Bước Đầu Thanh Lọc Gen Kháng Rầy Nâu Trên Một Số Giống Lúa Ở Đồng Bằng Sông Cửu Long Bằng Dấu Phân

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƢỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ VIỆN NGHIÊN CỨU VÀ PHÁT TRIỂN CÔNG NGHỆ SINH HỌC LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC NGÀNH CÔNG NGHỆ SINH HỌC BƢỚC ĐẦU THANH LỌC GEN KHÁNG RẦY NÂU TRÊN MỘT SỐ GIỐNG LÚA Ở ĐỒNG BẰNG SÔNG CỬU LONG BẰNG DẤU PHÂN TỬ SSR CÁN BỘ HƯỚNG DẪN Ts TRẦN NHÂN DŨNG SINH VIÊN THỰC HIỆN PHẠM THỊ PHƢƠNG THÚY MSSV: 3064484 LỚP: CNSHTT K32 Cần Thơ, Tháng 11/2010 PHẦN KÝ DUYỆT CÁN BỘ HƢỚNG DẪN SINH VIÊN THỰC HIỆN Ts Trần Nhân Dũng Phạm Thị Phương Thúy DUYỆT CỦA HỘI ĐỒNG BẢO VỆ LUẬN VĂN ……………………………………………………………………………………… …………………………………………………………………………………………… …………………………………………………………………………………………… …………………………………………………………………………………………… ……………………………………………………………………… Cần Thơ, ngày tháng năm 2010 CHỦ TỊCH HỘI ĐỒNG LỜI CẢM TẠ Để hồn thành tốt luận văn này, bên cạnh nỗ lực thân, em nhận giúp đỡ động viên nhiều người Em xin chân thành cảm tạ đến: Thầy Trần Nhân Dũng tận tình dạy bảo, hướng dẫn, thăm hỏi động viên em suốt q trình làm luận văn Cơ Trần Thị Xuân Mai, anh Trần Văn Bé Năm, anh Nguyễn Vũ Linh, chị Liễu Như Ý, anh Phạm Văn Một quan tâm, bảo giúp đỡ từ em bắt đầu làm đề tài hoàn thành Ban giám đốc Viện Nghiên cứu Phát triển Công nghệ Sinh học thầy cô Viện quan tâm, hỗ trợ tạo điều kiện thuận lợi để em hoàn thành tốt đề tài tốt nghiệp Em xin gởi lời cảm ơn chân thành đến: Các bạn lớp Cơng Nghệ Sinh Học Tiên Tiến khóa 32, người bạn đặc biệt bạn sinh viên Viện NC & PT Công nghệ Sinh học chia sẻ, động viên giúp đỡ nhiệt tình trình học tập sống Con xin gởi lịng tri ân sâu sắc đến ơng bà, cha mẹ, đấng sinh thành nuôi nấng, dạy bảo nên người, em thương yêu động viên giúp đỡ suốt thời gian qua TĨM TẮT Rầy nâu (Nilaparvata lugens Stal.) trùng gây hại lớn ảnh hưởng tới sản lượng lúa gạo nước ta nước khác giới Ứng dụng marker phân tử để xác định gen kháng rầy nâu (BPH) biện pháp hữu hiệu quan trọng chọn tạo giống lúa có khả kháng rầy nâu Trong nghiên cứu này, năm marker phân tử SSR (Simple Sequence Repeats) gồm RM190, RM227, RM260, RM17 RM273 sử dụng để khảo sát gen kháng rầy nâu lúa Phân tích sản phẩm gel agarose 3% cho thấy RM227, RM260 RM273 cho kết đơn hình (có kích thước band DNA nhau) RM190 RM17 cho kết đa hình Tuy nhiên, có marker RM190 cho thấy có liên kết với gen kháng rầy nâu lúa Marrker RM190 cho kích thước band DNA khoảng 130bp mẫu thể tính kháng rầy kích thước khoảng 120bp mẫu thể tính nhiễm rầy Do đó, RM190 có hiệu việc chọn tạo giống lúa kháng rầy nâu Đồng sơng Cửu Long Từ khóa: Rầy nâu, marker phân tử, giống lúa, SSR i MỤC LỤC Trang PHẦN KÝ DUYỆT LỜI CẢM TẠ TÓM TẮT .i MỤC LỤC ii DANH SÁCH BẢNG vi DANH SÁCH HÌNH vii CÁC TỪ VIẾT TẮT viii CHƢƠNG GIỚI THIỆU CHƢƠNG LƢỢC KHẢO TÀI LIỆU 2.1 Giới thiệu lúa 2.1.1 Tầm quan trọng lúa nước ta 2.1.2 Nguồn gốc lúa 2.1.3 Phân loại 2.2 Sơ lƣợc rầy nâu 2.2.1 Phân bố 2.2.2 Ký chủ 2.2.3 Đặc điểm hình thái 2.2.4 Tập quán sinh sống 2.2.5 Đặc điểm gây hại 2.2.6 Đặc điểm truyền bệnh 2.2.7 Tình hình gây hại 10 2.2.9 Cách phòng trừ bệnh rầy nâu lúa 11 2.3 Sơ lƣợc tính kháng rầy nâu 13 2.3.1 Khái niệm tính kháng rầy nâu giống lúa 13 2.3.2 Phân loại tính kháng .13 2.3.2.1 Tính kháng khơng di truyền 13 2.3.2.2 Tính kháng di truyền .13 ii 2.3.3 Cơ chế tính kháng 14 2.3.3.1 Cơ chế khơng ưa thích 14 2.3.3.2 Cơ chế kháng sinh 15 2.3.3.3 Cơ chế chịu đựng 15 2.4 Giống lúa kháng rầy nâu 15 2.5 Gen kháng loại hình sinh học rầy nâu 16 2.5.1 Xếp hạng nhóm gen kháng rầy nâu 16 2.5.2 Gen kháng rầy nâu 17 2.6 Kỹ thuật PCR 18 2.7 Kỹ thuật SSR (Simple