Xây dựng quy trình nhân giống lan mokara bằng kỹ thuật nuôi cấy mô​

TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM HÀ NỘI KHOA SINH – KTNN ===  === BẠCH THỊ KIM THẢO XÂY DỰNG QUY TRÌNH NHÂN GIỐNG LAN MOKARA BẰNG KỸ THUẬT NI CẤY MƠ KHĨA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC Chun ngành: Sinh lý học thực vật Hà Nội, 2019 TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM HÀ NỘI KHOA SINH – KTNN ===  === BẠCH THỊ KIM THẢO XÂY DỰNG QUY TRÌNH NHÂN GIỐNG LAN MOKARA BẰNG KỸ THUẬT NI CẤY MƠ KHĨA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC Chun ngành: Sinh lý học thực vật Người hướng dẫn khoa học PGS TS Nguyễn Văn Đính Hà Nội, 2019 LỜI CẢM ƠN Em xin bày tỏ lòng cảm ơn chân thành đến thầy giáo PGS.TS Nguyễn Văn Đính người tận tình hướng dẫn, bảo giúp đỡ em suốt trình thực đề tài Em xin trân trọng cảm ơn Ban Giám Hiệu Trường ĐHSP Hà Nội, Ban Chủ nhiệm khoa Sinh - KTNN trường ĐHSP Hà Nội tập thể cán giáo viên Bộ mơn TH, Phịng thí nghiệm Sinh lí học thực vật - Trường ĐHSP Hà Nội tạo điều kiện thuận lợi thiết bị phương tiện để em hồn thành tốt khóa luận Trong suốt q trình nghiên cứu, em nhận bảo nhiệt tình TS La Việt Hồng - khoa Sinh KTNN chị Nguyễn Thị Thu Đông anh Hà Đăng Chiến - Học viên Cao học K20 giúp đỡ, đóng góp ý kiến để em hồn thành khóa luận, nhân em xin gửi lời cảm ơn chân thành đến anh, chị Trong thời gian thực nghiên cứu, khơng tránh khỏi thiếu sót hạn chế Kính mong đóng góp ý kiến thầy giáo bạn để đề tài hồn thiện Em xin trân trọng cảm ơn! Vĩnh Phúc, ngày 30 tháng năm 2019 Sinh viên Bạch Thị Kim Thảo LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan cơng trình nghiên cứu tơi Do tơi thực hiện, số liệu, kết nghiên cứu khóa luận trung thực chưa cơng bố Vĩnh Phúc, ngày 30 tháng năm 2019 Người thực BẠCH THỊ KIM THẢO DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT BAP: 6-Benzyl amino purin IAA: β-Indole-acetíc acid MS: Murashige Skoog NAA: α- Napthalene acelic acid Nxb: Nhà xuất Tp.HCM: Thành phố Hồ Chí Minh MỤC LỤC MỞ ĐẦU 1 Lý chọn đề tài Mục đích nhiệm vụ nghiên cứu Ý nghĩa khoa học ý nghĩa thực tiễn NỘI DUNG CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Giới thiệu chung họ Phong lan 1.1.1 Vài nét họ Phong lan 1.1.2 Nguồn gốc, phân bố vị trí phân loại lan Mokara 1.1.3 Đặc điểm hình thái 1.1.4 Điều kiện sinh thái 1.2 Giá trị lan Mokara 1.2.1 Giá trị kinh tế 1.2.2 Giá trị thẩm mỹ 11 1.2.3 Công dụng khác 11 1.3 Tình hình nghiên cứu nhân giống họ Phong lan nước .11 1.3.1 Trên giới 11 1.3.2 Ở Việt Nam 12 CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG, PHẠM VI VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 14 2.1 Đối tượng