Khảo Sát Một Số Marker Phân Tử Dùng Trong Chọn Giống Lúa Kháng Rầy Nâu

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ VIỆN NGHIÊN CỨU VÀ PHÁT TRIỂN CÔNG NGHỆ SINH HỌC    LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC NGÀNH CÔNG NGHỆ SINH HỌC KHẢO SÁT MỘT SỐ MARKER PHÂN TỬ DÙNG TRONG CHỌN GIỐNG LÚA KHÁNG RẦY NÂU CÁN BỘ HƯỚNG DẪN TRẦN THỊ XUÂN MAI VIỆN NC&PT CNSH SINH VIÊN THỰC HIỆN LÝ TIẾN MSSV: 3064485 LỚP CÔNG NGHỆ SINH HỌC K32 Cần Thơ, Tháng 5/2010 PHẦN KÝ DUYỆT CÁN BỘ HƯỚNG DẪN SINH VIÊN THỰC HIỆN Trần Thị Xuân Mai Lý Tiến DUYỆT CỦA HỘI ĐỒNG BẢO VỆ LUẬN VĂN ………………………………………………………………………………………… ………………………………………………………………………………………… ………………………………………………………………………………………… ………………………………………………………………………………………… …………………………………………………………………………… Cần Thơ, ngày tháng năm 2010 CHỦ TỊCH HỘI ĐỒNG LỜI CẢM TẠ Để hoàn thành tốt đề tài luận văn tốt nghiệp bên cạnh nổ lực thân tơi cịn nhận nhiều giúp đỡ thầy cô bạn bè người thân Bởi trang luận văn xin gửi lời cảm ơn chân thành đến: - Cô Trần Thị Xuân Mai người hướng dẫn tơi tận tình suốt thời gian thực đề tài mặt lý thuyết thực tập - Cô Nguyễn Thị Liên Cô Nguyễn Thị Pha tận tình giúp đỡ dẫn tơi thời gian làm đề tài phịng thí nghiệm - Thầy Nguyễn Hữu Hiệp q thầy nhiệt tình giảng dạy, truyền đạt kinh nghiệm quý báu suốt thời gian học tập rèn luyện trường - Toàn thể Ban giám đốc, cán Viện NC & PT Công nghệ Sinh học hết lòng quan tâm tạo kiện thuận lợi thời gian học tập thực tập Viện - Bên cạnh xin ơn chị Lê Thị Xã, anh Trang Minh Phương hướng dẫn thời gian học việc phịng thí nghiệm - Tất bạn lớp Công nghệ Sinh học K32, đặc biệt bạn phịng thí nghiệm Cơng nghệ gen Thực vật hỗ trợ lúc thực đề tài Tôi xin đặc biệt gửi lời cảm ơn đến cha mẹ cha mẹ cho Một lần xin chân thành cảm ơn! TĨM TẮT Rầy nâu (Nilaparvata lugens Stal.) trùng gây hại lớn lúa nước ta nước khác Do ứng dụng marker phân tử để xác định gen kháng rầy nâu nhằm chọn tạo giống lúa có khả kháng rầy nâu nhằm làm đa dạng nguồn giống lúa trồng Khảo sát marker phân tử RM13, RM190, RM270, B43, S4019A, 7312.T4 thông qua kỹ thuật PCR phân tích sản phẩm PCR gel agarose Kết cho thấy marker RM13, RM270, B43, S4019A, 712.T4 cho kết đơn hình (có kích thước nhau) Đối với marker RM190 sau phân tích sản phẩm PCR gel agarose 3% cho thấy có đa hình mẫu Điều chứng tỏ marker RM190 liên kết với gen kháng rầy nâu, có 13 giống lúa kiểm tra với marker RM190, giống OM6377, NV1, HĐ1, MTL645, MTL500, MTL480, MTL495 có kích thước khoảng 130bp giống thể tính kháng rầy giống TN1, MTL633, MTL567, MTL560, MTL547 MTL110 có kích thước khoảng 120bp mẫu thể tính nhiễm rầy Từ khóa: Rầy nâu, marker phân tử, BHP (Brown Plant Hopper) i MỤC LỤC TÓM TẮT i MỤC LỤC ii DANH SÁCH BẢNG v DANH SÁCH HÌNH vi CÁC TỪ VIẾT TẮT vii CHƯƠNG – GIỚI THIỆU CHƯƠNG – LƯỢC KHẢO TÀI LIỆU 2.1 Sơ lược lúa .3 