Sử dụng kỹ thuật fish để kểm tra sự hội nhập của gen IL 6 phân lập từ người trong tế bào gốc phôi gà chuyển gen

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN - Nguyễn Tiến Lung SỬ DỤNG KỸ THUẬT FISH ĐỂ KIỂM TRA SỰ HỘI NHẬP CỦA GEN IL–6 PHÂN LẬP TỪ NGƯỜI TRONG TẾ BÀO GỐC PHÔI GÀ CHUYỂN GEN Chuyên ngành: Sinh học Thực nghiệm Mã số: 60.42.0114 LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: TS Nguyễn Lai Thành Hà Nội – 2013 LỜI CẢM ƠN Đầu tiên, xin bày tỏ lịng kính trọng biết ơn sâu sắc đến cố GS.TS Nguyễn Mộng Hùng, ngun Trưởng phịng Cơng nghệ Tế bào Động vật – Trung tâm Nghiên cứu Khoa học Sự sống, người sáng lập nên phịng thí nghiệm nơi học tập làm việc năm năm qua Trong ngày tháng ỏi làm việc thầy, học hỏi nhiều điều, khơng kiến thức, thao tác thực thí nghiệm mà kiên trì, tìm tịi, chịu khó Thầy truyền cho niềm đam mê nghiên cứu công nghệ tế bào động vật, đặc biệt lĩnh vực công nghệ tế bào gốc Tôi xin chân thành cảm ơn TS Nguyễn Lai Thành, người thầy hướng dẫn tơi thực khóa luận tốt nghiệp Đại học luận văn cao học Thầy tận tình hướng dẫn, truyền đạt kiến thức kinh nghiệm làm việc giúp tơi hồn thành nghiên cứu Trong q trình làm việc, tơi ln nhận lời nhận xét, góp ý quý báu từ thầy để thực tốt nghiên cứu Khơng vậy, sống, tơi ln nhận giúp đỡ thầy Tôi xin cảm ơn tập thể cán bộ, học viên sinh viên phịng Cơng nghệ Tế bào Động vật, đặc biệt CN Đinh Duy Thành dẫn, giúp đỡ thời gian thực nghiên cứu Tôi xin bày tỏ lịng biết ơn tới thầy cơng tác môn Sinh học Tế bào thầy cô Khoa Sinh học truyền đạt cho tơi kiến thức sở để tơi thực luận văn vận dụng công việc sau Tôi xin chân thành cảm ơn tới Phịng thí nghiệm trọng điểm Cơng nghệ Enzyme Protein – trường ĐH Khoa học Tự nhiên, Viện Công nghệ Sinh học – Viện Hàn lâm Khoa học Công nghệ Việt Nam, Trung tâm Nghiên cứu Gia cầm Thụy Phương – Viện Chăn nuôi Quốc gia tạo điều kiện giúp đỡ tơi hồn thành luận văn Tôi xin gửi lời cảm ơn tới gia đình, bạn bè người thân quan tâm, động viên tinh thần suốt trình học tập thực luận văn tốt nghiệp Cuối cùng, nghiên cứu tơi thực dựa kinh phí hỗ trợ từ đề tài thuộc Trung tâm Nghiên cứu Châu Á, Đại học Quốc gia Hà Nội “Sử dụng kỹ thuật FISH để kiểm tra hội nhập gen IL–6 phân lập từ người tế bào gốc phôi gà chuyển gen” TS Nguyễn Lai Thành làm Chủ nhiệm đề tài Tôi xin chân thành cảm ơn Trung tâm Chủ nhiệm đề tài Hà Nội, tháng 12 năm 2013 Nguyễn Tiến Lung Luận văn thạc sĩ khoa học 2013 Mục lục MỤC LỤC MỞ ĐẦU Chương – TỔNG QUAN 1.1.CHUYỂN GEN Ở GÀ 1.1.1 Các phương thức chuyển gen vào tế bào 1.1.2 Các phương pháp tạo gà chuyển gen 1.1.3 Những ứng dụng gà chuyển gen 10 1.2.KỸ THUẬT LAI HUỲNH QUANG TẠI CHỖ (FISH) 12 1.2.1 Nguyên lý 12 1.2.2 Đầu dò cho phản ứng lai 13 1.2.3 Ưu điểm kỹ thuật FISH 18 1.2.4 Ứng dụng kỹ thuật FISH 19 1.3.INTERLEUKIN Ở NGƯỜI 22 1.3.1 Giới thiệu 22 1.3.2 Chức 23 1.3.3 Những ứng dụng lâm sàng 24 1.3.4 Gen mã hóa IL–6 người 25 Chương – PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 26 2.1.ĐỐI TƯỢNG, VẬT LIỆU VÀ HÓA CHẤT 26 2.1.1 Đối tượng – vật liệu nghiên cứu 26 2.1.2 Dụng cụ vật tư tiêu hao 29 2.1.3 Thiết bị nghiên cứu 29 2.1.4 Hoá chất sử dụng 30 2.2.PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 32 2.2.1 Tổng hợp đầu dò gắn huỳnh quang cho phản ứng lai FISH 32 2.2.2 Thu nhận tế bào gốc phôi gà chuyển gen IL–6 người 34 2.2.3 Phương pháp lai huỳnh quang chỗ (FISH) 38 Chương – KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 40 Nguyễn Tiến Lung i K20 Sinh học thực nghiệm Luận văn thạc sĩ khoa học 2013 Mục lục 3.1.TỔNG HỢP ĐẦU DÒ HUỲNH QUANG BẰNG PHƯƠNG PHÁP PCR 40 3.1.1 Thiết kế cặp mồi nhân đoạn gen IL – 640 3.1.2 Tối ưu hóa điều kiện phản ứng PCR 46 3.1.3 Kết tổng hợp đầu dò phản ứng PCR 49 3.2.THU NHẬN TẾ BÀO GỐC PHÔI GÀ CHUYỂN GEN IL–6 NGƯỜI 50 3.2.1 Phân lập nhân nuôi tế bào gốc phôi gà 3.2.2 Thu nhận trì tế bào gốc phơi gà chuyển gen 3.2.3 Kiểm tra có mặt gen chuyển tế bào phản ứng PCR 50 52 54 3.3 KẾT QUẢ LAI FISH PHÁT HIỆN GEN IL–6 TRONG cESCs 55 3.4.THẢO LUẬN 57 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 61 TÀI LIỆU THAM KHẢO 62 PHỤ LỤC A Nguyễn Tiến Lung ii K20 Sinh học thực nghiệm Luận văn thạc sĩ khoa học 2013 Danh mục hình minh họa DANH MỤC HÌNH MINH HỌA Hình Chu trình tái retrovirus cách thức sản xuất vector retrovirus Hình Mơ hình chuyển gen thơng qua trung gian tế bào gà Hình Quy trình kỹ thuật FISH 12 Hình Cấu trúc số chất đánh dấu huỳnh quang thường sử dụng 14 Hình Vị trí nhiễm sắc thể nhân tế bào kỳ trung gian 19 Hình Kiểu nhân phổ nhiễm sắc thể tủy xương bệnh nhân đa u tủy 21 Hình Một số ảnh hưởng IL–6 thể 23 Hình Cấu trúc vector pLenti6/V5–DEST Gateway (ViraPower) Invitrogen 27 Hình Sơ đồ bố trí thí nghiệm 32 Hình 10 Kết kiểm tra độ đặc hiệu cặp mồi với cADN gen IL–6 42 Hình 11 Kết xác định vị trí tương đồng cADN mARN gen IL–6 43 Hình 12 Kết kiểm tra vị trí chèn gen IL–6 vector 44 Hình 13 Kết kiểm tra vị trí bắt cặp đầu dò vector 45 Hình 14 Kết kiểm tra khả bắt cặp đầu dò với hệ gen gà BLASTn 46 Hình 15 Biểu đồ ảnh hưởng nhiệt độ gắn mồi nồng độ ion Mg 2+ tới hiệu suất phản ứng