Poly-hydroxyalkanoate (PHA) là polyme có khả năng phân hủy sinh học được tổng hợp bởi nhiều nhóm vi sinh vật trong điều kiện hạn chế dinh dưỡng với vai trò làm nguồn dinh dưỡng dự trữ. Nhằm mục đích tìm kiếm và đánh giá thu chủng thuộc chi Bacillus có khả năng sản xuất của nhựa polyme phân hủy sinh học 06 chủng thuộc chi Bacillus đã được lựa chọn nghiên cứu và đánh giá.
Nghiên cứu khoa học Sàng lọc đánh giá khả tích lũy Polyhydroxyalkanoate từ số chủng Bacillus sp Nguyễn Thị Đà, Nguyễn Trọng Linh, Nguyễn Thu Trang, Trần Mạnh Hải, Lã Thị Huyền* Viện Công nghệ sinh học, Viện Hàn lâm Khoa học Công nghệ Việt Nam (Ngày đến tòa soạn: 13/8/2020; Ngày chấp nhận đăng: 28/9/2020) Tóm tắt Poly-hydroxyalkanoate (PHA) polyme có khả phân hủy sinh học tổng hợp nhiều nhóm vi sinh vật điều kiện hạn chế dinh dưỡng với vai trò làm nguồn dinh dưỡng dự trữ Nhằm mục đích tìm kiếm đánh giá thu chủng thuộc chi Bacillus có khả sản xuất nhựa polyme phân hủy sinh học 06 chủng thuộc chi Bacillus lựa chọn nghiên cứu đánh giá Các chủng sàng lọc kiểm tra khả tích lũy poly-β-hydroxybutyrate (PHB) việc sử dụng Nile blue A để nhuộm quan sát tế bào có màu cam tích lũy poly-βhydroxyalkanoates PHA Kết cho thấy có 05/06 chủng chiếm 83,3% có khả tích lũy PHA Chủng Bacillus sp DV01 cho thấy khả tích lũy cao Kết phân loại dựa trình tự 16S rRNA cho thấy chủng thuộc loài Bacillus megaterium với độ tương đồng đạt 100% đặt tên Bacillus megaterium DV01 Hàm lượng PHA B megaterium DV01 tách thu chiếm 23,9% so với sinh khối khô Từ khóa: PHA, 16S rRNA, Bacillus megaterium ĐẶT VẤN ĐỀ Việc sử dụng rộng rãi nhựa tổng hợp công nghiệp đời sống ngày dẫn tới nguy thay đổi đa dạng sinh học địa nhiễm mơi trường tính chất khơng phân hủy chúng Chính vậy, việc tìm kiếm phát có mặt polyhydroxyalkanoate (PHA) vi sinh vật tổng hợp với nhiều ưu điểm tính chất nhiệt dẻo, khả phân hủy tương thích sinh học khả tổng hợp từ nguồn nguyên liệu tái tạo thu hút quan tâm nghiên cứu lớn [1-2] PHA sử dụng làm vật liệu có giá trị cho sản xuất loạt sản phẩm tính chất khả phân hủy sinh học khả tương thích sinh học cao như: bao bì thân thiện với mơi trường, dược phẩm, nông nghiệp, ngành công nghiệp thực phẩm [3-4] PHA khơng đóng vai trị sản phẩm sản xuất nhựa sinh học mà khơng gây hại cho động vật nên cịn sử dụng làm phụ gia cho thức ăn heo cá [5] Ngồi chức dự trữ lượng, có mặt PHA tế bào chất làm tăng sức đề kháng vi sinh vật điều kiện thay đổi pH, nhiệt độ áp suất thẩm thấu, tiếp xúc với hóa chất độc hại [6] Sản phẩm thuộc nhóm PHA bao gồm: poly-β-hydroxybutyrate (PHB), Polyhydroxyvalerate (PHV), polydroxyhexanote (PHH), poylhydroxyoctanoate (PHO),… Trong đó, PHB PHA đơn giản nghiên cứu ứng dụng nhiều nhóm PHB tổng hợp nguồn dự trữ lượng nhiều vi sinh vật khác thuộc chi