Sequence Repeats - trình tự lặp lại đơn giản) 19 2.8 Một số nghiên cứu sử dụng dấu (marker) phân tử 20 CHƢƠNG PHƢƠNG TIỆN VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 23 3.1 Địa điểm thời gian 23 3.2 Phƣơng tiện thí nghiệm 23 3.2.1 Thiết bị 23 3.2.2 Hóa chất .23 3.2.3 Nguyên liệu 23 3.3 Phƣơng pháp thí nghiệm 23 3.3.1 Gieo lúa 23 3.3.2 Trích DNA 24 3.3.3 Xác định hàm lượng độ tinh DNA phương pháp đo quang phổ hấp thụ 26 3.3.4 Kỹ thuật PCR 27 3.3.5 Điện di 28 3.3.6 Gel Agarose 29 3.4 Thí nghiệm 1: Khảo sát tính đa hình marker RM190 với gen kháng rầy nâu giống lúa ĐBSCL 29 3.5 Thí nghiệm 2: Khảo sát tính đa hình marker RM227 với gen kháng rầy nâu giống lúa ĐBSCL 30 iii 3.6 Thí nghiệm 3: Khảo sát tính đa hình marker RM260 với gen kháng rầy nâu giống lúa ĐBSCL 30 3.6.1 Nghiệm thức 1: Chu trình nhiệt PCR với nhiệt độ bắt cặp (nhiệt độ gắn mồi) tăng dần 31 3.6.2 Nghiệm thức 2: Chu trình nhiệt PCR cho RM260 với nhiệt độ bắt cặp 540C 31 3.7 Thí nghiệm 4: Khảo sát tính đa hình marker RM17 với gen kháng rầy nâu giống lúa ĐBSCL 31 3.7.1 Nghiệm thức 1: Thực PCR cho RM17 có thành phần phản ứng theo cơng thức bảng 32 3.7.2 Nghiệm thức 2: Thực PCR cho RM17 có thành phần phản ứng theo công thức bảng 32 3.8 Thí nghiệm 5: Khảo sát tính đa hình marker RM273 với gen kháng rầy nâu giống lúa ĐBSCL 33 3.8.1 Nghiệm thức 1: Thực PCR cho RM273 có thành phần phản ứng theo cơng thức bảng chu trình nhiệt theo bảng 11 33 3.8.2 Nghiệm thức 2: Thực PCR cho RM273 có thành phần phản ứng theo công thức bảng chu trình nhiệt theo bảng 12 33 3.8.3 Nghiệm thức 3: Thực PCR cho RM273 có thành phần phản ứng theo công thức bảng chu trình nhiệt theo bảng 12 34 CHƢƠNG KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 35 4.1 Thí nghiệm 1: Khảo sát tính đa hình marker RM190 với gen kháng rầy nâu giống lúa ĐBSCL 35 4.2 Thí nghiệm 2: Khảo sát tính đa hình marker RM227 với gen kháng rầy nâu giống lúa ĐBSCL 38 4.3 Thí nghiệm 3: Khảo sát tính đa hình marker RM260 với gen kháng rầy nâu giống lúa ĐBSCL 39 4.3.1 Nghiệm thức 1: Chu trình nhiệt PCR với nhiệt độ bắt cặp (nhiệt độ gắn mồi) tăng dần 39 iv 4.3.2 Nghiệm thức 2: Chu trình nhiệt PCR RM260 với nhiệt độ bắt cặp 540C 39 4.4 Thí nghiệm 4: Khảo sát tính đa hình marker RM17 với gen kháng rầy nâu giống lúa ĐBSCL 40 4.4.1 Nghiệm thức 1: Thực PCR cho RM17 có thành phần phản ứng theo cơng thức bảng chu trình nhiệt theo bảng 10 40 4.4.2 Nghiệm thức 2: Thực PCR cho RM17 có thành phần phản ứng theo cơng thức bảng chu trình nhiệt bảng 10 41 4.5 Thí nghiệm 5: Khảo sát tính đa hình marker RM273 với gen kháng rầy nâu giống lúa ĐBSCL 42 4.5.1 Nghiệm thức 1: Thực PCR cho RM273 có thành phần phản ứng theo cơng thức bảng chu trình nhiệt theo bảng 11 42 4.5.2 Nghiệm thức 2: Thực PCR cho RM273 có thành phần phản ứng theo cơng thức bảng chu trình nhiệt theo bảng 12 43 4.5.3 Nghiệm thức 3: Thực PCR cho RM273 có thành phần phản ứng theo công thức bảng chu trình nhiệt theo bảng 12 44 CHƢƠNG KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 46 5.1 Kết luận 46 5.2 Kiến nghị 46 TÀI LIỆU THAM KHẢO 47 PHỤ LỤC Phụ lục Đo nồng độ nucleic acid giống lúa (mỗi giống chọn mẫu có kết tốt nhất) Phụ lục Hình gel Phụ lục Danh sách giống lúa đƣợc lọc đánh giá tính kháng rầy nâu v DANH SÁCH BẢNG Bảng Danh sách giống lúa 24 Bảng Danh sách primer sử dụng phản ứng PCR 27 Bảng Thành phần hóa chất phản ứng PCR 28 Bảng Mối liên hệ nồng độ gel kích thước phân tử DNA 29 Bảng Chu trình nhiệt PCR RM190 29 Bảng Chu trình nhiệt PCR RM227 30 Bảng Chu trình nhiệt PCR RM260 theo nghiệm thức 31 Bảng Chu trình nhiệt PCR RM260 theo nghiệm thức 31 Bảng Thành phần hóa chất phản ứng PCR RM17 theo