PCR 47 Hình 16 Kết giải trình tự nucleotide sản phẩm PCR so sánh với trình tự đầu dò theo lý thuyết 48 Hình 17 Kết điện di sản phẩm PCR tổng hợp đầu dò 49 Hình 18 cESCs 24 nuôi cấy in vitro sau phân lập 51 Hình 19 cESCs ni cấy lớp tế bào nuôi 52 Hình 20 Đánh giá ảnh hưởng lentivirus tới sinh trưởng cESCs 53 Hình 21 Kết phân tích PCR mẫu tế bào chuyển gen 54 Hình 22 Kết phân tích PCR mẫu tế bào qua lần cấy chuyển 55 Hình 23 Kết lai FISH tế bào gốc phôi gà chuyển gen IL–6 người .56 Nguyễn Tiến Lung iii K20 Sinh học thực nghiệm Luận văn thạc sĩ khoa học 2013 Danh mục bảng DANH MỤC BẢNG Bảng Một số chất đánh dấu huỳnh quang thuốc nhuộm sử dụng FISH 15 Bảng Vai trò số yếu tố vector pLenti6/V5–DEST Gateway 28 Bảng Dụng cụ vật tư tiêu hao sử dụng đề tài 29 Bảng Các thiết bị nghiên cứu sử dụng đề tài 29 Bảng Các hóa chất sử dụng đề tài 30 Bảng Thành phần phản ứng PCR tối ưu hóa điều kiện tổng hợp mồi IL–6 33 Bảng Thành phần môi trường nuôi cấy cESCs 35 Bảng Thành phẩn phản ứng PCR phát gen chuyển tế bào 37 Bảng Kết thiết kế cặp mồi sử dụng chương trình Primer3 41 Nguyễn Tiến Lung K20 Sinh học thực nghiệm iv Luận văn thạc sĩ khoa học 2013 Bảng ký hiệu chữ viết tắt BẢNG KÝ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT Từ viết tắt Viết đầy đủ ADN Acid deoxyribonucleic ARN Acid ribonucleic BLAST Basic Local Alignment Search Tool BSA Bovine serum albumin cESCs Chicken Embryonic Stem Cells cADN Complementary ADN CMV Cytomegalovirus DAPI 4',6–diamidino–2–phenylindole DIG Digoxigenin DNase Deoxyribonuclease EDTA Ethylenediaminetetraacetic acid FBS Fetal Bovine Serum FISH Fluorescence in situ hybridization HIV Human Immunodeficiency Virus IL–6 Interleukin – LTR Long Terminal Repeats NCBI National Center for Biotechnology Information PBS Phosphate Buffered Saline PCR Polymerase Chain Reaction PGCs Primordial germ cells RNase Ribonuclease SDS Sodium dodecyl sulfate SSC Saline – sodium citrate buffer SSCs Spermatogonial Stem Cells Ta Annealing template Tm Melting temperature Nguyễn Tiến Lung v K20 Sinh học thực nghiệm Luận văn thạc sĩ khoa học 2013 Mở đầu MỞ ĐẦU Sử dụng động vật chuyển gen để sản xuất loại protein dược phẩm hướng quan tâm từ lâu Trong lĩnh vực này, gia cầm chuyển gen ý đến với số lợi vượt trội so với động vật có vú thời gian tạo dịng ngắn, trứng có mơi trường vơ trùng tự nhiên, thành phần protein lịng trắng trứng đơn giản nên dễ tách sản phẩm chuyển gen,… Tính đến nay, nhiều protein dược phẩm tái tổ hợp người nghiên cứu tạo từ gà chuyển gen, số sản phẩm bước vào giai đoạn thử nghiệm kháng thể đơn dòng miR24 điều trị khối u ác tính, interferon β–1a chữa trị đa xơ cứng interferon α–2a có thuốc Roferon A chữa viêm gan C, ung thư máu Những nghiên cứu gà chuyển gen gần tập trung chủ yếu vào phương pháp thông qua tế bào gốc phôi, với ưu điểm lựa chọn từ đầu tế bào mang gen chuyển mong muốn trước tiêm chúng vào phơi nhận, tiết kiệm thời gian chi phí cho q trình sàng lọc thể chuyển gen từ bố mẹ khảm Để tạo động vật chuyển gen hiệu cần phải có hệ thống vector đủ mạnh để chuyển gen mong muốn với hiệu suất cao, trì ổn định thể vật chủ Hệ thống sử dụng thường xuyên dựa vào retrovirus (virus ARN) sử dụng enzyme thân máy phiên mã tế bào chủ để chép hệ gen chúng, sau tích hợp vào nhiễm sắc thể vật chủ trình phân bào Gần đây, nhóm nhỏ retrovirus lentivirus coi công cụ hứa hẹn chuyển gen Chúng mang đầy đủ ưu điểm retrovirus, cịn có khả chèn gen vào tế bào không phân chia, loại vector đặc biệt hiệu tế bào gốc phôi loại tế bào khó chuyển gen phương pháp khác Trong trình tạo động vật chuyển gen, bước sàng lọc tế bào hay thể mang gen mong muốn đóng vai trị quan trọng Gen chuyển cần cài vào ADN nhân tế bào để đảm bảo di truyền cho hệ sau qua đường sinh sản hữu tính, đồng thời phải trì bền vững qua nhiều hệ động vật Ngoài ra, Nguyễn Tiến Lung K20 Sinh học thực nghiệm Luận văn thạc sĩ khoa học 2013 Mở đầu gen chuyển phải nằm vị trí thích hợp: vùng ADN hoạt động, không chèn vào gen cấu trúc hay vùng ADN giữ chức điều hòa, Vì vậy, kỹ thuật nhằm xác định vị trí gen nhiễm sắc thể phát triển, số tốn dễ thực kỹ thuật lai huỳnh quang chỗ (fluorescence in situ hybridization – FISH) Cơ sở kỹ thuật FISH dựa bắt cặp xác giữa ADN đích đầu dị đánh dấu huỳnh quang có trình tự tương đồng Đây kỹ thuật sử dụng phổ biến sinh học phân tử chẩn đoán nhằm phát bất thường nhiễm sắc thể, nghiên cứu cấu trúc chức tế bào, lập đồ kiểu nhân, xây dựng hệ thống phát sinh lồi, Có thể nói FISH cầu nối lĩnh vực di truyền học cổ điển với di truyền học đại, kết hợp xác kỹ thuật di truyền phân tử quan sát trực quan từ kính hiển vi Ở Việt Nam, số bệnh viện lớn Bệnh viện K, Bệnh viện Trung ương Quân đội 108, Bệnh viên Nhi Trung ương, sử dụng kỹ thuật để chẩn đoán số bệnh di truyền người Tuy nhiên nghiên cứu bản, việc ứng dụng cịn hạn chế Đến nay, chưa có báo cáo việc sử dụng để đánh giá chèn gen ngoại lai vào hệ gen tế bào động vật Mặt khác, nghiên cứu trên, đầu dò sử dụng sản phẩm thương mại, tự thiết kế đặt tổng hợp hãng tiếng, chưa tự tổng hợp phịng thí nghiệm sử dụng chúng Vì vậy, nghiên