Sử Dụng Marker Phân Tử Bước Đầu Thanh Lọc Một Số Giống Lúa Mang Gen Kháng Rầy Nâu Ở Đồng Bằng Sông

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ VIỆN NGHIÊN CỨU VÀ PHÁT TRIỂN CÔNG NGHỆ SINH HỌC  LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC CHUYÊN NGÀNH CÔNG NGHỆ SINH HỌC SỬ DỤNG MARKER PHÂN TỬ BƯỚC ĐẦU THANH LỌC MỘT SỐ GIỐNG LÚA MANG GEN KHÁNG RẦY NÂU Ở ĐỒNG BẰNG SÔNG CỬU LONG CÁN BỘ HƯỚNG DẪN Ts TRẦN NHÂN DŨNG SINH VIÊN THỰC HIỆN NGUYỄN NGỌC QUỲNH ANH MSSV: 3064434 LỚP CNSH TIÊN TIẾN K32 Cần Thơ, Tháng 11/2010 PHẦN KÝ DUYỆT CÁN BỘ HƯỚNG DẪN SINH VIÊN THỰC HIỆN Ts.Trần Nhân Dũng Nguyễn Ngọc Quỳnh Anh DUYỆT CỦA HỘI ĐỒNG BẢO VỆ LUẬN VĂN ………………………………………………………………………………………… ………………………………………………………………………………………… ………………………………………………………………………………………… ………………………………………………………………………………………… …………………………………………………………………………… Cần Thơ, ngày tháng năm 2010 CHỦ TỊCH HỘI ĐỒNG LỜI CẢM TẠ Để hồn thành tốt luận văn này, em nhận giúp đỡ nhiều người Em xin chân thành cảm tạ đến Thầy Trần Nhân Dũng tận tình dạy bảo, hướng dẫn, thăm hỏi động viên Cơ Trần Thị Xn Mai tận tình hướng dẫn, cung cấp tài liệu cho lời khuyên bổ ích để em hồn thành đề tài nghiên cứu Anh Nguyễn Vũ Linh nhiệt tình giúp đỡ chuyên môn từ em bắt đầu làm đề tài hoàn thành Anh Trần Văn Bé Năm, chị Liễu Như Ý quan tâm, bảo em suốt thời gian qua Ban giám đốc Viện Nghiên cứu Phát triển Công nghệ Sinh học thầy cô Viện quan tâm, hỗ trợ tạo điều kiện thuận lợi để em hoàn thành tốt đề tài tốt nghiệp Các bạn lớp Công Nghệ Sinh Học tiên tiến khóa 32 chia sẻ, động viên giúp đỡ trình học tập sống Con xin gửi lòng biết ơn sâu sắc đến ông, bà, cha mẹ, người nuôi nấng, dạy bảo nên người động viên giúp đỡ suốt thời gian qua i TÓM TẮT Trong loại côn trùng gây hại lúa, rầy nâu (Nilaparvata lugens Stal.) xem nguồn đe dọa việc sản xuất gây thiệt hại đáng kể sản lượng hàng năm, đặc biệt nước châu Á Đối với công tác chọn giống nay, việc lai tạo giống mới, có khả kháng xem chiến lược quan trọng, góp phần giảm thiệt hại rầy nâu gây tăng suất lúa Trong nghiên cứu này, ba mươi giống lúa có nguồn gốc từ Viện nghiên cứu phát triển Đồng sông Cửu Long chọn để khảo sát nguồn gen kháng rầy với mồi SSR (Simple sequence repeats) RM13, RM270, RM190 mồi STS (Sequence-tagged site) 7312.T4A Dựa kết phân tích sản phẩm PCR gel agarose, hai mồi SSR RM13 RM270 khơng cho thấy đa hình giống lúa, không liên kết chặt chẽ với gen kháng rầy nâu Ngược lại, mồi SSR RM190 mồi STS 7312.T4A cho thấy liên kết chặt chẽ với gen kháng rầy bph4 Bph18 Trong ba mươi giống lúa khảo sát với mồi RM190, có mười sáu giống thể tính kháng rầy Đối với mồi 7312.T4A, kết cuối sản phẩm cắt cho thấy có mười hai giống lúa mang gen Bph18 Từ khóa: BHP (Brown Plant Hopper), biotype, gen kháng rầy nâu, marker SSR, marker STS i MỤC LỤC Trang KÝ TÊN HỘI ĐỒNG LỜI CẢM TẠ TÓM TẮT i MỤC LỤC .ii CÁC TỪ VIẾT TẮT v DANH SÁCH HÌNH vi DANH SÁCH BẢNG vii CHƯƠNG GIỚI THIỆU CHƯƠNG LƯỢC KHẢO TÀI LIỆU 2.1.Giới thiệu chung lúa 2.1.1.Phân bố 2.1.2 Nguồn gốc lúa 2.2 Sơ lược rầy nâu (Nilaparvata