nghiên cứu 14 2.2 Phạm vi nghiên cứu, địa điểm thời gian 14 2.3 Dụng cụ thiết bị thí nghiệm 15 2.3.1 Dụng cụ 15 2.3.2 Thiết bị 15 2.4 Phương pháp nghiên cứu 15 2.4.1 Thí nghiệm 1: Khử trùng mẫu 15 2.4.2 Thí nghiệm 2: Tái sinh chồi 16 2.4.3 Thí nghiệm 3: Nhân nhanh chồi in vitro 16 2.4.4 Thí nghiệm 4: Ra rễ - tạo in vitro hồn chỉnh 17 2.4.5 Thí nghiệm 5: Rèn luyện in vitro thích nghi với điều kiện môi trường 17 2.5 Phân tích thống kê số liệu 17 CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 18 3.1 Tạo vật liệu khởi đầu cho nuôi cấy in vitro 18 3.2 Tái sinh chồi in vitro 20 3.3 Nghiên cứu ảnh hưởng nồng độ BAP kết hợp với NAA đến khả nhân nhanh chồi 22 3.4 Nghiên cứu ảnh hưởng IAA đến khả tạo rễ in vitro 24 3.5 Rèn luyện in vitro thích nghi với điều kiện môi trường 25 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 28 DANH MỤC TÀI LIỆU THAM KHẢO 29 DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 2.1 Cơng thức thí nghiệm tạo vật liệu khởi đầu 15 Bảng 2.2 Công thức ảnh hưởng BAP lên tái sinh chồi in vitro 16 Bảng 2.3 Công thức ảnh hưởng NAA kết hợp với BAP đến khả nhân nhanh chồi in vitro 16 Bảng 2.4 Công thức ảnh hưởng IAA đến khả hình thành rễ 17 Bảng 3.1 Hiệu việc sử dụng javen để tạo vật liệu khởi đầu 19 Bảng 3.2 Ảnh hưởng nồng độ BAP đến khả tái sinh chồi 22 Bảng 3.3 Ảnh hưởng BAP kết hợp với NAA đến khả nhân nhanh chồi in vitro 23 Bảng 3.4 Ảnh hưởng IAA đến khả rễ 24 DANH MỤC CÁC HÌNH Hình 1.1 Lan Arachnis, Ascoentrum Vanda Hình 1.2 Một số loại lan Mokara Hình 2.1 Cây lan Mokara vườn thực nghiệm trường ĐHSPHN 14 Hình 2.2 Vườn lan Mokara vườn thực nghiệm trường ĐHSPHN 14 Hình 3.1 Mẫu cấy sống sau tuần quan sát 20 Hình 3.2 Mẫu in vitro ni cấy mơi trường B1 20 Hình 3.3 Cây in vitro ni cấy mơi trường có bổ sung MS + BAP + than hoạt tính (0,5 mg/l) + nước dừa 10% 23 Hình 3.4 Ảnh hưởng IAA đến khả tạo rễ in vito 25 Hình 3.5 Cây in vitro sau tuần rèn luyện 26 MỞ ĐẦU Lý chọn đề tài Họ Phong lan họ lớn thực vật có hoa với 800 chi 25.000 loài Hoa lan đánh giá cao vẻ đẹp lơi cuốn, quyến rũ đa dạng kích thước, hình dạng, màu sắc Hiện nay, hoa lan chiếm 8% thị phần ngành thương mại hoa giới có tiềm thay đổi tình hình kinh tế quốc gia [24] Trong vòng 10 năm trở lại đây, thị trường kinh doanh hoa lan Việt Nam phát triển mạnh mẽ nhu cầu cảnh nước tăng cao Tại Thành phố Hồ Chí Minh, việc sản xuất hoa lan tập trung chủ yếu huyện Củ Chi (188,1 ha) huyện Bình Chánh (31,1 ha) với sản lượng hàng năm khoảng 6,7 triệu chậu, 68,9 triệu cành, giá trị khoảng 613,9 tỷ đồng Trong đó, giống lan Mokara nhóm giống chủ lực việc phát triển diện tích cung cấp sản phẩm hoa lan cắt cành Thành phố Hồ Chí Minh hiệu cao, nhu cầu tiêu thụ thị trường nội địa xuất lớn [24] Số lượng hoa lan giống Mokara cung cấp cho Thành phố Hồ Chí Minh chủ yếu nhập từ Thái Lan hầu hết không kiểm định, nên không đảm bảo chất lượng Bên cạnh đó, chi phí đầu tư giống lan Mokara cao gây khó khăn cho việc mở rộng diện tích sản xuất Hiện nay, có nhiều đơn vị nghiên cứu nước nhân giống cung cấp giống lan Mokara nuôi cấy mô, số lượng khiêm tốn chưa đủ đáp ứng cho nhu cầu thị trường Vì việc đầu tư xây dựng phịng ni cấy mơ tế bào thực vật để phục vụ cho nhân giống in vitro hướng đến lai tạo giống lan Mokara giống lan khác cần thiết giai đoạn tương lai Bảng 3.1 Hiệu việc sử dụng javen để tạo vật liệu khởi đầu Công thức CT1(ĐC) CT2 CT3 CT4 CT5 LSD0,05 Trong cột, chữ theo sau khác a, b, c,… thể khác có ý nghĩa thống kê với α=0,05 Phân tích kết bảng 3.1 cho thấy: sử dụng CT1 (xử lí sơ bộ) 100% mẫu bị nhiễm, CT2 bắt đầu xuất mẫu sống đạt tỷ lệ 23,33% Khi tăng nồng độ javen từ CT3 - CT5 tỷ lệ mẫu nhiễm giảm từ 46,67% xuống 16,67% Tuy nhiên tỷ lệ mẫu chết tăng từ 0% 80% Do mà tỷ lệ mẫu sống giảm Ở CT4 ta thấy tỷ lệ mẫu nhiễm đạt 23,33%, tỷ lệ mẫu chết đạt 10%, mẫu sống đạt 66,67% cao Như theo chúng tơi để tạo mẫu phục vụ nhân giống CT4 phù hợp 19 Hình 3.1 Mẫu cấy sống sau tuần quan sát 3.2 Tái sinh chồi in vitro - Ảnh hưởng nồng độ BAP đến khả tái sinh chồi in vitro Mẫu cấy: nuôi cấy môi trường chứa MS + BAP với nồng độ khác (0; 0,5; 1; 1,5; 2mg/l) Sau chuyển sang mơi trường có chứa than hoạt tính (0,5mg/l) nước dừa 10% để kích thích kéo dài chồi Hình 3.2 Mẫu in vitro nuôi cấy môi trường B1 20 21 Bảng 3.2 Ảnh hưởng nồng độ BAP đến khả tái sinh chồi Công thức CT1 CT2 CT3 CT4 CT5 LSD0,05 Trong cột, chữ theo sau khác a, b, c,… thể khác có ý nghĩa thống kê với α=0,05 Phân tích kết bảng 3.2 cho thấy khơng sử dụng BAP chồi tái sinh thấp, số chồi đạt 1,50, với chiều cao 1,62 số 3,75 Khi tăng sử dụng nồng độ BAP số chồi tái sinh bắt đầu tăng nhận thấy đạt cao CT3 với tỷ lệ số chồi tái sinh đạt 5,50a, chiều cao chồi đạt 6,02a số đạt 5,50a Tuy nhiên tăng cao gây ức chế đến khả tái sinh chồi in vitro Như theo sử dụng CT3 phù hợp để tái sinh chồi in vitro 3.3 Nghiên cứu ảnh hưởng nồng độ BAP kết hợp với NAA đến khả nhân nhanh chồi Công việc xác định môi trường tối ưu để nuôi cấy nhân nhanh chồi, làm tăng hệ số nhân đồng thời chồi đạt chất lượng tốt, không bị biến dị trước chuyển sang mơi trường tạo hồn chỉnh u cầu thiếu nuôi cấy mô Bên cạnh việc cung cấp dinh dưỡng cho mơ ni cấy việc bổ sung nhiều chất điều hòa sinh trưởng auxin, cytokinin cần thiết để kích thích sinh trưởng, phát triển phân hóa quan, tạo sức sống tốt cho mô tổ chức Bên