3. Ý nghĩa khoa học và ý nghĩa thực tiễn
2.5. Phân tích thống kê số liệu
Các số liệu được xử lý trên Microsoft Office Excel 2010 và được phân tích trên máy tính theo chương trình Sirichai Statistics 7.0 2014.
CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
3.1. Tạo vật liệu khởi đầu cho nuôi cấy in vitro. - Ảnh
hưởng của nồng độ và thời gian lắc javen
Đây là giai đoạn đối tượng nuôi cấy ngoài tự nhiên vào điều kiện nuôi cấy in vitro. Đối với mỗi loại cây, mỗi loại mô khác nhau phải xác định phương thức khử trùng khác nhau cho hợp lí nhất. Thành công của giai đoạn này không chỉ phụ thuộc vào đối tượng cụ thể, cách lấy mẫu, thời điểm lấy mẫu mà còn phụ thuộc vào hóa chất sử dụng để khử trùng và thời gian khử trùng. Đối tượng phải khỏe mạnh, sạch bệnh, sinh trưởng tốt, lấy mẫu cẩn thận để không gây tổn thương mắt ngủ của cây, nên lấy vào thời điểm giữa trưa khi ánh nắng chiếu trực tiếp vào cây giúp loại bỏ bớt một số loại vi sinh vật.
Giai đoạn này cần đạt các tiêu chuẩn: tỷ lệ mẫu nhiễm virus, vi khuẩn, nấm là thấp nhất và tỷ lệ mẫu sống sạch bệnh là cao nhất. Do đó, việc xác định phương thức khử trùng có ý nghĩa quyết định đến sự thành công ban đầu của quá trình nhân giống tiếp theo.
Đề tài nhân giống lan Mokara sử dụng vật liệu là đoạn thân mang mắt ngủ để tạo vật liệu vô trùng. Thân lan mang mắt ngủ được khử trùng trong javen 5, 10, 15, 20% trong thời gian từ 5 đến 7 phút sau đó cấy vào môi trường nuôi cấy có chứa MS có bổ sung 0,7% agar, 3% sucrose.
Bảng 3.1. Hiệu quả của việc sử dụng javen để tạo vật liệu khởi đầu Công thức CT1(ĐC) CT2 CT3 CT4 CT5 LSD0,05
Trong cùng một cột, các chữ theo sau khác nhau a, b, c,… thể hiện sự khác nhau có ý nghĩa thống kê với α=0,05
Phân tích kết quả của bảng 3.1 cho thấy: khi sử dụng CT1 (xử lí sơ bộ) thì 100% mẫu bị nhiễm, ở CT2 bắt đầu xuất hiện mẫu sạch sống đạt tỷ lệ 23,33%. Khi tăng nồng độ javen từ CT3 - CT5 thì tỷ lệ mẫu nhiễm giảm từ 46,67% xuống còn 16,67%. Tuy nhiên tỷ lệ mẫu sạch chết cũng tăng từ 0% - 80%. Do vậy mà tỷ lệ mẫu sạch sống sẽ giảm. Ở CT4 ta thấy tỷ lệ mẫu sạch nhiễm đạt 23,33%, tỷ lệ mẫu sạch chết đạt 10%, mẫu sạch sống đạt 66,67% là cao nhất. Như vậy theo chúng tôi thì để tạo mẫu sạch phục vụ nhân giống thì CT4 là phù hợp nhất.
Hình 3.1. Mẫu cấy sạch sống sau 2 tuần quan sát 3.2. Tái sinh chồi in vitro
- Ảnh hưởng của nồng độ BAP đến khả năng tái sinh chồi in vitro
Mẫu cấy: được nuôi cấy trong môi trường chứa MS cơ bản + BAP với các nồng độ khác nhau (0; 0,5; 1; 1,5; 2mg/l). Sau đó chuyển sang môi trường có chứa than hoạt tính (0,5mg/l) và nước dừa 10% để kích thích kéo dài chồi.