lugens Stal) 2.2.1.Phân bố 2.2.2.Ký chủ .4 2.2.3 Đặc điểm hình thái .5 2.2.4 Đặc điểm gây hại truyền bệnh 2.2.5 Tình hình gây hại rầy nâu 2.2.6 Các loại hình sinh học rầy nâu 2.3 Lúa kháng rầy 2.3.1 Sơ lược đặc tính kháng rầy lúa .9 2.3.2 Gen kháng rầy nâu 10 2.3.3 Một số giống lúa kháng rầy trồng phổ biến 12 2.4 Kỹ thuật PCR (Polymerase Chain Reaction) 12 2.5 Kỹ thuật SSR (Simple Sequence Repeats) .13 2.6 Kỹ thuật STS (Sequence-tagged site) 13 2.7 Một số nghiên cứu sử dụng marker phân tử 14 ii 2.8 Enzyme giới hạn .15 2.8.1 Khái niệm .15 2.8.2 Phân loại cách gọi tên enzyme giới hạn 15 2.8.3 Nghiên cứu sử dụng enzyme HinfI 16 CHƯƠNG PHƯƠNG TIỆN VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 17 3.1 Thời gian địa điểm .17 3.2 Phương tiện nghiên cứu 17 3.2.1 Dụng cụ thiết bị 17 3.2.2 Hóa chất 17 3.2.3 Nguyên liệu 17 3.3 Phương pháp nghiên cứu 18 3.3.1 Ly trích DNA 18 3.3.2 Xác định hàm lượng độ tinh DNA phương pháp đo quang phổ hấp thụ 20 3.4 Phản ứng PCR 20 3.4.1 Hiệu chỉnh phản ứng PCR 22 3.4.2 Kiểm tra sản phẩm PCR gel agarose 22 3.4.3.Cắt enzyme giới hạn 23 CHƯƠNG KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 24 4.1 Kết PCR marker RM190, RM13, RM270 24 4.1.1 Kết PCR với cặp mồi RM190 24 4.1.2 Kết PCR với cặp mồi RM13 RM270 27 4.2 Kết PCR với cặp mồi 7312.T4A 30 4.3 Kết cắt sản phẩm PCR cặp mồi 7312.T4A enzyme HinfI 34 CHƯƠNG KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 37 5.1 Kết luận 37 5.2 Kiến nghị 37 TÀI LIỆU THAM KHẢO 39 iii PHỤ LỤC Phụ lục Bảng 3.10 Kết đo nồng độ nucleic acid Phụ lục Kết PCR với cặp mồi RM190 Hình 4.16 Kết PCR với mồi RM190 giống lúa Hình 4.17 Kết PCR với mồi RM190 22 giống lúa Hình 4.18 Kết PCR với mồi RM190 21 giống lúa Phụ lục Kết PCR với cặp mồi 7312.T4A Hình 4.19 Kết PCR với mồi 7312.T4A 18 mẫu lúa Phụ lục Hình ảnh số thiết bị chủ yếu phục vụ cho đề tài Hình 4.20 Một số thiết bị phục vụ cho thí nghiệm iv CÁC TỪ VIẾT TẮT STS Sequence-tagged sites bp Base pair, cặp bazơ BiH2O Nước cất hai lần CTAB Cetyl trimethyl ammonium bromide DNA Deoxyribonucleic acid dNTP Deoxyribonucleotide triphosphate EB Extraction buffer EDTA Ethylenediamine tetraacetic acid SSR Simple Sequence Repeats OD Optical density ĐBSCL Đồng sông Cửu Long PCR Polymerase Chain Reaction rpm Round per minute, vòng/ phút SDS Sodium dodecyl sulphate TE Tris-EDTA TBE Tris-Borate-EDTA v DANH SÁCH HÌNH Trang Hình 2.1 Rầy nâu cánh dài (A) rầy nâu cánh ngắn (B) Hình 2.2.Ấu trùng rầy Hình 2.3 Trứng rầy Hình 2.4 Vịng đời rầy nâu Hình 4.1 Kết điện di sản phẩm PCR với mồi RM190 gel agarose 3% 24 Hình 4.2 Kết PCR với mồi RM190 theo công thức thử nghiệm 25 Hình 4.3 Kết PCR với mồi RM190 theo công thức hiệu chỉnh gel agarose 3% 26 Hình 4.4 Kết PCR với mồi RM13 (A) RM270 (B) 28 Hình 4.5 Kết PCR cặp mồi RM13 (A) RM270 (B) theo công thức thử nghiệm 28 Hình 4.6 Kết chạy gradient cặp mồi RM270 29 Hình 4.7 Kết PCR cặp mồi RM13 RM270 theo công thức hiệu chỉnh 29 Hình 4.8 Kết PCR với cặp mồi 7312.T4A 30 Hình 4.9 Kết PCR với lượng Taq polymerase MgCl2 hiệu chỉnh 31 