Nghiên cứu này được thực hiện nhằm đánh giá ảnh hưởng của các liều khác nhau của protein sốc nhiệt ly trích từ vi khuẩn (DnaK) lên đáp ứng miễn dịch của tôm sú. Khả năng đáp ứng miễn dịch của tôm được kiểm tra bằng phản ứng Phenoloxidase thực hiện trên cuvet, so màu bằng quang phổ kế ở bước sóng 492nm và phản ứng định lượng Real-time PCR.
VIỆN NGHIÊN CỨU NUÔI TRỒNG THỦY SẢN ẢNH HƯỞNG CỦA CÁC LIỀU HEAT SHOCK PROTEIN LÊN CÁC THÔNG SỐ MIỄN DỊCH CỦA TÔM SÚ Lê Hồng Phước1*, Nguyễn Hồng Lộc1, Nguyễn Thị Hiền1, Võ Hồng Phượng1 TÓM TẮT Nghiên cứu thực nhằm đánh giá ảnh hưởng liều khác protein sốc nhiệt ly trích từ vi khuẩn (DnaK) lên đáp ứng miễn dịch tôm sú Khả đáp ứng miễn dịch tôm kiểm tra phản ứng Phenoloxidase thực cuvet, so màu quang phổ kế bước sóng 492nm phản ứng định lượng Real-time PCR DnaK ly trích từ chủng vi khuẩn E coli có khả biểu DnaK gắn với hexahistidine sau tinh kít tác dụng hạt từ Dynabead Lượng DnaK ly trích kiểm tra phương pháp Bradford DnaK sau trộn với dung dịch đệm nạp mẫu điện di gel 10% SDS-PAGE Gel sau điện di nhuộm với Bio-safe Coomassie stain (phản ứng SDS-PAGE) chuyển qua màng lai cho phản ứng với kháng thể đặc hiệu cho DnaK (phản ứng Western Blot) Tơm sú có trọng lượng trung bình 10-12g tiêm với liều khác DnaK (2, 4, 6, 8, 10 15µg/tơm), máu tơm thu thời điểm 2, 4, 10 sau tiêm DnaK Biểu gen prophenoloxidase kiểm tra phản ứng định lượng real-time PCR Tôm tiêm với 10 µg DnaK làm tăng biểu Prophenoloxidase (proPO) thời điểm sau tiêm khác biệt có ý nghĩa thống kê so với nghiệm thức khác (p < 0,05) Kết cho phép kết luận DnaK có khả điều khiển đáp ứng miễn dịch tơm sú Từ khóa: DnaK, tôm sú, HSP70, prophenoloxidase I ĐẶT VẤN ĐỀ Heat shock protein (Protein sốc nhiệt hay Hsp) loại protein sinh trình sốc nhiệt yếu tố khác thay đổi đột ngột yếu tố môi trường sống (pH, độ mặn, ) Hsp Ritossa khám phá vào năm 1962 ruồi dấm Drosophila melanogaster Tuy nhiên, đến năm 1974 có tên gọi thức Hsp Theo Lindquist Craig (1988), HSP tìm thấy hầu hết thể sinh vật Hsp chiếm từ 5-10% tổng protein tế bào bình thường tăng lên gấp 2-3 lần gặp phải yếu tố gây sốc nóng, lạnh, thiếu dinh dưỡng, thiếu ôxy nhiễm bệnh (Pockley, 2003) Căn trọng lượng phân tử, HSP phân làm nhiều nhóm Hsp40, Hsp60, Hsp70, Hsp90, Một nhóm Hsp nghiên cứu nhiều Hsp70 Nghiên cứu gần cho thấy nhiệt độ gây sốc khơng gây chết kích thích sinh lượng HSP làm tăng khả đáp ứng với tượng nhiễm khuẩn động vật không xương sống (Singh Aballay, 2006) Theo Campisi ctv., (2003), tiếp xúc với yếu tố gây sốc mạnh làm tăng cường Hsp72 chuột Đây xem dấu hiệu báo động kích thích phân tử NO hoạt động để chống lại vi khuẩn làm tăng cường khả phục hồi từ nhiễm khuẩn Nghiên cứu cá hồi, Sergio ctv., (2007) tìm