cạnh tỷ lệ auxin/cytokinin cịn quan trọng phát sinh hình thái hệ 22 thống nuôi cấy Sự kết hợp auxin cytokinin với tỷ lệ định làm tăng sinh trưởng chồi Trong nghiên cứu em có sử dụng tổ hợp NAA kết hợp BAP với nồng độ khác để khảo sát khả nhân nhanh chồi in vitro lan Mokara Hình 3.3 Cây in vitro ni cấy mơi trường có bổ sung MS + BAP + than hoạt tính (0,5 mg/l) + nước dừa 10% Bảng 3.3 Ảnh hưởng BAP kết hợp với NAA đến khả nhân nhanh chồi in vitro Công thức CT1 CT2 CT3 CT4 CT5 LSD0,05 Trong cột, chữ theo sau khác a, b, c,… thể khác có ý nghĩa thống kê với α=0,05 23 Phân tích kết bảng 3.3 cho thấy: bổ sung NAA vào mơi trường, có mặt auxin ảnh hưởng đến tích lũy cytokinin, hoạt tính BAP yếu nên số lượng chồi giảm theo Cụ thể hệ số nhân nhanh chồi cao đạt 3,33 chồi/mẫu, CT4 có bổ sung 1,5mg/ BAP kết hợp 0,2 mg/l NAA thấp CT1 3.4 Nghiên cứu ảnh hưởng IAA đến khả tạo rễ in vitro Tạo rễ giai đoạn cuối trình nhân nhanh in vitro Với mục đích tạo có sức sống cao, đạt tiêu chuẩn Đối với nuôi cấy mô tế bào thực vật auxin sử dụng để kích thích phân chia tế bào phân hóa rễ Những auxin dùng rộng rãi nuôi cấy mô tế bào thực vật IAA Để tăng khả rễ cho lan nghiên cứu em tiến hành lấy chồi lan Mokara thu từ thí nghiệm tách riêng lẻ cấy môi trường MS có bổ sung IAA nồng độ khác để khảo sát khả tạo rễ in vitro Bảng 3.4 Ảnh hưởng IAA đến khả rễ Công thức CT1 CT2 CT3 CT4 CT5 LSD0,05 Trong cột, chữ theo sau khác a, b, c,… thể khác có ý nghĩa thống kê với α=0,05 Phân tích kết bảng 3.4 cho ta thấy, CT1 khơng sử dụng IAA số rễ tạo chiều dài rễ khiêm tốn khoảng 0,92cm Ở CT2 tăng nồng độ IAA lên nhận thấy số lượng rễ tăng, kèm theo 24 tăng chiều dài rễ, đạt kết tốt CT4 với số rễ/cây đạt 4,66 rễ/cây chiều dài rễ đạt 3,56cm Tuy nhiên CT5 tăng thêm nồng độ IAA thấy số lượng rễ chiều dài rễ khơng tăng mà có xu hướng giảm Vì chúng tơi đề nghị sử dụng dụng CT4 công việc rễ - tạo hồn chỉnh Hình 3.4 Ảnh hưởng IAA đến khả tạo rễ in vito 3.5 Rèn luyện in vitro thích nghi với điều kiện mơi trường Khi in vitro đạt chiều cao từ - 4cm, có từ - rễ chuyển sang mơi trường ngồi: giá thể xơ dừa + phun dung dịch N:P:K với nồng độ 1-2%, giá thể trấu hun + dung dịch N:P:K nồng độ từ 1-2 % Thời gian 10 ngày phun vào dung dịch N:P:K nồng độ từ 1-2 % Cây lan trình dễ bị nhiều bệnh nên chậu thành chậu phải xử lý Formalin, với lan phun thường xun Boocđơ hay Zinep nồng độ 1% Casuran 1% Sau tuần xác định tỉ lệ sống sót (%) 25 a b c d Hình 3.5 Cây in vitro sau tuần rèn luyện (a Cây in vitro rèn luyện giá thể xơ dừa; b Sau tuần rèn luyện giá thể xơ dừa; c Cây in vitro rèn luyện giá thể trấu hun; d Sau tuần rèn luyện giá thể trấu hun) 26 Quy trình nhân