Hình 4.10 Kết PCR sau hiệu chỉnh lượng MgCl2 sử dụng nhiệt độ gắn mồi 31 Hình 4.11 Kết PCR sau hiệu chỉnh chu kỳ nồng độ DNA 32 Hình 4.12 Kết PCR với mồi 7312.T4A theo công thức hiệu chỉnh 33 Hình 4.13 Kết cắt DNA STS enzyme HinfI 14 mẫu lúa 34 Hình 4.14 Kết cắt DNA STS enzyme HinfI 12 mẫu lúa 34 Hình 4.15 Kết cắt DNA STS enzyme HinfI mẫu lúa 35 vi DANH SÁCH BẢNG Trang Bảng 3.1 Danh sách giống lúa 18 Bảng 3.2 Các primer sử dụng 20 Bảng 3.3 Thành phần phản ứng PCR 21 Bảng 3.4 Chu trình nhiệt thử nghiệm mồi RM190, RM13 RM270 21 Bảng 3.5 Chu trình nhiệt thử nghiệm mồi 7312.T4A 21 Bảng 3.6 Bảng mối liên hệ nồng độ gel kích thước phân tử DNA 22 Bảng 3.7 Hóa chất cắt DNA 23 Bảng 3.8 Kết tổng hợp giống lúa có mang gen bph4 27 Bảng 3.9 Kết tổng hợp giống lúa có mang gen Bph18 36 vii Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 32 - 2010 M 12 Trường ĐHCT 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 1000bp (B) Hình 4.12 Kết PCR với mồi 7312.T4A theo công thức hiệu chỉnh M: ladder 1kb, giếng 1: MNR1, 2: MTL652, 3: MTL660, 4: MTL662, 5: MTL663, 6: OM5756, 7: OM6018, 19: HĐ1, 20: TN1, 10 21: Ptb33, 11và 22: đối chứng âm (H2O), 12: MNR2, 13: MNR3, 14: MNR4, 15: MNR5, 16: OM4488, 17: OM5740,18: OM5756 Sản phẩm PCR khuếch đại với cặp mồi 7312.T4 ba mươi giống lúa tạo vạch nhất, rõ nét gel Tuy nhiên giống lúa tạo vạch có trọng lượng gần (khoảng 1000bp).Vì khơng thể so sánh khác biệt giống lúa, ta cần tiếp tục lấy sản phẩm PCR cắt với enzym HinfI để tìm đa hình giống 4.3 Kết cắt sản phẩm PCR cặp mồi 7312.T4A enzyme HinfI Sau thu sản phẩm PCR thể băng rõ nét đồng gel, ta tiến hành cắt sản phẩm ennzyme HinfI theo công thức Bảng 3.7 M 10 11 12 13 14 ~566bp 500bp ~398 bp Hình 4.13 Kết cắt DNA STS enzyme HinfI 14 mẫu lúa 33 Chuyên ngành Công nghệ Sinh học Viện NC&PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 32 - 2010 Trường ĐHCT M: ladder 100bp, giếng 1: MTL586, 2: MTL601, 3: MTL603, 4: MTL617, 5: MTL620, 6: MNR2, 7: MNR3, 8: MNR4, 9: MNR5, 10: OM4488, 11: OM5740, 12: HĐ1, 13: TN1và 14: Ptb33 M 15 16 17 19 20 21 22 23 24 25 26 PCR PCR M 1000bp Hình 4.14 Kết cắt DNA STS enzyme HinfI 12 mẫu lúa M: ladder 1kb, giếng 15: MTL652, 16: MTL660, 17: MTL662, 18: MTL663, 19: OM5756, 20: OM6018, 21: OM6379, 22: OM6599, 23: Nàng Hoa 9, 24: OMCS2000 (đối chứng), 25: ĐMT126, 26: ĐMT129 giếng kí hiệu PCR DNA STS chưa cắt với enzyme HinfI (DNA STS HĐ1 TN1) M M 27 28 29 30 31 327 33 349 PCR 10 PCR 1000bp ~ 566bp ~ 398 bp Hình 4.15 Kết cắt DNA STS enzyme HinfI mẫu lúa M: ladder 1kb, giếng 27: MTL621, 28: MTL638, 29: MTL640, 30: MTL 641, 31: MTL642, 32: MTL643, 33: MTL650, 34 : MNR1 giếng kí hiệu PCR DNA STS chưa cắt với enzyme HinfI (DNA STS HĐ1 TN1) Sản phẩm PCR sau cắt với enzyme HinfI, ta thấy có xuất đa hình giống lúa Theo Jena K.K (2005), sản phẩm cắt mẫu lúa mang gen kháng Bph18 thể hai băng chính, có trọng lượng khoảng 566bp 398bp gel agarose 2% 34 Chuyên ngành Công nghệ Sinh học Viện NC&PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 32 - 2010 Trường ĐHCT