nghiệm thức 32 Bảng 10 Chu trình nhiệt PCR RM17 32 Bảng 11 Chu trình nhiệt PCR RM273 nghiệm thức 33 Bảng 12 Chu trình nhiệt PCR RM273 nghiệm thức 33 Bảng 13 Danh sách lúa kháng rầy nâu marker RM190 37 vi DANH SÁCH HÌNH Hình Cây lúa Hình Rầy nâu .7 Hình Vòng đời rầy nâu Hình Lúa bị bệnh VLLXL Hình Kết điện di sản phẩm PCR gel agarose 3% sử dụng marker RM190 có thành phần phản ứng theo công thức (Bảng 3) 35 Hình Kết điện di sản phẩm PCR gel agarose 3% sử dụng marker RM190 35 Hình Kết điện di sản phẩm PCR gel agarose 3% sử dụng marker RM227 38 Hình Kết điện di sản phẩm PCR gel agarose 3% sử dụng marker RM260 với nhiệt độ bắt cặp tăng dần 39 Hình Kết điện di sản phẩm PCR gel agarose 3% sử dụng marker RM260 với nhiệt độ bắt cặp 540C .40 Hình 10 Kết điện di sản phẩm PCR gel agarose 3% sử dụng marker RM17 theo công thức bảng chu trình nhiệt bảng 11 .41 Hình 11 Kết điện di sản phẩm PCR gel agarose 3% sử dụng marker RM17 theo cơng thức bảng chu trình nhiệt bảng 10 .41 Hình 12 Kết điện di sản phẩm PCR gel agarose 3% sử dụng marker RM273 theo công thức bảng chu trình nhiệt bảng 11 43 Hình 13 Kết điện di sản phẩm PCR gel agarose 3% sử dụng marker RM273 theo cơng thức bảng chu trình nhiệt bảng 12 43 Hình 14 Kết điện di sản phẩm PCR gel agarose 3% sử dụng marker RM273 theo công thức bảng chu trình nhiệt bảng 12 44 vii Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 32 – 2010 Trường ĐHCT Theo nghiên cứu từ Rongbai et al (2006), có gen kháng rầy nâu chưa xác định rõ tìm thấy lập đồ từ giống lúa 2183, gen có vị trí gần cánh dài nhiễm sắc thể số 12 có khoảng cách di truyền 16,7 cM marker RM17 Khi phân tích sản phẩm PCR marker RM17 có đa hình, giống kháng 2183 cho band DNA với kích thước khoảng 180bp, cịn giống nhiễm TN1 cho band DNA có kích thước 200bp Tuy nhiên, thí nghiệm này, band DNA thu có kích thước khoảng 170bp, 180bp 190bp (Hình 11) Tuy cịn số band phụ khơng đáng kể band sáng rõ nét Riêng giống chuẩn nhiễm TN1 cho vạch DNA với kích thước 170bp 180bp Từ điều kết luận RM17 khơng có tính đặc hiệu liên kết với gen kháng rầy nâu giống lúa ĐBSCL Năm 2004, Trần Minh Bằng sử dụng marker RM17 nhằm xác định tính đa hình tính trạng mùi thơm lúa phân lập giống thể tính thơm mức độ: thơm, thơm nhẹ không thơm Căn để đánh giá đặc tính thơm dòng lúa nghiên cứu so sánh với hai giống đối chứng IR64 (không thơm) Khao Dawk Mali 105 (thơm) 22 giống lúa nghiên cứu tính trạng mùi thơm sử dụng marker RM17 kết cho thấy band DNA thể tính đa hình ba mức độ khơng xuất band dị hợp tử Tác giả nhận định đặc tính thơm đặc tính phức tạp, khó xác định dễ thay đổi Đồng thời, đặc tính bị ảnh hưởng nhiều yếu tố như: nhiệt độ, đất đai, dinh dưỡng phân bón… làm thay đổi đặc tính mùi thơm giống lúa Tác giả đề nghị cần tiếp tục khẳng định lại giống lúa phân lập thơm cách nhân giống lên số lượng lớn để đủ lượng hạt nấu thử mùi cơm nấu Marker RM17 cần tiếp tục nghiên cứu lập đồ di truyền đối tượng giống lúa kháng rầy giống lúa có mùi thơm để khảo sát rõ xem marker có liên kết chặt chẽ đặc tính lúa 4.5 Thí nghiệm 5: Khảo sát tính đa hình marker RM273 với gen kháng rầy nâu giống lúa ĐBSCL 4.5.1 Nghiệm thức 1: Thực PCR cho RM273 có thành phần phản ứng theo công thức bảng chu trình nhiệt theo bảng 11 Mẫu DNA lúa sử dụng TN1 Thực chu trình nhiệt với nhiệt độ bắt cặp tăng dần 57 oC, 59 oC, 61 oC 62oC Chuyên ngành Công nghệ Sinh học tiên tiến 42 Viện NC & PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 32 – 2010 Trường ĐHCT M 600bp Hình 12 Kết điện di sản phẩm PCR gel agarose 3% sử dụng marker RM273 theo công thức bảng chu trình nhiệt bảng 11 Giếng 1: 57 oC, giếng 2: 59 oC, giếng 3: 61 oC, giếng 4: 62 