Bài viết này sẽ thảo luận về các phương pháp hiện đang được sử dụng để đánh giá khả năng kháng khuẩn của dịch chiết thảo dược bao gồm từ việc lựa chọn nguyên liệu, lựa chọn dung môi, phương phát chiết xuất và phương pháp kiểm tra khả năng kháng khuẩn của dịch chiết.
Khoa học nông nghiệp Phương pháp đánh giá khả kháng khuẩn dịch chiết thảo dược Nguyễn Tài Năng TĨM TẮT Hướng nghiên cứu để tìm chất kháng sinh từ nguồn thảo dược thu hút quan tâm nhiều nhà khoa học đại nhằm đối phó với chủng vi khuẩn kháng thuốc quay trở lại lan rộng bệnh truyền nhiễm tưởng chừng khống chế trước Các bước số định hướng cho việc sử dụng phương pháp phù hợp để đánh giá khả kháng khuẩn dịch chiết thảo dược đề cập viết Key words: Thảo dược, khả kháng khuẩn, kháng thuốc, dịch chiết Mở đầu Phương pháp đánh giá mẫn cảm vi khuẩn với kháng sinh kỹ thuật nghiên cứu (Ymele-Leki et al., 2012) Nó sử dụng lâm sàng để xác định kháng thuốc vi khuẩn mẫn cảm chúng với loại kháng sinh Nó sử dụng để đánh giá khả chống vi sinh vật định hướng cho phát triển sản phẩm thuốc kháng sinh Ngày nay, tượng kháng thuốc ngày trở nên phổ biến Một loại kháng sinh tìm phải nhiều thời gian, tốc độ kháng thuốc vi khuẩn lại nhanh Nguy hình thành số loại vi khuẩn kháng với hầu hết loại kháng sinh có gây khó khăn lớn cho trình điều trị (Jorgensen and Ferraro, 2009) Kháng sinh có nguồn gốc thảo dược thu hút quan tâm nhà khoa học Việc sử dụng thảo dược chất kháng khuẩn, chống viêm có từ lâu thuốc đơng y Khoa học đại chứng minh khả kháng khuẩn nhiều loại thảo dược (Cowan, 1999) Kháng sinh thảo dược cho gây kháng thuốc, an tồn khơng gây tồn dư thể Nghiên cứu khả kháng khuẩn dịch chiết từ thảo dược có vai trị quan trọng việc tìm loại kháng sinh khẳng định sở khoa học việc sử dụng thảo dược Có nhiều phương pháp xác định khả kháng khuẩn dịch chiết thảo dược nhà khoa học sử dụng Sử dụng phương pháp khác có ảnh hưởng trực tiếp đến kết đánh giá hoạt tính kháng khuẩn thảo dược Bài viết thảo luận phương pháp sử dụng để đánh giá khả kháng khuẩn dịch chiết thảo dược bao gồm từ việc lựa chọn nguyên liệu, lựa chọn dung môi, phương phát chiết xuất phương pháp kiểm tra khả kháng khuẩn dịch chiết Nội dung 2.1 Phương pháp chuẩn bị dịch chiết thảo dược 2.1.1 Chuẩn bị nguyên liệu Việc lựa chọn nguyên liệu làm thảo dược thường dựa kinh nghiệm hướng dẫn truyền thống Các phần khác thân, lá, rễ, củ, hoa, số phần tất phần thu hái sử dụng làm thuốc Nguyên liệu sau lựa chọn phải làm sạch, thơng thường nước Thảo dược sử dụng dạng tươi khô để chuẩn bị dịch chiết Tuy nhiên, nhà khoa học thường sử dụng dạng khô với nhiều lý khác Thứ nhất, lượng nước có nguyên liệu tươi làm tăng khối lượng mẫu lượng dung môi cần thiết làm giảm nồng độ hiệu chiết xuất hoạt chất Thứ hai, đa số loại thảo dược truyền thống sử dụng dạng khô Để làm khơ ngun liệu phơi nắng, hong khô, sấy khô Trong phương pháp này, sấy khô nhiệt độ thấp 40 - 600C cho có nhiều ưu điểm như: hạn chế Đại học Hùng Vương - Khoa học Công nghệ 55 Khoa học nông nghiệp giảm hoạt tính thảo dược tác động ánh nắng mặt trời nhiệt độ cao, giảm chất lượng nguyên liệu nấm mốc 2.1.2 Lựa chọn dung môi Sử dụng dung môi chiết xuất thảo dược ảnh hưởng lớn đến hiệu chiết xuất hoạt tính sinh học chất Sự thành công việc xác định hoạt tính sinh học chất thảo dược phụ thuộc lớn vào dung môi sử dụng q trình chiết xuất Dung mơi sử dụng