2.1.1 Nguồn gốc 2.1.2 Phân loại 2.2 Sơ lược rầy nâu (Nilaparvata lugens Stal.) 2.2.1 Tập quán sinh sống cách gây hại .5 2.2.2 Đặc điểm gây hại .6 2.2.3 Tình hình gây hại .7 2.2.4 Biotype (loại hình sinh học) .7 2.3 Lúa kháng rầy 2.3.1 Các giống lúa kháng rầy nâu du nhập vào Việt Nam .8 2.3.2 Các giống lúa kháng rầy nước 2.3.3 Đặc tính kháng rầy lúa 10 2.4 Gen kháng rầy nâu lúa 11 2.5 Kỹ thuật PCR 13 2.5.1 Nguyên tắc kỹ thuật PCR 13 2.5.2 Thực nghiệm .14 ii 2.5.3 Các tiêu ảnh hưởng đến phản ứng PCR 14 2.6 Kỹ thuật SSR (Simple Sequence Repeats) .16 2.7 Kỹ thuật STS (Sequence-tagget site) 16 2.8 Một số nghiên cứu sử dụng marker phân tử .16 CHƯƠNG PHƯƠNG TIỆN VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .19 3.1 Thời gian địa điểm .19 3.2 Phương tiện nghiên cứu 19 3.2.1 Dụng cụ 19 3.2.2 Thiết bị 19 3.2.3 Hóa Chất 19 3.2.4 Nguyên liệu .19 3.3 Phương pháp nghiên cứu 20 3.3.1 Trích DNA (Quy trình CTAB) 20 3.3.2 Xác định hàm lượng độ tinh DNA phương pháp đo quang phổ hấp thụ 21 3.3.3 Kỹ thuật PCR .22 3.3.4 Điện di .23 3.3.5 Gel Agarose .24 3.3.6 PCR đa thành phần .24 3.4 Bố trí thí nghiệm 25 3.4.1 Thí nghiệm 1: Khảo sát liên kết marker phân tử gen kháng rầy nâu 25 3.4.2 Thí nghiệm 2: Khảo sát đa hình mẫu với cặp primer (PCR đa thành phần) 26 iii 3.4.3 Thí nghiệm 3: Khảo sát nhân tố ảnh hưởng đến phân tích sản phẩm PCR .26 CHƯƠNG KẾT QUẢ THẢO LUẬN 29 4.1 Kết khảo sát tính liên kết marker phân tử gen kháng rầy nâu số giống lúa ĐBSCL 29 4.1.1 Sử dụng marker RM13, RM190, RM270 29 4.1.2 Sử dụng marker B43, S4019A, 7312.T4 30 4.2 Khảo sát đa hình mẫu với cặp primer (PCR đa thành phần) 31 4.3 Khảo sát nhân tố ảnh hưởng đến phân tích sản phẩm PCR 32 CHƯƠNG KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ .37 5.1 Kết luận 37 5.2 Kiến nghị .37 TÀI LIỆU THAM KHẢO 38 iv DANH SÁCH BẢNG Bảng Danh sách giống lúa .20 Bảng Trình tự Primer .22 Bảng Thành phần phản ứng PCR 23 Bảng Chu trình nhiệt phản ứng PCR 23 Bảng Bảng mối liên hệ nồng độ gel kích thước phân tử DNA 24 Bảng Thành phần cho phản ứng PCR đa thành phần .25 Bảng Chu trình nhiệt phản ứng PCR đa thành phần 25 Bảng Chu trình nhiệt cho phản ứng PCR nghiệm thức .27 Bảng Chu trình nhiệt cho phản ứng PCR nghiệm thức .27 Bảng 10 Chu trình nhiệt cho phản ứng PCR nghiệm thức 28 v DANH SÁCH HÌNH Hình Vịng đời rầy nâu (A), Rầy nâu cánh dài (B), Rầy nâu cánh ngắn ấu trùng rầy nâu (C) Hình Lúa bị bệnh VLLXL Hình Nhiễm rầy mật độ cao Hình Kết điện di sản phẩm PCR gel agarose 3% 30 Hình Kết điện di sản phẩm PCR gel agarose 3% 31 Hình Kết điện di sản phẩm PCR đa thành phần gel agarose 2% 32 Hình Kết điện di sản phẩm PCR gel agarose 3% (A) 2% (B) 32 Hình Kết điện di sản phẩm PCR gel agarose 2% 33 Hình Kết điện di sản phẩm PCR gel agarose 2% 34 Hình 10 Kết điện di sản phẩm PCR gel agarose 3% với nhiệt độ bắt cặp primer 54oC sử dụng RM13 (A), RM190 (B) RM270 (C) 35 vi CÁC TỪ VIẾT TẮT Bph Brown plant hopper Biotype Loại hình sinh học CTAB Cetyl trimethyl ammonium bromide DNA Deoxyribonucleic acid EDTA Ethylene diamine tetraacetic acid ĐBSCL Đồng sông Cửu Long PCR Polymerase chain reaction SDS Sodium dodecyl sulfate SSR Simple sequence repeat STS Sequence-tagged site TE Tris-EDTA TBE Tris-Borate-EDTA VLLXL Vàng lùn, lùn xoắn vii Luận văn tốt nghiệp Đại học khóa 32 - 2010 Trường Đại học Cần Thơ Bảng Thành phần cho phản ứng PCR đa thành phần Thành phần Thể tích (µl) BiH20 Taq Buffer with KCl 2.5 MgCl2 dNTP Primer B43 Primer S4019A Forward Reverse Forward Reverse BSA 0.25 Taq polymerase 0.25 DNA Tổng cộng 25 Bảng Chu trình nhiệt phản ứng PCR đa thành phần Nhiệt độ Thời gian o 95 C phút o 95 C giây 54oC giây o 72 C phút 72oC phút o ∞ 10 C Chu kỳ 35 3.4 Bố trí thí nghiệm 3.4.1 Thí nghiệm 1: Khảo sát liên kết marker phân tử gen kháng rầy nâu Mục đích: Sử dụng marker RM13, RM190, RM270, B43, S4019A, 7312.T4A để khảo sát tính đa hình giống lúa phổ biến ĐBSCL Từ khảo sát liên kết marker phân tử gen kháng rầy nâu Thí nghiệm tiến hành sau: - Chuẩn bị mẫu: mẫu DNA ly trích từ giống lúa - Tiến hành: thực PCR theo bảng với từ cặp primer thiết kế từ marker kể Chuyên ngành Công nghệ Sinh học 25 Viện NC & PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học khóa 32 - 2010 Trường Đại học Cần Thơ - Kiểm tra sản phẩm PCR: sản phẩm PCR chạy điện di gel agarose 3% với hiệu điện 60V 150 phút 3.4.2 Thí nghiệm 2: Khảo sát đa hình mẫu với cặp primer (PCR đa thành phần) Mục đích: Sử dụng hai cặp primer phản ứng PCR nhằm tìm giải pháp tối ưu để khảo sát đa hình mẫu phân tích sản phẩm PCR Bên cạnh đó, với PCR đa thành phần ta rút ngắn thời gian phân tích, tiết kiệm chi phí phân tích Thí nghiệm tiến hành sau: Sử dụng marker phân tử B43 S4019A nhiễm sắc thể số - Chuẩn bị mẫu: mẫu DNA ly trích từ giống lúa - Tiến hành: thực phản ứng PCR theo bảng bảng - Kiểm tra sản phẩm PCR: sản phẩm PCR chạy điện di gel agarose gel 2% 3.4.3 Thí nghiệm 3: Khảo sát nhân tố ảnh hưởng đến phân tích sản phẩm PCR Mục đích: khảo sát yếu tố ảnh hưởng đến phân tích sản phẩm PCR chu trình cho phản ứng PCR, nồng độ gel agarose điện di Thí nghiệm tiến hành sau: - Chuẩn bị mẫu: mẫu DNA ly trích từ giống lúa - Nghiệm thức 1: Thực phản ứng PCR theo chu trình nhiệt (bảng 8) nồng độ gel agarose 3% sử dụng marker B43, S4019A, 7312.T4 Chuyên ngành Công nghệ Sinh học 26 Viện NC & PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học khóa 32 - 2010 Trường Đại học Cần Thơ Bảng Chu trình nhiệt cho phản ứng PCR nghiệm thức Nhiệt độ Thời gian o 95 C phút 95oC phút o 50 C phút 72oC phút 72oC 10 phút o ∞ 10 C Chu kỳ 35 - Nghiệm thức 2: Thực phản ứng PCR theo chu trình nhiệt giảm dần (bảng 9) nồng độ gel