cứu thực nhằm đánh giá tiềm ứng dụng vector chuyển gen lentivirus tế bào gốc phôi gà, sử dụng kỹ thuật FISH để phát vị trí gen chuyển IL–6 tế bào gốc phơi gà chuyển gen, từ tạo tiền đề cho việc tạo gà chuyển gen thông qua tế bào gốc Nghiên cứu góp phần phát triển kỹ thuật FISH nghiên cứu Việt Nam Nguyễn Tiến Lung K20 Sinh học thực nghiệm Luận văn thạc sĩ khoa học 2013 Phụ lục Phụ lục Kết giải trình tự sản phẩm PCR tổng hợp số điều kiện phản ứng khác Ta = 45,9oC; Mg2+ 1,75 mM Ta = 45,9oC; Mg2+ 3,25 mM Ta = 49,3oC; Mg2+ 1,75 mM Ta = 49,3oC; Mg2+ 3,25 mM Nguyễn Tiến Lung K20 Sinh học thực nghiệm B Luận văn thạc sĩ khoa học 2013 Phụ lục Ta = 45,9oC; Mg2+ 1,75 mM Ta = 45,9oC; Mg2+ 3,25 mM Ta = 49,3oC; Mg2+ 1,75 mM Ta = 49,3oC; Mg2+ 3,25 mM Nguyễn Tiến Lung K20 Sinh học thực nghiệm C Luận văn thạc sĩ khoa học 2013 Phụ lục Ta = 45,9oC; Mg2+ 1,75 mM Ta = 45,9oC; Mg2+ 3,25 mM Ta = 49,3oC; Mg2+ 1,75 mM Ta = 49,3oC; Mg2+ 3,25 mM Nguyễn Tiến Lung K20 Sinh học thực nghiệm D Luận văn thạc sĩ khoa học 2013 Phụ lục Ta = 45,9oC; Mg2+ 1,75 mM Ta = 45,9oC; Mg2+ 3,25 mM Ta = 49,3oC; Mg2+ 1,75 mM Ta = 49,3oC; Mg2+ 3,25 mM Nguyễn Tiến Lung K20 Sinh học thực nghiệm E Luận văn thạc sĩ khoa học 2013 Phụ lục Phụ lục Các cơng trình cơng bố có liên quan đến luận văn – Nguyễn Tiến Lung, Nguyễn Lai Thành (2012), “Thử nghiệm chuyển gen IL-6 người lentivirus vào tế bào gốc phơi gà”, Tạp chí Khoa học Công nghệ Viện Khoa học Công nghệ Việt Nam, Tập 50, Số 3C, trang 401–406 – Nguyễn Tiến Lung, Hoàng Thị Xoan, Nguyễn Lai Thành (2013), “Tổng hợp đầu dò gắn huỳnh quang phục vụ lai FISH sử dụng kỹ thuật DOP–PCR”, Tuyển tập Báo cáo khoa học Hội nghị Khoa học Cơng nghệ Sinh học Tồn quốc 2013, Quyển 1, trang 668–671 Nguyễn Tiến Lung K20 Sinh học thực nghiệm F Tạp chí Khoa học Công nghệ 50 (3C) (2012) 401–406 THỬ NGHIỆM CHUYỂN GEN IL-6 NGƯỜI BẰNG LENTIVIRUS VÀO TẾ BÀO GỐC PHÔI GÀ Nguyễn Tiến Lung*, Nguyễn Lai Thành Khoa Sinh học, Trường Đại học Khoa học Tự Nhiên, Đại học Quốc gia Hà Nội * Email: lungnt@gmail.com Đến Tòa soạn: 15/7/2012; Chấp nhận đăng: 1/11/2012 TĨM TẮT Gà chuyển gen có triển vọng lớn việc sản xuất protein tái tổ hợp Những phương pháp tạo gia cầm chuyển gen tập trung vào hướng thông qua tế bào gốc phôi Trong nghiên cứu này, mô tả tóm tắt phương pháp phân lập, nhân ni in vitro tế bào gốc phôi gà, chuyển nhiễm gen mã hóa interleukin (IL–6) phân lập từ người vào tế bào thông qua vector lentivirus vi tiêm tế bào nhận gen chuyển vào phôi gà ấp để tạo gà khảm mang tế bào chuyển gen Kết cho thấy vector lentivirus có khả chuyển gen vào tế bào gốc phôi gà cho hiệu cao ổn định Gen chuyển phát mẫu ADN tách từ ruột gà thu nhận Kết cho thấy tính khả thi việc ứng dụng tạo gà chuyển gen thông qua tế bào gốc Việt Nam Từ khóa Gà chuyển gen, tế bào gốc phơi, vector lentivirus, interleukin MỞ ĐẦU Interleukin (IL–6) protein điều hòa miễn dịch thuộc họ hematopoietin Trong thể, IL–6 có nhiều chức khác đặc trưng tiết tế bào khác điều kiện riêng biệt kích thích hệ thống miễn dịch đáp ứng lại tổn thương, kích thích hình thành xương, đóng vai trị quan trọng tạo máu hình thành tế bào máu, đóng vai trị nhân tố sinh trưởng tế bào lai sản xuất kháng thể, tế bào đa u tủy, [1, 2] Do đó, từ lâu IL–6 ứng dụng điều trị lâm sàng bệnh viêm khớp dạng thấp, viêm gan tự miễn, số bênh máu, [2, 3] Nhằm sản xuất IL–6 nói riêng nhiều loại protein tái tổ hợp nói chung, phương pháp ý đến thông qua động vật chuyển gen Đặc biệt, gà chuyển gen có lợi hẳn so với lồi động vật khác: thời gian tạo dòng, thành phần protein lòng trắng trứng đơn giản nên dễ tách chiết sản phẩm, trứng có môi trường vô trùng tự nhiên,… [4, 5] Những nghiên cứu gần tập trung chủ yếu vào phương pháp chuyển gen thông qua tế bào gốc phôi gà (chicken Embryonic Stem Cells – cESC) cESC tế bào đa tiềm khơng biệt hóa, có khả tăng sinh vô hạn nuôi cấy in vitro đặt vào điều kiện thích hợp biệt hóa thành tất tế bào chuyên hóa thể, có giao tử [6, 7] Nguyễn Tiến Lung, Nguyễn Lai Thành Phương pháp tạo gia cầm chuyển gen thông qua tế bào gốc có ưu điểm lựa chọn từ đầu tế bào mang gen chuyển mong muốn trước tiêm chúng vào phơi nhận, tiết kiệm thời gian chi phí cho q trình sàng lọc thể chuyển gen từ bố mẹ khảm [8] PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Phương pháp phân lập nuôi cấy cESC cESC phân lập từ đĩa phôi ấp theo mô tả Horiuchi cộng [9] Tế bào nuôi đĩa đường kính 35mm (Corning) phủ gelatin với mật độ khoảng 5x10 tế bào / cm2 Môi trường nuôi cấy cESC bao gồm Opti–MEM® (Gibco) bổ sung 10% thể tích FBS (Gibco), 1mM sodium pyruvate (Gibco), 100μM non–essential amino acid (Gibco), 2000U/ml LIF (Sigma), 45mM sodium bicarbonate (Sigma), 100U/ml Penicillin, 100 μg/ml Streptomycin (Gibco), 100μM β–mercaptoethanol (Gibco) 2.2 Phương pháp chuyển gen sử dụng vector lentivirus Vector lentivirus pLenti6/V5–DEST (Gateway) chèn gen IL–6 sử dụng làm vector chuyển gen thí nghiệm Khi cESC sinh trưởng đạt khoảng 80–90% bề mặt đĩa nuôi cấy, cESC thu nhận cách xử lý với Trypsin 0,25%/EDTA 0,025% (Sigma) ly tâm 200g 15 phút Loại bỏ dịch nổi, huyền