phổ hấp thụ
+ Đo hàm lượng DNA
Tùy vào cấu trúc của mỗi chất mà chúng có một đỉnh hấp thụ nhất định. Đối với nucleic acid, do sự tương tác giữa các proton và các electron của vòng purine và pyrimidine mà nó có khả năng hấp thụ lớn nhất ở bước sóng 260nm trong vùng tử ngoại và hấp thụ cực tiểu ở bước sóng từ 230nm - 240nm và không hấp thụ ở vùng có bước sóng lớn hơn 310nm. Dựa vào tính chất này mà người ta có thể xác định được hàm lượng các nucleic acid bằng phương pháp đo quang phổ hấp thụ ở bước sóng 260nm.
Độ hấp thụ này còn phụ thuộc vào các nhân tố như là: pH, nhiệt độ, cường độ ion. Độ hấp thụ tăng lên khi ở trong môi trường acid hoặc kiềm. Trong thí nghiệm này pha loãng DNA trong dung môi là TE 0,1 và ở nhiệt độ phòng.
Chuyên ngành Công nghệ Sinh học 22 Viện NC & PT Công nghệ Sinh học
Công thức tính hàm lượng và độ tinh sạch của DNA. Hàm lượng DNA (ng/µl) =50×HSPL×OD260 (1) Trong đó
HSPL : hệ số pha loãng
OD260 : chỉ số đo được ở bước sóng 260nm
Công thức (1) được áp dụng tính hàm lượng của DNA sợi đôi.
+ Đo độ tinh sạch của DNA
Trong mẫu DNA thường có lẫn phenol và protein. Những tạp chất này làm tăng độ hấp thụ ở bước sóng 280nm vùng tử ngoại. Vì vậy độ tinh sạch của dung dịch nucleic acid được đánh giá bằng tỉ lệ giữa độ hấp thụ ánh sáng ở hai bước sóng 260nm
và 280nm. Được tính bằng công thức sau: Độ sạch nucleic acid = OD260/OD280
Nếu tỉ lệ này nằm trong khoảng 1,8 đến 2 thì dung dịch DNA được xem là tinh sạch. Tỉ lệ này thấp hơn 1,8 chứng tỏ mẫu có lẫn tạp chất. Đối với dung dịch DNA sợi đôi, nếu tỉ lệ quá lớn thì chứng tỏ DNA có chứa trong mẫu bị biến tính hay bị phân hủy.
- Tiến hành:
Cho 90µl BiH20 và 10µl mẫu DNA vào tube 1,5ml. Sau đó tiến hành đo OD bằng máy đo OD Backman Coulter. Ghi nhận kết quả hiển thị trên màn hình máy tính.
3.3.3 Kỹ thuật PCR
Thực hiện phản ứng PCR lần lượt với từng cặp primer RM13, RM190, RM270, B43, S4019A, 7312.T4A được thiết kế từ các marker tương ứng.
Bảng 2. Trình tự của các Primer
Primer Forward Reverse bp
RM13 5’ TCC AAC ATG GCA AGA GAG AG 3’ 5’ GGT GGC ATT CGA TTC CAG 3’ 140
RM190 5’ CTT TGT CTA TCT CAA GAC AC 3’ 5’ TTG CAG ATG TTC TTC CTG ATG 3’ 130
RM270 5’ GGC CGT TGG TTC TAA AAT C 3’ 5’ TGC GCA GTA TCA TCG GCG AG 3’ 120
B43 5’ ACT CCA ATT GGT TCC TGT GG 3’ 5’ TGG ACT AAA AGC CGA TGA GC 3’ 800
S4019A 5’ CCA CCG TTT GAT CAT TCA TCT 3’ 5’ AAC AAA TTT GAG GGC AAA AA 3’ 270
7312.T4A 5’ ACG GCG GTG AGC ATT GG 3’ 5’ TAC AGC GAA AAG CAT AAA GAG TC 3’ 1000
Chuyên ngành Công nghệ Sinh học 23 Viện NC & PT Công nghệ Sinh học
Bảng 3. Thành phần phản ứng PCR
Thành phần Thể tích (µl)
BiH20 11
Taq Buffer with KCl 2.5
MgCl2 3 dNTP 4 Forward 1 Primer Reverse 1 BSA 0.25 Taq polymerase 0.25 DNA 2 Tổng cộng 25 (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Bảng 4. Chu trình nhiệt của phản ứng PCR
Nhiệt độ Thời gian Chu kỳ
95oC 2 phút 95oC 30 giây 50oC 30 giây 72oC 1 phút 35 72oC 10 phút 10oC ∞
Thực hiện phản ứng PCR lần lượt với các primer bằng thiết bị PC BIORAD.
