Tài liệu Ảnh hưởng của bổ sung các loại chế phẩm sinh học chứa vi khuẩn Bacillus trong ương ấu trùng ốc hương (Babylonia areolata).
Trang 1ẢNH HƯỞNG CỦA BỔ SUNG CÁC LOẠI
CHẾ PHẨM SINH HỌC CHỨA VI KHUẨN Bacillus
TRONG ƯƠNG ẤU TRÙNG ỐC HƯƠNG
(Babylonia areolata)
Ngô Thị Thu Thảo và Phạm Thị Tuyết Ngân 1
ABSTRACT
Larvae of sweet snail Babylonia areolata were nursed in 30 L tanks during 15 days of experiment period and supplemented with microbial products containing Bacillus at the density of 10 5 CFU/ml The experiment was designed with 3 treatments and 3 replicates were run per each treatment: 1) Bacillus strain was isolated from intensive shrimp pond in Soctrang province (B37); 2) Bacillus from PrawnBac product and 3) Bacillus strain from shrimp pond in other province in Mekong Delta Our findings showed that suplementation of Bacillus strain B37 resulted in significant higher (P<0.05) survival rate (40.9%), larval production (81.9 inds/L) and metamorphosis (40.4%) In addition, dentity of Vibrio was lowest in tanks with B37 suplementation compared to others (10 1 - 8.10 1 CFU/ml) This pattern indicated that the ability
to limit the development of Vibrio in nursing tanks Results of study could be useful to applied in molluscan hatcheries
Keywords: Bacillus, Babylonia areolata, larvae
Title: Effects of Bacillus based-probiotics during larval nursing of sweet snail (Babylonia areolata)
TÓM TẮT
Ấu trùng ốc hương Baylonia areolata được ương trong bể thể tích 30 lít và bổ sung các chế phẩm chứa vi khuẩn Bacillus khác nhau với mật độ 10 5 CFU/ml là: 1) Dòng Bacillus phân lập từ ao nuôi tôm sú thâm canh tại tỉnh Sóc Trăng (B37); 2) Chế phẩm Prawn Bac của Hoa Kỳ (PrawnBac) và 3) Chế phẩm sinh học có chứa Bacillus phân lập từ ao nuôi tôm thuộc một tỉnh khác tại ĐBSCL (CNSH) Kết quả cho thấy khi bổ sung dòng B37 tỷ lệ sống của ấu trùng ốc hương đạt 40,9%, năng suất 81,9 con/L, tỷ lệ ốc giống đạt 40,4% và khác biệt
có ý nghĩa so với các nghiệm thức khác (P<0,05) Dòng B37 khi bổ sung vào
bể ương đã hạn chế sự phát triển và làm cho mật độ vi khuẩn Vibrio đạt thấp nhất trong tất cả các nghiệm thức thí nghiệm (10 1 - 8x10 1 CFU/ml)
Từ khóa: Bacillus, ốc hương, Babylonia areolata, ấu trùng
1 Khoa Thủy sản, Đại học Cần Thơ
Trang 21 GIỚI THIỆU
Tảo đơn bào là thức ăn chính trong giai đoạn ương ấu trùng ốc hương tuy nhiên trong môi trường thiếu ánh sáng, tảo dễ tàn và quá trình phân hủy sẽ làm xấu đi chất lượng nước trong bể ương Ngoài ra trong quá trình ương nuôi ấu trùng, các loại thức ăn nhân tạo như Lansy, Fripak, bột thịt hàu… cũng được sử dụng nên làm cho môi trường nước mau bị ô nhiễm Bên cạnh các chất thải của quá trình tiêu hóa, ốc hương còn tiết ra dịch nhầy làm ô nhiễm môi trường Ấu trùng ốc hương rất mẫn cảm với những thay đổi của yếu tố môi trường và việc thay nước nếu gây ra quá nhiều xáo trộn sẽ làm giảm tỷ lệ sống và năng suất của quá trình xuất giống Sử dụng vi sinh vật hữu ích trong ương