giống in vitro lan Mokara Đoạn thân chứa mắt ngủ lan Mokara (1) Khử trùng mẫu Ảnh 1: lan Mokara Mẫu (2) Tái sinh nhân nhanh Ảnh 2: Mẫu vô trùng Cụm chồi in vitro (3) Ra rễ - tạo hoàn chỉnh Ảnh 3: Nhân nhanh chồi Cây hoàn chỉnh (4) Rèn luyện Ảnh 4: Ra rễ tạo hoàn chỉnh Cây in vitro qua rèn luyện Ảnh 5: Rèn luyện in vitro 27 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 1.Kết luận Dựa vào kết thu từ thí nghiệm, tơi xin rút số kết luận sau: - Môi trường khử trùng phù hợp với giống lan Mokara xử lí sơ kết hợp với javen 15% vòng phút - Mơi trường tái sinh chồi in vitro thích hợp MS có bổ sung BAP 1mg/l - Môi trường nhân nhanh phù hợp MS có bổ sung BAP 1,5mg/l kết hợp với NAA 0,2mg/l - Môi trường rễ - tạo hồn chỉnh thích hợp MS có bổ sung IAA 0,75mg/l - Giá thể rèn luyện in vitro có trạng thái tốt giá thể Kiến nghị - Tiếp tục nghiên cứu, rèn luyện giống lan Mokara điều kiện tự nhiên - Nghiên cứu sinh trưởng, phát triển in vitro lan Mokara đến hoa 28 DANH MỤC TÀI LIỆU THAM KHẢO Tiếng Việt Đặng Xuân Viên, 2011, “Nhân nhanh in vitro hoa Lan Mokara”, Luận văn tốt nghiệp, trường Đại học Nông Lâm TP Hồ Chí Minh GS.TS Phạm Hồng Hộ, “Cây cỏ Việt Nam”, tập 3 Hồ Thị Nga, Bùi Thanh Hịa, Trần Văn Minh (2017), Vi mơ nhiệt đới Mokara kỹ thuật nuôi cấy hoa, Tạp chí International Journal of Current Research, (04): 49135-49138 Ngô Quang Vũ (2002), “Những số hấp dẫn thị trường lan cắt cành giới”, trang 10, Tạp chí Hoan cảnh Nguyễn Đức Minh Hùng, Trần Văn Minh (2014), Nghiên cứu nguồn sáng đèn LED xanh đỏ đến sinh trưởng phát triển hoa lan mokara hông ( Paulownia) nuôi cấy mô Nhân giống hoa hồng kỹ thuật nuôi cấy invitro, Tạp chí Nơng nghiệp Phát triển nơng thơn, (21): 38-44 Nguyễn Thị Sơn, Từ Bích Thủy, Đặng Thị Nhàn, Nguyễn Thị Lý Anh, Hoàng Thị Nga, Nguyễn Quang Thạch (2014) “NHÂN GIỐNG IN VITRO LAN DENDROBIUM OFFICINALE KIMURA ET MIGO (Thạch Hộc Thiết Bì”, Tạp chí Khoa học Phát triển, Vol 12, No 8, 1274 – 1282 Nguyễn Thiện Tịch, (2006), “Kỹ thuật nuôi trồng hoa Lan” Nxb Nông Nghiệp TpHCM Nguyễn Văn Mã, La Việt Hồng, Ong Xuân Phong (2013), Phương pháp nghiên cứu sinh lý học thực vật, NXB Đại học Quốc gia Hà Nội Vương Thị Hồng Loan, Kha Nữ Tú Uyên, Nguyễn Thị Điệp, Lê Thị Thủy Tiên (2016), Khảo sát khả nhân nhanh protocorm like bodies tái sinh chồi lan mokara vàng chanh hệ thống ngập chìm tạm thời rita, Tạp chí Nơng nghiệp Phát triển nơng thơn,(5): 41-49 29 Tiếng nước ngồi 10 CBI (2007), The cut flower and floliage market in the EU, CBI market survey report, 1-20 11 CR Li, LJ Gan, KXia, X., CSHew (2008) “Responses of carboxylating enzymes, sucrose metabolizing enzymes and plant hormones in a tropical