thấy tiềm Hsp kháng nguyên kích thích sinh miễn dịch Kết kiểm tra phản ứng ELISA cho thấy kháng thể huyết cá nhiễm Piscirickettsia salmonis cho phản ứng dương tính với Hsp trích từ lồi vi khuẩn Do nhóm nghiên cứu cho Hsp sử dụng vaccine để kích thích sinh kháng thể Trung Tâm Quan Trắc Môi Trường & Bệnh Thủy Sản Nam Bộ, Viện Nghiên cứu Nuôi trồng Thủy sản *Email: lehongphuoc@yahoo.com TẠP CHÍ NGHỀ CÁ SƠNG CỬU LONG - SỐ - THÁNG 01/2016 25 VIỆN NGHIÊN CỨU NUÔI TRỒNG THỦY SẢN Hsp nghiên cứu lĩnh vực bệnh đối tượng thủy sản thông qua việc sử dụng ấu trùng Artemia franciscana nuôi điều kiện vơ trùng mơ hình mẫu để gây bệnh thực nghiệm với vi khuẩn Quy trình sốc nhiệt khơng gây chết có tác dụng kích thích sản sinh Hsp70 Artemia tối ưu hóa Cụ thể ấu trùng Artemia ni 28°C gây sốc 37°C 30 phút sau cho khoảng thời gian hồi phục kiểm tra khả đề kháng Artemia gây sốc với Vibrio campbellii Kết cho thấy quy trình tăng cường khả kháng Vibrios gây bệnh ấu trùng Artemia gây sốc nhiệt Tỷ lệ sống tăng gấp đơi nhóm gây sốc nhiệt so với nhóm đối chứng chứng tỏ Hsp70 có vai trị bảo vệ Artemia tác nhân gây bệnh (Yeong ctv., 2007, 2008) Ảnh hưởng Hsp70 lên khả bảo hộ Artemia Vibrio thực thông qua việc khảo sát hàm lượng hoạt động phenoloxidase (Baruah ctv., 2010) Kết cho thấy PO sinh sau cho Artemia ăn E coli siêu tổng hợp Artemia-Hsp70 thấp tương đương với nhóm cho tiếp xúc với Vibrio Tuy nhiên, việc kết hợp yếu tố dẫn đến việc tăng cường hoạt động PO, kết tương thích với lượng RNA thơng tin (bằng kỹ thuật RT-PCR) Từ kết cho thấy hệ thống miễn dịch trước tiên hoạt hố Hsp70, sau kích thích tối đa thời điểm tiếp xúc với tác nhân gây bệnh Điều cho thấy khả đạt tình trạng hoạt hóa hệ miễn dịch tồn đặc điểm quan trọng vật nuôi thủy sản Quy trình hoạt hóa hệ thống miễn dịch lần thực động vật nuôi thủy sản cụ thể tơm sú, thành cơng có khả ứng dụng cho chương trình chọn giống tơm sú dựa vào tính trạng kháng bệnh Mục đích nghiên cứu kiểm tra ảnh hưởng protein sốc nhiệt ly trích từ vi 26 khuẩn (DnaK) lên khả đáp ứng miễn dịch tôm sú II VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Ly trích tinh DnaK DnaK ly trích tinh từ chủng vi khuẩn E coli có khả biểu DnaK gắn với hexahistidine Bước ly trích DnaK cấy E coli từ ống giữ giống lên đĩa thạch Luria-Bertani (LB) ủ 37°C 24 sau chọn khuẩn lạc cấy tăng sinh môi trường lỏng LB đến pha log (mật độ quang OD600 nm = 0,4 - 0,6) Việc kích thích sinh DnaK protein thực cách thêm đường L-arabinose (0,5 mg/ml) sau tiếp tục ủ 37°C Toàn vi khuẩn tăng sinh chuyển qua ống falcon vô trùng ly tâm 2.200g 15 phút, thu cặn hòa vào dung dịch đệm Phosphate-Buffered Saline 1X (PBS, pH = 7,2, Sigma-Aldrich) Vi khuẩn bị làm vỡ tế bào đồng dập mẫu mini