Phân tích proteomics mô ung thư của bệnh nhân ung thư đại trực tràng

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN - Nguyễn Thị Ngọc Hà PHÂN TÍCH PROTEOMICS MÔ UNG THƢ CỦA BỆNH NHÂN UNG THƢ ĐẠI TRỰC TRÀNG LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC Hà Nội – Năm 2012 ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN - Nguyễn Thị Ngọc Hà PHÂN TÍCH PROTEOMICS MƠ UNG THƢ CỦA BỆNH NHÂN UNG THƢ ĐẠI TRỰC TRÀNG Chuyên ngành: Sinh học thực nghiệm Mã số: 60 42 30 LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC NGƢỜI HƢỚNG DẪN KHOA HỌC PGS.TS Trịnh Hồng Thái Hà Nội – Năm 2012 MỤC LỤC MỞ ĐẦU Chƣơng – TỔNG QUAN .3 1.1 TỔNG QUAN VỀ UNG THƢ ĐẠI TRỰC TRÀNG 1.1.1 Ung thƣ đại trực tràng gì? 1.1.2 Nguyên nhân dẫn đến ung thƣ đại trực tràng 1.1.3 Các hệ thống phân loại giai đoạn ung thƣ đại trực tràng 1.2 NGHIÊN CỨU CHỈ THỊ SINH HỌC ĐỐI VỚI UNG THƢ 12 1.2.1 Chỉ thị sinh học ung thƣ 12 1.2.2 Các kỹ thuật sinh học phân tử đƣợc ứng dụng để nghiên cứu thị sinh học ung thƣ 14 1.3 PROTEOMICS TRONG NGHIÊN CỨU UNG THƢ ĐẠI TRỰC TRÀNG 16 1.3.1 Proteomic gì? 16 1.3.2 Công cụ nghiên cứu proteomics 17 1.3.3 Ứng dụng proteomics nghiên cứu ung thƣ đại trực tràng 19 Chƣơng - NGUYÊN LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 28 2.1 NGUYÊN LIỆU 28 2.1.1 Đối tƣợng nghiên cứu 28 2.1.2 Hóa chất 28 2.1.3 Thiết bị 29 2.2 PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 29 2.2.1 Xử lý mẫu mô đại trực tràng 29 2.2.2 Định lƣợng protein phƣơng pháp Bradford 31 2.2.3 Điện di hai chiều 31 2.2.4 Phân tích hình ảnh gel điện di hai chiều 33 2.2.5 Cắt thủy phân spot 34 2.2.6 Phân tích khối phổ nhận dạng protein 35 Chƣơng - KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 37 3.1 TÁCH CHIẾT PROTEIN MÔ ĐẠI TRỰC TRÀNG 37 3.2 PHÂN TÁCH PROTEIN MÔ ĐẠI TRỰC TRÀNG TRÊN BẢN GEL ĐIỆN DI HAI CHIỀU 39 3.3 PHÂN TÍCH HÌNH ẢNH BẢN GEL ĐIỆN DI HAI CHIỀU .40 3.4 XÁC ĐỊNH PROTEIN BẰNG PHƢƠNG PHÁP MALDI-TOF MS 43 3.5 ĐẶC ĐIỂM, VAI TRÒ CỦA CÁC PROTEIN BIỂU HIỆN KHÁC BIỆT 52 3.5.1 Protein liên quan đến chu trình tế bào apoptosis 56 3.5.2 Protein liên quan đến trình miễn dịch bảo vệ thể 58 3.5.3 Protein tham gia cấu trúc tế bào 60 3.5.4 Protein tham gia trình trao đổi chất 61 3.5.5 Protein liên quan đến trình phiên mã, dịch mã, cải biến sau phiên mã, dịch mã 62 KẾT LUẬN 64 KIẾN NGHỊ 65 TÀI LIỆU THAM KHẢO 66 PHỤ LỤC DANH SÁCH BỆNH NHÂN UNG THƢ ĐẠI TRỰC TRÀNG ĐƢỢC SỬ DỤNG TRONG NGHIÊN CỨU i PHỤ LỤC KẾT QUẢ NHẬN DIỆN PROTEIN BẰNG CƠ SỞ DỮ LIỆU NCBI SỬ DỤNG PHẦN MỀM MASCOT .ii BẢNG KÝ HIỆU VÀ CÁC CHỮ VIẾT TẮT 2-DE Điện di hai chiều (Two - Dimensional Electrophoresis) ABC Ammonium Bicarbonate AcCN Acetonitrile AFAP Hội chứng đa polyp tuyến nhẹ di truyền (Attenuated Familial Adenomatous Polypsis) APC Adenomatous Polyposis Coli CHAPS 3-[(3-cholamidopropyl)dimethylammonio]-1-propanesulfonic acid CHCA α-Cyano-4-hydroxycinnamic acid CEA Kháng nguyên phôi thai (Carcinoembryonic Antigen) CK Cytokeratin cs Cộng Da Dalton DTT Dithiothreitol ELISA Enzyme-linked immunosorbent assay FAP Hội chứng đa polyp tuyến gia đình (Familial Adenomatous Polyposis) HCCS Suppressor of tumorigenicity 20 protein HNPCC Hội chứng ung thƣ đại tràng di truyền đa