phù hóa tế bào Opti–MEM® cho đạt nồng độ 0,5x106 tế bào/ml Huyền phù tế bào ủ hạt virus (trung bình 20 virus/tế bào) 370C 15 phút, sau ly tâm 800g 30 phút Tế bào huyền phù hóa mơi trường ni cấy, chuyển vào đĩa đường kính 35mm (Corning) với mật độ khoảng 5x104 tế bào/cm2 nuôi tủ ấm 370C, 5% CO2, độ ẩm 90% 2.3 Phương pháp mở cửa sổ vi tiêm tế bào gốc vào đĩa phôi ấp Qua lần cấy chuyển, phần tế bào thu nhận để kiểm tra có mặt gen chuyển phản ứng PCR Những mẫu tế bào dương tính phản ứng PCR thu nhận để vi tiêm vào đĩa phôi ấp Phương pháp mở cửa sổ vi tiêm tế bào gốc vào đĩa phôi ấp thực theo quy trình thiết lập tác giả Nguyễn Mộng Hùng (2005) Nguyễn Thị Hồng Hạnh (2010) [10, 11] Mỗi phơi tiêm vào thể tích 2μl huyền phù tế bào với nồng độ 150 – 250 tế bào/µl Sau vi tiêm, cửa sổ đậy lại lớp màng chuẩn bị từ vỏ trứng dán kín keo Duco Trứng sau vi tiêm ấp điều kiện nhiệt độ 37–38oC, độ ẩm 55%–75%, thường xuyên kiểm tra phát triển phôi 2.4 Phương pháp phát gen chuyển phản ứng PCR Các mẫu cần kiểm tra tách chiết ADN hệ gen DNA Isolation Kit for Cells and Tissues (Roche) Sản phẩm tách chiết phân tích PCR để kiểm tra có mặt gen chuyển IL– cặp mồi đặc hiệu nhân đoạn ADN 630bp (mồi xuôi IL6F: 5’– CACCTAGCTAGCGCC GCCACCATGAACTCCTTCTCCACAAGCG–3’; mồi ngược IL6R: 5’–CTCGAGGAATTC TCACAACATTTGCCGAAGAGCCC–3’) Cặp mồi khuếch đại đoạn ADN 321bp gen ribosome 18S sử dụng nhằm chứng minh diện ADN hệ gen gà mẫu thí nghiệm (mồi xi 18SFor 5’–GTCGGCGTCCAACTTCTT–3’; mồi 402 Thử nghiệm chuyển gen IL–6 người lentivirus vào tế bào gốc phôi gà ngược 18SRev 5’–CGATCCGAGGACCTCACT–3’) Sản phẩm PCR điện di gel agarose 1%, nhuộm Ethidium bromide (Invitrogen) nồng độ g/ml phân tích kết KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1 Phân lập nuôi cấy cESC Sau 24 phân lập nuôi cấy, cESC thực bám dính vào đáy đĩa ni cấy, kết hợp với thành quần lạc cESC với đặc điểm hình thái đặc trưng: tế bào trịn, nhân lớn, nhân chiếm hầu hết tế bào chất, tế bào liên kết với lỏng lẻo (Hình 24A) Yếu tố quan trọng việc trì cESC in vitro mà giữ đặc tính đa tiềm có mặt lớp tế bào nuôi [8, 12] Khi nuôi cấy lớp tế bào nuôi nguyên bào sợi thai chuột bất hoạt phân bào, cESC có xu hướng xâm lấn xuống lớp tế bào nuôi bám trực tiếp vào bề mặt đĩa ni cấy (Hình 24B) Những kết tương đồng với nghiên cứu công bố trước giới Việt Nam [8, 13, 14] Hình 24 cESC nuôi cấy in vitro (A) cESC 24 sau phân lập nuôi cấy chất gelatin; (B) Quần lạc cESC sinh trưởng lớp tế bào nuôi (10x32) 3.2 Kiểm tra có mặt gen chuyển hệ gen cESC Sau chuyển nhiễm, trình cấy chuyển, phần tế bào thu nhận tách chiết ADN hệ gen để thực phản ứng PCR nhằm kiểm tra có mặt gen chuyển IL– Trong nghiên cứu sử dụng cặp mồi đặc hiệu để khuếch đại đoạn ADN có kích thước 630bp gen chuyển IL–6 321bp gen ribosome 18S Kết điện di sản phẩm PCR thể Hình 25 Gen chuyển phát tất mẫu tế bào lây nhiễm với vector lentivirus Mặt khác, để kiểm tra gen chuyển có trì ổn định qua hệ tế bào hay không, qua lần cấy chuyển cESC, tiến hành thu tế bào để tách chiết DNA phân tích PCR Kết kiểm tra cho thấy, sau 20 ngày nuôi cấy với lần cấy chuyển, gen chuyển trì ổn định hệ gen cESC Những kết bước đầu chứng minh vector có nguồn gốc lentivirus có khả chuyển gen vào cESC với hiệu cao ổn định Điều có ý nghĩa nghiên cứu Pain cộng rằng, cESC có khả nhận gen chuyển khó khăn nhiều so với tế bào biệt hóa [8] 403 Nguyễn Tiến Lung, Nguyễn Lai Thành Hình 25 Kết phân tích PCR với cESC chuyển gen (–) : Đối chứng âm; (18S) Mẫu đối chứng 18S (321bp); (+) Đối chứng dương; (M) Thang chuẩn 0,5– 4,6kb; (ĐC) Mẫu tế bào đối chứng không chuyển nhiễm; (E1101, E1102, E1203) Các mẫu tế bào chuyển nhiễm; (E1808: F1, F2, F3) Mẫu tế bào E1203 trải qua lần cấy chuyển 3.3 Kết vi tiêm tế bào gốc nhận gen vào đĩa phôi gà chưa ấp Vị trí lựa chọn vi tiêm vùng mờ đĩa phơi [11] Qua lần thí nghiệm, có 90 trứng vi tiêm, tỷ lệ phôi phát triển không cao, đặc biệt phôi bị chết giai đoạn sớm nhiều (lên tới 60%), nguyên nhân phơi bị tổn thương nhiễm khuẩn q trình thao tác; phơi nhạy cảm với tác động bên ngồi, tế bào gốc phơi sau q trình ni cấy in vitro lây nhiễm virus gây nên biệt hóa bất thường hội nhập vào phôi nhận, làm phôi chết sớm Kết thúc đợt thí nghiệm, có gà nở ra, đạt tỷ lệ 10% Hình 26 Kết phân tích PCR mẫu mơ gà G1–ES2509 chuyển gen thơng qua tế bào gốc phôi (–) : Đối chứng âm khơng có ADN khn; (ĐC) Mẫu đối chứng khơng tiêm; (+) Đối chứng dương plasmid mang gen IL-6; (M) Thang chuẩn 0,5–4,6kb; (18S) Sản phẩm khuếch đại đoạn gen ribosome 18S (321bp); (IL6) Sản phẩm khuếch đại đoạn gen IL–6 (630bp) Các gà nở lấy phần mô, quan khác để tách chiết ADN hệ gen làm khuôn cho phản ứng PCR nhằm kiểm tra có mặt gen IL-6 người Kết điện di sản phẩm PCR mẫu mô thu từ gà G1–ES2509 chuyển gen qua tế bào gốc phơi thể Hình Gen chuyển IL–6 phát mẫu ruột mà không tìm thấy mơ 404 Thử nghiệm chuyển gen IL–6 người lentivirus vào tế bào gốc phôi gà khác Đối với gà nở từ phôi vi tiêm cịn lại, khơng có mẫu xuất băng IL– người Hiệu thu thấp cho thấy khả hội nhập cESC mang gen chuyển vào phôi nhận hạn chế, nguyên nhân