beadsbeater (Biospec, USA) ly tâm 2.200 g phút 4°C, thu dịch để tinh DnaK kít tác dng ca cỏc ht t Dynabeads (Dynabeadsđ His-Tag Isolation v1àl DND/RNA free water 8,5µl cDNA mẫu Chu trình nhiệt: 50oC/ phút 95oC/10 phút 95oC/15 giây 60oC/1 phút 95 C/5 phút o 35 chu kỳ Tăng nhiệt độ từ 55oC lên 95oC 80 bước, bước tăng 0,5oC 10 giây Tính giá trị ∆CT gen đích = CT mẫu thử CT mẫu đối chứng (CT số chu kỳ mà tín hiệu huỳnh quang bắt đầu vượt qua giá trị threshold) Nếu quy trình qPCR có lặp lại tính giá trị trung bình ∆CT gen đích Thực tương tự để giá trị trung bình ∆CT gen tham chiếu Tính giá trị ∆∆CT = trung bình ∆CTgen đích - trung bình ∆CT gen tham chiếu Tỉ lệ biểu gen (R) = 2-∆∆CT 28 TẠP CHÍ NGHỀ CÁ SƠNG CỬU LONG - SỐ - THÁNG 01/2016 VIỆN NGHIÊN CỨU NUÔI TRỒNG THỦY SẢN 2.6 Bố trí thí nghiệm Thí nghiệm có nghiệm thức gồm nghiệm thức đối chứng nghiệm thức tiêm với nồng độ Hsp70 (2, 4, 6, 8, 10, 15 µg/0,2 ml/tơm) Mỗi nghiệm thức gồm tơm có trọng lượng trung bình 10-12 g thời điểm thu mẫu Thu máu thời điểm 2, 4, 10 sau tiêm DnaK Thực phản ứng phenoloxidase đọc quang phổ kế theo phương pháp trình bày phần Ngồi Hình Tinh DnaK hạt từ eppendroff Xác định hàm lượng protein DnaK tinh dựa theo quy trình Quick StartTM Bradford Protein Assay (BIO-RAD) Việc định lượng protein DnaK tinh dùng Hình Chuyển gel sau điện di SDSPAGE lên màng lai để thực phản ứng Western Blot thực phản ứng định lượng RT-PCR từ máu tôm thu III KẾT QUẢ 3.1 Ly trích DnaK DnaK tinh kít tác dụng hạt từ Dynabeads (Dynabeads® His-Tag Isolation & Pull down, Invitrogen) mô tả cụ thể phần phương pháp Hình Bước cuối tinh (qua lọc ly tâm) làm sở cho phản ứng SDS-PAGE Western Blot Kết ly trích tinh thu lượng DnaK với nồng độ thơng thường từ 1-2 µg/µl Hình Bản gel sau ghép với màng lai vào bồn điện di để thực phản ứng Western Blot TẠP CHÍ NGHỀ CÁ SƠNG CỬU LONG - SỐ - THÁNG 01/2016 29 VIỆN NGHIÊN CỨU NUÔI TRỒNG THỦY SẢN Hình Kết điện di SDS-PAGE DnaK sản sinh từ E coli (1µg DnaK tinh điện di nhuộm với Commassie Biosafe; M = thang protein) (hình trái) DnaK xác định sau thực phản ứng Western Blot (hình phải) 3.2 Ảnh hưởng liều DnaK lên đáp ứng miễn dịch tôm sú 3.2.1 Kết phản ứng PO assay tiêm tôm sú với liều DnaK khác với quy trình Baruah ctv., (2011) với quy Kiểm tra phản ứng phenoloxidase phản ứng tạo màu đo quang phổ kế bước sóng 492nm Máu tôm sau thu chứa eppendroff giữ lạnh (Hình 6) sau tiến hành ly tâm thu cặn tế bào thực bước làm vỡ tế bào mô tả phần phương pháp Cuối thực phản ứng PO assay cuvet (Hình 7) Trong nghiên cứu này, Các tác giả thực PO assay đo OD PO assay tham khảo có bổ sung so sánh Hình Máu tôm thu chứa dung dịch kháng đông, giữ lạnh 30 trình tương tự đối tượng Artemia máy đọc ELISA Tuy nhiên có