oC, M: Ladder 100bp Dựa vào hình 12, ta thấy nhiệt độ bắt cặp 57 oC 62 oC cho band DNA sáng rõ Ở nhiệt độ bắt cặp chọn 57 oC sản phẩm khơng cho band phụ mờ 4.5.2 Nghiệm thức 2: Thực PCR cho RM273 có thành phần phản ứng theo cơng thức bảng chu trình nhiệt theo bảng 12 Chu trình nhiệt PCR RM273 nghiệm thức thực với nhiệt độ gắn mồi 570C M 10 11 12 13 14 15 16 17 600bp Hình 13 Kết điện di sản phẩm PCR gel agarose 3% sử dụng marker RM273 theo công thức bảng chu trình nhiệt bảng 12 M: Ladder 100bp, giếng 2: TN1, giếng 3: PTB33, giếng 4: HĐ1, giếng 5: MTL512, giếng 6: MTL547, giếng 7: TP1, giếng 8: OM4884, giếng 9: OM5490, giếng 10: OM6070, giếng 11: OM6976, giếng 12: OM7340, giếng 13: OM7398, giếng 14: OM8232, giếng 15: OMCF46, giếng 16: VND95-20, giếng 17: Đối chứng âm (H2O) Chuyên ngành Công nghệ Sinh học tiên tiến 43 Viện NC & PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 32 – 2010 Trường ĐHCT Hình 13 cho thấy band DNA xuất đa hình chưa rõ nét band dày sáng nên chưa quan sát tách rõ band DNA Do nghiệm thức ta giảm thể tích DNA từ 2µl xuống 1µl nhằm giảm nồng độ DNA để kết band DNA không dày tách rõ nét 4.5.3 Nghiệm thức 3: Thực PCR cho RM273 có thành phần phản ứng theo công thức bảng chu trình nhiệt theo bảng 12 10 11 12 13 14 15 16 M 600bp 200bp Hình 14 Kết điện di sản phẩm PCR gel agarose 3% sử dụng marker RM273 theo công thức bảng chu trình nhiệt bảng 12 Giếng 1: TN1, giếng 2: PTB33, giếng 3: HĐ1, giếng 4: MTL560, giếng 5: TP2, giếng 6: OM4092, giếng 7: OM5953, giếng 8: OM6624, giếng 9: OM6916, giếng 10: OM6992, giếng 11: OM7364, giếng 12: OM8923, giếng 13: OM-SUB1, giếng 14: VND95-20, giếng 15: OM5464, giếng 16: Đối chứng âm (H2O), giếng 17: Ladder 100bp Qua nghiệm thức, sản phẩm PCR RM273 tối ưu với thành phần hóa chất phản ứng theo công thức bảng chu trình nhiệt bảng 12 Theo Rongbai et al (2006), marker RM273 nằm vị trí cánh dài nhiễm sắc thể số đồng phân ly với loại gen kháng rầy nâu bph18(t) RM273 có khoảng cách di truyền 6,0 cM, nằm phía gen bph18(t) Khi phân tích sản phẩm PCR RM273, tác giả thu band DNA có trọng lượng phân tử 200bp với đối chứng chuẩn nhiễm giống lúa TN1 band DNA có kích thước phân tử 220bp với đối chứng chuẩn kháng giống lúa 2183 Thí nghiệm thực có đối chứng chuẩn nhiễm TN1 có kích thước phân tử band DNA khoảng 200bp (khơng có mẫu đối chứng kháng 2183) Chuyên ngành Công nghệ Sinh học tiên tiến 44 Viện NC & PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 32 – 2010 Trường ĐHCT Nhìn chung chưa thấy tính đa hình xuất rõ nét giống lúa ĐBSCL (Hình 14) Vì phạm vi đề tài hạn hẹp thời gian khơng cho phép nên thí nghiệm RM273 cịn hạn chế Tuy tối ưu hóa thành phần phản ứng chu trình nhiệt PCR chưa kiểm tra sản phẩm PCR với nồng độ gel agarose khác chưa có mẫu đối chứng kháng 2183 mà Rongbai et al (2006) sử dụng để kiểm tra tính đa hình Do đề nghị khảo sát thêm nồng độ agarose phù hợp cho marker RM273 sử dụng giống 2183 làm chuẩn kháng Chuyên ngành Công nghệ Sinh học tiên tiến 45 Viện NC & PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 32 – 2010 Trường ĐHCT CHƢƠNG KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 5.1 Kết luận RM190, RM227, RM17 RM273 tối ưu hóa thành phần phản ứng chu trình nhiệt PCR Riêng marker RM260 chưa cho kết rõ nét gel agarose 3% Marker RM190 cho kết đa hình gel agarose 3%, band 130bp kháng rầy nâu band 120bp nhiễm rầy Từ marker RM190, kết khảo sát 14 giống lúa nhiễm rầy 26 giống kháng rầy (Bảng 13) Marker RM227, RM260 RM273 biểu kết band đơn hình gel agarose 3% Marker RM17 thể tính đa hình khơng có liên kết với gen kháng rầy nâu giống chuẩn nhiễm TN1 thể band dị hợp tử gel Có thể RM17 liên