Dựa theo kết hình gel ta thấy : + Những giống cho mang gen kháng gồm giống giếng 5, 6, 7, 10, 19, 21, 22, 23, 24, 29, 33 34 + Các giống giếng: 1, 2, 3, 4, 8, 9, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 20, 25, 26, 27, 28, 30, 31, 32 cho nhất, có kích thước khoảng 900- 980bp Điều chứng minh giống không mang gen kháng Bph18 phản ứng cắt với enzyme bị cắt đoạn nhỏ dao động khoảng 20bp- 25bp Các giống đối chứng HĐ1 Ptb33 thí nghiệm không mang gen kháng Bph18 Kết sản phẩm cắt với enzyme HinfI phù hợp với nghiên cứu Jena K K et al (2005), tác giả nghiên cứu việc xây dựng đồ độ phân giải cao gen kháng rầy nây Bph18(t) nhiễm sắc thể số 12 ứng dụng chọn giống lúa (Oryza sativa L.) kháng rầy Tuy nhiên, thí nghiệm mẫu giếng 5, 7, 22 , 23, 24 29 ngồi xuất hai băng khoảng 566bp 398bp cịn có thêm băng vị trí khoảng 900bp Giống TN1 cho băng vị trí Theo nhiều nghiên cứu trước Haiyuan yang (2002) hay Sogawa Pathak (1976) giống TN1 giống lúa không mang kháng rầy nhiễm với tất loại biotype rầy nâu Vì vậy, ta đặt giả thuyết với giống thể ba băng vị trí trên, có khả giống lúa giống dị hợp tử mang gen kháng Bph18 Ngoài theo nghiên cứu Jena K K (2005), sản phẩm cắt giống lúa IR65482-7-216-1-2 ( nguồn giống mang gen Bph18) thể hai băng vị trí khoảng 566bp 398bp 35 Chuyên ngành Công nghệ Sinh học Viện NC&PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 32 - 2010 Trường ĐHCT Bảng 3.9 Kết tổng hợp giống lúa có mang gen Bph18 STT Giống lúa STT MNR1 OM6599 MNR2 Nàng Hoa MNR3 OMCS2000 (đối chứng A1) OM4488 10 MTL620 OM5756 11 MTL640 OM6379 12 MTL650 Giống lúa 36 Chuyên ngành Công nghệ Sinh học Viện NC&PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 32 - 2010 Trường ĐHCT CHƯƠNG KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 5.1 Kết luận + Với marker RM13 điều kiện tốt cho phân tích sản phẩm PCR theo công thức Bảng 3.3 hiệu chỉnh (lượng Taq polymerase sử dụng 0.5µl, MgCl2 2.5 µl ) chu trình nhiệt Bảng 3.4, nồng độ gel agarose 3% Riêng RM270 nhiệt độ bắt cặp tối ưu 60 0C + Các marker RM13 RM270 cho kết đơn hình chứng tỏ marker chưa thể tính liên kết với gen kháng rầy nâu số giống lúa ĐBSCL + Marker RM190 cho kết đa hình tốt gel agarose 3%, theo cơng thức chu trình nhiệt hiệu chỉnh giống với hai marker RM13 RM270 Trong số ba mươi giống lúa kiểm tra với marker RM190, ta thu mười sáu giống thể tính kháng rầy nâu + Đối với marker 7312.T4 chu trình nhiệt phù hợp cho marker chu trình Bảng 3.5 hiệu chỉnh (nhiệt độ bắt cặp 600C, thời gian kéo dài 1phút 25 giây, số lượng chu kỳ phản ứng 30 chu kỳ) Bên cạnh ta thành cơng việc hiệu chỉnh thành phần phản ứng PCR để đạt hiệu khuếch đại tối ưu (lượng Taq polymerase sử dụng 0.4µl, MgCl2 µl DNA 1µl) Sau phân tích sản phẩm cắt với enzyme giới hạn, ta thu mười hai giống lúa mang gen kháng Bph18 thể hai băng vị trí khoảng 566bp 398bp Ngồi ra, giống MTL620, MNR3, OM6599, Nàng Hoa 9, OMCS2000 MTL640 sau tham gia phản ứng cắt xuất ba băng vị trí khoảng 398bp, 566bp 900bp Điều này, giải thích giống lúa giống dị hợp tử mang gen kháng 