Alcaligenes, Azotobacter, Bacillus, Klebsiella, Pseudomonas, Rhizobium, Staphylococcus Rhodococcus Chi Bacillus vi khuẩn *Điện thoại: 0982141298 Email: lthuyen@ibt.ac.vn Tạp chí Kiểm nghiệm An toàn thực phẩm - Tập 3, Số 3, 2020 165 Sàng lọc đánh giá khả tích lũy Polyhydroxyalkanoate gram dương phát có khả tổng hợp PHB [7] Khả tổng hợp PHA chi biết đến loài như: Bacillus megaterium, Bacillus cereus, Bacillus subtilis, Bacillus licheniformis, Bacillus thuringensis, [7-10] Chi ứng dụng rộng rãi sản xuất sản phẩm công nghiệp đặc tính an tồn, khả tiết độ bền plasmid tái tổ hợp Chi Bacillus đối tượng nghiên cứu tiềm cho sản xuất PHB có khả lên men môi trường nghèo dinh dưỡng có khả sử dụng nhiều nguồn carbon khác để tổng hợp PHA [11] Với mong muốn tìm kiếm chủng thuộc chi Bacillus có khả sinh tổng hợp tích lũy PHA nhằm ứng dụng lên men thu PHA từ nguồn Carbon khác nhau, nghiên cứu này, 06 chủng thuộc chi sàng lọc khả tổng hợp, tích lũy PHB thông qua phương pháp nhuộm huỳnh quang sử dụng Nile Blue A VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Chủng giống Sáu (06) chủng thuộc chi Bacillus sử dụng nghiên cứu bao gồm Bacillus sp DV01, Bacillus sp DV01, Bacillus subtilis KL1, Bacillus subtilis KL2, Bacillus subtilis KL3 Bacillus sp M1 Các chủng nghiên cứu lưu giữ sưu tập chủng giống phòng Công nghệ tế bào động vật, Viện Công nghệ sinh học, Viện Hàn lâm Khoa học Công nghệ Việt Nam 2.2 Môi trường điều kiên nuôi cấy chủng 2.2.1 Môi trường Chủng nghiên cứu bảo quản lạnh hoạt hóa cách ni cấy 18 - 24 h 37oC môi trường LB với thành phần (g/L): Peptone (10), cao nấm men (5), NaCl (5) Khống 1: Mơi trường ni cấy chủng cho lên men pha xác định mơi trường khống [8] với số cải tiến thành phần (g/L): Na2HPO4.2H2O (4,5); KH2PO4 (1,5); MgSO4.7H2O (0,2); (NH4)2SO4 (2); CaCl2.2H2O (0,02); NH4Fe(III) Citrate (0,05); cao nấm men (5); peptone (5) glucose (10) Khống 2: Mơi trường lên men pha thu PHA (g/L): Na2HPO4.2H2O (4,5); KH2PO4 (1,5); MgSO4.7H2O (0,2); (NH4)2SO4 (2); NH4Fe (III) Citrate (0,05); glucose (10); acid citric (1); vi lượng (2 mL) Dung dịch vi lượng 0,1 mL với thành phần (mg/L): ZnSO4.7H2O (10); MnCl2.4H2O (3); H3BO3 (30); CoCl2.6H2O (20); CuCl2.2H2O (1); NiCl2.6H2O (2); Na2MoO4.2H2O (3) Các hóa chất cơng ty uy tín Mỹ, Đức Trung Quốc cung cấp 2.2.2 Điều kiện nuôi cấy thu PHA Chủng nghiên cứu ni lắc 120 vịng/phút, 37oC mơi trường khống dinh dưỡng khống qua đêm, sau hút thu sinh khối ly tâm bổ sung vào bình 250 mL chứa 100 mL mơi trường khống tiến hành ni lắc 120 vòng/phút 37oC 96 h 2.3 Quan sát PHA tích lũy tế bào Chủng nghiên cứu cấy mơi trường khống đặc sau cấy chuyển sang mơi trường khống đặc có bổ sung dung dịch Nile blue A (0,5 µg/mL) Để thực phương pháp này, Nile blue A pha dimethylsulfoxide (DMSO) với hàm lượng 0,25 mg/mL sau