kết với tính trạng mùi thơm lúa 5.2 Kiến nghị Tối ưu hóa chu trình nhiệt cho RM260 Marker RM17 cần tiếp tục nghiên cứu lập đồ di truyền đối tượng giống lúa kháng rầy giống lúa có mùi thơm để khảo sát rõ xem marker có liên kết chặt chẽ đặc tính lúa Khảo sát thêm nồng độ gel agarose khác cho marker RM273 sử dụng thêm giống đối chứng kháng 2183 để kiểm tra lại tính đa hình Tiếp tục khảo sát tính liên kết marker RM190 với số giống lúa khác Chuyên ngành Công nghệ Sinh học tiên tiến 46 Viện NC & PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 32 – 2010 Trường ĐHCT TÀI LIỆU THAM KHẢO Tiếng việt Bùi Chí Bửu 2006 Giống lúa cao sản tình hình rầy nâu bộc phát ĐBSCL Tạp chí nơng nghiệp phát triển nơng thơn 9: 16-17 Bùi Chí Bửu, K Reganayaki A.S Reddy 1997 Phân tích di truyền tính kháng rầy nâu giống lúa hoang nhờ marker Kết nghiên cứu Khoa học 1977 - 1997, Viện Lúa ĐBSCL, Nxb Nơng Nghiệp Thành Phố Hồ Chí Minh Bùi Chí Bửu Nguyễn Thị Lang 2007 Ứng dụng cơng nghệ sinh học cải tiến giống lúa, Nxb Nông Nghiệp Hà Nội Bùi Chí Bửu Nguyễn Thị Lang 2009 Sản xuất lúa gạo việt nam - Thành tựu & thách thức Festival Lúa Gạo Việt Nam, Hậu Giang Hồ Huỳnh Thùy Dương 2003 Sinh học Phân tử Nxb Giáo dục Lưu Thị Ngọc Huyền, Vũ Đức Quang, Lưu Minh Cúc, Nguyễn Thị Lang Thiều Văn Đường 2009 Tạp chí nơng nghiệp phát triển nơng thơn 7: 9-13 Lưu Thị Ngọc Huyền, Vũ Đức Quang Thiều Văn Đường 2003 Định vị gen kháng rầy nâu BPH4 BPH6 nhiễm sắc thể lúa Tạp chí di truyền học ứng dụng 2: 29-33 Lý Tiến 2010 Khảo sát số marker phân tử dùng chọn giống lúa kháng rầy nâu Luận văn tốt nghiệp đại học ngành Công nghệ sinh học, Đại học Cần Thơ Nguyễn Đức Khiêm, 2006 Giáo trình Cơn Trùng Nơng Nghiệp Nxb Nông Nghiệp Hà Nội, trang 99-104 Nguyễn Ngọc Đệ 2007 Giáo trình lúa, Khoa Nơng nghiệp Sinh học ứng dụng, Đại học Cần Thơ Nguyễn Thị Giáng Đan 2008 Phát gen kháng rầy nâu số giống lúa Đồng sông Cửu Long dấu phân tử Luận văn tốt nghiệp đại học ngành Công nghệ sinh học, Đại học Cần Thơ Nguyễn Thị Lang, Trần Thị Thu Hằng, Phạm Thị Thu Hà, Bùi Thị Dương Khuyều, Phạm Công Thành, Nguyễn Thạch Cân, Bùi Chí Bửu 2006 Ứng dụng STS (Sequence tagged sites) SSR (Simple sequence repeat) marker để đánh giá giống chống chịu rầy nâu lúa Oryza sativa L Tạp chí nơng nghiệp phát triển nơng thơn 1: 11-15 Chuyên ngành Công nghệ Sinh học tiên tiến 47 Viện NC & PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 32 – 2010 Trường ĐHCT Nguyễn Văn Đĩnh Trần Thị Liên 2004 Khảo sát tính kháng rầy nâu (Nilaparvata lugens Stal.) giống lúa Đồng Bằng Sơng Hồng miền núi phía Bắc Việt Nam Báo cáo Khoa Học hội nghị côn trùng học tồn quốc lần 5: 335-339, NXB Nơng Nghiệp Hà Nội Nguyễn Văn Huỳnh 1997 Bài giảng giống kháng côn trùng Tủ sách Đại học Cần Thơ, trang 25-46 Nguyễn Văn Huỳnh Lê Thị Sen 2004 Giáo trình trùng nơng nghiệp Trường Đại học Cần Thơ, trang 25-46 Nguyễn Văn Luật 2002 Cây lúa Việt Nam kỷ 20, Nxb Nông Nghiệp Hà Nội Phạm Văn Kim 2000 Bài giảng nguyên lý bệnh hại trồng Khoa Nông Nghiệp trường Đại học Cần Thơ Tủ sách Đại học Cần Thơ, trang 37 Phạm Văn Lầm 2006 Những điều cần biết rầy nâu biện pháp phòng trừ NXB Lao Động Phạm Văn Một 2010 Thanh lọc sử dụng dấu phân tử nhằm phát giống lúa mang gen kháng rầy nâu Cần Thơ Luận văn tốt nghiệp đại học ngành Công nghệ sinh học, Đại học Cần Thơ Trần Đình Long 1997 Chọn giống trồng Nxb Nông nghiệp Hà Nội Viện Khoa học kỹ thuật Nông nghiệp Việt Nam, trang 151-164 Trần Minh Bằng 2004 Bước đầu phát dấu phân tử liên kết với tính thơm số giống lúa Đồng sông Cửu Long Luận văn tốt nghiệp đại học ngành Trồng trọt, Đại học Cần Thơ Trần Nhân Dũng, Lý Tiến, Nguyễn Vũ Linh Trần Thị Xuân Mai 2010 Khảo