Nghiệm thức 1: Thực hiện phản ứng PCR theo chu trình nhiệt bảng 8 và nồng độ gel agarose là 3% và 2% 3 marker B43, S4019A, 7312.T4.
Kết quả điện di (hình 7) ta thấy: khi thực hiện PCR theo chu trình nhiệt bảng 8 cho ra band khá rõ và sáng, bên cạnh đó còn xuất hiện nhiều band phụ gây ảnh hưởng đến việc phân tích sau này. Với nồng độ gel agarose là 3% thì các band chạy khá chậm, kể cả thang chuẩn vẫn chưa tách hết các band (hình 7A). Với nồng độ 2% thì các band đã tách ra khá rõ (hình 7B).
A B
Hình 7. Kết quả điện di sản phẩm PCR trên gel agarose 3% (A) và 2% (B) sử dụng marker B43 và 7312.T4
Giếng 1: Ladder 100bp, giếng 2. OM4495, giếng 3: MTL500, giếng 4: MTL560, giếng 5: OM5637 (A2), giếng 6: OMCS2000 (ĐCA1), giếng 7: OM4900,
1 2 3 4 5 6 7 8 500bp 1000bp 1 2 3 4 5 6 7 8 2 3 4 5 6 7 1 2 9 10 11 12 6 7 13 9 10 11 12 6 7 13 B43 7312.T4 B43 7312.T4 500bp 500bp 1000bp 270bp 800bp
Chuyên ngành Công nghệ Sinh học 33 Viện NC & PT Công nghệ Sinh học
giếng 8: đối chứng âm (H2O), giếng 9: MTL495, giếng 10: MTL480, giếng 11: NV1, giếng 12: HĐ1, giếng 13: Jasmin
Vì vậy ở nghiệm thức 1 chọn được nồng độ để phân tích trên gel thích hợp với marker B43, S4019, 7312.T4 là 2%. Bên cạnh đó để giảm bớt các band phụ ta tiến hành hiệu chỉnh lại chu trình nhiệt cho phản ứng PCR.
Nghiệm thức 2: Thực hiện phản ứng PCR theo chu trình nhiệt bảng 9
Hình 8. Kết quả điện di sản phẩm PCR trên gel agarose 2% sử dụng marker B43, 7312.T4
Giếng 1: Ladder 100bp, giếng 2: OM4495, giếng 3: MTL500, giếng 4: MTL560, giếng 5: OM5637 (A1), giếng 6: OMCS2000 (ĐCA1), giếng 7: OM4900, giếng 8: Đối chứng âm (H2O)
Kết quả điện di sản phẩm PCR (hình 8) theo chu trình nhiệt bảng 9 với nồng độ gel agarose 2% ta thấy: các band cần phân tích 800bp (B43) và 1000bp (7312.T4) hiện khá rõ, ít xuất hiện band phụ hơn so với nghiệm thí 1. Bên cạnh đó, vẫn chưa thấy được sự đa hình ở các marker này khi đã cải thiện điều kiện phản ứng PCR.
Nghiệm thức 3: Thực hiện phản ứng PCR theo bảng 9 và nồng độ gel agarose 2% sử dụng 3 marker RM13, RM190, RM270.
Kết quả điện di (hình 9) ta thấy:
1 2 3 4 5 6 7 8 2 3 4 5 6 7 8
500bp 1000bp
Chuyên ngành Công nghệ Sinh học 34 Viện NC & PT Công nghệ Sinh học
Hình 9. Kết quả điện di sản phẩm PCR trên gel agarose 2% sử dụng RM13 (giếng 2-5 và 11) và RM190 ( giếng 6-10)
Giếng 1: Ladder 100bp, giếng 2: OMCS2000 (ĐCA1), giếng 3: OM4218 (A1), giếng 4: OM5199, giếng 5: OM4495, giếng 6: OMCS2000 (ĐCA1), giếng 7: OM4218 (A1), giếng 8: OM5199, giếng 9: OM4495, giếng 10: Jasmin, giếng 11: Jasmin, giếng 12: Đối chứng âm (H20)
Với nhiệt độ bắt cặp primer là 52oC (bảng 10) thấy band chính (140bp) tương đối rõ, nhưng lại xuất hiện nhiều band phụ với marker RM13. Còn với nồng độ gel agarose 2% ta thấy sự khác biệt giữa các band trong giếng từ 6-9 và giếng 10 (marker RM190). Nhưng sự khác biệt này cũng chưa thể hiện rõ nét trên bản gel. Do đó nghiệm thức với nhiệt độ bắt cặp primer là 52oC và nồng độ gel agarose là 2 % chưa phù hợp để khảo sát tính đa hình đối với marker RM13, RM190, RM270.