bổ sung vào mơi trường khống Chủng nghiên cứu nuôi cấy môi trường sau 48 h lấy quan sát PHA tích lũy tế bào soi kính hiển vi 166 Tạp chí Kiểm nghiệm An toàn thực phẩm - Tập 3, Số 3, 2020 Nguyễn Thị Đà, Nguyễn Trọng Linh, Nguyễn Thu Trang, Lã Thị Huyền huỳnh quang Tế bào tích lũy PHA có cam sáng bắt màu với Nile blue A 2.4 Phương pháp nhuộm với Nile blue lam kính Chuẩn bị lam kính nhỏ giọt nước vơ trùng sau lấy sinh khối chủng nghiên cứu nuôi cấy môi trường khống sau 48 h Dùng que cấy hịa chủng tan giọt nước làm khô nhanh lửa đèn cồn Nhỏ 20 µL Nile blue A (pha DMSO với hàm lượng 0,25 mg/mL) dàn ủ lam kính 55oC 10 phút Sau đó, mẫu lấy nhỏ acid acetic 8% để khoảng phút rửa 02 - 03 lần vịi nước chảy nhẹ Mẫu làm khơ soi kính hiển vi huỳnh quang bước sóng 460 nm 2.5 Phương pháp tách chiết PHA PHA chủng nghiên cứu tinh phương pháp gia nhiệt kết hợp xử lý dung môi Sinh khối tế bào sau nuôi thu ly tâm rửa lần với dung dịch đệm phosphate, pH 7,2 sau hịa lại mL đệm tiến hành gia nhiệt lị vi sóng mức công suất 140W, quay dừng sau 30 giây 15 phút Dịch chứa tế bào sau gia nhiệt chuyển sang ống thủy tinh có nút xố sau bổ sung thêm dung dịch ethanol : aceton theo tỷ lệ : 1, búng trộn sinh khối ủ - h nhằm mục đích tăng tính thấm màng tế bào Tế bào sau ủ thu ly tâm tốc độ 5.000 vòng/phút, 15 phút bổ sung mL chloroform, xoáy chặt nắp tiến hành lắc - h để PHA hịa tan hồn tồn Hỗn hợp dung dịch ly tâm 10.000 vòng/phút 10 phút thu pha chứa chloroform chuyển ống thủy tinh Dịch chứa chloroform PHA hòa tan sau thu bổ sung methanol lạnh theo tỷ lệ : 8, tương ứng Kết tủa PHA thu ly tâm 12.000 vịng/phút 20 phút làm khơ tủ hút bảo quản cho nghiên cứu 2.6 Phương pháp Crotonic xác định hàm lượng nhựa sinh học Lượng PHA mẫu lấy xác định phương pháp đo quang phổ cách chuyển đổi PHA thành acid crotonic xử lý với acid sulfuric Dung dịch chuẩn acid crotonic chuẩn bị với nồng độ tăng dần khác Độ hấp thụ acid crotonic đo bước sóng 235 nm từ xác định phương trình chuẩn có dạng y = ax + b Trong nghiên cứu này, tế bào vi sinh vật xử lý theo phương pháp 2.4.1 đến thu dịch chloroform sau lắc hòa tan PHA tế bào bước Hút 200 µL dịch chloroform chứa PHA hịa tan sau bổ sung 200 µl H2SO4 98% đun 100oC 30 phút để toàn PHA dung dịch chuyển thành acid crotonic có màu nâu Dung dịch sau đun để nguội tiến hành đo OD bước sóng 230 nm Mẫu chuẩn sử dụng PHB (Sigma) hòa tan chloroform với hàm lượng mL/mL, sau tính nồng độ thích hợp để dựng đường chuẩn Kết xác định hàm lượng PHA dung dịch xác định theo phương trình xây dựng Mẫu đối chứng chuẩn chloroform + H2SO4 xử lý quy trình 2.7 Tách chiết DNA tổng số Chủng nghiên cứu ni qua đêm mơi trường LB sau ly tâm thu sinh khối tiến hành tách chiết DNA tổng số theo Ausubel cs [12] Ly tâm thu sinh khối tế bào phút tốc độ 5.000 