3.2.1. Dụng cụ - Chày và cối đá - Giấy nhôm - Kẹp, kéo - Tube 1.5, 2.2 ml - Micropipet
- Đầu côn vàng, xanh và trắng
3.2.2. Thiết bị
- Máy ủ - Máy ly tâm - Máy votex - Cân điện tử
- Máy đo OD Backman Coulter - Bộ điện di
- Máy PCR BIORAD
- Máy chụp gel BIORAD UV 2000
3.2.3. Hóa Chất
Trích DNA: Nitơ lỏng, Extraction Buffer (EB), SDS 10%, Isopropanol, TE, CTAB, Chloroform/isoamylalcolhol, Ethanol 96% và 70%, Bi H20.
Chạy điện di: TBE, Loading buffer (LB), Ethidium Bromide.
Phản ứng PCR: BiH20, Buffer, MgCl2, Taq polymerase, dNTP, Primer RM13, RM190, RM270, B43, S4019A, 7312.T4A.
3.2.4. Nguyên liệu
Sử dụng 30 giống lúa được từ Viện Nghiên cứu và Phát triển Công nghệ Sinh học, Viện Nghiên cứu và Phát triển ĐBSCL.
Chuyên ngành Công nghệ Sinh học 20 Viện NC & PT Công nghệ Sinh học
Bảng 1. Danh sách các giống lúa
STT Giống lúa Ký hiệu STT Giống lúa Ký hiệu
1 MTL110 1a, 1b 16 OM4900 16a, 16b
2 MTL480 2a, 2b 17 OM6377 17a, 17b
3 MTL495 3a, 3b 18 OM5637 (A2) 18a, 18b
4 MTL500 4a, 4b 19 PTB33 19a, 19b
5 MTL547 5a, 8b 20 TN1 (chuẩn nhiễm) 20a, 20b
6 MTL560 6a, 6b 21 MTL499 21a, 21b
7 MTL567 7a, 7b 22 MTL589 22a, 22b
8 MTL633 8a, 8b 23 MTL664 23a, 23b
9 MTL645 9b, 9b 24 567/7/1 (ĐC) 24a, 24b
10 HĐ1 10a, 10b 25 OM3526 25a, 25b
11 NV1 (chuẩn kháng) 11a, 11b 26 OM4495 26a, 26b
12 OM4495 12a ,12b 27 IR50404 27a, 27b
13 IR50404 13a, 13b 28 OM5637 (A2) 28a, 28b
14 OMCS2000 (ĐCA1) 14a, 14b 29 TRẮNG TÉP 29a, 29b
15 OM6561-12 (A2) 15a, 15b 30 Jasmin 30a, 30b (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
3.3. Phương pháp nghiên cứu
3.3.1. Trích DNA (Quy trình CTAB)
Khử trùng bề mặt mẫu (lá lúa) bằng cồn 70o, cắt nhỏ mẫu, gói lại trong giấy nhôm
Ngâm trong nitơ lỏng khoảng 10 phút. Nghiền mẫu thành bột bằng chày và cối đá. Cho mẫu và 1/3 tube 2,2ml
Cho thêm vào mỗi tube 1ml Extraction buffer (10 ml EB + 7 µl β- Mercaptoethanol).
Cho thêm 50µl SDS 10% vào mỗi tube.
Chuyên ngành Công nghệ Sinh học 21 Viện NC & PT Công nghệ Sinh học
Ly tâm 13.000 vòng/phút trong 10 phút. Lấy 800µl dịch trong ở trên cho vào tube mới. Cho 800µl Isopropanol vào mỗi tube, lắc đều. Ủ mẫu ở – 20oC trong 2 giờ.
Ly tâm 13.000 vòng/phút trong 10 phút, bỏ nước, lấy phần trầm hiện. Cho thêm 400µl TE pH 8 và 400µl CTAB, ủ mẫu ở 65oC trong 30 phút.
Cho 800µl Chloroform/Isoamylalcolhol, đảo nhẹ. (Tỷ lệ 24ml Chloroform: 1ml Isoamylalcolhol). Ly tâm 13.000 vòng/phút trong 10 phút.
Lấy 700µl phần trong ở trên chuyển sang tube mới.