tác giả thực phản ứng cuvet đơn đo OD máy quang phổ (Sritunyalucksana ctv., 1999; Sung ctv., 1998) nghiên cứu tôm sú tôm xanh Về PO assay thực nhờ L-DOPA dung dịch đệm (có thể đệm citrate Tris saline buffer) Hình Phản ứng PO assay thực cuvet TẠP CHÍ NGHỀ CÁ SÔNG CỬU LONG - SỐ - THÁNG 01/2016 VIỆN NGHIÊN CỨU NUÔI TRỒNG THỦY SẢN Ở thời điểm sau tiêm DnaK có tăng nhẹ phenoloxidase nghiệm thức tiêm 8, 10 15µg protein, liều tiêm cịn lại có phenoloxidase tăng khơng khác nhiều so với đối chứng (Đồ thị 1) Khuynh hướng ghi nhận lần thí nghiệm thứ (Đồ thị 2) Ở thời điểm 10 sau tiêm DnaK, hầu hết nghiệm thức tiêm DnaK có biến động phenoloxidase gần với nghiệm thức đối chứng Nghiệm thức tiêm 10µg DnaK có phenoloxidase tăng thời điểm thu mẫu Tuy nhiên, việc tăng giảm phenoloxidase nghiệm thức chưa có khác biệt rõ rệt Chính vậy, phản ứng định lượng realtime PCR cần thực để xem biến động mặt định lượng nghiệm thức theo thời gian thu mẫu khác (Kết trình bày phần sau) Đồ thị Biến động lượng phenoloxidase sau tiêm DnaK liều 2, 4, 6, 8, 10 15 µg/tơm (thí nghiệm 1) Đồ thị Biến động lượng phenoloxidase sau tiêm DnaK liều 2, 4, 6, 8, 10 15 µg/tơm (thí nghiệm 2) TẠP CHÍ NGHỀ CÁ SÔNG CỬU LONG - SỐ - THÁNG 01/2016 31 VIỆN NGHIÊN CỨU NUÔI TRỒNG THỦY SẢN 3.2.2 Kết định lượng phenoloxidase RT-PCR máu tôm thu sau tiêm với liều khác DnaK Kết Đồ thị cho thấy thời điểm sau tiêm DnaK có gia tăng đáng kể (gấp lần so với đối chứng) PO nghiệm thức tiêm 10 µg DnaK Sự khác biệt cịn tìm thấy thời điểm Tuy nhiên thời điểm 10 khơng tìm thấy khác biệt tỷ lệ biểu mRNA ProPO nghiệm thức Ở lần thí nghiệm thứ hai cho khuynh hướng tương tự (Đồ thị 4) Đồ thị Kết định lượng PO RT-PCR sau tiêm tôm với liều khác DnaK (thí nghiệm 1) Đồ thị Kết định lượng PO RT-PCR sau tiêm tôm với liều khác DnaK (thí nghiệm 2) 32 TẠP CHÍ NGHỀ CÁ SƠNG CỬU LONG - SỐ - THÁNG 01/2016 VIỆN NGHIÊN CỨU NUÔI TRỒNG THỦY SẢN IV THẢO LUẬN Hsp70 loại protein nhận định thường hữu hầu hết loại tế bào, tăng mạnh đáp ứng với điều kiện stress hay yếu tố lạ tôm sú điều ngoại lệ Ở liều tiêm 10 μg DnaK kích thích biểu PO cao gấp lần thời điểm sau tiêm Lượng PO cao nghiệm thức thời điểm sau giảm đáng kể thời điểm thu mẫu cịn lại Có thể chất DnaK hay đáp ứng miễn dịch tôm biểu kéo dài khoảng thời gian ngắn Ở thời điểm sau bình ổn hệ miễn dịch nên khơng thấy tăng giảm PO đáng kể Đã có nhiều nghiên cứu cho HSP70 đóng vai trị yếu tố hoạt hóa hệ miễn dịch tự nhiên (Pockley, 2003; Tsan, 2004) cụ thể kích thích hoạt động tế bào hệ miễn dịch Nghiên cứu ứng dụng HSP70 tái tổ hợp cho thấy HSP70 có khả kích thích sản sinh cytokines IL-1 hay TNF-α từ bạch cầu đơn nhân lớn người hay đại thực bào chuột điều kiện in vitro (Basu ctv., 2002; Galdiero ctv., 