phải đảm bảo yếu tố tính độc thấp, dễ bay nhiệt độ thấp, hòa tan nhanh giữ hoạt tính chất nguyên liệu Lựa chọn dung môi phụ thuộc vào mục đích sử dụng sản phẩm chiết xuất Sau chiết xuất khó loại bỏ hết dung môi, dung môi phải đảm bảo ảnh hưởng đến thí nghiệm Lựa chọn dung môi phụ thuộc vào hợp chất đích mà ta muốn chiết xuất khỏi thảo dược Hầu hết dung môi sử dụng nghiên cứu khả kháng khuẩn dịch chiết thảo dược Methanol, Ethanol nước Ngoài số dung môi hữu khác sử dụng không phổ biến như: Acetic acid, Aceton, Dichloromethan Trong cách sử dụng thảo dược truyền thống nước sử dụng phổ biến làm dung môi Tuy nhiên nghiên cứu gần thấy rằng, sử dụng dung môi hữu hoạt tính kháng khuẩn dịch chiết thu có độ ổn định so với dung môi nước Những nghiên cứu gần thường sử dụng dung môi cồn Methanol cồn Ethanol (Jeyaseelan et al., 2012) 2.1.3 Phương pháp chiết Lựa chọn phương pháp chiết xuất thường dựa sở thời gian chiết dài hay ngắn, đặc tính lý hóa dung mơi, nhiệt độ chiết, kích thước thảo dược tỷ lệ lượng dung môi thảo dược sử dụng Nguyên tắc phải nghiền nhỏ thảo dược để tăng diện tích bề mặt tăng hiệu chiết xuất Tùy theo độ nhỏ đặc tính nguyên liệu, khả hịa tan vào dung mơi hoạt chất điều kiện ngâm tĩnh, kết hợp lắc, siêu âm mà thời gian chiết từ phút đến vài vài ngày Tỷ lệ nguyên liệu dung mơi dùng mức 1:10 đến 1:5 Phương pháp chiết sử dụng rộng rãi bao gồm việc nghiền nhỏ nguyên liệu, khuấy dung môi 10 phút, ngâm qua đêm sau lọc lấy dịch chiết Dịch chiết lọc qua giấy lọc ly tâm tốc độ 3000 vòng/phút 10 phút để loại bỏ cặn kết hợp ly tâm trước lọc sau Dịch chiết sau lọc cô đặc điều kiện áp suất thấp 2.2 Phương pháp kiểm tra tính kháng khuẩn dịch chiết 2.2.1 Phương pháp khuếch tán thạch - Phương pháp sử dụng khoanh giấy Việc sử dụng khoanh giấy kháng sinh bề mặt đĩa thạch để đánh giá khả kháng khuẩn sử dụng từ năm 40 kỷ XX cải tiến nhiều Hiện kỹ thuật sử dụng nhiều để đánh giá khả kháng khuẩn dịch chiết thảo dược Phương pháp bao gồm 56 Đại học Hùng Vương - K hoa học Công nghệ bước: đĩa thạch cấy vi khuẩn sau đặt khoanh giấy thấm dịch chiết lên bề mặt đĩa thạch Lượng vi khuẩn cấy nồng độ 108 CFU/ml (CFU: Colony Forming Unit, hay đơn vị khuẩn lạc) Đường kính khoanh giấy thấm khoảng mm thấm dịch chiết trước sau đặt lên mơi trường thạch Muller Hinton Sau đĩa thạch ủ tủ ấm nhiệt độ thời gian thích hợp (từ 25 370C từ 18 đến 48 giờ) Đánh giá khả kháng khuẩn qua đường kính vơ khuẩn xung quanh khoanh giấy Đường kính vơ khuẩn đo vùng xung quanh khoanh giấy nơi lượng vi khuẩn mọc giảm 80% so với khu vực xa khoanh giấy phân biệt mắt thường (Klancnik et al., 2010) - Phương pháp đục lỗ thạch Phương pháp giống với phương pháp sử dụng khoanh giấy Điểm khác thay dùng khoanh giấy thấm dịch chiết, người ta đục lỗ đĩa thạch đường kính khoảng - mm dịch chiết vào, lỗ chứa từ 0,05 đến 0,1 ml dịch chiết 2.2.2 Phương pháp pha lỗng mơi trường lỏng Đây phương pháp quan trọng, cho phép đánh giá định lượng nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) kháng sinh hay dịch chiết vi khuẩn Trong phương pháp này, kháng sinh dịch chiết pha loãng theo số môi trường nuôi cấy vi khuẩn Vi khuẩn giống pha sẵn nồng độ 106 CFU/ml cho lượng đồng vào môi trường ni cấy có kháng sinh hay dịch Khoa học nông nghiệp chiết nồng độ khác Phương pháp thực phiến có nhiều giếng nuôi cấy ống nghiệm Với phương pháp sử dụng phiến ni cấy