polyp (Hereditary Nonpolyposis Colon Cancer) HSP Protein sốc nhiệt (Heat sock protein) HUPO Tổ chức nghiên cứu hệ protein ngƣời (Human Proteome Organisation) IAA Iodoacetamide IEF Điện di phân vùng đẳng điện (Isoelectric Focusing) IPG Gradient pH cố định (Immobilized pH gradient) LC-MS/MS Sắc ký lỏng kết nối với khối phổ (Liquid Chromatography coupled with tandem Mass Spectrometry) MALDI-TOF Matrix-assisted laser desorption ionization time-of-flight MS Khối phổ (Mass spectrometry) PBS Đệm muối Photphat (Phosphate Buffer Saline) PMF Đặc trƣng khối peptide (Peptide Mass Fingerprint) SDS Sodium dodecyl sulfate SDS-PAGE Điện di gel polyacrylamide có SDS (SDS-Polyacrylamide Gel Electrophoresis) SELDI-TOF Surface-enhanced laser desorption/ionization time - of - flight Spot Điểm protein TAA Kháng nguyên liên quan đến khối u (Tumor Associated Antigens) TFA Trifluoroacetic acid TNM Tumor – Lympho node – Metastases DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng Các giai đoạn bệnh TNM tỉ lệ sống sót giai đoạn bệnh khác Bảng Các hóa chất sử dụng nghiên cứu Bảng Các bƣớc chạy điện di đẳng điện IPG strip dài 17cm Bảng Số lƣợng spot protein phân tách gel điện di hai chiều Bảng Thống kê spot protein biểu khác biệt gel điện di hai chiều bệnh nhân Bảng Danh sách protein đƣợc xác định MALDI TOF-MS từ gel mô ung thƣ so sánh với gel mơ đại trực tràng bình thƣờng bệnh nhân ung thƣ đại trực tràng Bảng Tóm tắt chức protein đƣợc định danh biểu khác biệt mô ung thƣ đại trực tràng so với mô đại trực tràng bình thƣờng DANH MỤC CÁC HÌNH Hình Hình ảnh đại trực tràng Hình Các giai đoạn phát triển ung thƣ đại trực tràng Hình Phân tích hình ảnh gel điện di hai chiều sử dụng phần mềm Phoretix Hình Điện di kiểm tra phân đoạn dịch chiết protein từ mô đại trực tràng bình thƣờng mơ ung thƣ đại trực tràng gel polyacrylamide 10% có SDS Hình Điện di kiểm tra mẫu tủa phân đoạn dịch chiết protein PBS lysis từ mô đại trực tràng bình thƣờng mơ ung thƣ đại trực tràng Hình Phân tách protein mơ đại trực tràng bệnh nhân mã số 11781 gel điện di hai chiều Hình Minh họa spot biểu khác biệt gel mô ung thƣ so với mơ bình thƣờng Hình Các spot protein biểu khác biệt gel điện di hai chiều mẫu mô ung thƣ đại trực tràng so với mẫu mơ đại trực tràng bình thƣờng bệnh nhân ung thƣ đại trực tràng mã số 11781 Hình Phân tích khối phổ peptide thu đƣợc sau thủy phân protein T17B33 enzyme trypsin Hình 10 Kết nhận dạng protein tra cứu sở liệu NCBI sử dụng phần mềm Mascot Hình 11 Các nhóm protein theo chức Hình 12 Quá trình apoptosis tế bào Hình 13 Sơ đồ trình diện kháng nguyên phức hệ phù hợp tổ chức mô cho tế bào lympho T Hình 14 Cơ chế tác dụng Zinc finger protein trình phiên mã Luận văn thạc sĩ Nguyễn Thị Ngọc Hà MỞ ĐẦU Ung thƣ đại trực tràng bệnh ung thƣ phổ biến giới, đứng thứ ba sau ung thƣ phổi ung thƣ vú Đây bệnh có tỷ lệ tử vong cao tỷ lệ mắc bệnh có xu hƣớng ngày tăng Theo thống kê, năm 2008 ƣớc tính có khoảng 1,24 triệu ngƣời giới đƣợc chẩn đoán mắc ung thƣ đại trực tràng, chiếm khoảng 10% số loại ung thƣ Số ca tử vong ung thƣ đại trực tràng năm 2008 610.000 ca toàn giới, chiếm khoảng 8% số lƣợng tử vong ung thƣ Tại Việt Nam, ung thƣ đại trực tràng loại ung