3.3.4. Điện di
Điện di là một kĩ thuật được ứng dụng rộng rãi trong phòng thí nghiệm sinh học, hóa học, đặc biệt là sinh học phân tử để tách các hạt tích điện như là DNA, RNA, protein... Như chúng ta đã biết các phân tử nucleic acid mang điện tích âm và khi đặt chúng trong một điện trường thì các phần tử tích điện này sẽ di chuyển từ cực âm sang cực dương. Khi tiến hành điện di trên bản gel (gel agarose hoặc là gel polyacrylamid), các phần tử này sẽ dịch chuyển qua các lỗ gel để đến cực dương. Các hạt có kích thước nhỏ dễ dàng di chuyển qua các lỗ gel, các hạt có kích thước lớn thì di chuyển chậm hơn. Chính vì vậy mà có thể phân tách các hạt tích điện này theo kích thước bằng cách điện di trên gel.
Thông thường người ta dùng hai loại gel là gel agarose và gel polyacrylamid. Gel agarose cho phép phân tách các phân tử DNA sợi đôi có kích thước từ 100 đến 10000
Chuyên ngành Công nghệ Sinh học 24 Viện NC & PT Công nghệ Sinh học
bp. Còn gel polyacrylamid cho phép phân tách các phân tử DNA sợi đơn có kích thước nhỏ dưới 500 nucleotide và còn có thể tách riêng từng phân tử DNA có kích thước khác nhau là một nucleotide. Tùy theo kích thước đối tượng DNA muốn tách mà ta sử dụng gel với các nồng độ khác nhau.
Bảng 5. Bảng mối liên hệ giữa nồng độ gel và kích thước phân tử DNA
Nồng độ Agarose Kích thước phân tử DNA cần phân tích (bp)
0.6% 1000 - 20000 0.7% 800 - 10000 1% 500 - 7000 1,2% 400 - 6000 1,5% 200 - 3000 2,0% 100 - 2000
Trong điện di DNA thường sử dụng đệm đó là đệm TBE.
Sau khi tiến hành điện di thì cần phải làm hiện hình các phân tử DNA trên gel. Đối với gel agarose thì người ta dùng thuốc nhuộm Ethidium bromide. Chất này sẽ gắn xen vào giữa các base của phân tử DNA và phát huỳnh quang khi chiếu tia tử ngoại.
3.3.5. Gel agarose
Để khảo sát tính đa hình của các mẫu DNA được ly trích từ các giống khi sử dụng các primer RM13, RM190, RM270, B43, S4019A, 7312.T4A thì nồng độ gel agarose là 2% và 3%.
Bản gel nhỏ 3% được chuẩn bị bằng cách cân 0.45g agarose nấu với 15ml TBE 1X trong microwave khoảng 2 – 3’. Để nguội khoảng 500C rồi cho vào 0,3µl Ethidium Bromide, lắc đều và đổ vào khay đã được cài lược sẵn. Sau 20 – 30’, gel cứng lại, đặt gel vào bồn điện di có chứa dung dịch đệm TBE cùng loại. Tiến hành load sản phẩm PCR được trộn đều với Loading buffer vào các giếng trên gel. Điện di khoảng 120 – 150’ cho đến khi vạch Loading buffer chạy đến cuối bản gel thì dừng lại, mang gel đi
chụp bằng máy chụp hình gel Biorad UV 2000 và ghi nhận kết quả. Bản gel lớn 3% thực hiện tương tự như gel nhỏ nhưng thay đổi như sau: 0.9g
agarose, 30ml TBE và 0.6µl Ethidium Bromide.
3.3.6. PCR đa thành phần.
Thực hiện phản ứng PCR với 2 cặp mồi từ 2 cặp marker B43 và S4019A trên nhiễm sắc thể 4 theo thành phần và chu trình nhiệt như sau:
Chuyên ngành Công nghệ Sinh học 25 Viện NC & PT Công nghệ Sinh học
Bảng 6. Thành phần cho một phản ứng PCR đa thành phần
Thành phần Thể tích (µl)
BiH20 5
Taq Buffer with KCl 2.5
MgCl2 3 dNTP 4 Forward 2 Primer B43 Reverse 2 Forward 2 Primer S4019A Reverse 2 BSA 0.25 Taq polymerase 0.25 DNA 2 Tổng cộng 25
Bảng 7. Chu trình nhiệt của phản ứng PCR đa thành phần
Nhiệt độ Thời gian Chu kỳ
95oC 2 phút 95oC 5 giây 54oC 5 giây 72oC 5 phút 35 72oC 5 phút 10oC ∞ 3.4. Bố trí thí nghiệm (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});