vòng/phút Tế bào hòa tan hỗn hp dung dch A (567 àL ì TE, 30 àl SDS 10% µl proteinase K 20 mg/mL) ủ 37oC h Sau ủ, bổ sung 100 µL NaCl M trộn Sau bước này, 80 µL dung dịch CTAB / NaCl bổ sung, trộn mẫu ủ 10 phút 65oC Bổ sung V (v/v) dung dịch Chloroform: isoamyl alcohol (24 : 1), đảo ly tâm thu pha phía sang Eppendoff mới, tiếp tục lặp lại bước Tạp chí Kiểm nghiệm An toàn thực phẩm - Tập 3, Số 3, 2020 167 Sàng lọc đánh giá khả tích lũy Polyhydroxyalkanoate lần DNA thu cách tủa với isopropanol (0,6 thể tích (v/v)) khoảng h - 20oC rửa lại 500 µL ethanol (70%) DNA rửa, làm khơ hịa tan 100 µL TE Dịch DNA bảo quản -20oC để dùng cho nghiên cứu 2.8 Phương pháp phân lập gen 16S rRNA Tách DNA tổng số chủng chạy PCR gene 16S rRNA cặp mồi: 16SF-5’ AGAGTTTGATCMTGGC 3’, 16SR-5’ TACCTTGTTACGACT 3’ Thành phần PCR bao gồm: Dream Taq buffer (5 µL), dNTP 5mM (2 µL), PriF16S/ PriR16S 10pmol (1 µL), DNA khn, Taq polymerase (0,25 µL) 50 µL phản ứng chu kỳ chạy PCR: 95oC, phút; (95oC, phút; 55oC, 1phút 20’’; 72 oC, phút) × 30 lần; 72 oC, phút; oC-∞ KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 3.1 Khả tích lũy PHA Sàng lọc khả tích lũy PHA chủng nghiên cứu đánh giá nuôi cấy chủng môi trường khống có bổ sung Nile blue A sau 48 h Sau ni cấy, chủng có tích lũy PHA bắt màu cam soi kính hiển vi huỳnh quang Theo tác giả công bố khả tổng hợp PHA nhóm Bacillus đa dạng loài như: B megaterium [13], B subtilis [7], Trong nghiên cứu này, kết chụp kính hiển vi huỳnh quang cho thấy 06 chủng có 05 chủng có quan sát thấy hạt phát quang màu cam sáng soi kính (Hình 1) Điều chứng tỏ có 05/06 chủng có khả tích lũy PHA chủng: Bacillus sp DV01, Bacillus subtilis KL1, Bacillus subtilis KL2, Bacillus subtilis KL3, Bacillus sp DV02 Riêng chủng Bacillus sp M1 khơng có khả tích lũy PHA Tại điều kiện ni cấy, chủng Bacillus sp DV01 cho thấy có khả sinh trưởng sinh tổng hợp PHA tốt 06 chủng mơi trường khống Chính vậy, chủng Bacillus sp DV01 lựa chọn để nghiên cứu phân loại, xác định hàm lượng PHA Hình Khả tích lũy PHA chủng nghiên cứu mơi trường khống có bổ sung Nile blue A quan sát kính hiển vi huỳnh quang 168 Tạp chí Kiểm nghiệm An toàn thực phẩm - Tập 3, Số 3, 2020 Nguyễn Thị Đà, Nguyễn Trọng Linh, Nguyễn Thu Trang, Lã Thị Huyền Chủng Bacillus sp DV01 nghiên cứu nuôi cấy thu sinh khối tách thu PHA mơi trường khống Kết tách PHA từ chủng chọn lọc thể Bảng Hình Bảng Khả tổng hợp PHA chủng chọn lọc STT Chỉ tiêu nghiên cứu Hàm lượng sinh khối khô (CWD)/100 mL Hàm lượng PHA thu được/100 mL % PHA/CWD Hàm lượng (g) 0,3615 0,0864 23,9% Hình Hình ảnh kết tách PHA chủng chọn lọc Khi ni cấy mơi trường khống 2, phương pháp crotonic cho thấy chủng DV01 có khả tích lũy PHA với 1,231 g/mL dịch nuôi cấy tương ứng với 34,05% PHA Kết tương ứng với công bố Wu cộng đánh