nuôi các đối tượng thủy sản đang được áp dụng rộng rãi (Garriques và Arevalo, 1995, Havennaar và Huys, 2003; Phạm Thị Tuyết Ngân và Trương Quốc Phú, 2010) Các nghiên cứu đều cho thấy vi khuẩn hữu ích đóng vai trò quan trọng quá trình phân hủy chất hữu cơ, cải thiện chất lượng nước, chuyển hóa các khí độc như NH3-, NO2- sang các dạng không độc hại Nghiên cứu này được thực hiện nhằm đánh giá ảnh hưởng của việc bổ sung các dòng vi khuẩn hữu ích khác nhau đến các yếu tố môi trường và hiệu quả của việc ương nuôi ấu trùng ốc hương
2 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP
2.1 Vật liệu thí nghiệm
Đối tượng thí nghiệm là ấu trùng ốc hương được sinh sản từ nguồn ốc bố mẹ nuôi tại trại thực nghiệm Động vật thân mềm - Khoa Thủy sản - Đại học Cần Thơ Bể ương có thể tích 30 lít, mật độ ương ấu trùng là 200 con/lít Nước ót được xử lý, pha với nước máy và duy trì độ mặn 30‰ Trong quá trình thí nghiệm, bể ương được sục khí liên tục và thay nước 25-50% sau mỗi 3 ngày ương
Các dòng vi khuẩn hữu ích được bổ sung theo 3 nghiệm thức khác nhau, mỗi nghiệm thức lặp lại 3 lần Trong đó dòng Bacillus B37 (B37) là vi khuẩn
Bacillus sp chủng 37 của Khoa Thủy sản Đại học Cần Thơ, được phân lập từ
ao nuôi tôm sú huyện Vĩnh Châu, Sóc Trăng Prawn Bac là chế phẩm sinh học
được sản xuất tại Mỹ có thành phần là Bacillus subtilis, Bacillus licheniformis,
Bacillus megaterium, Bacillus amyloliquefaciens và các loại enzyme như
Protease, Amylase, Esterase, Cellulose, Xylanase Dòng Bacillus được phân
lập trong ao nuôi tôm tại một tỉnh khác thuộc Đồng bằng sông Cửu Long
(CNSH) có thành phần gồm có Bacillus subtilis, Pseudomonas sp, nấm men và
Lactobacillus
2.2 Phương pháp nuôi tăng sinh và bổ sung vi khuẩn Bacillus
Chủng vi khuẩn Bacillus B37 và các CPSH được phục hồi trên môi trường
Trang 3Bertani (LB) Sau khi nuôi tăng sinh mật độ vi khuẩn được xác định bằng phương pháp đo OD ở bước sóng 600 nm Đối với các chế phẩm sinh học (PrawnBac và CNSH), trước khi cho vào bể ương thì cân khối lượng, cho vào nước và sục khí 1-2h cho hệ vi khuẩn trong chế phẩm hoạt động Mật độ vi
ngày bổ sung vi khuẩn một lần và thu mẫu trước khi bổ sung đợt mới cho đến khi kết thúc thí nghiệm
2.3 Phương pháp xác định mật độ tổng vi khuẩn và Vibrio
Nước muối sinh lý (0,85%) đã tiệt trùng ở 121ºC trong 20 phút dùng để pha loãng mẫu chứa trong các ống nghiệm 9 mL Môi trường TSA (Tripticase Soya
được chuẩn bị để cấy vi khuẩn Một ml nước bể ương được chuyển vào ống nghiệm chứa 9 mL nước muối sinh lý đã tiệt trùng, trộn đều bằng máy khoảng
1 phút đạt độ pha loãng 10-1 Tiếp tục pha loãng đến khi đạt độ pha loãng thích hợp, bắt đầu từ độ pha loãng 10-2 chỉ lắc 30 giây và để lắng 15 giây Sau đó, 3
độ pha loãng thích hợp được chọn cho mật độ của vi khuẩn tổng cộng và vi
khuẩn Vibrio Từ mỗi nồng độ pha loãng, 100μL của mẫu nước được hút ra và
nồng độ pha loãng lặp lại 3 lần Đĩa môi trường sau khi tán được ủ ở 30oC trong 24 – 28 giờ