5.2 Kiến nghị + Tiếp tục sử dụng marker 7312.T4A để nghiên cứu tính kháng rầy nâu giống lúa khác ĐBSCL Phân tích kết PCR thông qua phương pháp cắt với enzyme cắt giới hạn HinfI, từ khảo sát tính liên kết marker gen kháng rầy nâu 37 Chuyên ngành Công nghệ Sinh học Viện NC&PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 32 - 2010 Trường ĐHCT + Đồng thời tiếp tục khảo sát tính liên kết marker RM190 với số giống lúa khác + Tiến hành đưa giống lúa có mang gen kháng rầy khảo sát vào trồng thử nghiệm đồng, để đánh giá hiệu kháng giống trước đưa vào sản xuất đại trà 38 Chuyên ngành Công nghệ Sinh học Viện NC&PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 32 - 2010 Trường ĐHCT TÀI LIỆU THAM KHẢO Tiếng việt Bùi Chí Bửu, K.Reganayaki, A.S Reddy 1997 Phân tích di truyền tính kháng rầy nâu giống lúa hoang nhờ marker phân tử Kết nghiên cứu Khoa học 1977 1997, Viện Lúa ĐBSCL, NXB Nông Nghiệp Thành Phố Hồ Chí Minh Bùi Chí Bửu Nguyễn Thị Lang 2005 Nghiên cứu ứng dụng marker phân tử để phát gen kháng rầy nâu lúa (Oryza sativa L.) Hội nghị khoa học tồn quốc Cơng nghệ sinh học năm 2005, trang: 165-169 Bùi Chí Bửu 2006 Giống lúa cao sản tình hình rầy nâu bộc phát ĐBSCL Tạp chí nơng nghiệp phát triển nơng thơn 9: 16-17 Bùi Chí Bửu Nguyễn Thị Lang 2007 Chọn giống trồng phương pháp truyền thống phân tử TP Hồ Chí Minh NXB Nơng nghiệp Cục Bảo Vệ Thực Vật 2000 Vụ lúa đông xuân 1999 - 2000 Tình hình sâu bệnh biện pháp đạo phịng trừ Tạp chí Bảo vệ thực vật 4: 21-28 Hồ Huỳnh Thùy Dương 2003 Sinh học phân tử NXB Giáo dục TPHCM Khuất Hữu Thanh 2003 Cơ sở Di truyền phân tử Kỹ thuật gen NXB Khoa học Kỹ thuật Hà Nội, trang 140-141 Lưu Thị Ngọc Huyền, Vũ Đức Quang Thiếu Văn Đường 2003 Định vị gen kháng rầy nâu bph4 Bph6 nhiễm sắc thể lúa Tạp chí di truyền học ứng dụng 2: 29-33 Lý Tiến 2010 Khảo sát số marker phân tử dùng chọn giống lúa kháng rầy nâu Luận văn tốt nghiệp đại học Viện Nghiên cứu Phát triển Công nghệ Sinh học.Trường Đại học Cần Thơ Nguyễn Đình Giao, Nguyễn Thiện Huyên, Nguyễn Hữu Tề Hà Cơng Vượng, 1997 Giáo trình Cây Lương Thực NXB Nông Nghiệp Hà Nôi, trang 7-15 Nguyễn Đức Khiêm 2006 Giáo trình Cơn Trùng Nơng Nghiệp NXB Nông Nghiệp Hà Nội, trang 99-104 39 Chuyên ngành Công nghệ Sinh học Viện NC&PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 32 - 2010 Trường ĐHCT Nguyễn Ngọc Đệ 2007 Giáo trình lúa Tủ sách Đại học Cần Thơ Trường Đại học Cần Thơ Nguyễn Văn Huỳnh.1997 Bài giảng giống kháng côn trùng Tủ sách Đại học Cần Thơ Trường Đại học Cần Thơ, trang 25-46 Nguyễn Văn Huỳnh Lê Thị Sen 2004 Giáo trình trùng nơng nghiệp Trường Đại học Cần Thơ Tủ sách Đại học Cần Thơ, trang 36-39 Nguyễn Văn Luật 2002 Cây lúa Việt Nam kỷ 20, NXB Nông Nghiệp Hà Nội Phạm Văn Kim 2000 Bài giảng nguyên lý bệnh hại trồng Khoa Nông Nghiệp Trường Đại học Cần Thơ Tủ sách Đại học Cần Thơ, trang 37 Trịnh Đình Đạt 2006 Công nghệ sinh học tập 4-Công nghệ Di truyền NXB Giáo dục Trung tâm bảo vệ thực vật phía Bắc 2000 Tình hình phát sinh gầy hại sâu bệnh số trồng năm 1998 – 2000 Tài liệu báo