thƣ đứng thứ năm loại ung thƣ thƣờng gặp, sau ung thƣ dày, phổi, vú, vòm họng Theo thống kê Bệnh viện Ung Bƣớu thành phố Hồ Chí Minh, năm 2008, bệnh viện có 306 ca bệnh ung thƣ đại trực tràng số ngày gia tăng Tính đến tháng năm 2009, có đến 220 bệnh nhân đến điều trị ung thƣ đại trực tràng [54] Tỷ lệ mắc ung thƣ đại trực tràng 9% tổng số bệnh nhân ung thƣ [55] Việc chẩn đoán phát sớm ung thƣ đại trực tràng có ý nghĩa quan trọng, giúp làm tăng hiệu điều trị bệnh, giảm tỷ lệ tử vong loại ung thƣ gây Thực tế cho thấy, phát khối u đại trực tràng giai đoạn đầu chữa trị kịp thời tỷ lệ sống sót bệnh nhân sau năm 80 – 100% Hiện nay, số phƣơng pháp xét nghiệm lâm sàng đƣợc áp dụng để chẩn đoán ung thƣ đại trực tràng nhƣ chẩn đốn hình ảnh thơng quan nội soi, sinh thiết, chụp X quang, xét nghiệm tìm máu phân, thăm khám trực tiếp, sử dụng thị CEA Nhƣợc điểm phƣơng pháp thƣờng phát bệnh giai đoạn muộn, phƣơng pháp nội soi thƣờng gây khó chịu cho bệnh nhân, xét nghiệm máu phân cho nhiều kết dƣơng tính âm tính giả nên hiệu chẩn đốn điều trị bệnh khơng cao Vì vậy, nhu cầu đặt cho nhà khoa học làm để tìm đƣợc thị sinh học đặc trƣng để chẩn đoán, phát ung thƣ đại trực tràng giai đoạn sớm Luận văn thạc sĩ Nguyễn Thị Ngọc Hà Hiện nay, hƣớng nghiên cứu thị sinh học cho ung thƣ đại trực tràng đƣợc nhà khoa học quan tâm sử dụng công cụ proteomics Bằng việc phân tích biến đổi thành phần, số lƣợng protein có mặt huyết thanh, dịch thể, mô ung thƣ bệnh nhân ung thƣ, nhà khoa học hi vọng tìm đƣợc thị sinh học mới, dễ nhận biết để ứng dụng chẩn đoán ung thƣ đại trực tràng giai đoạn sớm, nhằm phục vụ công tác chẩn đốn, điều trị bệnh cách hiệu Trong khn khổ luận văn này, tiến hành đề tài nghiên cứu “Phân tích proteomics mơ ung thƣ bệnh nhân ung thƣ đại trực tràng“ với mục tiêu: - Phân tách hệ protein tách chiết từ mô đại trực tràng bình thƣờng mơ ung thƣ đại trực tràng bệnh nhân ung thƣ đại trực tràng - Phân tích so sánh biểu khác biệt protein mô ung thƣ đại trực tràng so với mơ đại trực tràng bình thƣờng thơng qua biểu điểm protein gel điện di hai chiều - Nhận dạng đƣợc số protein biểu khác biệt đặc trƣng mô ung thƣ đại trực tràng mơ đại trực tràng bình thƣờng Đề tài đƣợc thực phòng Proteomics Sinh học Cấu trúc thuộc phịng thí nghiệm Trọng điểm Cơng nghệ Enzyme Protein, Trƣờng Đại học Khoa học Tự nhiên, Đại học Quốc gia Hà Nội Luận văn cao học Nguyễn Thị Ngọc Hà 17 Jing Y., Zhang J., Waxman S., Mira-y-Lopez R (1996), “Upregulation of cytokeratins and 18 in human breast cancer T47D cells is retinoid-specific and retinoic acid receptor-dependent”, Differentiation, 60(2),pp 109-117 18 Kim C Y., Jung W Y., Lee H J., Kim H K., Kim A., Shin B K (2012), “Proteomic analysis reveals overexpression of moesin and cytokeratin 17 proteins in colorectal carcinoma”, Oncol Rep., 27(3), pp 608-620 19 Kim T E., Kim Y W., Hwang S Y., Shin S M., Shin J W., Lee Y H., Shin S Y., Han K T., Lee J M., Namkoong S E., Kim J W (2002), “Candidate tumor suppressor, HCCS-1 is downregulated in human cancers and induces apoptosis in cervical cancer”, Int J Cancer, 97, pp.780–786 20 Habermann J K., Bader F G., Franke C., Zimmermann K., Gemoll T., Fritzsche B., Ried T., Auer