giá khả tích lũy hàm lượng PHA chủng Bacillus sp JMa5 đạt 25 - 35% [14] Tuy nhiên, tách thu PHA từ chủng nghiên cứu DV01 phương pháp gia nhiệt kết hợp hàm lượng PHA đạt 0,864 g/L tương ứng 23,9% với lượng sinh khối khô chủng chọn lọc thu 3,615 g/L 3.2 Đặc điểm phân loại chủng chọn lọc Chủng Bacillus sp DV01 nuôi cấy qua đêm mơi trường LB 37oC sau tiến hành tách chiết DNA tổng số theo phương pháp CTAB/NaCl Ausubel cs, 1994 [12] Hình thái khuẩn lạc chủng nghiên cứu thể hình 3A Kết khuếch đại gen 16S rRNA chủng chọn lọc thể Hình 3B Dựa vào kết điện di đồ hình 3B cho thấy, sản phẩm PCR bắt cặp đặc hiệu với gen 16S rRNA băng vạch có kích thước khoảng 1500 bp (Hình 3B) Sản phẩm PCR thu được, tinh giải trình tự Hình Hình ảnh khuẩn lạc môi trường LB (A) điện di đồ sản phẩm PCR gen 16S rRNA (B) chủng Bacillus sp DV01 Tạp chí Kiểm nghiệm An tồn thực phẩm - Tập 3, Số 3, 2020 169 Sàng lọc đánh giá khả tích lũy Polyhydroxyalkanoate Kết đọc trình tự Gen 16S rRNA chủng xử lý phần mềm xử lý trình tự MEGA6.0, BioEdit, Chromas,…và trang web trực tuyến http://ncbi.nlm.nih.gov thu đoạn gen 16S rRNA có độ dài 1421 nucleotide so sánh với liệu gen cung cấp Genbank Kết so sánh tương đồng trình tự gen 16S rRNA chủng nghiên cứu với trình tự 16S rRNA số chủng thuộc chi Bacillus ngân hàng gen NCBI trình bày Bảng Bảng Kết so sánh tương đồng trình tự gen 16S rRNA chủng nghiên cứu với trình tự 16S rRNA số chủng thuộc chi Bacillus ngân hàng gen NCBI Mã chủng Chủng so sánh MH064437.1 MK389288.1 MT033060.1 MT184834.1 NR_024697.1 NR_074540.1 NR_043403.1 NR_043242.1 NR_024689.1 NR_112116.2 NR_075005.2 NR_074923.1 NR_025446.1 B megaterium NA2-14 B megaterium N15270 B megaterium BHS1 B megaterium NEPZ-22 B mycoides DSM 11821 B cereus ATCC 14579 B thuringiensis IAM 12077 B pumilus ATCC 7061 B atrophaeus JCM 9070 B subtilis IAM 12118 B velezensis FZB42 B licheniformis ATCC 14580 B halodurans DSM 497 Chiều dài gen so sánh 1421 1421 1421 1421 1425 1425 1425 1422 1424 1425 1425 1425 1404 Điểm sai khác 0 0 74 75 77 83 90 88 89 92 92 Độ tương đồng (%) 100 100 100 100 94,246 94,175 94,035 93,812 93,118 93,123 93,053 92,842 93,091 Kết Bảng cho thấy trình tự gen 16S rRNA chủng Bacillus sp DV01 có độ tương đồng 100% so với chủng B megaterium so sánh (MH064437.1; MK389288.1; MT033060.1; MT184834.1) Dựa kết trình tự gen 16S rRNA chủng Bacillus sp DV01 phân loại thuộc lồi Bacillus megaterium Dựa trình tự gen 16S rRNA xây dựng phát sinh chủng loài chủng tuyển chọn Cây phát sinh chủng loại xây dựng theo phương pháp Neighbor joining sử dụng phép toán Tamura - Nei với độ lặp lại 1.000 lần phần mềm chuyên dụng Kết phân tích phát sinh lồi chủng tuyển chọn trình bày Hình Hình Cây phát sinh lồi chủng chọn lọc dựa phần mềm MEGA 170 Tạp chí Kiểm nghiệm An tồn thực phẩm - Tập 3, Số 3, 2020 Nguyễn Thị Đà, Nguyễn Trọng Linh, Nguyễn Thu Trang, Lã Thị Huyền KẾT LUẬN Từ 06 chủng thuộc chi Bacillus lưu giữ xác định 05 chủng có khả bắt màu Nile blue ni cấy mơi trường khống cải tiến Thông qua nghiên cứu, chủng Bacillus sp DV01 lựa chọn để phân loại xác định khả tích lũy PHA Dựa trình tự 16S rRNA cho thấy chủng thuộc loài Bacillus megaterium cho thấy tích lũy 0,864 g/L PHA ni cấy mơi trường khống có cải tiến LỜI CẢM ƠN Đây cơng trình thực nhờ hỗ trợ kinh phí đề tài Bộ Công thương TS Nguyễn Thị Đà với đề tài cấp: “Nghiên cứu tạo chế phẩm sinh học tái tổ hợp sinh tổng hợp bioplastic từ phụ phẩm chế biến thủy sản” ĐT.08.19/CNSHCB TÀI LIỆU THAM KHẢO [1] K Yasotha, M K Aroua, K B Ramachandran, and I K P Tan, “Recovery of mediumchain-length polyhydroxyalkanoates (PHAs) through enzymatic digestion treatments and ultrafiltration”, Biochemical Engineering Journal, vol 30, no 3, pp 260-268, 2006 [2] M Koller, “Switching from petro-plastics to microbial polyhydroxyalkanoates (PHA): the biotechnological escape route of choice out of the plastic predicament?”, Euro Biotech Journal, vol 3, no 1, pp 32-44, 2019 [3] D C Meng, R Shen, H Yao, J C Chen, Q Wu, G Q Chen, “Engineering the diversity of polyesters”, Current Opinion Biotechnology, vol 29, pp 24-33, 2014 [4] G Q Chen, “In Plastics from Bacteria: Natural Functions and Applications”, vol 14, Springer Science & Business Media, 2010 [5] X Wang, X J Jiang, F Wu, Y Ma, “Microbial poly (3- hydroxybutyrate) (PHB) as a feed additive for fishes and piglets”, Biotechnology Journal, Published online, 2019 [6] S Obruca, P Sedlacek, M Koller, D Kucera, I Pernicova, “Involvement of polyhydroxyalkanoates in stress resistance of microbial cells: biotechnological consequences and applications”, Biotechnology Advance, vol 36, no 3, pp 856-870, 2018 [7] M Singh, S K Patel, and V C Kalia, “Bacillus subtilis as potential producer for polyhydroxyalkanoates”, Microbial Cell Factories, vol 8, no 1, pp 38, 2009 [8] A Rodríguez Contreras, M Koller, M Miranda de Sousa Dias, M CalafellMonfort, G Braunegg, and M S Marqués Calvo, “High production of poly (3-hydroxybutyrate) from a wild Bacillus megaterium Bolivian strain”, Journal of Applied Microbiology, vol 114, no 5, pp 1378-1387, 2013 [9] S Mohapatra et al., “Bacillus and biopolymer: Prospects and challenges”, Biochemistry and Biophysics Report, vol 12, pp 206-213, 2017 [10] V Gowda and S Shivakumar, “Agrowaste-based Polyhydroxyalkanoate (PHA) production using hydrolytic potential of Bacillus thuringiensis IAM 12077”, Brazilian Archieves of Biology and Technology, vol 57, no 1, pp 55-61, 2014 [11] M Thirumala, S V Reddy, and S K Mahmood, “Production and characterization of PHB Tạp chí Kiểm nghiệm An tồn thực phẩm - Tập 