2.4 Phương pháp xác định mật độ vi khuẩn Bacillus
Sau khi pha loãng, để nhiệt kế vào một ống nghiệm khác có chứa nước Sau đó
để vào nước nóng ở 80ºC trong 10 phút rồi lấy các ống nghiệm ra (Nguyễn Lân Dũng, 1983) Sau đó dùng micropipete hút 100 µL dung dịch huyền phù vi
khuẩn cho vào các đĩa chứa môi trường chuyên biệt cho giống Bacillus rồi
dùng que thủy tinh tán đều đến khi mẫu khô Ủ ở 28ºC trong 24 - 48 giờ Sau khi ủ xác định mật số như cách đã trình bày ở trên
2.5 Phương pháp thu và phân tích chất lượng nước
Các chỉ tiêu chất lượng nước như nhiệt độ, độ mặn, pH, NH4/NH3 và NO2 được ghi nhận trước khi tiến hành thu mẫu Mẫu xác định chất lượng nước được thu cùng thời điểm với thu mẫu vi sinh và được xác định bằng bộ test SERA (Germany)
2.6 Cách cho ăn và quản lý ấu trùng ốc hương
Ấu trùng ốc hương được cho ăn 3 lần/ngày bằng tảo Chaetoceros calcitrans có
bổ sung Fripak vào lúc 8 giờ, 14 giờ và 20 giờ Kích thước ấu trùng được xác định lúc bắt đầu thí nghiệm và sau mỗi 3 ngày để tính tốc độ tăng trưởng Số lượng ấu trùng trong từng bể ương cũng được định lượng khi bắt đầu và khi kết thúc thí nghiệm để tính tỉ lệ sống
Trang 4Sử dụng phần mềm Excel tính toán các giá trị trung bình, độ lệch chuẩn và xử
lý thống kê ANOVA bằng phần mềm SPSS để so sánh sự khác biệt giữa giá trị trung bình của các nghiệm thức ở mức p<0,05
3 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
3.1 Biến động các yếu tố môi trường
3.1.1 Nhiệt độ
Hình 1 Biến động nhiệt độ ( o C) trong quá trình thí nghiệm
Hình 1 cho thấy nhiệt độ buổi sáng tăng dần và giữ ổn định trong suốt thời gian
trong 6 ngày đầu dao động từ 28-30oC và giữ ổn định trong các ngày tiếp theo Vào cuối thời gian thí nghiệm, nhiệt độ có biến động nhưng vẫn nằm trong khoảng an toàn cho sự phát triển của ấu trùng Kết quả này phù hợp với nhận định của Nguyễn Thị Xuân Thu (2006) là ốc hương có thể sống ở nhiệt độ
12-35oC, khoảng nhiệt độ thích hợp từ 26-28oC
3.1.2 pH
Giá trị pH ở các nghiệm thức dao động từ 7,1-8,7 và không có sự chênh lệch giữa các nghiệm thức Theo Nguyễn Thị Xuân Thu (2006), giá trị pH từ 6-9 thích hợp cho phát triển ấu trùng ốc hương
3.1.3 NH 4 + /NH 3 (mg/L)
suốt quá trình thí nghiệm và có xu hướng giảm dần từ ngày thứ 11 đến ngày
các loài thủy sản có thể sinh trưởng là 0,2 - 2,0 mg/L
23
24
25
26
27
28
29
30
31
32
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16
Ngày thí nghiệm
Trang 53.1.4 Nitrite (mg/L)
Hàm lượng NO2- bắt đầu tăng nhanh từ ngày 5 đến ngày 15 của quá trình thí nghiệm Đây là kết quả của hiện tượng tích lũy chất dinh dưỡng từ thức ăn dư thừa và chất thải của ấu trùng ốc hương Biến động hàm lượng các chất đạm trong các bể ương ấu trùng cho thấy vi khuẩn dòng B37 hoặc các CPSH khác dường như chưa phát huy hiệu quả triệt để trong quá trình chuyển hóa đạm hoặc cũng có thể do chu kỳ thu mẫu ngắn mà đặc điểm này chưa được làm rõ (Bảng 1) Boyd (1998) cho rằng hàm lượng NO2- trong nước nên thấp hơn 0,1 mg/L NO2- là một trong những yếu tố khó kiểm soát trong hệ thống nước tĩnh,