sát số thị phân tử dùng chọn tạo giống lúa kháng rầy nâu (Nilaparvata lugens Stal.) vùng Đồng sơng Cửu Long, Việt Nam Tạp chí Cơng nghệ Sinh học (3A): 573-579 Trịnh Đình Đạt 2008 Cơng nghệ sinh học tập bốn: công nghệ di truyền, Nxb Giáo dục Tùng Anh 2009 Khảo sát hệ protein số giống lúa kháng rầy Đồng Bằng Sông Cửu Long kỹ thuật điện di Luận văn tốt nghiệp đại học ngành Công nghệ sinh học, Đại học Cần Thơ Chuyên ngành Công nghệ Sinh học tiên tiến 48 Viện NC & PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 32 – 2010 Trường ĐHCT Tiếng Anh Alam, S.N and M.B Cohen 1998 Detection and analysis of QTLs for resistance to the brown planthopper, Nilaparvata lugens, in a doubled-haploid rice population Theor Appl Genet 97: 1370-1379 Athwal, D.S., M.D Pathak, E.H Bacalangco and C.D Pura 1971 Genetics of resistance to brown planthoppers and green leafhoppers in Oryza sativa L Crop Sci 11: 747-750 Brar, D.S., P.S Virk, K.K Jena and G.S Khush 2009 Breeding for resistance to planthoppers in rice Los Banos (Philippines): 401-428 Chang, T.T 1976 The rice culture Philosophical Transactions of the Royal Society London, B, 275:143-157 Chen, J.W., L Wang, X.F Pang Q.H Pan 2006 Gentic analysis and fine mapping of a rice brown planthopper (Nilaparvata lugens Stal.) resistance gen bph19(t) Mol Gen Genomics 275: 321-329 Chowdhury, K.A and S.S Ghosh 1953 Rice in ancient in India Sci Cult.19: 207209 De Candolle 1883.Origins of cultivated plants International Science Library Paris De Datta, S.K 1981 Principles and Practices of Rice Production John Wiley, New York Grist, D.H 1975 Rice Fifth edition London Ikeda, R and D.A.Vaughan 2006 The distribution of resistance genesto the brown planthopper in rice germplasm International Rice Research Institute, P.O Box 933, Manila, Philippines Ishii, T., D.S Brar, D.S Multani and G.S Khush 1994 Molecular tagging of genes for brown planthopper resistance and earliness introgressed from Oryza australiensis into cultivated rice, O sativa Genome 37: 217-221 Jairin, J 2009 The current status of marker assisted breeding for brown planthopper resistance in Thailand Jena, K.K., J.U Jeung, J.H Lee, H.C Choi and D.S Brar 2005 High-resolution of a new brown planthopper (BPH) resistance gene, Bph18(t), and marker-assisted Chuyên ngành Công nghệ Sinh học tiên tiến 49 Viện NC & PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 32 – 2010 Trường ĐHCT selection for BPH resistance in rice (Oryza sativa L), Theor Appl Genet 112: 288-297 Kabir, M.A and G.S Khush 1988 Genetic analysis of resistance to brown planthopper in rice (Oryza sativa L) Plant Breed 100: 54-58 Kawaguchi, M., K Murata, T Ishii, S Takumi, N Mori and C Nakamura 2001 Assignment of a Brown Planthopper (Nilaparvata lugens Stal) Resistance Gene bph4 to the Rice Chromosome Breeding Science 51: 13-18 Kimmin, F.M 1989 Electrical penetration graphs from Nilaparvara lugens on resistant and susceptible rice varieties Entomol Exp Appl 50: 69-79 Kogan, M and E.F Ortman 1978 Antixenosis a new term proposed to defined Painter’s “non preference” modality of resistance Bull Entomol Soc Am 24: 175-176 Lakshminarayana, A and G.S Khush 1977 New genes for resistance to the brown planthopper in rice Crop Science 17: 97-100 Lang, N.T and B.C Buu 2003 Genetic And Physical Maps Of Gene Bph10 Controling Brown Plant Hopper Resistance In Rice (Oryza sativa L.) Omonrice 11: 35-40 Lang, N.T., D Barr, G.S Khush, N Huang and B.C Buu 1999 Development of STS Markers to Indentify Brown Planthopper Resistance in a Segregating Population Omonrice 7: 27-28 Li-Hong, S., W.C Ming, S.C Chao, L.Y Qiang, Z.H Qu and W.J Min 2006 