1997) Prophenoloxidase đóng vai trị quan trọng đáp ứng miễn dịch giáp xác Các nghiên cứu cho thấy ProPO có vai trị quan trọng chế miễn dịch chống lại bệnh nhiễm khuẩn hay ký sinh trùng (Cerenius Söderhäll, 2004) Hiện chưa thấy công bố nghiên cứu ảnh hưởng tiêm Hsp70 lên PO tôm sú Tuy nhiên, ảnh hưởng kết hợp Hsp70 vi khuẩn Vibrio campbellii lên PO Artemia Baruah ctv., (2011) nghiên cứu Theo nhóm tác giả cho Artemia ni điều kiện vô trùng ăn Hsp70 từ Artemia Hsp70 kích thích sinh từ E coli gây nhiễm V campbellii cho thấy tăng cường hệ thống ProPO chứng minh mRNA mức độ protein Nghiên cứu cho thấy Hsp70 có nguồn gốc từ prokaryotic hay eukaryotic nguồn khơi dậy tác dụng bảo hộ miễn dịch Artemia chống lại tác nhân gây bệnh cách hoạt hóa hệ thống ProPO Đây nghiên cứu hoạt động hoạt hóa Hsp70 động vật không xương sống Theo Ryckaert ctv., (2010) Hsp70 tái tổ hợp tiêm vào playfish (Xiphophorus maculates) có vai trị kích thích miễn dịch kháng lại tác nhân gây bệnh Yersinia ruckeri Tuy nhiên, hiệu bảo hộ chưa so sánh với vaccine Trong nghiên cứu này, nghiệm thức tiêm Hsp70 liều 2, 4, µg DnaK khơng có khác biệt lớn phenoloxidase so với nhóm đối chứng thời điểm thu mẫu Theo nghiên cứu trước lượng PO sinh có liên quan đến chu kỳ lột xác tôm Liu ctv., (2004) nghiên cứu tôm thẻ chân trắng 8,0–14,4 g giai đoạn lột xác khác cho thấy tổng số tế bào máu cao giai đoạn sau lột xác lớp vỏ cứng (intermoult) thấp giai đoạn vừa sau lột xác Hoạt động phenoloxidase cao giai đoạn intermoult thấp giai đoạn vừa sau lột xác Hoạt động thực bào tôm với Vibrio alginolyticus giảm cách đáng kể giai đoạn vừa sau lột xác giai đoạn tiền lột xác Trong thí nghiệm khác, tiêm tôm thẻ chân trắng giai đoạn lột xác khác với 105 CFU V alginolyticus cho thấy sau 10 tiêm cho thấy tỷ lệ chết nhóm vừa sau lột xác cao có ý nghĩa so với nhóm giai đoạn intermoult Sau 48-120 theo dõi cho thấy nhóm tơm giai đoạn vừa sau lột xác có tỷ lệ chết cao nhóm intermoult cho tỷ lệ chết thấp Vì để loại trừ khả ảnh hưởng giai đoạn lột xác đến phenoloxidase sau tiêm với liều khác DnaK, nghiên cứu chúng TẠP CHÍ NGHỀ CÁ SƠNG CỬU LONG - SỐ - THÁNG 01/2016 33 VIỆN NGHIÊN CỨU NUÔI TRỒNG THỦY SẢN chọn lựa tôm đồng giai đoạn lột xác trước tiến hành thí nghiệm Theo Sung (2014) cho ấu trùng tơm thẻ chân trắng ăn E coli YS có khả sản sinh DnaK kích thích Arabinose làm tăng cường khả đề kháng gây nhiễm với V harveyi Bằng phương pháp Realtime PCR nhóm tác giả tìm thấy nhóm cho ăn E coli tăng crustin mRNA gấp lần so với nhóm đối chứng Tuy nhiên nhóm tác giả khơng tìm thấy khác biệt so với nhóm đối chứng tiêu miễn dịch khác ProPO, penaeidin, hemocyanin peroxinectin Theo kết nghiên cứu Hu ctv., (2014) cho thấy DnaK có khả kích thích