G., Bruch H P., Roblick U J (2008), “From the genome to the proteome - biomarkers in colorectal cancer”, Langenbeck's Archives of Surgery, 393(1), pp 93-104 21 Labianca R., Beretta G D., Kildani B., Milesi L., Merlin F., Mosconi S., Pessi M A., Prochilo T., Quadri A., Gatta G., Braud de F., Wils J (2010), “Colon cancer”, Critical Reviews in Oncology/Hematology, 74(2010), 106–133 22 Lee I M., Shiroma E J., Lobelo F., Puska P., Blair S N., Katzmarzyk P T (2012), “Effect of physical inactivity on major non-communicable diseases worldwide: an analysis of burden of disease and life expectancy”, Lancet 23 Li C., Tan Y X., Zhou H., Ding S J., Li S J., Ma D J., Man X B., Hong Y., Zhang L., Li L., Xia Q C., Wu J R., Wang H Y., Zeng R (2005), “Proteomic analysis of hepatitis B virus-associated hepatocellular carcinoma: Identification of potential tumor markers”, Proteomics, 5(4), pp 1125-1139 24 Liebler D C (2002), Introduction to Proteomics, Humana Press, Totowa, NJ, USA 68 Luận văn cao học 25 Nguyễn Thị Ngọc Hà Lucas S D., Ek B., Rask L., Rastad J., Akerström G., Juhlin C (1997), “Aberrantly expressed cytokeratin 1, a tumor-associated autoantigen in papillary thyroid carcinoma”, Int J Cancer., 73(2), pp 171-177 26 Marion M B (1976), “A Rapid and Sensitive Method for the Quantitation of Microgram Quantities of Protein Utilizing the Principle of Protein – Dye Binding”, Analytical Biochemistry, 72, pp 248 – 254 27 Maximilian L W., Maike A L., Markus R (2012), “The central role of initiator caspase-9 in apoptosis signal transduction and the regulation of its activation and activity on the apoptosome”, Experimental Cell Research, 318(11), pp 1213–1220 28 National Commission of Digestive Disease (2008), “Cancers of the Digestive System”, Nature, 445, pp 111-115 29 Newton K F., Newman W., Hill J (2010), “Review of biomarkers in colorectal cancer”, Colorectal Disease, 14(1), pp 3-17 30 Parkin D M., Bray F I., Devesa S S (2001), “Cancer burden in the year 2000 The global picture”, Eur J Cancer 2001, 37(8), pp 4-66 31 Peng Y., Li X., Wu M., Yang J., Liu M., Zhang W., Xiang B., Wang X., Li X., Li G., Shen S (2012), “New prognosis biomarkers identified by dynamic proteomic analysis of colorectal cancer”, Mol BioSyst., 8, pp 3077-3088 32 Polanski M., Anderson N.L (2006), “A List of Candidate Cancer Biomarkers for Targeted Proteomics”, Biomarker Insights, 2, pp 1-48 33 Radiya G A., Helen M B., Ruth M A (2012), “Zinc fingers of the cerebellum (Zic): Transcription factors and co-factors”, The International Journal of Biochemistry & Cell Biology, 44(11), pp 2065–2068 34 Research Advocacy Network (2010), Biomarkers in Cancer – An Introductory Guide for Advocates 69 Luận văn cao học Nguyễn Thị Ngọc Hà 35 Shi Y L., Ping A., Hui-Yun C., Xue B., Ying-Nan Z., Bo Y., Fu-Yi Z., Gang C (2010), “Proteomic analysis of differentially expressed proteins involving in liver metastasis of human colorectal carcinoma”, Hepatobiliary Pancreat Dis Int, 9, pp 149-153 36 Tan H T., Wu W., Ng Y Z., Zhang X., Yan B., Ong C W., Tan S., Salto-Tellez M., Hooi S C., Chung M C (2012), “Proteomic analysis of colorectal cancer metastasis: stathmin-1 revealed as a