vector lentivirus có ảnh hưởng lớn tới việc trì trạng thái đa tiềm cESC mà khơng biểu mặt hình thái q trình ni cấy in vitro, gen chuyển cài ngẫu nhiên vào vị trí gen hoạt động, ảnh hưởng tới sức sống cESC Mặc dù kết thu cịn hạn chế song cho thấy tính khả thi phương pháp tạo gà chuyển gen thông qua tế bào gốc KẾT LUẬN Vector lentivirus chuyển nhiễm vào tế bào gốc phơi gà nuôi cấy Gen chuyển IL–6 phân lập từ người xâm nhập vào hệ gen tế bào gà tồn bền vững qua lần phân bào Một lợi thấy rõ ràng vector lentivirus sử dụng để chuyển gen không gây ảnh hưởng nhiều tới sức sống tế bào sau chuyển nhiễm với vector Tế bào gốc phôi gà chuyển gen mang gen IL–6 người chuyển vào đĩa phơi nhận có khả tạo khảm gà tỷ lệ thấp Lời cảm ơn Kết nghiên cứu hồn thành với hỗ trợ kinh phí từ đề tài cấp Nhà nước KC.04.04/06–10 Quỹ hỗ trợ nghiên cứu Châu Á, Đại học Quốc gia Hà nội Chúng xin chân thành cảm ơn cố GS.TS Nguyễn Mộng Hùng, người đầu hướng nghiên cứu tạo động vật chuyển gen Việt Nam, người xây dựng nên đề tài nghiên cứu Chúng tơi xin cảm ơn Phịng Cơng nghệ tế bào động vật, Viện Công nghệ Sinh học, Viện khoa học Việt nam cung cấp lentivirus cho trình nghiên cứu TÀI LIỆU THAM KHẢO Kishimoto T – IL-6: from its discovery to clinical applications, International Immunology 22(5) (2010) 347-352 Sehgal P B – Interleukin-6: Molecular Pathophysiology, J Investig Dermatol 94(s6) (1990) 2s6s Suganami Y., Kawashima H., Hasegawa D., Sato S., and Hoshika A – Clinical application of rapid assay of serum interleukin-6 in Kawasaki disease., Pediatrics International 50(2) (2008) 264-266 Harvey A J., and Ivarie R – Validating the hen as a bioreactor for the production of exogenous proteins in egg white, Poultry Science 82(6) (2003) 927-930 Lillico S G., Mcgrew M J., Sherman A., and Sang H M – Transgenic chickens as bioreactors for protein–based drugs, Drug Discovery Today 10(3) (2005) 191-196 Kirschstein R., and Skirboll L.R – Stem cells: Scientific progress and future research directions, The National Institutes of Health, US Department of Health and Human Services, 2001 Macdonald J., Glover J D., Taylor L., Sang H M., and McGrew M J – Characterisation and germline transmission of cultured avian primordial germ cells, PLoS ONE 5(11) (2010) e15518 Pain B., Chenevier P., and Samarut J – Chicken embryonic stem cells and transgenic strategies, Cells Tissues Organs 165(3–4) (1999) 212-219 405 Nguyễn Tiến Lung, Nguyễn Lai Thành Horiuchi H., Furusawa S., and Matsuda H – “Maintenance of chicken embryonic stem cells in vitro”, in Embryonic stem cell protocols – Volume 1: Isolation and characterization, Humana Press, New York, USA, 2006, pp 17-34 10 Nguyễn Mộng Hùng, Chu Văn Trung, Hà Minh Tiệp, Bùi Việt Anh, Phùng Đức Tiến, Bạch Thị Thanh Dân, Phạm Nguyệt Hằng, Nguyễn Duy Điều – Tạo gà ác tiềm khảm Lương Phượng vi tiêm tế bào gốc phơi, Tạp chí Khoa học ĐHQGHN: Khoa học Tự nhiên Công nghệ (2005), 1-4 11 Nguyễn Thị Hồng Hạnh, Nguyễn Lai Thành, Nguyễn Duy Điều, Thân Thị Trang Uyên, Lê Thị Tuyết, Thân Thị Linh Quyên – Thử nghiệm chuyển gen EGFP gà (Gallus gallus domesticus) sử dụng vector pT2/BH-CVpf-SB11 phương pháp vi tiêm vào phơi gà ấp, Tạp chí Khoa học ĐHQGHN: Khoa học Tự nhiên Công nghệ 26(2S) (2010) 124-131 12 Lavial F., Montillet G., Bachelard E., Samarut J., and Pain B – Chicken stem cells as a model to generate transgenic chicken: present and perspectives, The Journal of Poultry Science 43(4) (2006) 313-322 13 Petitte J N., Liu G., and Yang Z – Avian pluripotent stem cells, Mechanisms of Development 121(9) (2004) 1159-1168 14 Nguyễn Mộng Hùng, Chu Văn Trung, Bùi Việt Anh, Phan Ngọc Quang, Vũ Minh Đức, Hà Minh Tiệp, Thân Thị Trang Uyên, Nguyễn Hồng Thịnh – Ni cấy tế bào gốc phơi gà (Gallus gallus domesticus) in vitro, Những vấn đề nghiên cứu sống định hướng sinh-y học, Tuyển tập Báo cáo Khoa học, NXB Khoa học Kỹ thuật Hà Nội, 2004, tr 235-238 ABTRACT TRANSFOMATION OF HUMAN IL-6 GENE TO CHICKEN EMBRYONIC STEM CELLS USING LENTIVIRUS VECTOR Production of recombinant proteins in chicken egg has the great promise in medical applications Currently, the method of creating transgenic poultry has been mainly based on embryonic stem cells In this study, we transfer genes encoding interleukin (IL-6) isolated from humans in to in vitro embryonic stem cells by using lentivirus vector The IL-6 genescreened embryonic stem cells were injected into recipient embryos at h incubation to generate chimeric chickens carrying the transgenic cells The results show that lentivirus vector capable of transferring genes into chicken embryonic stem cells for high efficiency and stability One of nine obtained chicken was determined with the presence of transgenic IL-6 gene in the intestines Keywords: Transgenic chicken, embryonic stem cell, lentivirus vector, interleukin 406 HỘI NGHỊ KHOA HỌC CÔNG NGHỆ SINH HỌC TỒN QUỐC 2013 TỔNG HỢP ĐẦU DỊ GẮN HUỲNH QUANG PHỤC VỤ LAI FISH SỬ DỤNG KỸ THUẬT DOP–PCR Nguyễn Tiến Lung, Hoàng Thị Xoan, Nguyễn Lai Thành Trường Đại học Khoa học Tự Nhiên, Đại học Quốc gia Hà Nội