Bảng 3.2. Ảnh hưởng của nồng độ BAP đến khả năng tái sinh chồi Công thức CT1 CT2 CT3 CT4 CT5 LSD0,05
Trong cùng một cột, các chữ theo sau khác nhau a, b, c,… thể hiện sự khác nhau có ý nghĩa thống kê với α=0,05
Phân tích kết quả của bảng 3.2 cho thấy khi không sử dụng BAP thì chồi tái sinh rất thấp, số chồi chỉ đạt 1,50, với chiều cao là 1,62 và số lá là 3,75. Khi tăng sử dụng nồng độ BAP thì số chồi tái sinh cũng bắt đầu tăng và nhận thấy đạt cao nhất ở CT3 với tỷ lệ số chồi tái sinh đạt 5,50a, chiều cao chồi đạt 6,02a và số lá đạt 5,50a. Tuy nhiên khi tăng quá cao thì gây ức chế đến khả năng tái sinh chồi in vitro. Như vậy thì theo chúng tôi sử dụng CT3 là phù hợp nhất để tái sinh chồi in vitro.
3.3. Nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ BAP kết hợp với NAA đến khả năng nhân nhanh chồi năng nhân nhanh chồi
Công việc xác định được môi trường tối ưu để nuôi cấy nhân nhanh chồi, làm tăng hệ số nhân đồng thời các chồi đạt chất lượng tốt, không bị biến dị trước khi chuyển sang môi trường tạo cây hoàn chỉnh là một yêu cầu không thể thiếu trong nuôi cấy mô. Bên cạnh việc cung cấp dinh dưỡng cho mô nuôi cấy thì việc bổ sung một hoặc nhiều chất điều hòa sinh trưởng như auxin, cytokinin là rất cần thiết để kích thích sinh trưởng, phát triển và phân hóa các cơ quan, tạo sức sống tốt cho mô và các tổ chức. Bên cạnh đó thì tỷ lệ auxin/cytokinin còn rất quan trọng đối với sự phát sinh hình thái trong hệ
thống nuôi cấy. Sự kết hợp giữa auxin và cytokinin với một tỷ lệ nhất định làm tăng sự sinh trưởng của chồi. Trong nghiên cứu của em có sử dụng tổ hợp NAA kết hợp BAP với các nồng độ khác nhau để khảo sát khả năng nhân nhanh chồi in vitro của lan Mokara.
Hình 3.3. Cây in vitro được nuôi cấy trong môi trường có bổ
sung MS + BAP + than hoạt tính (0,5 mg/l) + nước dừa 10% Bảng 3.3. Ảnh hưởng của BAP kết hợp với NAA đến khả
năng nhân nhanh chồi in vitro
Công thức CT1 CT2 CT3 CT4 CT5 LSD0,05
Trong cùng một cột, các chữ theo sau khác nhau a, b, c,… thể hiện sự khác nhau có ý nghĩa thống kê với α=0,05
Phân tích kết quả tại bảng 3.3 cho thấy: khi bổ sung NAA vào môi trường, sự có mặt của auxin đã ảnh hưởng đến sự tích lũy cytokinin, do đó hoạt tính của BAP yếu hơn nên số lượng chồi cũng giảm theo. Cụ thể hệ số nhân nhanh chồi cao nhất đạt 3,33 chồi/mẫu, ở CT4 có bổ sung 1,5mg/ BAP kết hợp 0,2 mg/l NAA và thấp nhất ở CT1
3.4. Nghiên cứu ảnh hưởng của IAA đến khả năng tạo rễ của cây in vitro.
Tạo rễ là giai đoạn cuối cùng của quá trình nhân nhanh in vitro. Với mục đích tạo cây con có sức sống cao, đạt tiêu chuẩn ra cây. Đối với nuôi cấy mô tế bào thực vật auxin được sử dụng để kích thích phân chia tế bào và phân hóa rễ. Những auxin được dùng rộng rãi trong nuôi cấy mô và tế bào thực vật là IAA. Để tăng khả năng ra rễ cho cây lan nghiên cứu em đã tiến hành lấy chồi của lan Mokara thu được từ các thí nghiệm trên rồi tách riêng lẻ và cấy trên môi trường MS cơ bản có bổ sung IAA ở các nồng độ khác nhau để khảo sát khả năng tạo rễ in vitro.
Bảng 3.4. Ảnh hưởng của IAA đến khả năng ra rễ của cây
Công thức CT1 CT2 CT3 CT4 CT5 LSD0,05
Trong cùng một cột, các chữ theo sau khác nhau a, b, c,… thể hiện sự khác nhau có ý nghĩa thống kê với α=0,05
Phân tích kết quả của bảng 3.4 cho ta thấy, ở CT1 khi không sử dụng IAA thì số rễ tạo ra ít và chiều dài rễ khiêm tốn chỉ trong khoảng 0,92cm. Ở CT2 khi tăng nồng độ IAA lên thì nhận thấy rằng số lượng rễ tăng, kèm theo
sự tăng về chiều dài của rễ, đạt kết quả tốt nhất ở CT4 với số rễ/cây đạt 4,66 rễ/cây và chiều dài rễ đạt 3,56cm. Tuy nhiên ở CT5 khi tăng thêm nồng độ IAA thì thấy số lượng rễ và chiều dài rễ không tăng mà có xu hướng giảm. Vì vậy chúng tôi đề nghị sử dụng dụng CT4 trong công việc ra rễ - tạo cây hoàn chỉnh.