(Menasveta et al., 1980)
Bảng 1 Trung bình giá trị pH, hàm lượng NH 4 + /NH 3 và NO 2 - trong các nghiệm
thức
Nghiệm thức
3.2 Biến động mật độ Bacillus trong bể nuôi ấu trùng
Hình 2 Biến động mật độ vi khuẩn Bacillus trong nước
Mật độ vi khuẩn Bacillus đạt cao nhất ở nghiệm thức bổ sung dòng B37
(4,8.105 - 2,6.106 CFU/ml), tiếp theo là nghiệm thức CNSH (5,8.104 - 9,9.105
CFU/ml), và nghiệm thức Prawn Bac (2,5.104 - 9,4.105 CFU/ml) Tất cả các
nghiệm thức bổ sung vi khuẩn định kỳ đều có mật độ vi khuẩn Bacillus cao
0.00
1.00
2.00
3.00
4.00
5.00
6.00
7.00
Ngày
B-37 Prawn Bac CNSH
Trang 6(Hình 2) và khác biệt không có ý nghĩa thống kê với nhau (p>0,05) Nghiệm
thức bổ sung dòng B37 có thời gian duy trì mật độ vi khuẩn Bacillus ổn định
qua các lần thu mẫu, thời gian thích ứng nhanh hơn và thời gian tồn tại trong nước lâu hơn các nghiệm thức khác (5 ngày)
3.3 Mật độ Vibrio tổng cộng (CFU/ml)
9,1.102 CFU/ml Các nghiệm thức bổ sung vi khuẩn có mật độ vi khuẩn Vibrio
trong nước tương đối thấp qua các lần thu mẫu Nghiệm thức B37 có mật độ vi
khuẩn Vibrio thấp nhất và khác biệt có ý nghĩa thống kê với các nghiệm thức
còn lại (p<0,05) Điều này chứng tỏ dòng vi khuẩn B37 đạt hiệu quả cao hơn
về khả năng lấn át các dòng vi khuẩn Vibrio (Hình 3).Moriaty (1998) thu được
kết quả là khi bổ sung vi khuẩn Bacillus có thể kiểm soát được Vibrio, làm tăng
tỉ lệ sống của tôm sú đồng thời hạn chế được mầm bệnh do vi khuẩn phát sáng
Vibrio spp trong nước và bùn đáy ao
0.00
0.50
1.00
1.50
2.00
2.50
3.00
3.50
Ngày
B-37 Prawn Bac CNSH
Hình 3 Biến động mật độ vi khuẩn Vibrio trong nước
3.4 Mật độ vi khuẩn tổng cộng (CFU/ml)
Kết quả phân tích cho thấy mật độ vi khuẩn tổng cộng trong các nghiệm thức dao động từ 4,5.105 - 4,9.106 CFU/ml (Hình 4) Khi bổ sung vi khuẩn Bacillus hoặc CPSH một cách định kỳ thì mật độ vi khuẩn dao động tương đối ổn định
Vì vậy việc bổ sung định kỳ vi khuẩn có lợi đã giúp cho mật độ vi khuẩn trong quá trình ương ổn định hơn và hạn chế sự phát triển của nhóm vi khuẩn có hại, đồng thời còn giúp cải thiện môi trường tốt hơn và tạo điều kiện thuận lợi cho
ấu trùng phát triển Theo Anderson (1993) trong nước sạch thì tổng vi khuẩn nhỏ hơn 103 CFU/mL, nếu mật đô vi khuẩn vượt 107 CFU/mL sẽ có hại cho vật nuôi và môi trường trở nên xấu đi Mật độ tổng vi khuẩn khi kết thúc thí nghiệm vẫn nằm trong giới hạn cho phép
Trang 71.00
2.00
3.00
4.00
5.00
6.00
7.00
8.00
9.00
Ngày
Hình 4 Biến động mật độ vi khuẩn tổng cộng trong nước (CFU/ml)
3.5 Tăng trưởng chiều dài của ấu trùng ốc hương
Chiều dài ấu trùng tăng theo quá trình nuôi, ở nghiệm thức bổ sung B37 tốc độ tăng trưởng của ấu trùng ốc hương nhanh hơn, tuy nhiên khác biệt giữa các nghiệm thức không có ý nghĩa thống kê (p>0,05) Chiều dài của ấu trùng tăng nhanh vào 5 ngày đầu và cho đến khi kết thúc thí nghiệm, dao động từ 98-191
µm (Hình 5) Sự hiện diện của vi khuẩn Bacillus trong bể ương đã góp phần