agarose 2%, sử dụng marker B43, S4019A, 7312.T4 Bảng Chu trình nhiệt cho phản ứng PCR nghiệm thức Nhiệt độ Thời gian o 95 C phút 95oC 30 giây o 58 C 30 giây 72oC phút 30 giây 95 oC 30 giây o 55 C 30 giây 72 oC phút 30 giây 95 oC 30 giây o 52 C 30 giây 72 oC phút 30 giây o 72 C 10 phút o ∞ 10 C Chu kỳ 10 10 25 - Nghiệm thức 3: Thực phản ứng PCR theo chu trình nhiệt (bảng 10) nồng độ gel agarose 2% sử dụng marker RM13, RM190, RM270 Chuyên ngành Công nghệ Sinh học 27 Viện NC & PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học khóa 32 - 2010 Trường Đại học Cần Thơ Bảng 10 Chu trình nhiệt cho phản ứng PCR nghiệm thức Nhiệt độ Thời gian o 95 C phút o 95 C 45 giây 52oC 45 giây o 72 C phút o 72 C 10 phút 10oC ∞ Chu kỳ 35 - Nghiệm thức 4: Thực phản ứng PCR theo chu trình nhiệt bảng 10 thay đổi nhiệt độ bắt cặp primer 54 oC nồng độ gel agarose 3% sử dụng marker RM13, RM190, RM270 Chuyên ngành Công nghệ Sinh học 28 Viện NC & PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học khóa 32 - 2010 Trường Đại học Cần Thơ CHƯƠNG KẾT QUẢ THẢO LUẬN 4.1 Kết khảo sát tính liên kết marker phân tử gen kháng rầy nâu số giống lúa ĐBSCL 4.1.1 Sử dụng marker RM13, RM190, RM270 Thực phản ứng PCR theo bảng Kết điện di sản phẩm PCR (hình 4) ta thấy: Với marker RM13 cho band khoảng 140bp marker RM270 cho band khoảng 120bp có số band phụ Sử dụng marker, sản phẩm PCR điều có band có kích thước (đơn hình) Theo Trịnh Thị Lũy (2008) sử dụng marker RM13 RM270 sau chạy PCR điện di gel agarose 3% xuất đa hình giống lúa nguồn lúa hoang Nhưng thí nghiệm kết điện di sản phẩm PCR dùng marker RM13 RM270 xuất đơn hình nguồn giống khác nhau, thí nghiệm sử dụng giống lúa ĐBSCL, Trịnh Thị Lũy sử dụng quần thể lúa hoang Chứng tỏ marker chưa liên kết với gen kháng rầy nâu số lúa giống ĐBSCL Với marker RM190 mẫu giếng 2, 3, có band khoảng 130bp khác với mẫu giếng có band khoảng 120bp Theo Jaripong Jairin (2006) sử dụng marker RM190 cho kết đa hình Bên cạnh ta xác định kích thước mẫu từ giếng – với marker RM190 ladder 100bp, bên cạnh nghiên cứu Jaringpong Jairin không sử dụng ladder nên ta xác định rõ kích thước mẫu sau điện di Chuyên ngành Công nghệ Sinh học 29 Viện NC & PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học khóa 32 - 2010 Trường Đại học Cần Thơ RM13 RM190 RM270 6 500bp band phụ 140bp 120bp 120bp 130bp Hình Kết điện di sản phẩm PCR gel agarose 3% sử dụng marker RM13, RM190, RM270 Giếng 1: Ladder 100bp, giếng 2: 567/7/1 (ĐC), giếng 3: MTL589, giếng 4: OM35265, giếng 5: MTL560, giếng 6: MTL500, giếng 7: đối chứng âm (H2O) 4.1.2 Sử dụng marker B43, S4019A, 7312.T4 Sau thực PCR theo bảng 3, bảng phân tích sản phẩm PCR gel agarose 3% ta thấy: Với marker S4019A (hình 5A) mẫu khơng có khác biệt kích thước phân tử Ngồi band cần phân tích khoảng 270 (bp) xuất nhiều band