Cho 1,4 ml Ethanol 96% vào, đảo nhẹ, để 15 phút ở nhiệt độ phòng. Ly tâm 13.000 vòng/phút trong 10 phút, bỏ nước, giữ lại phần tủa.
Cho 700µl Ethanol 70% vào, đảo nhẹ. Ly tâm 13000 vòng/phút trong 10 phút, bỏ nước, lấy phần trầm hiện. Lặp lại lần nữa với Ethanol 70%, thấm miệng tube trên giấy thấm.
Sấy chân không các tube ở 45oC trong 10 phút. Hòa tan DNA với 100µl TE 0,1.
3.3.2. Xác định hàm lượng và độ tinh sạch của DNA bằng phương pháp đo quang phổ hấp thụ phổ hấp thụ
+ Đo hàm lượng DNA
Tùy vào cấu trúc của mỗi chất mà chúng có một đỉnh hấp thụ nhất định. Đối với nucleic acid, do sự tương tác giữa các proton và các electron của vòng purine và pyrimidine mà nó có khả năng hấp thụ lớn nhất ở bước sóng 260nm trong vùng tử ngoại và hấp thụ cực tiểu ở bước sóng từ 230nm - 240nm và không hấp thụ ở vùng có bước sóng lớn hơn 310nm. Dựa vào tính chất này mà người ta có thể xác định được hàm lượng các nucleic acid bằng phương pháp đo quang phổ hấp thụ ở bước sóng 260nm.
Độ hấp thụ này còn phụ thuộc vào các nhân tố như là: pH, nhiệt độ, cường độ ion. Độ hấp thụ tăng lên khi ở trong môi trường acid hoặc kiềm. Trong thí nghiệm này pha loãng DNA trong dung môi là TE 0,1 và ở nhiệt độ phòng.
Chuyên ngành Công nghệ Sinh học 22 Viện NC & PT Công nghệ Sinh học
Công thức tính hàm lượng và độ tinh sạch của DNA. Hàm lượng DNA (ng/µl) =50×HSPL×OD260 (1) Trong đó
HSPL : hệ số pha loãng
OD260 : chỉ số đo được ở bước sóng 260nm
Công thức (1) được áp dụng tính hàm lượng của DNA sợi đôi.
+ Đo độ tinh sạch của DNA
Trong mẫu DNA thường có lẫn phenol và protein. Những tạp chất này làm tăng độ hấp thụ ở bước sóng 280nm vùng tử ngoại. Vì vậy độ tinh sạch của dung dịch nucleic acid được đánh giá bằng tỉ lệ giữa độ hấp thụ ánh sáng ở hai bước sóng 260nm
và 280nm. Được tính bằng công thức sau: Độ sạch nucleic acid = OD260/OD280
Nếu tỉ lệ này nằm trong khoảng 1,8 đến 2 thì dung dịch DNA được xem là tinh sạch. Tỉ lệ này thấp hơn 1,8 chứng tỏ mẫu có lẫn tạp chất. Đối với dung dịch DNA sợi đôi, nếu tỉ lệ quá lớn thì chứng tỏ DNA có chứa trong mẫu bị biến tính hay bị phân hủy.
- Tiến hành:
Cho 90µl BiH20 và 10µl mẫu DNA vào tube 1,5ml. Sau đó tiến hành đo OD bằng máy đo OD Backman Coulter. Ghi nhận kết quả hiển thị trên màn hình máy tính.
3.3.3 Kỹ thuật PCR (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Thực hiện phản ứng PCR lần lượt với từng cặp primer RM13, RM190, RM270, B43, S4019A, 7312.T4A được thiết kế từ các marker tương ứng.