phân hủy các hợp chất hữu cơ dư thừa và duy trì môi trường nuôi ổn định Mặt
khác có thể vi khuẩn Bacillus đã sử dụng tảo và các hạt thức ăn như giá thể để
phát triển do đó làm tăng giá trị dinh dưỡng của thức ăn và kích thích sinh trưởng của ấu trùng
0 50
100
150
200
250
Ngày thí nghiệm
Hình 5 Chiều dài ấu trùng ốc hương theo thời gian thí nghiệm
Trang 83.6 Tăng trưởng chiều rộng của ấu trùng ốc hương
Hình 6 cho thấy chiều rộng của ấu trùng cũng tăng dần trong quá trình thí nghiệm, dao động từ 71-168 µm Nguyễn Thị Xuân Thu (2006) thu được kết quả là ấu trùng ốc hương có chiều dài đạt từ 445,9 - 949,5 µm và chiều rộng từ 296,8 - 731,7 µm Các kết quả này đều cao hơn so với ấu trùng được sinh sản nhân tạo tại khoa Thủy sản, Đại học Cần Thơ Có thể nguồn ốc bố mẹ tham gia sinh sản sớm và có kích thước nhỏ hơn nên ảnh hưởng đến kích thước ấu trùng Cũng có thể quá trình thu mẫu không đều và cố định bằng formol cho nên cánh tiêm mao của ấu trùng bị co lại và ảnh hưởng đến các chỉ tiêu đo đạc
0 20 40 60 80 100 120 140 160 180
Ngày thí nghiệm
Hình 6 Chiều rộng ấu trùng ốc hương theo thời gian thí nghiệm
3.7 Tốc độ tăng trưởng tuyệt đối của ấu trùng
Tốc độ tăng trưởng chiều dài của ấu trùng 5 ngày đầu đạt cao nhất ở nghiệm thức B37 (1,9 µm/ngày) và tiếp tục tăng trong các ngày sau đó (Bảng 2) Ở ngày thứ 15, ấu trùng ở nghiệm thức bổ sung B37 cũng có tốc độ tăng trưởng chiều dài đạt cao nhất (6,4 µm/ngày)
Bảng 2 Tốc độ tăng trưởng tuyệt đối của ấu trùng ốc hương theo thời gian
(µm/ngày)
Ngày thí nghiệm Tốc độ tăng trưởng
Chiều dài
Chiều rộng
Trang 9Trong 5 ngày đầu, tốc độ tăng trưởng chiều rộng của ấu trùng ở nghiệm thức
bổ sung B37 đạt cao nhất (1,1 µm/ngày) và tiếp tục tăng dần theo thời gian
nuôi Ấu trùng ở nghiệm thức bổ sung chế phẩm Prawn Bac có tốc độ tăng
trưởng chậm nhất vào cuối thí nghiệm Tuy nhiên tốc độ tăng trưởng về chiều dài và rộng của ấu trùng ở các nghiệm thức khác biệt không có ý nghĩa thống
kê (p>0,05)
3.8 Tỷ lệ sống và năng suất ấu trùng
Trung bình tỷ lệ sống ấu trùng ốc hương đạt cao nhất ở nghiệm thức bổ sung
B37 (40,9%) và thấp nhất ở nghiệm thức bổ sung chế phẩm Prawn Bac
(32,8%) Ở nghiệm thức bổ sung dòng vi khuẩn B37, năng suất ấu trùng (81,9 con/L) và tỷ lệ biến thái thành ốc giống (40,4%) cũng đạt cao nhất và khác biệt
có ý nghĩa thống kê với các nghiệm thức khác (p<0,05) Nguyễn Thị Xuân Thu (2006) thu được tỷ lệ sống ấu trùng ốc hương đạt 64,7% khi sử dụng 3 loại tảo
là Nannochloropsis oculata, Platymonas sp., Chaetoceros muelleri trong quá
trình ương Có thể khẩu phần tảo chỉ bao gồm một loài và sự cố về sục khí trong ngày đầu thí nghiệm đã ảnh hưởng đến tỷ lệ sống của ấu trùng ở tất cả các nghiệm thức thí nghiệm Tuy nhiên tổng hợp các kết quả về các yếu tố môi
trường, mật độ vi khuẩn (tổng cộng, Vibrio, Bacillus), tỷ lệ sống và năng suất ương ấu trùng cho thấy việc bổ sung dòng vi khuẩn Bacillus B37 phân lập từ
ao nuôi tôm sú thâm canh đã đạt được kết quả tốt hơn so với các dòng vi khuẩn thí nghiệm khác (Bảng 3)