3, Số 3, 2020 171 Sàng lọc đánh giá khả tích lũy Polyhydroxyalkanoate from two novel strains of Bacillus spp isolated from soil and activated sludge”, Journal of Industrial Microbiology and Biotechnology, vol 37, no 3, pp 271-278, 2010 [12] FM Ausubel, R Brent, RE Kingston, DD Moore, JG Seidman, JA Smith, K Struhl, Wiley CJ, RD Allison, M Bittner, S Blackshaw, “Current Protocols in Molecular Biology”, John Wiley & Sons, 2003 [13] S R Pandian, V Deepak, K Kalishwaralal, N Rameshkumar, M Jeyaraj, and S Gurunathan, “Optimization and fed-batch production of PHB utilizing dairy waste and sea water as nutrient souces by Bacillus megaterium SRKP-3”, Bioresource Technology, vol 101, no 2, pp 705-711, 2010 [14] Wu, Q., Huang, H., Hu, G.H., Chen, J., Ho, K.P., Chen, G.Q., 2001, “Production of poly3-hydroxybutyrate by Bacillus sp JMa5 cultivated in molasses media”, Antonie van Leeuwenhoek, vol 80, pp.111-118, 2001 Screenning and determination of polyhydroxyalkanoate production by Bacillus sp strains Nguyen Thi Da, Nguyen Trong Linh, Nguyen Thi Thu Trang, Tran Manh Hai, La Thi Huyen Institute of Biotechnology, Viet Nam Academy of Science and Technology, Hanoi Abstract Polyhydroxyalkanoates (PHAs) are biodegradable polymers produced by microbes as reserve material when they were cultured in a limitation of nutrients and excess C source mediums PHAs can be synthesized by various bacteria including gram positive and gramnegative bacteria Among the PHA-producing gram-positive bacteria, Bacillus sp produce and accumulate various monomer compositions of PHAs In this study, about 83.3% of strains (05/06 strains) can accumulate PHAs production Bacillus sp DV01 accumulated a amount of PHA 23.9% of CWD after 96h when cultured in modified basal medium containing 1% (w/v) glucose Bacillus sp DV01 was identified by sequecing the gene coding for 16S rRNA BLAST results showed the obtained 16S rRNA sequence of this strain revealed 100% with the Bacillus megaterium and so-called Bacillus megaterium DV01 Keywords: PHA, 16S rRNA, Bacillus megaterium DV01 172 Tạp chí Kiểm nghiệm An tồn thực phẩm - Tập 3, Số 3, 2020 ... 05/06 chủng có khả tích lũy PHA chủng: Bacillus sp DV01, Bacillus subtilis KL1, Bacillus subtilis KL2, Bacillus subtilis KL3, Bacillus sp DV02 Riêng chủng Bacillus sp M1 khơng có khả tích lũy PHA... oC-∞ KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 3.1 Khả tích lũy PHA Sàng lọc khả tích lũy PHA chủng nghiên cứu đánh giá ni cấy chủng mơi trường khống có bổ sung Nile blue A sau 48 h Sau ni cấy, chủng có tích lũy PHA bắt.. .Sàng lọc đánh giá khả tích lũy Polyhydroxyalkanoate gram dương phát có khả tổng hợp PHB [7] Khả tổng hợp PHA chi biết đến loài như: Bacillus megaterium, Bacillus cereus, Bacillus subtilis, Bacillus