Mapping and Marker-assisted Selection of a Brown Planthopper Resistance Gene bph2 in Rice (Oryza sativa L.) Acta Gentica Sinica 33: 717-723 Luy, T.T, P.T.T Ha, N.T Lang, B.C Buu 2008 Introgression of a resistance gene to brown planthopper from Oryza rufipopon to cultilars, Omonrice 16, 2008 Nemamoto, H., R lkeda and C Kaneda 1989 New genes for resistance to brown planthopper, Nilaparvata lugens Stal in rice Jpn J Breed 39: 23-28 Painter, R.H 1951 Insect resistance in crop plants The Macmillan Co., New York Rahman, M.L., W Jaing, S.H Chu, Y Qiao, T.H Ham and M.K Woo 2009 Highresolution mapping of two rice brown planthopper resistance gene, Bph20(t) and Bph21(t), originating from Oryza minuta, Theor Appl Genet 119: 1237-1246 Chuyên ngành Công nghệ Sinh học tiên tiến 50 Viện NC & PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 32 – 2010 Trường ĐHCT Rongbai, L., L Lishu, W Sumei, W Yanping, C Yingzhi, B Delang, Y Lang, H Fengkuan, L Weili, Z Xiangjun, L Xiaoyong, Y Xingqing and W Yuanwen 2006 The Evaluation and Utilization of New Genes for Brown Planthopper Resistance in Common Wild Rice (Oryza rufipogon Griff.) Molecular Plant Breeding 4: 365-371 Roscheviez, R.J 1931 A contribution to the study of rice Tr Prikl Bot Genet Selek 27: 3-133 (in Russ.) Sampath, S 1964 Suggestions for a revision of the genus Oryza In Rice Genetics and Cytogenetics, Proc Symp., Los Banos, Philippines, Elsevier, Amsterdam, p 2223 Soundararajan, R.P., P Kadirvel , J.K Gunathilagara and M Maheswaran 2004 Mapping of quantitative trait loci associated with resistance to brown planthopper in rice by means of a doubled-haploid population Crop Sci 44: 2214-2220 Ying, Z., T Xiaoli and H Fenkunkan 2006 Content variations of the secondary compounds in rice plants and their influence on rice resistance to brown planthopper, Nilaparvata lugens Rice science 13(1): 75-78 Zhang, Q 2007 Strategies for developing Green Super Rice Proc Natl Acad Sci USA 104: 16402-16409 Chuyên ngành Công nghệ Sinh học tiên tiến 51 Viện NC & PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 32 – 2010 Trường ĐHCT Trang web http://chicucbvtvlamdong.com/cacquytrinhmohinh/raynau.pdf (ngày 30/10/2010) http://snnptnt.thanhhoa.gov.vn/Agr/picturenews/vang%20lun%203.jpg (ngày 01/11/2010) http://www.baocantho.com.vn/?mod=detnews&catid=72&p=&id=66639 (ngày 05/11/2010) http://www.baodongnai.com.vn/default.aspx?tabid=564&idmid=2&ItemID=48701 (ngày 27/10/2010) http://www.clrri.org/rice/var/raynau.pdf (ngày 27/10/2010) http://www.flmnh.ufl.edu/cowries/amplify.html (ngày 31/10/2010) http://www.khuyennongvn.gov.vn/g-ttdh/tinh-hinh-dich-ray-nau-benh-vang-lun-lunxoan-la-cac-tinh-phia-nam/view (ngày 31/10/2010) Chuyên ngành Công nghệ Sinh học tiên tiến 52 Viện NC & PT Công nghệ Sinh học PHỤ LỤC Phụ lục Đo nồng độ nucleic acid giống lúa (mỗi giống chọn mẫu có kết tốt nhất) Bảng 14 Bảng đo nồng độ nucleic acid giống lúa Nồng độ STT Tên mẫu 260nm 280nm 260/280 280/260 (nm) (nm) DNA (ng/µl) MTL567 1,0067 0,5029 2,0016 0,4996 503,35 MTL577 1,6213 0,8077 2,0074 0,4982 810,65 MTL587 1,1211 0,5643 1,9865 0,5034 560,55 MTL600 0,8215 0,4186 1,9625 0,5095 410,75 MTL608 0,3894 0,1970 1,9768 0,5059 194,7 MTL612 1,3203 0,6616 1,9957 0,5011 660,15 MTL616 0,8684 0,4373 1,9857 0,5036 434,2 MTL631 2,1260 1,1327 1,8769 0,5328 1063 MTL634 1,0719 0,5365 1,9978 0,5006 535,95 10 MTL648 1,2047 0,6097 1,9759 0,5061 602,35 11 MTL655 1,4611 0,7348 1,9885 0,5029 730,55 12 MTL656 2,4062 1,3328 1,8054 0,5539 1203,1 13 MTL659 1,3611 0,6916 1,9682 0,5081 680,55 14 MTL661 1,5496 0,7828 1,9795 0,5052 774,8 15 MTL664 1,4881 0,7404 2,0098 0,4976 744,05 16 MTL560 