Bảng 3 Tỉ lệ sống của ấu trùng, năng suất ương và tỉ lệ biến thái của ấu trùng ốc
hương
Nghiệm thức Các chỉ tiêu theo dõi
Các giá trị có chữ cái khác nhau trên cùng một hàng thì khác biệt có ý nghĩa thống kê (P<0,05)
4 KẾT LUẬN
- Tỷ lệ sống (40,9%), năng suất (81,9 con/l) và tỉ lệ ốc (40,4%) đạt cao nhất
ở nghiệm thức bổ sung dòng vi khuẩn Bacillus B37 và khác biệt có ý nghĩa
thống kê (p<0,05) so với các nghiệm thức bổ sung chế phẩm sinh học khác
Trăng vào bể ương nuôi ấu trùng ốc hương làm cho tổng vi khuẩn Vibrio
đạt thấp nhất Kết quả chứng tỏ dòng vi khuẩn này đạt hiệu quả về khả năng lấn át các dòng vi khuẩn có hại
Trang 10TÀI LIỆU THAM KHẢO
Anderson, I 1993 The veterinary approach to marine prawns In: Aquaculture for veterinarians: fish husbandry and medicine (Editor Brown L.), pp 271-296 Boyd, C.E 1990 Water quality in pond for aquaculture Birmingham Publishing Co., Birmingham, USA 482 p
Boyd, C.E., 1998 Water Quality in pond for aquaculture Department of Fisheries and Aplied Aquaculture Auburn University Alabama 36849 USA
Briggs, M.R.P and Funge-Smith, S.J., 1994 A nutrient budget of some intensive marine ponds in Thailand Aquaculture Fisheries Management 24: p 789-811
Chanratchakool, P., 2003 Problem in Penaeus monodon culture in low salinity
areas Advice on Aquatic Animal Health Care Aquaculture Asia, vol VIII, No.1; pp.54 – 55
Huys, G 2003 Sampling and sample Processing procedures for the isolation of aquaculture associated bacteria
Mai Duy Minh, 2004 Ảnh hưởng của các loại thức ăn lên sinh trưởng và tỉ lệ
sống của ấu trùng ốc hương Babylonia areolata (Link 1807) Tuyển tập báo
cáo khoa học Hội thảo động vật thân mềm toàn quốc lần thứ 3, Nhà xuất bản Nông nghiệp, trang 199 – 203
Moriarty, D.J.W., 1998 Control of luminous Vibrio species in Penaeid
aquaculture ponds Aquaculture 164 : 351-258
Ngô Anh Tuấn, 2001 Đặc điểm phân bố và tình hình khai thác ốc hương
(Babylonia areolata) tại vùng biển Bình Thuận Tuyển tập báo cáo khoa học
Hội thảo Động vật thân mềm toàn quốc lần thứ 1, Nhà xuất bản Nông nghiệp: trang 118 – 126
Nguyễn Lân Dũng, 1983 Thực tập vi sinh vật học Nhà xuất bản Đại học và Trung học chuyên nghiệp Hà Nội
Nguyễn Thị Xuân Thu 2006 Đặc điểm sinh học kỹ thuật sản xuất giống và nuôi
ốc hương (Babylonia areolata, Link 1807) Nhà xuất bản Nông nghiệp, TP.Hồ
Chí Minh, 77 trang
Phạm Thị Tuyết Ngân và Trương Quốc Phú, 2010 Biến động các yếu tố môi
trường và mật độ vi khuẩn Bacillus chọn lọc trong bể nuôi tôm sú (Penaeus monodon) Tạp chí Khoa học Đại học Cần Thơ 14b: trang 29-42
Vaseeharan, B and Ramasamy, 2003 Control of pathogenic Vibrio spp by Bacillus subtilis BT23, a possible probiotic treatment for Black Tiger Shrimp (Penaeus monodon)
Whetstone, J.M., G.D Treece, C.L Browdy and A.D Stokes., 2002 Opportunities and Constraints in Marine Shrimp Farming Southern Regional Aquaculture Centrer (SRAC) publication No 2600 USDA