Bảng 2. Trình tự của các Primer
Primer Forward Reverse bp
RM13 5’ TCC AAC ATG GCA AGA GAG AG 3’ 5’ GGT GGC ATT CGA TTC CAG 3’ 140
RM190 5’ CTT TGT CTA TCT CAA GAC AC 3’ 5’ TTG CAG ATG TTC TTC CTG ATG 3’ 130
RM270 5’ GGC CGT TGG TTC TAA AAT C 3’ 5’ TGC GCA GTA TCA TCG GCG AG 3’ 120
B43 5’ ACT CCA ATT GGT TCC TGT GG 3’ 5’ TGG ACT AAA AGC CGA TGA GC 3’ 800
S4019A 5’ CCA CCG TTT GAT CAT TCA TCT 3’ 5’ AAC AAA TTT GAG GGC AAA AA 3’ 270
7312.T4A 5’ ACG GCG GTG AGC ATT GG 3’ 5’ TAC AGC GAA AAG CAT AAA GAG TC 3’ 1000
Chuyên ngành Công nghệ Sinh học 23 Viện NC & PT Công nghệ Sinh học
Bảng 3. Thành phần phản ứng PCR
Thành phần Thể tích (µl)
BiH20 11
Taq Buffer with KCl 2.5
MgCl2 3 dNTP 4 Forward 1 Primer Reverse 1 BSA 0.25 Taq polymerase 0.25 DNA 2 Tổng cộng 25
Bảng 4. Chu trình nhiệt của phản ứng PCR
Nhiệt độ Thời gian Chu kỳ
95oC 2 phút 95oC 30 giây 50oC 30 giây 72oC 1 phút 35 72oC 10 phút 10oC ∞
Thực hiện phản ứng PCR lần lượt với các primer bằng thiết bị PC BIORAD.
3.3.4. Điện di
Điện di là một kĩ thuật được ứng dụng rộng rãi trong phòng thí nghiệm sinh học, hóa học, đặc biệt là sinh học phân tử để tách các hạt tích điện như là DNA, RNA, protein... Như chúng ta đã biết các phân tử nucleic acid mang điện tích âm và khi đặt chúng trong một điện trường thì các phần tử tích điện này sẽ di chuyển từ cực âm sang cực dương. Khi tiến hành điện di trên bản gel (gel agarose hoặc là gel polyacrylamid), các phần tử này sẽ dịch chuyển qua các lỗ gel để đến cực dương. Các hạt có kích thước nhỏ dễ dàng di chuyển qua các lỗ gel, các hạt có kích thước lớn thì di chuyển chậm hơn. Chính vì vậy mà có thể phân tách các hạt tích điện này theo kích thước bằng cách điện di trên gel.
Thông thường người ta dùng hai loại gel là gel agarose và gel polyacrylamid. Gel agarose cho phép phân tách các phân tử DNA sợi đôi có kích thước từ 100 đến 10000
Chuyên ngành Công nghệ Sinh học 24 Viện NC & PT Công nghệ Sinh học
bp. Còn gel polyacrylamid cho phép phân tách các phân tử DNA sợi đơn có kích thước nhỏ dưới 500 nucleotide và còn có thể tách riêng từng phân tử DNA có kích thước khác nhau là một nucleotide. Tùy theo kích thước đối tượng DNA muốn tách mà ta sử dụng gel với các nồng độ khác nhau.
Bảng 5. Bảng mối liên hệ giữa nồng độ gel và kích thước phân tử DNA
Nồng độ Agarose Kích thước phân tử DNA cần phân tích (bp)
0.6% 1000 - 20000 0.7% 800 - 10000 1% 500 - 7000 1,2% 400 - 6000 1,5% 200 - 3000 2,0% 100 - 2000
Trong điện di DNA thường sử dụng đệm đó là đệm TBE.
Sau khi tiến hành điện di thì cần phải làm hiện hình các phân tử DNA trên gel. Đối với gel agarose thì người ta dùng thuốc nhuộm Ethidium bromide. Chất này sẽ gắn xen vào giữa các base của phân tử DNA và phát huỳnh quang khi chiếu tia tử ngoại.
3.3.5. Gel agarose (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Để khảo sát tính đa hình của các mẫu DNA được ly trích từ các giống khi sử dụng các primer RM13, RM190, RM270, B43, S4019A, 7312.T4A thì nồng độ gel agarose là 2% và 3%.
Bản gel nhỏ 3% được chuẩn bị bằng cách cân 0.45g agarose nấu với 15ml TBE 1X trong microwave khoảng 2 – 3’. Để nguội khoảng 500C rồi cho vào 0,3µl Ethidium Bromide, lắc đều và đổ vào khay đã được cài lược sẵn. Sau 20 – 30’, gel cứng lại, đặt gel vào bồn điện di có chứa dung dịch đệm TBE cùng loại. Tiến hành load sản phẩm PCR được trộn đều với Loading buffer vào các giếng trên gel. Điện di khoảng 120 – 150’ cho đến khi vạch Loading buffer chạy đến cuối bản gel thì dừng lại, mang gel đi
chụp bằng máy chụp hình gel Biorad UV 2000 và ghi nhận kết quả. Bản gel lớn 3% thực hiện tương tự như gel nhỏ nhưng thay đổi như sau: 0.9g
agarose, 30ml TBE và 0.6µl Ethidium Bromide.