cáo tổng kết công tác Bảo vệ thực vật năm 2000 kế hoạch công tác năm 2001 tỉnh phía Bắc Võ Thị Hương Lan 2006 Giáo Trình Sinh Học Phân Tử Tế Bào Và Ứng Dụng NXB Giáo dục Tiếng Anh Alam S.N and Cohen M.B 1998 Detection and analysis of QTLs for resistance to the brown planthopper, Nilaparvata lugens, in a doubled haploid rice population Theor Appl Genet 97: 1370-1379 Athwal D S., Pathak M D., Bacalangco E H and Pura C D 1971 Genetics of resistance to brown planthoppers and green leafhoppers in Oryza sativa L Crop Sci 11: 747-750 Chang, T.T et al 1981 Descriptors for rice Oryza sativa L IRRI, Philippines De Candolle 1883.Origins of cultivated plants International Science Library Paris Grist, D H 1975 Rice Fifth edition London Haiyuan yang, Xiang ren, Qingmei weng, Lili zhu and Guangcun He 2002 Molecular mapping and genetic analysis of a rice brown planthopper (Nilaparata lugens Stal) resistance gene Hereditas 136: 39–43 40 Chuyên ngành Công nghệ Sinh học Viện NC&PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 32 - 2010 Trường ĐHCT Ikeda, R and Vaughan D.A 2006 The distribution of resistance genesto the brown plant hopper in rice germplasm International Rice Research Institute, P.O Box 933, Manila, Philippines Jena K K et al 2005 High-resolution of a new brown planthopper (BPH) resistance gene, Bph18(t), and marker-assisted selection for BPH resistance in rice (Oryza sativa L) Theor Appl Genet 112: 288–297 Jennings, P.R., W.R Coffman and H.E Kauffman 1979 Rice improvements International Rice Research Institute, Los Banos, Philippines, pp.186 Kabir, M.A and Khush G.S 1988 Genetic analysis of resistance to brown planthopper in rice (Oryza sativa L) Plant Breed 100: 54-58 Kawaguchi M., Murata K., Ishii T., Takumi S., Mori N., Nakamura C 2001 Assignment of a brown planthopper (Nilaparvata lugens Stal) resistance gene bph4 to the rice chromosome Breed Sci 51:13-18 Kurata N., Nagamura Y., Yamamoto K., Harushima Y., and N sue 1994 A 300 kilobase interval genetic map of rice including 883 expressed sequences Nat Genet 8: 365-372 Lakshminarayana, A.and Khush G.S 1977 New genes for resistance to the brown planthopper in rice Crop Science 17: 97-100 McCouch S.R 1988 Molecular mapping of rice chromosomes Theor Appl Genet 76: 815-829 Mullis K., Erlich H., Arnheim N., Horn G., Saiki R and Scharf S 1989 Process for amplifying, detecting, and/or cloning nucleic acid sequences using a thermostable enzyme US 4800159, January 24 (1989) Nemamoto, lkeda H., R., and Kaneda C 1989 New genes for resistance to brown planthopper, Nilaparvata lugens Stal in rice Jpn J Breed 39: 23-28 Nguyen Thị Lang, D.Barr, Gurder S.Khush, Ning Huang and Bui Chi Buu, 1999 Development of STS Markers to Indentify Brown Planthopper Resistance in a Segregating Population OmonRice 7: 27-28 Olson, M., Hood L., Cantor C., and Botstein D 1989 A common language for physical mapping of the human genome Science 245: 1434-1435 41 Chuyên ngành Công nghệ Sinh học Viện NC&PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 