epiphytic CAM orchid to CO2enrichment” Plant, Cell & amp; Environment, Vol 25, Issue 12 Dagawa Y and Kunisaki JT (1982), “Clonal propagation of orchid by tissue culture”, Plant tissue culture, 8:683-684 13 Dyah Widiastoety (2014) “Pengaruh Auksin dan Sitokinin Terhadap Pertumbuhan Planlet Anggrek Mokara”, Indonesian Center for Horticulture Research and Development, Vol 24, Issue , 230-238 14 Ho Thi Nga, Bui Thanh Hoa and Tran Van Minh April (2017), International Journal of Current Research, Micropropagation of tropical Mokara by flower-stalk culture techunique, Vol 9, Issue, 04, pp.49135-49138, 15 Jun Yamazaki, Kazamitsu Miyoshi (2006), In vitro Asymbiotic Germination of Immature Seed and Formation of Protocorm by Cephalanthera falcata (Orchidaceae), Annals of botany, 98 (6): 1197-1206 16 Ken Tokuhara and Masahiro Mii(2001), Induction of embryogenic callus and cell suspension culture from shoot tips excised from flower stalk buds of phalaenopsis (orchidaceae), Society for In Vitro Biology, 17 Maridass M, Mahesh R, Raju G, Benniamin A, Muthuchelian (2010), “ In vitro Propagation of Dendrobium nanum through rhizome bud culture”, 18 Morel G (1964), “A new means ofclonal propagation of orchids”, Am Orchid Soc Bull, 33:473-478 30 19 Morel G (1960) “Producing virus-free Cymbium, Am”, Orchid Soc Bull, 29:495-497 20 Pan-Chi Liou (2005), Marching toward the Market – the Business Potential for Agricultủal Biotechnology in Taiwan, Horticultural Division Agricultural Research Institute, Council of Agriculuture Executive Yuan Taichung Hsien, 89 21 Scully R (1967), “Aspects of meristem of meristem culture in the Cattleya alliance, Amer”, Orchid Soc Bull, 36:103-108 22 USDA (United State Department of Agriculture) (2004), Economic Research Service, Briefing Room – Floriculture crops, 18-26 Tài liệu internet 23 https://khoahoc.tv/cat-canh-nhan-giong-lan-co-loi-lon-39887 24 https://vi.wikipedia.org/wiki/H%E1%BB%8D_Lan 25 https://www.academia.edu/17138132/K%E1%BB%B9_thu%E1%BA%ADt_nh %C3%A2n_gi%E1%BB%91ng_Lan_Mokara 31 ... lượng giống giảm giá thành Từ thực tế trên, chọn đề tài ? ?Xây dựng quy trình nhân giống hoa lan Mokara kỹ thuật ni cấy mơ” Mục đích nhiệm vụ nghiên cứu 2.1 Mục đích nghiên cứu Xây dựng quy trình nhân. .. vitro hướng đến lai tạo giống lan Mokara giống lan khác cần thiết giai đoạn tương lai Áp dụng nhân giống kỹ thuật nuôi cấy mô cần thiết có hệ số nhân cao, nhân nhanh hàng loạt giống có suất phẩm chất... 2.1 Cây lan Mokara vườn thực nghiệm trường ĐHSPHN 2.2 Phạm vi nghiên cứu, địa điểm thời gian Phạm vi nghiên cứu: xây dựng quy trình nhân giống lan Mokara kĩ thuật ni mơ Hình 2.2 Vườn lan Mokara