hệ thống miễn dịch tôm thẻ chân trắng Sau tiêm tôm thẻ chân trắng với DnaK tinh liều µg/tơm nhóm tác giả tìm thấy có tăng có ý nghĩa thống kê tiêu transglutaminases prophenoloxidases tôm thẻ chân trắng thời điểm sau tiêm DnaK Ngoài tăng PO cịn có tăng giảm gen liên quan đến miễn dịch tôm thẻ chân trắng Penaeidin (PEN), Transgluminase (TGase-1), endogenous HSP70 34 (lvHSP70) (lv = left ventricular) Tuy nhiên, tất gen điều hòa miễn dịch tăng sau tiêm DnaK giới hạn số điểm thời gian định V KẾT LUẬN Tiêm tôm với 8, 10 µg DnaK làm tăng biểu proPO thời điểm sau tiêm, điều xác định phản ứng định lượng RT-PCR Kết kiểm tra hoạt tính phenoloxidase phản ứng Phenoloxidase thực cuvet chưa thấy khác biệt lớn hoạt tính phenoloxidase tiêm tôm với DnaK Tuy nhiên với kết định lượng cho thấy khác biệt có ý nghĩa thống kê số thời điểm thu mẫu LỜI CÁM ƠN Nghiên cứu thực nội dung chương trình nghiên cứu song phương Việt Bỉ với kinh phí từ Quỹ phát triển Khoa học Công nghệ Quốc gia Nhóm tác giả chân thành cảm ơn tài trợ Quỹ giúp đỡ giáo sư thuộc Laboratory of Aquaculture & Artemia Reference Center (Gent, Belgium) TẠP CHÍ NGHỀ CÁ SƠNG CỬU LONG - SỐ - THÁNG 01/2016 VIỆN NGHIÊN CỨU NUÔI TRỒNG THỦY SẢN TÀI LIỆU THAM KHẢO Basu, N., Todgham, A.E., Ackerman, P.A., Bibeau, M.R., Nakano, K., Schulte, P.M., Iwama, G.K., 2002 Heat shock protein genes and their functional significance in fish Gene 295: 173–183 Baruah, K., Ranjan, J., Sorgeloos, P and Bossier, P., 2010 Efficacy of heterologous and homologous heat shock protein 70s as protective agents to Artemia franciscana challenged with Vibrio campbellii Fish & Shellfish Immunology 29: 733-739 Baruah, K., Ranjan, J., Sorgeloos, P., Macrae, T.H and Bossier, P., 2011 Primming the prophenoloxidase system of Artemia Franciscana by heat shock proteins protects against Vibrio campbellii challenge Fish & Shellfish Immunology 31(1):134-41 Cerenius, L., Soderhall, K., 2004 The prophenoloxidaseactivating system in invertebrates Immunology Review 198: 116–126 Galdiero, M., de l’Ero, G.C., Marcatili, A., 1997 Cytokine and adhesion molecule expression in human monocytes and endothelial cells stimulated with bacterial heat shock proteins Infecion and Immunity 65 (2): 699-707 Hu, B., Phuoc, L.H., Sorgeloos, P., Bossier, P., 2014 Bacterial HSP70 (DnaK) is an efficient immune stimulator in Litopenaeus vannamei Aquaculture, 418–419, 87–93 Ji, P-F., Yao, C-L., Wang, Z-Y., 2009 Immune response and gene expression in shrimp (Litopenaeus vannamei) hemocytes and hepatopancreas against some pathogen-associated molecular patterns Fish & Shellfish Immunology 27: 563-570 Lindquist, S., and Craig, E A., 1988 The heat shock proteins Annual Review Genetic 22: 