3.3.6. PCR đa thành phần.
Thực hiện phản ứng PCR với 2 cặp mồi từ 2 cặp marker B43 và S4019A trên nhiễm sắc thể 4 theo thành phần và chu trình nhiệt như sau:
Chuyên ngành Công nghệ Sinh học 25 Viện NC & PT Công nghệ Sinh học
Bảng 6. Thành phần cho một phản ứng PCR đa thành phần
Thành phần Thể tích (µl)
BiH20 5
Taq Buffer with KCl 2.5
MgCl2 3 dNTP 4 Forward 2 Primer B43 Reverse 2 Forward 2 Primer S4019A Reverse 2 BSA 0.25 Taq polymerase 0.25 DNA 2 Tổng cộng 25
Bảng 7. Chu trình nhiệt của phản ứng PCR đa thành phần
Nhiệt độ Thời gian Chu kỳ
95oC 2 phút 95oC 5 giây 54oC 5 giây 72oC 5 phút 35 72oC 5 phút 10oC ∞ 3.4. Bố trí thí nghiệm
3.4.1. Thí nghiệm 1: Khảo sát sự liên kết giữa các marker phân tử và gen kháng rầy nâu. nâu.
Mục đích: Sử dụng các marker RM13, RM190, RM270, B43, S4019A, 7312.T4A để khảo sát tính đa hình của các giống lúa phổ biến ở ĐBSCL. Từ đó khảo sát sự liên kết giữa các marker phân tử và các gen kháng rầy nâu.
Thí nghiệm được tiến hành như sau:
- Chuẩn bị mẫu: các mẫu DNA được ly trích từ các giống lúa.
- Tiến hành: thực hiện PCR theo bảng 3 và 4 lần lượt với từ cặp primer được thiết kế từ các marker kể trên.
Chuyên ngành Công nghệ Sinh học 26 Viện NC & PT Công nghệ Sinh học
- Kiểm tra sản phẩm PCR: sản phẩm PCR được chạy điện di trên gel agarose 3% với hiệu điện thế là 60V trong 150 phút.
3.4.2. Thí nghiệm 2: Khảo sát sự đa hình giữa các mẫu với 2 cặp primer (PCR đa thành phần) thành phần)
Mục đích: Sử dụng hai cặp primer trong cùng một phản ứng PCR nhằm tìm ra giải pháp tối ưu để khảo sát sự đa hình giữa các mẫu trong phân tích sản phẩm PCR. Bên cạnh đó, với PCR đa thành phần ta sẽ rút ngắn thời gian phân tích, tiết kiệm chi phí trong phân tích.
Thí nghiệm được tiến hành như sau: Sử dụng 2 marker phân tử B43 và S4019A trên cùng một nhiễm sắc thể số 4
- Chuẩn bị mẫu: các mẫu DNA được ly trích từ các giống lúa. - Tiến hành: thực hiện phản ứng PCR theo bảng 6 và bảng 7.
- Kiểm tra sản phẩm PCR: sản phẩm PCR được chạy điện di trên gel agarose trên gel 2%.
3.4.3. Thí nghiệm 3: Khảo sát các nhân tố ảnh hưởng đến sự phân tích sản phẩm PCR.
Mục đích: khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến sự phân tích sản phẩm PCR như chu trình cho phản ứng PCR, nồng độ gel agarose khi điện di.
Thí nghiệm được tiến hành như sau: (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
- Chuẩn bị mẫu: các mẫu DNA được ly trích từ các giống lúa.
- Nghiệm thức 1: Thực hiện phản ứng PCR theo chu trình nhiệt (bảng 8) và nồng độ gel agarose là 3% sử dụng 3 marker B43, S4019A, 7312.T4.
Chuyên ngành Công nghệ Sinh học 27 Viện NC & PT Công nghệ Sinh học
Bảng 8. Chu trình nhiệt cho phản ứng PCR ở nghiệm thức 1
Nhiệt độ Thời gian Chu kỳ
95oC 2 phút 95oC 1 phút 50oC 1 phút 72oC 2 phút 35 72oC 10 phút 10oC ∞
- Nghiệm thức 2: Thực hiện phản ứng PCR theo chu trình nhiệt giảm dần (bảng 9) và nồng độ gel agarose là 2%, sử dụng 3 marker B43, S4019A, 7312.T4.