phụ Nên ta khơng thể xác định tính liên kết marker S4019A gen kháng rầy Với marker B43 (hình 5B) 7312.T4 (hình 5C) cho kết đơn hình band có độ sáng mờ không đồng Nguyên nhân nồng độ DNA chưa đồng mẫu, thời gian phản ứng PCR ngắn nên sản phẩm PCR nhân lên 10 11 12 10 11 12 800bp 500bp 500bp 270bp A Chuyên ngành Công nghệ Sinh học B 30 Viện NC & PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học khóa 32 - 2010 Trường Đại học Cần Thơ 13 14 15 16 17 18 16 16 12 1000bp 500bp C Hình Kết điện di sản phẩm PCR gel agarose 3% sử dụng marker S4019 (A), B43 (B), 7312.T4 (C) Giếng 1: Ladder 100bp, giếng 2: OM4495, giếng 3: 567/7/1 (ĐC), giếng 4: IR50404, giếng 5: OM5637 (A2), giếng 6: MTL560, giếng 7: OMCS2000 (ĐCA1), giếng 8: OM6561-12 (A2), giếng 9: MTL664, giếng 10: MTL499, giếng 11: TRẮNG TÉP, giếng 12: đối chứng âm (H20), giếng 13: MTL495, giếng 14 NV1, giếng 15: HĐ1, giếng 16: MTL500, giếng 17: OM4900, giếng 18: MTL589 Qua thí nghiệm ta thấy, marker RM13, RM270, B43, S4019A, 7312.T4 chưa thể rõ tính liên kết với gen kháng rầy, marker RM190 thể tính đa hình Bên cạnh đó, kết điện di ta thấy band gel mờ, ngồi band cần phân tích ứng với marker cịn xuất band khơng mong muốn, điều ảnh hưởng đến phân tích Do cần tiến hành tối ưu điều kiện PCR Theo ta cần tiếp tục khảo sát với số giống lúa khác 4.2 Khảo sát đa hình mẫu với cặp primer (PCR đa thành phần) Thực phản ứng PCR đa thành phần theo bảng Kết điện di sản phẩm PCR đa thành phần gel agarose 2% (hình 6) ta thấy: gel xuất band marker B43 (800bp) S4019 (270bp), band khơng thấy có đa hình Điều chứng tỏ marker chưa thể tính liên kết với gen kháng rầy nâu Tuy nhiên, thí nghiệm khơng cho kết đa hình, với PCR đa thành ta khảo sát cặp primer phản ứng PCR, điều giúp rút ngắn thời gian tiết kiệm chi phí nghiên cứu Chun ngành Cơng nghệ Sinh học 31 Viện NC & PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học khóa 32 - 2010 Trường Đại học Cần Thơ 1000bp 800bp 500bp 270bp Hình Kết điện di sản phẩm PCR đa thành phần gel agarose 2% Giếng 1: Ladder 100bp, giếng 1: OM4495, giếng 3: MTL500, giếng 4: NV1, giếng 5: HĐ1, giếng 6: OMCS2000 (ĐCA1), giếng 7: OM4900, giếng 8: Đối chứng âm (H20) 4.3 Khảo sát nhân tố ảnh hưởng đến phân tích sản phẩm PCR Nghiệm thức 1: Thực phản ứng PCR theo chu trình nhiệt bảng nồng độ gel agarose 3% 2% marker B43, S4019A, 7312.T4 Kết điện di (hình 7) ta thấy: thực PCR theo chu trình nhiệt bảng cho band rõ sáng, bên cạnh cịn xuất nhiều band phụ gây ảnh hưởng đến việc phân tích sau Với nồng độ gel agarose 3% band chạy chậm, kể thang chuẩn chưa tách hết band (hình 7A) Với nồng độ 2% band tách rõ (hình 7B) 500bp 1000bp 500bp B43 7312.T4 10 11 12 13 10 11 12 13 B43 A 7312.T4 B Hình Kết điện di sản phẩm PCR gel agarose 3% (A) 2% (B) sử dụng marker B43 7312.T4 Giếng 1: Ladder 100bp, giếng