Nghiệm thức 4: Thực hiện phản ứng PCR theo chu trình nhiệt như (bảng 10) với nhiệt độ bắt cặp primer là 54oC và nồng độ gel agarose là 3% sử dụng 3 marker RM13, RM190, RM270. A B 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 1 2 3 4 5 6 1 2 3 4 5 6 4 500bp 140bp 120bp 500bp 130bp 500bp 140bp 120bp
Chuyên ngành Công nghệ Sinh học 35 Viện NC & PT Công nghệ Sinh học
C
Hình 10. Kết quả điện di sản phẩm PCR gel trên agarose 3% với nhiệt độ bắt cặp primer là 54oC sử dụng RM13 (A), RM270 (B) và RM190 (C)
Giếng 1: Ladder 100bp, giếng 2: OMCS2000 (ĐCA1), giếng 3: OM6561-12 (A0), giếng 4: OM4218 (A1), giếng 5: OM5199 (A1), giếng 6. OM5199-2, giếng 7:TN1, giếng 8: đối chứng âm (H20), giếng 9: OM6377, giếng 10: NV1, giếng 11: HĐ1, giếng 12: MTL645, giếng 13: MTL633, giếng 14: MTL567, giếng 15: MTL560, giếng 16: MTL547, giếng 17: MTL500, giếng 18: MTL480, giếng 19: MTL495, giếng 20: MTL110, giếng 21: Ladder 100bp.
Kết quả điện di (hình 10) ta thấy: các band sáng rõ, marker RM13 (140bp) và RM270 (120bp) cho ra các band đơn hình. Còn RM190 (hình 10C) ta thấy rõ sự đa hình giữa các mẫu. Mẫu ở giếng 9, 10, 11 là các giống OM6377, NV1, HĐ1 là các giống đã được thanh lọc ngoài đồng ruộng ứng với band có kích thích khoảng 130bp, mẫu ở giếng 7 là giống lúa TN1 là giống đã được thanh lọc ngoài đồng ruộng là nhiễm rầy ứng với band có kích thích khoảng 120bp là những mẫu nhiễm rầy. Qua đó ta thấy kết quả điện di hình (10) ta thấy phù hợp với kết quả thanh lọc ngoài đồng ruộng. Chứng tỏ marker RM190 liên kết mạnh với gen kháng rầy.
Nói tóm lại qua 4 nghiệm thức ở thí nghiệm 3 cho thấy. Đối với 3 marker RM13, RM190, RM270 với chu trình nhiệt theo bảng 11 và nồng độ gel agarose thích hợp là 3% thì sản phẩm PCR thể hiện trên gel khá rõ độ tách các band dễ dàng nhận ra sự đa hình (RM190). Đối với marker B43, 7312.T4 và S4019A thì chu trình nhiệt theo bảng 9 nồng độ gel 2% thì sản phẩm PCR sẽ giảm được band không mong muốn. Qua đó còn chứng minh, các marker RM13, RM270, B43, 7312.T4, S4019 chưa thể hiện rõ sự liên kết giữa các marker này và tính kháng rầy trên một số giống lúa ở ĐBSCL.
7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21
500bp
Chuyên ngành Công nghệ Sinh học 36 Viện NC & PT Công nghệ Sinh học
Đối với marker RM190 có thể hiện tính đa hình giữa các band, có mẫu sau khi điện di cho ra band có kích thước phân tử khoảng 130bp là thể hiện tính kháng với rầy nâu. Còn các mẫu khi điện di cho ra band có kích thước phân tử khoảng 120bp thể hiện tính nhiễm rầy. Có 13 giống kiểm tra với marker RM190 thì các giống lúa kháng rấy là: OM6377, NV1, HĐ1, MTL645, MTL500, MTL480, MTL495 và các giống nhiễm là: TN1, MTL633, MTL567, MTL560, MTL547 và MTL110.
Theo Jaripong Jairin, 2006, cũng đã xác định RM190 có liên kết rất mạnh với gen kháng rầy nâu Bph3 trên nhiễm sắc thể 6.
Chuyên ngành Công nghệ Sinh học 37 Viện NC & PT Công nghệ Sinh học
CHƯƠNG 5 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