0,8076 0,3865 2,0898 0,4785 403,8 17 TP2 0,6125 0,3120 1,9630 0,5094 306,25 18 OM4092 2,0608 1,0466 1,9691 0,4840 1030,4 19 OM5953 0,3444 0,1910 1,8029 0,5549 172,2 20 OM6624 0,8737 0,4378 1,9955 0,5011 436,85 Nồng độ STT Tên mẫu 260nm 280nm 260/280 280/260 (nm) (nm) DNA (ng/µl) 21 OM6916 0,2922 0,1481 1,9724 0,5070 146,1 22 OM6992 0,6497 0,3437 1,8902 0,5290 324,85 23 OM7364 0,9698 0,5085 1,9073 0,5243 484,9 24 OM8923 1,3942 0,7213 1,9329 0,5174 697,1 25 OM-SUB1 1,0002 0,5287 1,8919 0,5286 500,1 26 OMCS2000 0,7197 0,3610 1,9937 0,5016 359,85 27 OM5464 0,3573 0,1813 1,9711 0,5072 178,65 28 MTL512 0,2985 0,1514 1,9719 0,5071 149,25 29 MTL547 0,6795 0,3495 1,9440 0,5144 339,75 30 TP1 0,6838 0,3563 1,9192 0,5210 341,9 31 OM4884 0,9264 0,4721 1,9622 0,5096 463,2 32 OM5490 0,8545 0,4354 1,9625 0,5095 427,25 33 OM6070 1,0054 0,5045 1,9931 0,5017 502,7 34 OM6976 1,1924 0,5887 2,0258 0,4938 596,2 35 OM7340 0,8482 0,4168 2,0348 0,4915 424,1 36 OM7398 0,2775 0,1483 1,8710 0,5345 138,75 37 OM8232 0,8383 0,4202 1,9951 0,5012 419,15 38 OMCF46 0,9458 0,4813 1,9650 0,5089 472,9 39 VND95-20 0,2303 0,1206 1,9155 0,5221 115,15 40 TN1 (chuẩn nhiễm) 0,6695 0,3371 1,9860 0,5035 334,75 41 PTB33 0,6310 0,2851 2,2131 0,4519 315,5 42 HĐ1 (chuẩn kháng) 0,9636 0,4596 2,0965 0,4770 481,8 Phụ lục Hình gel 10 11 12 13 14 15 16 M 600bp 130bp 120bp Hình 15 Kết điện di sản phẩm PCR sử dụng marker RM190 Giếng 1: TN1, giếng 2: PTB33, giếng 3: HĐ1, giếng 4: MTL512, giếng 5: MTL547, giếng 6: TP1, giếng 7: OM4884, giếng 8: OM5490, giếng 9: OM6070, giếng 10: OM6976, giếng 11: OM7340, giếng 12: OM7398, giếng 13: OM8232, giếng 14: OMCF46, giếng 15: VND95-20, giếng 16: Đối chứng âm (H2O), M: Ladder 100bp 10 11 12 13 14 15 16 M 600bp 120bp 130bp Hình 16 Kết điện di sản phẩm PCR sử dụng marker RM190 Giếng 1: PTB33, giếng 2: HĐ1, giếng 3: MTL560, giếng 4: TP2, giếng 5: OM4092, giếng 6: OM5953, giếng 7: OM6624, giếng 8: OM6916, giếng 9: OM6992, giếng 10: OM7364, giếng 11: OM8923, giếng 12: OM-SUB1, giếng 13: OMCS2000, giếng 14: OM5464, giếng 15: Đối chứng âm (H2O), giếng 16: TN1, M: Ladder 100bp Phụ lục Danh sách giống lúa đƣợc lọc đánh giá tính kháng rầy nâu Trong 42 giống lúa sử dụng để phát gen kháng rầy nâu có 15 giống Miền Tây lúa (MTL) lọc kiểm tra tính kháng rầy kiểu hình Bảng 15 Danh sách giống lúa đánh giá tính kháng rầy nâu kiểu hình STT Giống lúa Vụ Cấp MTL567 HT07 3,7 MTL577 HT07 3,0 MTL587 HT08 4,0 MTL600 HT08 2,0 MTL608 HT08 3,0 MTL612 HT08 3,0 MTL616 HT08 3,0 MTL631 HT09 2,3 MTL634 HT09 1,5 10 MTL648 HT09 2,3 11 MTL655 HT09 2,3 12 MTL656 HT09 1,7 13 MTL659 HT09 1,7 14 MTL661 HT09 3,0 15 MTL664 HT09 3,0 Bảng 16 Cấp hại triệu chứng mạ bị hại Cấp hại Tỷ lệ chết rầy triệu chứng mạ ≥ 70% rầy chết, mạ khỏe < 70% rầy chết, mạ khỏe Cây mạ bị biến vàng phận (≤50%) Hầu hết phận bị biến vàng (>50%) Cây mạ héo Cây mạ chết Bảng 17 Cấp hại mức độ kháng rầy nâu Cấp hại Mức độ kháng Cấp – cấp Kháng (K) Cấp 3,1 – cấp 4,5 Kháng vừa (KV) Cấp 4,6 – cấp 5,5 Nhiễm vừa (NV) Cấp 5,6 – cấp 7,0 Nhiễm (N) Cấp 7,1 – cấp Nhiễm nặng (NN) ... kháng rầy nâu 2.3.1 Khái niệm tính kháng rầy nâu giống lúa Tính kháng rầy nâu đặc tính giống lúa có khả chống lại cơng rầy nâu làm giảm tác hại rầy nâu gây Trên giống kháng rầy nâu khơng có rầy. .. tính kháng địi hỏi phải có diện số đặc tính kháng rầy nâu lúa, đồng thời phản ứng rầy nâu giống không thuận lợi Tính kháng sinh mà đa số giống kháng rầy có ảnh hưởng bất lợi giống lúa rầy nâu. .. dụng dấu phân tử SSR việc đánh giá phân tích có mặt gen kháng rầy nâu phép lai quy tụ gen kháng rầy số giống lúa Đồng sơng Hồng ĐBSCL Từ chọn hai dòng (OM-DT2) (OM-DT3) đưa vào giống kháng rầy