32 - 2010 Trường ĐHCT Phạm Thị Mui and Bui Ba Bong 1999 Evaluation of rice varieties for resistance to brown planthopper in the Mekong Delta OmonRice 7:1-8 Rahman M.L., Jiang W., Chu S.H., Qiao Y, Ham T.H., Woo M.K., Lee J., Khanam M.S., Chin J.H., Jeung J.U., Brar D.S., Jena K.K., Koh H.J 2009 Highresolution mapping of two brown planthopper resistance genes, Bph20(t) and Bph21(t), originating from Oryza minuta.Theor Appl Genet 119: 1237-1246 Rogers S.O., Bendich A.J 1988 Extraction of DNA from plant tissues Plant Molecular Biology Manual 6: l-10 Roscheviez R J 1931 A contribution to the study of rice Tr Prikl Bot Genet Selek 27: 3-133 (in Russ.) Singh J.P et al 1990 Inheritance of resistance to white-backed planthopper, Sogatella furcifera (Horvath) in some rice cultivars Euphytica 46: 95-100 Sogawa K., and Pathak M.D 1976 Mechanism of brown planthopper resistance inMudgo variety in rice (Hemiptera: Delphacidae) Appl Entomol Zool 5: 145– 158 Soundararajan R.P., Kadirvel P., Gunathilagara j.K., Maheswaran M 2004 Mapping of quantitative trait loci associated with resistance to brown planthopper in rice by means of a doubled-haploid population Crop Sci 44: 2214-2220 Su C.C et al 2002 Detection and analysis QTL for resistance to brown planthopper, Nilaparvata lugens (Stal), in rice (Oryza sativa L.) using backcross inbred lines Acta Genet Sin 29: 332-338 Trinh Thi Luy, Pham Thi Thu Ha, Nguyen Thi Lang and Bui Chi Buu 2008 Introgression of a resistance gene to brown plant hopper from Oryza rufipopon to cultilars, OmonRice 16 Wu, P., Zhang G., and Huang N 1996 Identification of QTLs control- ling quantitative characters in rice using RFLP markers Euphytica 89: 349–354 Ying, Z., Xiaoli T and Fengkuan H 2006 Content variations of the secondary compounds in rice plants and their influence on rice resistance to brown plant hopper, Nilaparvata lugens Rice science 13: 75-78 42 Chuyên ngành Công nghệ Sinh học Viện NC&PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 32 - 2010 Trường ĐHCT Zhang Q 2007 Strategies for developing Green Super Rice Proc Natl Acad Sci USA 104: 16402-16409 Trang web http://www.vaas.org.vn/download/caylua/10/059_raynau.htm (Ngày 18/10/2010) http://www.hcmbiotech.com.vn (Ngày 18/10/2010) http://www.khuyennongvn.gov.vn (Ngày 18/10/2010) http://www.festivalluagao.vn (Ngày 18/10/2010) http://cayluongthuc.blogspot.com (Ngày 18/10/2010) http://hau1.info/forum/showthread.php?t=1809 (Ngày 20/10/2010) http://www.mpbio.com/product_info.php?products_id=151260 (Ngày 20/10/2010) 43 Chuyên ngành Công nghệ Sinh học Viện NC&PT Công nghệ Sinh học PHỤ LỤC Phụ lục Bảng 3.10 Kết đo nồng độ nucleic acid Mẫu Nồng độ 260nm 280nm 260nm/280nm 280nm/260nm DNA (µg/ml) 0.4792 0.2389 2.0057 0.4896 239.6 0.1727 0.0839 2.0586 0.4858 86.35 0.4050 0.2117 1.9129 0.5228 202.5 0.5743 0.3015 1.9044 0.5251 287.15 0.2047 0.1007 2.0339 0.4917 102.35 0.5350 0.2822 1.8955 0.5276 267.5 0.7797 0.4146 1.8806 0.5317 389.85 0.7637 0.3768 2.0286 0.4934 396.85 0.2580 0.1234 