OM4495, giếng 3: MTL500, giếng 4: MTL560, giếng 5: OM5637 (A2), giếng 6: OMCS2000 (ĐCA1), giếng 7: OM4900, Chuyên ngành Công nghệ Sinh học 32 Viện NC & PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học khóa 32 - 2010 Trường Đại học Cần Thơ giếng 8: đối chứng âm (H2O), giếng 9: MTL495, giếng 10: MTL480, giếng 11: NV1, giếng 12: HĐ1, giếng 13: Jasmin Vì nghiệm thức chọn nồng độ để phân tích gel thích hợp với marker B43, S4019, 7312.T4 2% Bên cạnh để giảm bớt band phụ ta tiến hành hiệu chỉnh lại chu trình nhiệt cho phản ứng PCR Nghiệm thức 2: Thực phản ứng PCR theo chu trình nhiệt bảng 1000bp 500bp 8 B43 7312.T4 Hình Kết điện di sản phẩm PCR gel agarose 2% sử dụng marker B43, 7312.T4 Giếng 1: Ladder 100bp, giếng 2: OM4495, giếng 3: MTL500, giếng 4: MTL560, giếng 5: OM5637 (A1), giếng 6: OMCS2000 (ĐCA1), giếng 7: OM4900, giếng 8: Đối chứng âm (H2O) Kết điện di sản phẩm PCR (hình 8) theo chu trình nhiệt bảng với nồng độ gel agarose 2% ta thấy: band cần phân tích 800bp (B43) 1000bp (7312.T4) rõ, xuất band phụ so với nghiệm thí Bên cạnh đó, chưa thấy đa hình marker cải thiện điều kiện phản ứng PCR Nghiệm thức 3: Thực phản ứng PCR theo bảng nồng độ gel agarose 2% sử dụng marker RM13, RM190, RM270 Kết điện di (hình 9) ta thấy: Chun ngành Cơng nghệ Sinh học 33 Viện NC & PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học khóa 32 - 2010 Trường Đại học Cần Thơ 10 11 12 500bp 140bp 120bp 130bp Hình Kết điện di sản phẩm PCR gel agarose 2% sử dụng RM13 (giếng 2-5 11) RM190 ( giếng 6-10) Giếng 1: Ladder 100bp, giếng 2: OMCS2000 (ĐCA1), giếng 3: OM4218 (A1), giếng 4: OM5199, giếng 5: OM4495, giếng 6: OMCS2000 (ĐCA1), giếng 7: OM4218 (A1), giếng 8: OM5199, giếng 9: OM4495, giếng 10: Jasmin, giếng 11: Jasmin, giếng 12: Đối chứng âm (H20) Với nhiệt độ bắt cặp primer 52oC (bảng 10) thấy band (140bp) tương đối rõ, lại xuất nhiều band phụ với marker RM13 Còn với nồng độ gel agarose 2% ta thấy khác biệt band giếng từ 6-9 giếng 10 (marker RM190) Nhưng khác biệt chưa thể rõ nét gel Do nghiệm thức với nhiệt độ bắt cặp primer 52oC nồng độ gel agarose % chưa phù hợp để khảo sát tính đa hình marker RM13, RM190, RM270 Nghiệm thức 4: Thực phản ứng PCR theo chu trình nhiệt (bảng 10) với nhiệt độ bắt cặp primer 54oC nồng độ gel agarose 3% sử dụng marker RM13, RM190, RM270 500bp 6 500bp 140bp 120bp A Chuyên ngành Công nghệ Sinh học B 34 Viện NC & PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học khóa 32 - 2010 Trường Đại học Cần Thơ 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 500bp 130bp 120bp C Hình 10 Kết điện di sản phẩm PCR gel agarose 3% với nhiệt độ bắt cặp primer 54oC sử dụng RM13 (A), RM270 (B) RM190 (C) Giếng 1: Ladder 100bp, giếng 2: OMCS2000 (ĐCA1), giếng 3: OM6561-12 (A0), giếng 4: OM4218 (A1), giếng 5: OM5199 (A1), giếng