Hình 3.4. Ảnh hưởng của IAA đến khả năng tạo rễ in vito
3.5. Rèn luyện cây in vitro thích nghi với điều kiện môi trường.
Khi cây in vitro đạt chiều cao từ 3 - 4cm, có từ 3 - 5 rễ sẽ được chuyển sang môi trường ngoài: trên giá thể xơ dừa + phun dung dịch N:P:K với nồng độ 1-2%, trên giá thể trấu hun + dung dịch N:P:K nồng độ từ 1-2 %. Thời gian 10 ngày phun vào dung dịch N:P:K nồng độ từ 1-2 %. Cây lan trong quá trình này rất dễ bị nhiều bệnh nên chậu và thành chậu phải được xử lý Formalin, với cây lan con có thể phun thường xuyên Boocđô hay Zinep nồng độ 1% hoặc Casuran 1%. Sau 2 tuần xác định tỉ lệ sống sót (%).
a b
c d
Hình 3.5. Cây in vitro sau 2 tuần rèn luyện
(a. Cây in vitro rèn luyện trên giá thể xơ dừa; b. Sau 2 tuần rèn luyện trên giá thể xơ dừa; c. Cây in vitro rèn luyện trên giá thể trấu hun; d. Sau 2 tuần rèn luyện trên giá thể trấu hun)
Quy trình nhân giống in vitro lan Mokara
Đoạn thân chứa mắt ngủ của lan Mokara
(1) Khử trùng mẫu
Ảnh 1: lan Mokara
Mẫu sạch
(2) Tái sinh và nhân nhanh
Ảnh 2: Mẫu vô trùng
Cụm chồi in vitro
(3) Ra rễ - tạo cây hoàn chỉnh
Ảnh 3: Nhân nhanh chồi
Cây hoàn chỉnh
(4) Rèn luyện cây con
Ảnh 4: Ra rễ tạo cây hoàn chỉnh
Cây con in vitro đã qua rèn luyện
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 1.Kết luận
Dựa vào những kết quả thu được từ thí nghiệm, tôi xin rút ra một số kết luận sau:
- Môi trường khử trùng phù hợp với giống lan Mokara là xử lí sơ bộ kết hợp với javen 15% trong vòng 6 phút.
- Môi trường tái sinh chồi in vitro thích hợp nhất là MS cơ bản có bổ sung BAP 1mg/l.
- Môi trường nhân nhanh phù hợp nhất là MS cơ bản có bổ sung BAP 1,5mg/l kết hợp với NAA 0,2mg/l.
- Môi trường ra rễ - tạo cây hoàn chỉnh thích hợp nhất là MS cơ bản có bổ sung IAA 0,75mg/l.
- Giá thể rèn luyện cây con in vitro có trạng thái tốt nhất là trên giá thể
2. Kiến nghị
- Tiếp tục nghiên cứu, rèn luyện cây giống lan Mokara trong điều kiện tự nhiên.
- Nghiên cứu sự sinh trưởng, phát triển của cây con in vitro lan Mokara đến khi ra hoa
DANH MỤC TÀI LIỆU THAM KHẢO Tiếng Việt
1. Đặng Xuân Viên, 2011, “Nhân nhanh in vitro hoa Lan Mokara”, Luận văn tốt nghiệp, trường Đại học Nông Lâm TP. Hồ Chí Minh.
2. GS.TS. Phạm Hoàng Hộ, “Cây cỏ Việt Nam”, tập 3
3. Hồ Thị Nga, Bùi Thanh Hòa, Trần Văn Minh (2017), Vi mô của nhiệt đới Mokara bằng kỹ thuật nuôi cấy hoa, Tạp chí International Journal of Current
Research, 9 (04): 49135-49138.
4. Ngô Quang Vũ (2002), “Những con số hấp dẫn thị trường lan cắt cành thế
giới”, trang 10, Tạp chí Hoan cảnh.