player in cancer cell migration and prognostic marker”, J Proteome Res., 11(2), pp 1433-1445 37 Xue H., Lu B., Zhang J., Wu M., Huang Q., Wu Q., Sheng H., Wu D., Hu J., Lai M (2010), “Identification of serum biomarkers for colorectal cancer metastasis using a differential secretome approach”, J Proteome Res ;9(1), pp 545-55 38 Xuezhi B., Quingsong L., Tet W F., Shashikant J., Tao Y., Han-Ming S., Choon N O., Peh Y C., Kong W E, Choy-Leong H (2006), “Proteomic Analysis of Colorectal Cancer Reveals Alterations in Metabolic Pathways”, Molecular & Cellular Proteomics, 5(6), pp 1119 - 1130 39 Yu J K., Chen Y D., Zheng S (2004), “An integrated approach to the detection of colorectal cancer utilizing proteomics and bioinformatics”, World J Gastroenterol, 10, pp 3127-3131 40 Ward D G., Nyangoma S., Joy H., Hamilton E., Wei W., Tselepis C., Steven N., Wakelam M J O , Johnson P J , Ismail T., Martin A (2008), “Proteomic profiling of urine for the detection of colon cancer”, Proteome Science, 2008, pp 6-19 41 Watson A J., Collins P D (2011), “Colon cancer: acivilixation disorder”, Digestive diseases, 29(2):, pp 222-228 42 Weng Y R., Cui Y., Fang J Y (2012), “Biological functions of cytokeratin 18 in cancer”, Mol Cancer Res., 10(4), pp 485-493 70 Luận văn cao học Nguyễn Thị Ngọc Hà 43 Westermeier R., Naven T (2002), Proteomics in practice, Wiley-VCH Verlag- GmbH, Freiburg 44 Wittenmayer N., Jandrig B., Rothkegel M., Schlüter K., Arnold W., Haensch W., Scherneck S., Jockusch B M (2004), “Tumor Suppressor Activity of Profilin Requires a Functional Actin Binding Site”, Mol Biol Cell., 15(4), pp 1600-1608 45 World Health Organisation (2008), Global Cancer Facts & Figures, 2rd Edition, American Cancer Society Inc Công cụ World Wide Web 46 http://www.cancerstaging.org/staging/index.html (6/12/2012) 47 http://www.cancer.gov/cancertopics/pdq/treatment/colon/Patient/page2 (20/12/2012) 48 http://www.cancer.gov/dictionary (20/12/2012) 49 http://giangduongykhoa.wordpress.com/2009/02/22/ung-th%C6% (15/12/2012) 50 http://iwandahnial.wordpress.com/2010/11/16/understanding-colorectal-cancer (10/12/2012) 51 http://www.lesc.ic.ac.uk/projects/appp.html (12/12/2012) 52 http://www.medicinenet.com/colon_cancer/page2.htm (02/12/2012) 53 http://www.sinobiological.com/Cancer-Biomarker-a-835.html (10/12/2012) 54 http://www.timbacsy.com/tin-tuc-ung-thu-ung-th%C6%B0-d%E1%BA%A1i- tr %E1%BB%B1c-trang-co-di-truy%E1%BB%81n/ (15/12/2012) 55 http://ungthuvn.org/chude.aspx?id=406 (20/12/2012) 56 http://www.uniprot.org/ (25/12/2012) 57 http://www.webmd.com/digestive-disorders/picture-of-the-colon (25/05/2012) 71 Luận văn cao học Nguyễn Thị Ngọc Hà PHỤ LỤC DANH SÁCH BỆNH NHÂN UNG THƢ ĐẠI TRỰC TRÀNG ĐƢỢC SỬ DỤNG TRONG NGHIÊN CỨU TT Mã 8276 10597 10608 11781 10483 2903 3558 11812 4644 10 4841 i Luận văn cao học Nguyễn Thị Ngọc Hà PHỤ LỤC KẾT QUẢ NHẬN DIỆN PROTEIN BẰNG CƠ SỞ DỮ LIỆU NCBI SỬ DỤNG PHẦN MỀM MASCOT Mascot Search Results User Email Search title Database Taxonomy Timestamp Top Score Mascot Score Histogram Protein score is -10*Log(P), where P is the probability that the observed match is a random event Protein scores greater than 66 are significant (p