viện Y Học Dân Tộc Tp Hồ Chí Minh) củ gừng (mua chợ Bà Chiểu, quận Bình Thạnh, Tp Hồ Chí Minh), sơ Hình 1: Hệ thống ngấm kiệt TẠP CHÍ NGHỀ CÁ SƠNG CỬU LONG - SỐ 15 - THÁNG 12/2019 VIỆN NGHIÊN CỨU NUÔI TRỒNG THỦY SẢN II sệt bảo quản lạnh -200C để sử dụng cho thí nghiệm thử khả kháng khuẩn phương pháp đĩa giấy khuếch tán, xác định nồng độ ức chế tối thiểu (Yasuko Sekita ctv.,) nồng độ diệt khuẩn tối thiểu (MBC) 2.3 Phương pháp đánh giá khả kháng khuẩn cao chiết thảo dược 2.3.1 Phương pháp đĩa giấy khuếch tán (Ahn ctv., 1994) Tẩm 20 µl cao chiết thảo dược (0,33 g/ml) vào đĩa giấy vơ trùng có đường kính mm, nghiệm thức đối chứng âm tẩm ethanol 96%, 72% 48%, loại tẩm vào đĩa giấy, đặt đĩa giấy vào tủ vô trùng 15 phút cho cao chiết khuếch tán vào đĩa giấy Ở nghiệm thức đối chứng dương, đĩa giấy tẩm ba loại kháng sinh thương mại amoxillin (10 µg), doxycycline (30 µg) florfenicol (30 µg) (Nam Khoa) Chủng S agalactiae nuôi cấy môi trường Brain Heart Infusion Broth (110493, Merck) 24 giờ, sau so với ống Mc Farland để mật độ 108 CFU/ ml (tương ứng ống 0,5), tiếp tục pha loãng 100 lần với nước muối sinh lý để đạt mật độ 106 CFU/ml Hút 1000 µl dịch khuẩn 106 CFU/ml, tráng que thủy tinh tam giác mặt thạch BHI agar (110886, Merck) 30 giây cho vi khuẩn thấm vào mặt thạch Sau dùng micropipet hút bỏ lượng dung dịch dư Lật úp đĩa thạch để tủ cấy vô trùng phút cho khô Đặt đĩa thạch vào tủ mát 4oC 15 phút để cao chiết có thời gian khuếch tán đĩa thạch Sau chuyển tất đĩa thạch vào ủ tủ ấm 30oC, đo đường kính vịng vơ khuẩn tạo thành xung quanh đĩa giấy sau 24 (nếu có) Vi khuẩn mẫn cảm với dịch chiết vịng vơ khuẩn ≥ mm, vi khuẩn kháng với dịch chiết vịng vơ khuẩn