OM5199-2, giếng 7:TN1, giếng 8: đối chứng âm (H20), giếng 9: OM6377, giếng 10: NV1, giếng 11: HĐ1, giếng 12: MTL645, giếng 13: MTL633, giếng 14: MTL567, giếng 15: MTL560, giếng 16: MTL547, giếng 17: MTL500, giếng 18: MTL480, giếng 19: MTL495, giếng 20: MTL110, giếng 21: Ladder 100bp Kết điện di (hình 10) ta thấy: band sáng rõ, marker RM13 (140bp) RM270 (120bp) cho band đơn hình Cịn RM190 (hình 10C) ta thấy rõ đa hình mẫu Mẫu giếng 9, 10, 11 giống OM6377, NV1, HĐ1 giống lọc ngồi đồng ruộng ứng với band có kích thích khoảng 130bp, mẫu giếng giống lúa TN1 giống lọc đồng ruộng nhiễm rầy ứng với band có kích thích khoảng 120bp mẫu nhiễm rầy Qua ta thấy kết điện di hình (10) ta thấy phù hợp với kết lọc đồng ruộng Chứng tỏ marker RM190 liên kết mạnh với gen kháng rầy Nói tóm lại qua nghiệm thức thí nghiệm cho thấy Đối với marker RM13, RM190, RM270 với chu trình nhiệt theo bảng 11 nồng độ gel agarose thích hợp 3% sản phẩm PCR thể gel rõ độ tách band dễ dàng nhận đa hình (RM190) Đối với marker B43, 7312.T4 S4019A chu trình nhiệt theo bảng nồng độ gel 2% sản phẩm PCR giảm band khơng mong muốn Qua cịn chứng minh, marker RM13, RM270, B43, 7312.T4, S4019 chưa thể rõ liên kết marker tính kháng rầy số giống lúa ĐBSCL Chuyên ngành Công nghệ Sinh học 35 Viện NC & PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học khóa 32 - 2010 Trường Đại học Cần Thơ Đối với marker RM190 tính đa hình band, có mẫu sau điện di cho band có kích thước phân tử khoảng 130bp thể tính kháng với rầy nâu Cịn mẫu điện di cho band có kích thước phân tử khoảng 120bp thể tính nhiễm rầy Có 13 giống kiểm tra với marker RM190 giống lúa kháng rấy là: OM6377, NV1, HĐ1, MTL645, MTL500, MTL480, MTL495 giống nhiễm là: TN1, MTL633, MTL567, MTL560, MTL547 MTL110 Theo Jaripong Jairin, 2006, xác định RM190 có liên kết mạnh với gen kháng rầy nâu Bph3 nhiễm sắc thể Chuyên ngành Công nghệ Sinh học 36 Viện NC & PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học khóa 32 - 2010 Trường Đại học Cần Thơ CHƯƠNG KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 5.1 Kết luận - Với marker B43 S4019, 7312.T4 điều kiện tốt cho phân tích sản phẩm PCR chu trình nhiệt (bảng 9) với nồng độ gel agarose 2% - Với marker RM13, RM190, RM270 điều kiện tốt cho phân tích sản phẩm PCR chu trình nhiệt (bảng 10) với nhiệt độ bắt cặp primer 54oC với nồng độ gel agarose 3% - Các marker RM13, RM270, B43, S4019, 7312.T4, PCR cho kết đơn hình chứng tỏ marker chưa thể tính liên kết với gen kháng rầy nâu số giống lúa ĐBSCL - Marker RM190 cho kết đa hình, band 130bp kháng rầy nâu 120bp nhiễm rầy Có 13 giống lúa kiểm tra với marker RM190, giống OM6377, NV1, HĐ1, MTL645, MTL500, MTL480, MTL495 thể tính kháng rầy nâu giống TN1, MTL633, MTL567, MTL560, MTL547 MTL110 thể tính nhiễm 5.2 Kiến nghị - Tiếp tục sử dụng sản phẩm