Bảng 9. Chu trình nhiệt cho phản ứng PCR ở nghiệm thức 2
Nhiệt độ Thời gian Chu kỳ
95oC 2 phút 95oC 30 giây 58oC 30 giây 72oC 1 phút 30 giây 10 95 oC 30 giây 55 oC 30 giây 72 oC 1 phút 30 giây 10 95 oC 30 giây 52 oC 30 giây 72 oC 1 phút 30 giây 25 72oC 10 phút 10oC ∞
- Nghiệm thức 3: Thực hiện phản ứng PCR theo chu trình nhiệt (bảng 10) nồng độ gel agarose 2% sử dụng 3 marker RM13, RM190, RM270.
Chuyên ngành Công nghệ Sinh học 28 Viện NC & PT Công nghệ Sinh học
Bảng 10. Chu trình nhiệt cho phản ứng PCR ở nghiệm thức 3
Nhiệt độ Thời gian Chu kỳ
95oC 2 phút 95oC 45 giây 52oC 45 giây 72oC 1 phút 35 72oC 10 phút 10oC ∞
- Nghiệm thức 4: Thực hiện phản ứng PCR theo chu trình nhiệt bảng 10 nhưng thay đổi nhiệt độ bắt cặp primer là 54 oC và nồng độ gel agarose là 3% sử dụng 3 marker RM13, RM190, RM270.
Chuyên ngành Công nghệ Sinh học 29 Viện NC & PT Công nghệ Sinh học
CHƯƠNG 4 KẾT QUẢ THẢO LUẬN
4.1. Kết quả khảo sát tính liên kết giữa marker phân tử và gen kháng rầy nâu trên một số giống lúa ở ĐBSCL. trên một số giống lúa ở ĐBSCL.
4.1.1. Sử dụng marker RM13, RM190, RM270
Thực hiện phản ứng PCR theo bảng 3 và 4. Kết quả điện di sản phẩm PCR (hình 4) ta thấy:
Với marker RM13 cho ra band khoảng 140bp và marker RM270 cho ra band khoảng 120bp và có một số band phụ. Sử dụng 2 marker, sản phẩm PCR điều có các band có cùng kích thước (đơn hình). Theo Trịnh Thị Lũy (2008) sử dụng marker RM13 và RM270 sau khi chạy PCR và điện di trên gel agarose 3% thì sẽ xuất hiện sự đa hình giữa các giống lúa đối với nguồn lúa hoang. Nhưng trong thí nghiệm này thì kết quả điện di sản phẩm PCR khi dùng marker RM13 và RM270 thì xuất hiện đơn hình do nguồn giống khác nhau, thí nghiệm 1 sử dụng các giống lúa ở ĐBSCL, trong khi đó Trịnh Thị Lũy sử dụng trên quần thể lúa hoang. Chứng tỏ 2 marker chưa liên kết với gen kháng rầy nâu trên một số lúa giống ở ĐBSCL.
Với marker RM190 các mẫu ở giếng 2, 3, 5 và 6 có band khoảng 130bp khác với mẫu ở giếng 4 có band khoảng 120bp. Theo Jaripong Jairin (2006) khi sử dụng marker RM190 cũng cho ra kết quả đa hình. Bên cạnh đó ta có thể xác định được kích thước của các mẫu từ giếng 2 – 6 với marker RM190 bằng ladder 100bp, bên cạnh đó trong nghiên cứu của Jaringpong Jairin không sử dụng ladder nên ta không thể xác định rõ kích thước của mẫu sau khi điện di.
Chuyên ngành Công nghệ Sinh học 30 Viện NC & PT Công nghệ Sinh học
Hình 4. Kết quả điện di sản phẩm PCR trên gel agarose 3% sử dụng marker RM13, RM190, RM270
Giếng 1: Ladder 100bp, giếng 2: 567/7/1 (ĐC), giếng 3: MTL589, giếng 4: OM35265, giếng 5: MTL560, giếng 6: MTL500, giếng 7: đối chứng âm (H2O)