TÓM TẮT Lai huỳnh quang chỗ (FISH) kỹ thuật di truyền tế bào sử dụng để phát xác định vị trí trình tự ADN cụ thể tế bào FISH sử dụng đầu dò gắn huỳnh quang liên kết với vị trí đặc hiệu nhiễm sắc thể tế bào đích Trong nghiên cứu chúng tơi thiết kế mồi chuẩn hóa điều kiện phản ứng DOP–PCR để tổng hợp đầu dò gắn Alexa 568 đặc hiệu với gen interleukin–6 người Đầu dò tổng hợp với cường độ tín hiệu quỳnh quang cao, đồng thời bước đầu sử dụng để phát gen tương ứng tế bào gốc phôi gà chuyển gen Kết nghiên cứu góp phần phát triển việc ứng dụng kỹ thuật FISH nghiên cứu ứng dụng Việt Nam Từ khóa: lai huỳnh quang chỗ (FISH), đầu dò gắn huỳnh quang, DOP–PCR MỞ ĐẦU Lai huỳnh quang chỗ (Fluorescence In Situ Hybryzation – FISH) phương pháp lai ADN sử dụng phổ biến Trong phản ứng FISH, đầu dị đặc hiệu với trình tự đích đánh dấu chất phát huỳnh quang, phân tích kính hiển vi huỳnh quang, cho phép phát xác định vị trí gen đích mẫu nghiên cứu Kỹ thuật sử dụng phổ biến sinh học phân tử chẩn đoán điều trị nhằm phát bất thường nhiễm sắc thể, nghiên cứu khối u, lập đồ kiểu nhân, xây dựng hệ thống phát sinh lồi, Có thể nói FISH cầu nối lĩnh vực di truyền học cổ điển với di truyền học đại, kết hợp xác kỹ thuật di truyền phân tử quan sát trực quan kính hiển vi (Bishop, 2010; Wolman, 1997) Ở Việt Nam nay, số bệnh viện lớn Bệnh viện K, Bệnh viện Trung ương Quân đội 108, Bệnh viên Nhi Trung ương, sử dụng FISH để chẩn đoán số bệnh di truyền người (Đặng Thị Hồng Nhung, Nguyễn Duy Ngọc, 2008; Nguyễn Thị Tân Sinh et al, 2011) Tuy nhiên, nghiên cứu bản, việc ứng dụng cịn hạn chế Đến nay, chưa có báo cáo việc sử dụng phương pháp để đánh giá chèn gen ngoại lai vào hệ gen tế bào động vật Mặt khác, nghiên cứu trên, đầu dò sử dụng sản phẩm thương mại, tự thiết kế đặt tổng hợp hãng tiếng, chưa tự tổng hợp phòng thí nghiệm sử dụng chúng (Đặng Thị Hồng Nhung, Nguyễn Duy Ngọc, 2008; Nguyễn Thị Tân Sinh et al, 2011; Nguyễn Văn Nguyên et al, 2011) Trước đây, tiến hành chuyển gen mã hóa interleukin–6 (IL–6) vào tế bào gốc phôi gà thông qua vector chuyển gen pL6/IL6 (dựa vector pLenti6/V5–DEST (Gateway), chèn thêm gen IL–6), gen chuyển phát tế bào phản ứng PCR Tuy nhiên tiêm tế bào vào phôi nhận, hiệu thu không cao, nguyên nhân gen chuyển chèn vào vị trí gen hoạt động tế bào, từ gây nên biến động bất thường làm tế bào hội nhập vào phôi nhận phôi bị chết (Nguyễn Tiến Lung, Nguyễn Lai Thành, 2012) Vì việc xác định vị trí chèn gen ngoại lai nhiễm sắc thể tế bào, từ dự đoán ảnh hưởng chúng việc làm cần thiết Nghiên cứu tập trung theo hướng tổng hợp đầu dò đặc hiệu gen IL–6 người phòng thí nghiệm làm nguyên liệu cho phản ứng lai VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU Thiết kế cặp mồi để tổng hợp đầu dò đặc hiệu gen IL–6 người Các cặp mồi tổng hợp đầu dị (kích thước khoảng 300bp) đặc hiệu gen IL–6 người thiết kế dựa trình tự cDNA chương trình thiết kế mồi Primer3 Cặp mồi (IL6–F IL6–R) có thơng số phù hợp kiểm tra khả tổng hợp với vector chuyển gen ADN hệ gen tế bào chủ (hệ gen gà Gallus gallus domesticus) công cụ tìm kiếm BLAST sở liệu NCBI Sau kiểm tra, cặp mồi đặt tổng hợp hãng BioBasic Tối ưu hóa điều kiện phản ứng PCR tổng hợp đầu dò 2+ Trong nghiên cứu này, hai điều kiện chuẩn hóa nhiệt độ bắt cặp mồi nồng độ Mg phản ứng (nồng độ 2+ Mg cao, nhiệt độ bắt cặp thấp tăng hiệu suất PCR làm giảm độ đặc hiệu) Nồng độ chất phản ứng PCR bao gồm: dNTP 0,15 mM loại; mồi IL6–F IL6–R 0,5 mM loại; 0,1 U/µl Taq DNA polymerase; PCR buffer 1X (khơng chứa MgCl2); 0,3 ng/µl khuôn (vector pL6/IL6); MgCl dải nồng độ 1–4 mM Chu kỳ o o nhiệt phản ứng PCR: 94 C phút trước chu kỳ đầu tiên; 35 chu kỳ: biến tính 94 C 30 giây, gắn mồi với o o o gradient nhiệt độ 45–55 C 30 giây, tổng hợp 72 C 30 giây; 72 C phút sau chu kỳ cuối Sản phẩm điện di gel agarose 1,5% nhuộm ethidium bromide 2µg/ml để đánh giá hàm lượng ADN tổng hợp Ngoài ra, mẫu sản phẩm giải trình tự hệ thống máy ABI 3130 Sequencer nhằm đánh giá mức độ tương đồng sản phẩm tổng hợp với trình tự đầu dị theo thiết kế Tổng hợp đầu dò phản ứng DOP–PCR 2+ Thành phần phản ứng PCR tương tự trên, nồng độ Mg chuẩn hóa, nồng độ dTTP giảm xuống 0,05 mM, bổ sung Alexa 568–5–dUTP (Invitrogen) 1mM cho nồng độ cuối 0,10 mM Chu kỳ nhiệt phản ứng o o DOP–PCR: 94 C phút trước chu kỳ đầu tiên; 35 chu kỳ: biến tính 94 C 30 giây, gắn mồi theo nhiệt độ tối o o ưu 60 giây, tổng hợp 72 C 60 giây tăng thêm giây sau chu kỳ; 72 C phút sau chu kỳ cuối Sản phẩm tổng hợp tinh để sử dụng cho phản ứng lai FISH Đánh giá khả lai đầu dò Đệm lai chứa đầu dò chuẩn bị với thành phần có nồng độ sau: 0,5–1,5 ng/µl đầu dị; formamide 50%; 668 HỘI NGHỊ KHOA HỌC CƠNG NGHỆ SINH HỌC TOÀN QUỐC 2013 SDS 0,1%; 300 ng/ml ADN tinh trùng cá; pha SSC 2X (NaCl 300 mM; sodium citrate 30 mM) Tế bào gốc phôi gà o chuyển gen IL–6 gắn lên lam, xử lý qua RNase trypsin, sau ủ 10µl đệm lai, biến tính 70 C 10 o o phút lai 65 C qua đêm (ít 12 giờ) Sau lai, tiêu hạ từ từ nhiệt độ xuống 37 C, rửa qua formamide 20%/SSC 0,1X SSC 2x, tiếp tục ủ đệm phát (BSA 5%; Tween 20 nồng độ 0,2%; pha SSC 4X) 30 