5. Nguyễn Đức Minh Hùng, Trần Văn Minh (2014), Nghiên cứu nguồn sáng
đèn LED xanh và đỏ đến sinh trưởng và phát triển hoa lan mokara và cây hông ( Paulownia) trong nuôi cấy mô Nhân giống cây hoa hồng bằng kỹ thuật nuôi cấy invitro, Tạp chí Nông nghiệp và Phát triển nông thôn, (21): 38-44.
6. Nguyễn Thị Sơn, Từ Bích Thủy, Đặng Thị Nhàn, Nguyễn Thị Lý Anh, Hoàng Thị Nga, Nguyễn Quang Thạch (2014) “NHÂN GIỐNG IN VITRO LAN DENDROBIUM OFFICINALE KIMURA ET MIGO (Thạch Hộc Thiết Bì”, Tạp chí Khoa học và Phát triển, Vol 12, No 8, 1274 – 1282.
7. Nguyễn Thiện Tịch, (2006), “Kỹ thuật nuôi trồng hoa Lan” Nxb Nông Nghiệp TpHCM.
8. Nguyễn Văn Mã, La Việt Hồng, Ong Xuân Phong (2013), Phương
pháp
nghiên cứu sinh lý học thực vật, NXB Đại học Quốc gia Hà Nội.
9. Vương Thị Hồng Loan, Kha Nữ Tú Uyên, Nguyễn Thị Điệp, Lê Thị Thủy Tiên (2016), Khảo sát khả năng nhân nhanh protocorm like bodies và tái sinh chồi lan mokara vàng chanh trong hệ thống ngập chìm tạm thời rita, Tạp chí
Tiếng nước ngoài
10. CBI (2007), The cut flower and floliage market in the EU, CBI market
survey report, 1-20.
11. CR Li, LJ Gan, KXia, X., CSHew (2008) “Responses of carboxylating
enzymes, sucrose metabolizing enzymes and plant hormones in a tropical epiphytic CAM orchid to CO2enrichment” Plant, Cell & amp; Environment, Vol 25, Issue 3.
12. Dagawa Y and Kunisaki JT (1982), “Clonal propagation of orchid by tissue culture”, Plant tissue culture, 8:683-684.
13. Dyah Widiastoety (2014) “Pengaruh Auksin dan Sitokinin Terhadap Pertumbuhan Planlet Anggrek Mokara”, Indonesian Center for Horticulture
Research and Development, Vol 24, Issue 3 , 230-238
14. Ho Thi Nga, Bui Thanh Hoa and Tran Van Minh April (2017), International Journal of Current Research, Micropropagation of tropical
Mokara by flower-stalk culture techunique, Vol. 9, Issue, 04, pp.49135-49138,
15. Jun Yamazaki, Kazamitsu Miyoshi (2006), In vitro Asymbiotic Germination of Immature Seed and Formation of Protocorm by Cephalanthera falcata (Orchidaceae), Annals of botany, 98 (6): 1197-1206.
16. Ken Tokuhara and Masahiro Mii(2001), Induction of embryogenic callus and cell suspension culture from shoot tips excised from flower stalk buds of phalaenopsis (orchidaceae), Society for In Vitro Biology,
17. Maridass M, Mahesh R, Raju G, Benniamin A, Muthuchelian (2010), “
In vitro Propagation of Dendrobium nanum through rhizome bud culture”,
18. Morel G (1964), “A new means ofclonal propagation of orchids”, Am
19. Morel G (1960). “Producing virus-free Cymbium, Am”, Orchid Soc
Bull,
29:495-497
20. Pan-Chi Liou (2005), Marching toward the Market – the Business Potential for Agricultủal Biotechnology in Taiwan, Horticultural Division Agricultural Research Institute, Council of Agriculuture Executive Yuan. Taichung Hsien, 89.
21. Scully R (1967), “Aspects of meristem of meristem culture in the Cattleya alliance, Amer”, Orchid Soc Bull, 36:103-108.
22. USDA (United State Department of Agriculture) (2004), Economic
Research Service, Briefing Room – Floriculture crops, 18-26.
Tài liệu internet
23. https://khoahoc.tv/cat-canh-nhan-giong-lan-co-loi-lon-39887
24. https://vi.wikipedia.org/wiki/H%E1%BB%8D_Lan
25. https://www.academia.edu/17138132/K%E1%BB%B9_thu%E1%BA%ADt_nh