2.0910 0.4782 129 10 0.8855 0.4660 1.9001 0.5263 442.75 11 0.4662 0.2515 1.8532 0.5396 233.1 12 0.5642 0.2973 1.8980 0.5269 282.1 13 0.3353 0.1802 1.8608 0.5374 167.65 14 0.3360 0.1800 1.8671 0.5356 168 15 0.2485 0.1338 1.8572 0.5384 124.25 16 0.7749 0.4102 1.8889 0.5294 387.45 17 0.5465 0.2694 2.0282 0.4931 273.25 18 0.8612 0.4254 2.0244 0.4940 430.6 19 0.9639 0.4746 2.0311 0.4924 481.95 20 0.9596 0.4739 2.0248 0.4939 479.8 21 0.7589 0.3780 2.0075 0.4981 379.45 22 0.8282 0.4237 1.9546 0.5116 414.1 23 0.3307 0.1647 2.0078 0.4981 165.35 24 0.7280 0.3690 1.9726 0.5069 364 25 1.0119 0.5066 1.9975 0.5006 505.95 26 1.0611 0.5406 1.9628 0.5095 530.55 27 0.7552 0.3666 2.0601 0.4854 377.6 28 1.1767 0.5906 1.9926 0.5019 588.35 29 0.6678 0.3343 1.9977 0.5006 333.9 30 1.1211 0.5622 1.9942 0.5015 560.55 31 0.6310 0.2851 2.2131 0.4519 315.5 32 0.9636 0.4596 2.0965 0.4770 481.8 33 0.3165 0.1597 1.9813 0.5047 158.25 34 1.0049 0.4928 2.0390 0.4904 502.45 Phụ lục Kết PCR với cặp mồi RM190 M 10 11 500bp Hình 4.16 Kết PCR với mồi RM190 giống lúa M: ladder 100bp, giếng 1: OM6018, 2: OM6379, 3: OM6599, 4: Nàng Hoa 9, 5: ĐMT126, 7: ĐMT129, 8: Ptb33, 9: TN1, 10: HĐ1 11: đối chứng âm (H2O) M 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 500bp Hình 4.17 Kết PCR với mồi RM190 22 giống lúa M: ladder 100bp, giếng 12: Nàng Hoa 9, 13: MTL621, 14 15: MTL642, 16: MTL650, 17: MTL660, 18: MTL663, 19: MTL662, 20 21: HĐ1, 22: TN1, 23: OMCS2000, 24: đối chứng âm (H2O) M 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 500bp Hình 4.18 Kết PCR với mồi RM190 21 giống lúa M: ladder 100bp, giếng 12: MTL586, 13: MTL601, 14: MTL603, 15: MTL617, 16: MTL620, 17: MTL638 , 18: đối chứng âm (H2O), 19: MTL640, 20: MTL641, 21: MTL652, 22: HĐ1, 23: TN1, 24: OMCS2000 Phụ lục Kết PCR với cặp mồi 7312.T4A M 10 11 1000bp (A) M 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 1000bp (B) (C) Hình 4.19 Kết PCR với mồi 7312.T4A 18 mẫu lúa M: ladder 100bp, giếng 1: MTL621, 2: MTL638, 3: MTL640, 4: MTL641, 5: MTL642, 6: MTL643, 7: MTL650, 25: HĐ1, 26: TN1, 10: Ptb33, 11, 17 19: đối chứng âm (H2O), 12: OM6379, 13: OM6599, 14: Nàng Hoa 9, 15: OMCS2000, 16: ĐMT126, 18: ĐMT129, 20: MTL586, 21: MTL601, 22: MTL603, 23: MTL617 24: MTL620 Phụ lục Hình ảnh số thiết bị chủ yếu phục vụ cho đề tài Máy PCR BIORAD C2000 Máy chụp hình gel BIORAD UV Bồn điện di Máy ly tâm eppendorf 5417C Máy đo Beckman Coulter U 640 B Hình 4.20 Một số thiết bị phục vụ cho thí nghiệm ... hại rầy nâu 2.2.6 Các loại hình sinh học rầy nâu 2.3 Lúa kháng rầy 2.3.1 Sơ lược đặc tính kháng rầy lúa .9 2.3.2 Gen kháng rầy nâu 10 2.3.3 Một số giống lúa. .. Trường ĐHCT 2.3 Lúa kháng rầy 2.3.1 Sơ lược đặc tính kháng rầy lúa Theo Nguyễn Văn Huỳnh (1997) giống lúa coi kháng rầy nâu, rầy ăn, ở, đẻ trứng phát triển giống Các giống kháng mang một, hai ba... chế kháng sinh tính kháng địi hỏi phải có diện số đặc tính kháng rầy nâu lúa, đồng thời phản ứng rầy nâu giống khơng thuận lợi Tính kháng sinh mà đa số giống kháng rầy có ảnh hưởng bất lợi giống