phút Các mẫu nhuộm DAPI µg/ml 10 phút trước phân tích hệ thống hiển vi huỳnh quang Axiovert 100M Confocal LSM (Zeiss) KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN Kết thiết kế cặp mồi đặc hiệu cho gen IL–6 người Sử dụng chương trình Primer3, dựa trình tự cDNA gen IL–6, thiết kế cặp mồi với sản phẩm tương ứng có kích thước 288–336 bp sử dụng làm đầu dị, cặp mồi có chất lượng tốt theo kết xử lý chương trình Primer (kích thước sản phẩm 289bp) là: IL6–F: TGC TCC TGG TGT TG (nhiệt độ tách mồi Tm = 46,2oC) o IL6–R: TTC ACC AGG CAA GT (Tm = 44,6 C) Kết kiểm tra công cụ Nucleotide – BLAST (BLASTn) cho thấy cặp mồi thiết kế có độ đặc hiệu độ nhạy cao với cDNA gen IL–6 (độ tương đồng đạt 100%) Sử dụng trình tự đầu dị nhân lên theo lý thuyết (kích thước 289bp), chúng tơi đánh giá khả bắt cặp với vector pL6/IL6 với hệ gen tế bào chủ (gà Lương Phượng Gallus gallus domesticus) Kết cho thấy đầu dò bắt cặp đặc hiệu với vector vị trí 2537–2835, nằm vị trí gen chuyển IL–6 (ở vị trí 2485 – 3123), cho thấy tổng hợp đầu dò vector pL6/IL6 thu sản phẩm gen IL–6 Khi kiểm tra với hệ gen gà Gallus gallus domesticus, đầu dị khơng bắt cặp với vị trí nào, nên sử dụng để kiểm tra khả chuyển gen IL–6 tế bào gà Kết tối ưu hóa điều kiện phản ứng 2+ Nồng độ Mg thường sử dụng phản ứng PCR 1,00 – 4,00 mM, nhiệt độ bắt cặp mồi thường cao o nhiệt độ biến tính 5–10 C Trong nghiên cứu chúng tơi tối ưu hóa điều kiện phản ứng với thơng số nhiệt độ o o 2+ bắt cặp mồi 45 C – 55 C nồng độ ion Mg 1,00 – 4,00 mM 2+ Kết đánh giá hiệu suất phản ứng cách điện di sản phẩm PCR cho thấy, nồng độ Mg tăng dần (1,00–3,25 2+ mM), lượng sản phẩm sinh nhiều, nồng độ Mg lên cao (4 mM) phản ứng PCR bị ức chế, o lượng sản phẩm thu Nhiệt độ gắn mồi 49,3 C cho kết khuếch đại gen tốt nhiệt độ 2+ o thử nghiệm Trong tất mẫu, mẫu nồng độ Mg 3,25 mM nhiệt độ gắn mồi 49,3 C thu nhiều sản phẩm PCR nhất, tức băng điện di có độ sáng lớn (Hình 27) Yêu cầu quan trọng việc tổng hợp đầu dị trình tự đoạn khuếch đại phải đảm bảo xác Vì chúng 2+ tơi thu số mẫu có độ sáng băng điện di khác để tiến hành giải trình tự: nồng độ Mg 1,75M 3,25M, o o nồng độ chọn mẫu có nhiệt độ gắn mồi 45,9 C 49,3 C Kết giải trình tự so sánh trình tự thu với trình tự đầu dị theo lý thuyết cho thấy sản phẩm PCR có trình tự vị trí tương đồng cao (trên 90%) với trình tự đầu dị theo lý thuyết Mặc dù vậy, mẫu cho mức độ tín hiệu khác nhau: mẫu tổng hợp điều kiện nồng độ 2+ o Mg 3,25M, nhiệt độ gắn mồi 49,3 C cho tín hiệu rõ nét nhất, độ nhiễu thấp; mẫu lại có độ nhiễu cao tín hiệu khơng rõ (Hình 16) Hình 27 Kết điện di sản phẩm PCR đánh giá ảnh hưởng nhiệt độ gắn mồi nồng độ Mg 2+ tới hiệu suất phản ứng 669 HỘI NGHỊ KHOA HỌC CÔNG NGHỆ SINH HỌC TỒN QUỐC 2013 Hình 28 Kết giải trình tự sản phẩm PCR so sánh với trình tự đầu dị lý thuyết Kết giải trình tự mẫu (hình trên) kết so sánh với trình tự đầu dị theo lý thuyết (hình dưới); Các mẫu tổng hơp điều kiện khác nhau: Mg2+ 1,75 M; Ta = 45,9oC (1); Mg2+ 1,75 M; Ta = 49,3oC (2); Mg2+ 3,25 M; Ta = 45,9oC (3); Mg2+ 3,25 M; Ta = 49,3oC (4) Kết tổng hợp đầu dị phản ứng DOP–PCR Hình 29 Kết điện di sản phẩm PCR tổng hợp đầu dò Các giếng 1-3: mẫu đối chứng sau nhuộm ethidium bromide, tổng hợp với dNTP thường, khuôn tổng hợp: giếng - H 2O (đối chứng âm); giếng - vector pL6/IL6; giếng - ADN gà Giếng 4: mẫu tổng hợp từ vector pL6/IL6 với thành phần phản ứng bổ sung dUTP đánh dấu, không nhuộm ethidium bromide o Đầu dò tổng hợp phản ứng DOP–PCR, với thời gian tổng hợp 72 C kéo dài sau chu kỳ, nguyên liệu tổng hợp chứa thêm dUTP gắn Alexa 568 có cấu trúc cồng kềnh, cần thời gian dài để vận chuyển gắn vào chuỗi tổng hợp Kết điện di cho thấy: băng kích thước 289bp (kích thước gần băng 300bp thang chuẩn) thu mẫu PCR sử dụng khuôn vector chuyển gen pL6/IL6, không xuất mẫu ADN hệ gen gà, chứng minh thực nghiệm độ đặc hiệu cặp mồi với gen IL–6 người vector Mẫu tổng hợp sử dụng dUTP đánh dấu Alexa 568 thu băng có kích thước tương đương, độ sáng đủ quan sát mắt thường không nhuộm qua thuốc nhuộm đặc hiệu, cho thấy sản phẩm đánh dấu với mức độ tương đối lớn (Hình 29) Sản phẩm tinh nhằm chuẩn bị cho nghiên cứu Các mẫu đầu dò cho cường độ huỳnh quang (theo số đơn vị huỳnh quang tương đối – RFU) bước sóng 665 nm 102,1–106,5 Kết lai FISH sử dụng đầu dò Sử dụng đầu dò tổng hợp thực phản ứng lai FISH với tế bào gốc phôi gà chuyển gen IL–6 người, thu kết thể Hình 23 Hình 30 Kết lai FISH tế bào gốc phôi gà chuyển gen IL–6 người sử dụng đầu dò tổng hợp (ĐC) Mẫu đối chứng; (TN) mẫu chuyển gen Nhân tế bào nhuộm với DAPI bắt màu xanh lam Các vị trí bắt cặp đặc hiệu đầu dò đánh dấu Alexa 568 ADN nhân tế bào có màu đỏ (vị trí mũi tên) Thảo luận tiềm ứng dụng đầu dò tổng hợp chỗ DOP–PCR Ở Việt Nam, kỹ thuật FISH ứng dụng số bệnh viện lớn viện nghiên cứu hải sản, nhiên đầu dò sử dụng sản phẩm thương mại, tự thiết kế đặt tổng hợp hãng tiếng (Đặng 670 HỘI NGHỊ KHOA HỌC CƠNG NGHỆ SINH HỌC TỒN QUỐC 2013 Thị Hồng Nhung, Nguyễn Duy Ngọc, 2008; Nguyễn Thị Tân Sinh et al, 2011; Nguyễn Văn Nguyên et al, 2011) Trong nghiên cứu