PCR từ marker khơng cho band đa hình để phân tích cách cắt với enzyme cắt giới hạn, từ khảo sát tính liên kết marker gen kháng rầy nâu - Tiếp tục khảo sát tính liên kết marker RM190 với số giống lúa khác Chuyên ngành Công nghệ Sinh học 37 Viện NC & PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học khóa 32 - 2010 Trường Đại học Cần Thơ TÀI LIỆU THAM KHẢO Tiếng Việt Bùi Chí Bửu Nguyễn Thị Lang 2007 Ứng dụng cơng nghệ sinh học cải tiến giống lúa, Nxb Nông Nghiệp Hà Nội Bùi Chí Bửu, K.Reganayaki, A.S Reddy 1997 Phân tích di truyền tính kháng rầy nâu giống lúa hoang nhờ marker phân tử, kết nghiên cứu khoa học 1977 – 1997, Viện lúa ĐBSCL, Nxb Nông nghiệp TP Hồ Chí Minh Nguyễn Văn Luật 2002 Cây lúa Việt Nam kỷ 20, Nxb Nông nghiệp Hà Nội Nguyễn Ngọc Đệ 2007 Giáo trình lúa, Khoa Nông nghiệp Sinh học ứng dụng, Trường Đại học Cần Thơ, Nguyễn Thị Cẩm Nhung 2009 Luận văn tốt nghiệp “Sử dụng dấu phân tử phát gen kháng rầy nâu số giống lúa ĐBSCL”, khoa Khoa học, Trường Đại học Cần Thơ Nguyễn Thị Lang 2002 Phương pháp nghiên cứu công nghệ sinh học, Nxb Nơng Nghiệp Trình Đình Đạt 2008 Cơng nghệ sinh học tập bốn: công nghệ di truyền, Nxb Giáo dục Tiếng Anh Jirapong Jairin et al 2006 Mapping of a broad-spectrum brown planthopper resistance gene, Bph3, on rice chromosome 6, Mol Breeding (2007) 19: 35–44 K K Jena et at 2005 High-resolution of a new brown planthopper (BPH) resistance gene, Bph18(t), and marker-assisted selection for BPH resistance in rice (Oryza sativa L), Theor Appl Genet (2006) 112: 288–297 Md Lutfor Rahman et al 2009 High-resolution mapping of two rice brown planthopper resistance gene, Bph20(t) and Bph21(t), originating from Oryza minuta, Theor Appl Genet Trinh Thi Luy et al 2008 Introgression of a resistance gene to brown plant hopper from Oryza rufipopon to cultilars, OMONRICE 16, 2008 Chuyên ngành Công nghệ Sinh học 38 Viện NC & PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học khóa 32 - 2010 Trường Đại học Cần Thơ SU Chang-Chao et al, 2006 SSR Mapping of Brown Planthopper Resistance Gene Bph9 in Kaharamana, an Indica Rice (Oryza sativa L.) Acata Genetica Sinica, March 2006, 33 (3): 262-268 Chuyên ngành Công nghệ Sinh học 39 Viện NC & PT Công nghệ Sinh học ... diện số đặc tính kháng rầy nâu lúa, đồng thời phản ứng rầy nâu giống không thuận lợi Tính kháng sinh mà đa số giống kháng rầy có ảnh hưởng bất lợi giống lúa rầy nâu chúng ăn phải Đối với giống rầy. .. 2007) Do chọn lựa marker liên kết với gen kháng sâu bệnh điều cần thiết Chính đề tài ? ?Khảo sát số marker phân tử dùng chọn giống lúa kháng rầy nâu? ?? góp phần giải nhiều vấn đề công tác chọn giống. .. 2.3 Lúa kháng rầy 2.3.1 Các giống lúa kháng rầy nâu du nhập vào Việt Nam .8 2.3.2 Các giống lúa kháng rầy nước 2.3.3 Đặc tính kháng rầy lúa 10 2.4 Gen kháng rầy nâu