631-637 Liu, C-H., Yeh, S-T., Cheng, S-Y., and Chen, J-C., 2004 The immune response of the white shrimp Litopenaeus vannamei and its susceptibility to Vibrio infection in relation with the moult cycle Fish & Shellfish Immunology 16: 151–161 Liu, C.H., Yeh, S.P., Kuo, C.M., Cheng, W., Chou, C.H., 2006 The effect of sodium alginate on the immune response of tiger shrimp via dietary administration: activity and gene transcription Fish & Shellfish Immunology 21:442-253 Pockley, A G., 2003 Heat shock proteins as regulators of the immune response The Lancet 362: 469476 Pockley, A.G., 2005 Heat shock proteins as regulators of the immune response The Lancet 362: 469–476 Ryckaert, J., Pasmans, F., Tobback, E., Duchateau, L., Decostere, A., Haesebrouck, F., 2010 Heat shock proteins protect platyfish (Xiphophorus maculatus) from Yersinia ruckeri induced mortality Fish & Shellfish Immunology 28: 228–231 Sergio, H M., Pablo, C., Marcela, Z., Jorge, O., Fernando, G., Patricio, C., and Vitalia, H., 2007 Immunological characterization of a bacterial protein isolated from salmonid fish naturally infected with Piscirickettsia salmonis Vaccine 25: 2095–2102 Singh, V., and Aballay, A., 2006 Heat-shock transcription factor (HSF)-1 pathway required for Caenorhabditis elegans immunity Proceedings of the National Academy of Sciences USA 103: 13092-13097 Sritunyalucksana, K., sithisarn, P., withayachumnarnkul, B., and flegel, T.W., 1999 Activation of prophenoloxidase, agglutinin and antibacterial activity in haemolymph of the black tiger prawn, Penaeus monodon, by immunostimulants Fish & Shellfish Immunology 9: 21–30 Sung, H.H., Chang, H.J., Her, C.H., Chang, J.C., Song, Y.L., 1998 Phenoloxidase activity of hemocytes derived from Penaeus monodon and Macrobrachium rosenbergii Journal of Invertebrate Pathology 71(1): 26-33 Sung, Y.Y., 2014 Heat Shock Proteins: An Alternative to Control Disease in Aquatic Organism Journal of Marine Science: Research & Development 4:e126 doi: 10.4172/2155-9910.1000e126 Tsan, M.F., 2004 Cytokine function of heat-shock proteins AJP: Cell Physiology, 286, 739-744 Yeong, Y.S., Van Damme, E J.M., Sorgeloos, P., and Bossier, P., 2007 Non-lethal heat shock protect gnotobiotic Artemia franciscana larvae against virulent Vibrios Fish & Shellfish Immunology 22: 318-326 Yeong, Y S., Pineda, C., MacRae, T H., Sorgeloos, P., and Bossier, P., 2008 Exposure of gnotobiotic Artemia franciscana larvae to abiotic stress promotes heat shock protein 70 synthesis and enhances resistance to pathogenic Vibrio campbellii Cell Stress Chaperones 13(1): 59-66 Yeong, Y.S, Ashame, M.S., Chen, S., MacRae, T.H., Sorgeloos, P and Bossier, P., 2009 Feeding Artemia franciscana (Kellogg) larvae with bacterial heat shock protein, protects from Vibrio campbellii infection Journal of Fish Diseases 32 (8): 675-685 TẠP CHÍ NGHỀ CÁ SƠNG CỬU LONG - SỐ - THÁNG 01/2016 35 VIỆN NGHIÊN CỨU NUÔI TRỒNG THỦY SẢN EFFECT OF DIFFERENT DOSE OF HEAT SHOCK PROTEINS ON IMMUNE PARAMETERS OF BLACK TIGER SHRIMP (Penaeus monodon) Le Hong Phuoc1*, Nguyen Hong Loc1, Nguyen Thi Hien1, Vo Hong Phuong1 ABSTRACT This study was conducted to evaluate the effect of different doses of bacterial heat shock protein (DnaK) on immune response of black tiger shrimp (Penaeus monodon) Shrimp’s immune response was tested by carrying out phenoloxidase reaction in cuvet, then measuring OD492nm by photospectrometer and quantification of mRNA by Real-time PCR DnaK was extracted from E coli strain overexpressing DnaK with a hexahistidine-tag After extraction DnaK was purified by Dynabead manegtic beads The concentration of purified recombinant DnaK was determined by Bradford assay DnaK sample was then combined with loading buffer and electrophoresed in 10% SDS-PAGE gels Gels were either stained with Bio-safe Coomassie stain (SDS-PAGE) or transferred to polyvinylidene fluoride membranes for antibody probing (Western Blot) The juvenile P monodon shrimp (mean body weight = 10-12g) were injected with DnaK at a dose of 2, 4, 6, 8, 10 or 15 µg shrimp-1 Haemolymph were collected at 2, 4, 7, and 10 hours post DnaK injection The expression of prophenoloxidases gene was monitored via quantitative RT-PCR Shrimps injected with or 10 µg DnaK resulted in significantly increase in PO at and hours post injection compared to other treatments (p < 0.05) This result suggests that DnaK is able to modulate immune responses in P monodon Keywords: DnaK, shrimp, prophenoloxidase, HSP70 Người phản biện: TS Nguyễn Thị Ngọc Tĩnh Ngày nhận bài: 18/11/2015 Ngày thông qua phản biện: 18/12/2015 Ngày duyệt đăng: 25/12/2015 Southern Monitoring Center for Aquaculture Environment and Epidemic, Research Institute for Aquaculture No2 * Email: lehongphuoc@yahoo.com 36 TẠP CHÍ NGHỀ CÁ SƠNG CỬU LONG - SỐ - THÁNG 01/2016 ... định sau thực phản ứng Western Blot (hình phải) 3.2 Ảnh hưởng liều DnaK lên đáp ứng miễn dịch tôm sú 3.2.1 Kết phản ứng PO assay tiêm tôm sú với liều DnaK khác với quy trình Baruah ctv., (2011)... thống miễn dịch lần thực động vật nuôi thủy sản cụ thể tôm sú, thành công có khả ứng dụng cho chương trình chọn giống tơm sú dựa vào tính trạng kháng bệnh Mục đích nghiên cứu kiểm tra ảnh hưởng protein. .. Söderhäll, 2004) Hiện chưa thấy công bố nghiên cứu ảnh hưởng tiêm Hsp70 lên PO tôm sú Tuy nhiên, ảnh hưởng kết hợp Hsp70 vi khuẩn Vibrio campbellii lên PO Artemia Baruah ctv., (2011) nghiên cứu Theo