này, tiến hành thiết kế mồi tự tổng hợp đầu dò đánh dấu Alexa 568 phản ứng DOP– PCR phòng thí nghiệm Thực nghiệm cho thấy cơng việc khơng đơn giản dUTP gắn Alexa 568 có cấu trúc cồng kềnh gây nhiều khó khăn cho q trình tổng hợp điều kiện phịng thí nghiệm Tỷ lệ nồng độ dUTP : dTTP phản ứng PCR theo dẫn nhà sản xuất 1:3, phải đến chúng tơi phải nâng dần lên 2:1 thu kết tương đối khả quan Khả tổng hợp Taq DNA polymerase cần xét đến Thực tế số loại Taq Promega (GoTaq®), Invitrogen, cung cấp số đơn vị nước thử nghiệm không thu hiệu mong muốn, sử dụng DNA Taq Polymerase (Cat No M0267L, New England Bio Lab) Nguyên nhân cịn ẩn số chúng tơi Trong nghiên cứu này, đầu dò thiết kế cho có kích thước khoảng 300bp để đủ tín hiệu huỳnh quang phát kính hiển vi, số tương đối lớn sử dụng Chúng phải tiến hành phản ứng lai nhiệt o o độ cao (65 C, so với đầu dò oligo thương mại 37 C) bước đầu thu kết Trong nghiên cứu tiến hành, chúng tơi tiếp tục tối ưu hóa điều kiện để giảm hàm lượng dUTP sử dụng phản ứng PCR, thử nghiệm tổng hợp đầu dò mạch đơn, bẻ gãy đầu dò nhằm nâng cao hiệu suất phản ứng FISH Đầu dò tổng hợp tiếp tục sử dụng nhằm xác định vị trí xác (vị trí nào, nhiễm sắc thể nào) gen chuyển IL–6 tế bào gốc phôi gà KẾT LUẬN Chúng thiết kế cặp mồi chuẩn hóa điều kiện để tổng hợp đầu dò gắn Alexa 568 đặc hiệu với gen IL– người Cặp mồi thiết kế có trình tự TGC TCC TGG TGT TG (IL6–F) TTC ACC AGG CAA GT (IL6–R), nhân đoạn ADN có kích thước 289bp từ cDNA gen IL–6 Điều kiện PCR thích hợp nhiệt độ gắn mồi 2+ o nồng độ Mg để tổng hợp tương ứng 49,3 C 3,25 mM Sử dụng phương pháp DOP–PCR, tổng hợp đầu dò đặc hiệu cho gen IL–6 người chứng minh sử dụng để phát gen tương ứng tế bào gốc phôi gà chuyển gen Lần Việt Nam, tự tổng hợp đầu dị phịng thí nghiệm sử dụng cho lai FISH Điều có ý nghĩa quan trọng cho nhà nghiên cứu chủ động tạo nguồn đầu dò tương ứng với gen quan tâm thí nghiệm Lời cảm ơn Nghiên cứu phần kết đề tài “Sử dụng kỹ thuật FISH để kiểm tra hội nhập gen IL-6 phân lập từ người tế bào gốc phôi gà chuyển gen” Trung tâm Hỗ trợ Nghiên cứu Châu Á – ĐHQG Hà Nội tài trợ kinh phí Chúng tơi xin chân thành cảm nhóm nghiên cứu Phịng Cơng nghệ tế bào động vật, Viện Công nghệ Sinh học giúp đỡ hoàn thiện vector chuyển gen sử dụng cho nghiên cứu TÀI LIỆU THAM KHẢO Bishop R (2010), Applications of fluorescence in situ hybridization (FISH) in detecting genetic aberrations of medical significance Bioscience Horizons 3(1): 85-95 Đặng Thị Hồng Nhung, Nguyễn Duy Ngọc (2008), Áp dụng kỹ thuật huỳnh quang chỗ phát bất thường cấu trúc nhiễm sắc thể Bệnh viện Nhi Trung ương Tạp chí nghiên cứu y học 57: 57-62 Nguyễn Thị Tân Sinh, Ngô Diễm Ngọc, An Thuỳ Lan, Đinh Thị Hồng Nhung, Lê Thị Liễu, Nguyễn Thanh Liêm (2011), Ứng dụng kỹ thuật lai huỳnh quang chỗ chẩn đoán trước sinh lệch bội nhiễm sắc thể thường gặp Tạp chí Y học lâm sàng Số đặc biệt tháng 2/2011: 253-258 Nguyễn Tiến Lung, Nguyễn Lai Thành (2012), Thử nghiệm chuyển gen IL-6 người lentivirus vào tế bào gốc phơi gà Tạp chí Khoa học Cơng nghệ - Viện Khoa học Công nghệ Việt Nam 50(3C): 401-406 Nguyễn Văn Nguyên, Lê Thanh Tùng, Lưu Xuân Hòa, Vũ Tuấn Nam, Vũ Minh Hào, Đinh Thái Bình (2011), Thử nghiệm kỹ thuật lai huỳnh quang chỗ F.I.S.H nhận diện nhanh chuẩn xác số loài tảo giáp độc hại, in Tuyển tập báo cáo Hội nghị khoa học cơng nghệ biển tồn quốc lần thứ V p 261-268 Wolman SR (1997), Applications of fluorescence in situ hybridization techniques in cytopathology Cancer Cytopathology 81(4): 193-197 PRODUCE FLUORESCENT–LABELING PROBE FOR FISH USING DOP–PCR ASSAY Nguyen Tien Lung, Hoang Thi Xoan, Nguyen Lai Thanh Faculty of Biology, VNU University of Science, 334 Nguyen Trai, Hanoi, Vietnam SUMMARY Fluorescence in situ hybridization (FISH) is a cytogenetic technique that is used to detect and localize specific DNA sequences in cells FISH uses fluorescent–labeling probes that specifically bind to those parts of a chromosome in target cell In this study, we design and optimize condition of DOP–PCR reaction for produce Alexa 568–labeling probe which specifically bind with human interleukin–6 gene Probe was produceed with hight fluorescent intensity, and used to detect corresponding gene in transgenic chicken embryonic stem cells This result contributes to the development of the FISH technique applied basic research and application in Vietnam Keywords: fluorescence in situ hybridization (FISH), fluorescent–labeling probe, DOP–PCR 671 ... gen lentivirus tế bào gốc phôi gà, sử dụng kỹ thuật FISH để phát vị trí gen chuyển IL? ? ?6 tế bào gốc phơi gà chuyển gen, từ tạo tiền đề cho việc tạo gà chuyển gen thông qua tế bào gốc Nghiên cứu... (Promega) để sử dụng cho phản ứng lai FISH 2.2.2 Thu nhận tế bào gốc phôi gà chuyển gen IL? ? ?6 người 2.2.2.1 Phương pháp phân lập tế bào gốc từ đĩa phôi giai đoạn X cESCs phân lập từ đĩa phôi giai... tâm Nghiên cứu Châu Á, Đại học Quốc gia Hà Nội ? ?Sử dụng kỹ thuật FISH để kiểm tra hội nhập gen IL? ? ?6 phân lập từ người tế bào gốc phôi gà chuyển gen? ?? TS Nguyễn Lai Thành làm Chủ nhiệm đề tài Tôi