dung tích 0,2 ml/giếng thường kết hợp với máy đọc độ cản quang dùng thuốc thử INT (một dạng muối tetrazolium) để đọc kết Còn phương pháp sử dụng ống nghiệm kiểm tra độ đục mơi trường nuôi cấy đọc kết mắt thường, nhiên phương pháp cần nhiều môi trường nuôi cấy Ở nồng độ kháng sinh hay dịch chiết thấp bắt đầu có suy giảm mạnh mọc vi khuẩn xác định nồng độc ức chế tối thiểu (Klancnik et al., 2010) 2.2.3 Phương pháp pha lỗng mơi trường thạch Phương pháp pha lỗng mơi trường thạch tiến hành đĩa thạch với nồng độ dịch chiết khác Để chuẩn bị đĩa thạch này, thạch chứa môi trường nuôi cấy làm tan chảy hấp khử trùng, hạ nhiệt độ xuống giữ nước nóng 500 C Dịch chiết bổ sung vào môi trường thạch nồng độ khác cách sử dụng mơi trường thạch cịn tan chảy để pha lỗng theo số sau đổ đĩa Các đĩa thạch nuôi cấy chứa dịch chiết nồng độ khác để đông cứng khô bề mặt sau cấy vi khuẩn trải bề mặt thạch MIC xác định nồng độ dịch chiết thấp mơi trường thạch mà ức chế hồn tồn hình thành khuẩn lạc có số khuẩn lạc đĩa thạch đường kính 90 mm (NIHE, 2013) Kết luận Thảo dược nguồn nguyên liệu tự nhiên có nhiều thành phần kháng khuẩn tiềm Phương pháp thu hái, chế biến làm ảnh hưởng đến thành phần hoạt tính thảo dược Phương pháp xác định, đánh giá khả kháng khuẩn dịch chiết thảo dược bao gồm cách quy trình thu hái, chiết xuất, kiểm tra hoạt tính cần tối ưu tiêu chuẩn hóa để có kết xác, đảm bảo độ tin cậy Tài liệu tham khảo COWAN, M M 1999, Plant products as antimicrobial agents Clin Microbiol Rev, 12, 564-82 JEYASEELAN, E C., JENOTHINY, S., PATHMANATHAN, M & JEYADEVAN, J 2012, Antibacterial activity of sequentially extracted organic solvent extracts of fruits, flowers and leaves of Lawsonia inermis L from Jaffna Asian Pac J Trop Biomed, 2, 798-802 JORGENSEN, J H & FERRARO, M J 2009, Antimicrobial susceptibility testing: a review of general principles and contemporary practices Clin Infect Dis, 49, 1749-55 KLANCNIK, A., PISKERNIK, S., JERSEK, B & MOZINA, S S 2010, Evaluation of diffusion and dilution methods to determine the antibacterial activity of plant extracts J Microbiol Methods, 81, 121-6 YMELE-LEKI, P., CAO, S., SHARP, J., LAMBERT, K G., MCADAM, A J., HUSSON, R N., TAMAYO, G., CLARDY, J & WATNICK, P I 2012, A highthroughput screen identifies a new natural product with broadspectrum antibacterial activity PLoS One, 7, e31307 NIHE 2013, Quy trình xác định nồng độ kháng sinh tối thiểu ức chế vi khuẩn (MIC) [Online] Available: http:// w w w n i h e org v n / n e w - v n / thuong-quy-va-huong-dan-kythuat/937/Qui-trinh-xac-dinhnong-do-khang-sinh-toi-thieuuc-che-vi-khuan-MIC.vhtm [Accessed] SUMMARY Nguyen Tai Nang Hung Vuong University D Key words: Đại học Hùng Vương - Khoa học Công ngheä 57 ... khoanh giấy kháng sinh bề mặt đĩa thạch để đánh giá khả kháng khuẩn sử dụng từ năm 40 kỷ XX cải tiến nhiều Hiện kỹ thuật sử dụng nhiều để đánh giá khả kháng khuẩn dịch chiết thảo dược Phương pháp bao... nhiều thành phần kháng khuẩn tiềm Phương pháp thu hái, chế biến làm ảnh hưởng đến thành phần hoạt tính thảo dược Phương pháp xác định, đánh giá khả kháng khuẩn dịch chiết thảo dược bao gồm cách... Phương pháp pha lỗng mơi trường lỏng Đây phương pháp quan trọng, cho phép đánh giá định lượng nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) kháng sinh hay dịch chiết vi khuẩn Trong phương pháp này, kháng sinh dịch